Summary
I denna studie kommer att använda en in situ lastningsanordning i kombination med mikro-Röntgen datortomografi för fibrösa gemensamma biomekanik diskuteras. Experimentella avläsning identifierbara med en total förändring i gemensamma biomekanik kommer att omfatta: 1) reaktionär kraft kontra förskjutning, dvs tandcylindervolymen i alveolära uttag och dess reaktionära svar på belastning, 2) tredimensionella (3D) rumslig konfiguration och Morfometri, dvs geometriska förhållandet av tanden med den alveolära uttag, och 3) förändringar i avläsning 1 och 2 på grund av en ändring i lastaxeln, dvs koncentriska eller excentriska laster.
Abstract
Denna studie visar en roman biomekanik testprotokoll. Fördelen med detta protokoll innefattar användning av en in situ-lastningsanordning som är kopplad till en hög upplösning röntgenmikroskop, vilket möjliggör visualisering av de inre strukturella element under simulerade fysiologiska belastningar och våta förhållanden. Experimentella prover kommer att omfatta intakt ben parodontala ligamentet (PDL)-tand fibrösa lederna. Resultaten kommer att belysa tre viktiga funktioner i protokollet, eftersom de kan tillämpas på organnivå biomekanik: 1) reaktionär kraft kontra förskjutning: tand cylindervolymen i alveolära uttag och dess reaktionära svar lastning, 2) tredimensionella (3D) spatial konfiguration och Morfometri: geometriskt förhållande av tanden med den alveolära uttag, och 3) förändringar i avläsning 1 och 2 på grund av en förändring i lastaxel, dvs från koncentriskt till excentriska belastningar. Effekten av den föreslagna protokollet kommer att utvärderas genom att koppla mekanisk testing avläsning till 3D Morfometri och övergripande biomekanik leden. Vidare kommer denna teknik betonar behovet av att jämvikta experimentella betingelser specifikt reaktionära laster före förvärvande tomogram av fiberförband. Det bör noteras att det föreslagna protokollet är begränsat till att testa prover enligt ex vivo-förhållanden, och att användningen av kontrastmedel för att visualisera mjukdelar mekanisk reaktion kan leda till felaktiga slutsatser om vävnads-och organnivå biomekanik.
Introduction
Flera experimentella metoder att fortsätta att användas för att undersöka biomekanik diarthrodial och fibrösa lederna. Speciella metoder för biomekanik tandorgan innefatta användning av töjningsgivare 1-3, photoelasticity metoderna 4, 5, Moiré interferometri 6, 7, elektronisk fläckmönster interferometri 8 och digitala bildkorrelations (DIC) 9-14. I denna studie, inkluderar den innovativa tillvägagångssätt icke-invasiv avbildning med röntgen för att avslöja de inre strukturerna i ett fiber gemensamt (mineraliserade vävnader och deras gränssnitt som består av mjukare zoner, och gränssnitt vävnader såsom ligament) vid belastning motsvarande in vivo-förhållanden. En in situ-lastningsanordning som är kopplad till en mikro-röntgenmikroskop kommer att användas. Lasten-tid och lastförskjutningskurvor kommer att samlas in som molar av intresse inom en nyskördade råtta hemi-käken är laddad. Den main Målet med strategin som presenteras i denna studie är att betona effekten av tredimensionella morfologi av tand-ben genom att jämföra villkoren på: 1) ingen last och när den är lastad, och när 2) koncentriskt och excentriskt laddad. Eliminerar behovet av snittprover, samt att utföra experiment på hela intakta organ på vått väglag kommer att möjliggöra maximal bevara 3D-spänningstillstånd. Detta öppnar ett nytt område av utredning för att förstå dynamiska processer i komplexet under olika belastningsscenarier.
I denna studie, de metoder för att testa PDL biomekanik inom en intakt fibrös gemensamt av en Sprague Dawley råtta, ett gemensamt betraktas som en optimal bioteknik modellsystem kommer att presenteras. Experiment kommer att omfatta simulering av tugg laster vid hydratiserade förhållanden för att lyfta fram tre viktiga funktioner i det gemensamma eftersom de hänför sig till organnivå biomekanik. De tre punkter kommer att omfatta: 1) reaktionär kraft kontra förskjutning:tand cylindervolymen i alveolära uttag och dess reaktionära svar på belastning, 2) tredimensionella (3D) rumslig konfiguration och Morfometri: geometriska förhållandet av tanden med den alveolära uttag, och 3) förändringar i avläsning 1 och 2 på grund av en förändring i lastaxel, dvs från koncentriskt till excentriska belastningar. De tre grundläggande avläsning av den föreslagna tekniken kan tillämpas för att undersöka den adaptiva naturen av leder hos ryggradsdjur antingen beroende på förändringar i funktionella krav, och / eller sjukdom. Förändringar i de tidigare nämnda avläsning, speciellt sambandet mellan reaktionära laster med förskjutning, och resulterande bakåtlasttids-och lastförskjutningskurvor vid olika belastningshastigheter kan användas för att markera de totala förändringarna i joint biomekanik. Effekten av den föreslagna protokollet kommer att utvärderas genom att koppla mekaniska provnings avläsning till 3D Morfometri och övergripande biomekanik leden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurstallar och eutanasi: Alla djur som används i denna demonstration inhystes i patogenfria förhållanden i enlighet med riktlinjerna i Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) och National Institute of Health (NIH).
Ge djur med standardhårdpelletråttfoder och vatten ad lib. Avliva djur via en två-stegsmetod av koldioxid kvävning, bilaterala torakotomi enligt standardprotokollet för UCSF som godkänts av IACUC. Utför biomekaniska tester inom 24 timmar efter djuroffer för att undvika vävnadsnedbrytning.
1. Upprättande och Dissektion av en råtta Mandible eller Maxilla
- Avlägsna rått mandibles genom att försiktigt avskärande membranös vävnad och muskelvävnad bilagor samtidigt bevara hela underkäken, inklusive coronoideus processen och kondylära processen (fig 1) 15.
- Separata hemimandibles med bilefully skära den fibrösa vävnaden av mandibular symphysis med en skalpell blad.
Obs! Koronara och kondylära processer och ramus av underkäken (Figur 1) bör tas bort om de fysiskt förhindra biomekanisk testning av 2: a molar. - Skär framtänderna utan att exponera pulpakammaren att den inte hindrar lastning av molar.
2. Provberedning för in situ-tryckbelastning (Figur 2)
- Immobilisera provet på en ståltappen genom att använda ett material som är betydligt styvare än de experimentella provet innan det fylls på i en in situ laddningsenhet (Figur 2A).
Anm: Polymetylmetakrylat (PMMA) användes för att immobilisera förlagan i denna studie och överskott, om någon, avlägsnades med användning av en dental explorer. - Rikta ocklusalytan på molar (er) av intresse parallellt med AFM metallpreparatskivan med en rak kant i bådaplan (dvs. mesial-distal och buckala språkiga).
- Skapa ett tråg med ett trubbigt instrument som omger kindtänderna.
OBS: Detta utrymme bör fungera som en "vallgrav" för att innehålla överflödig vätska och hålla vävnader hydrering under in situ belastning. - Förbered tandytan för att bygga upp för koncentrisk (Figur 2B) eller excentriska (figur 2C) lastning med en dental komposit. Etsa ytan av tanden av intresse med 35% fosforsyra gel på ocklusal yta för 15 sek.
- Skölj etsmedlet noggrant med avjoniserat vatten och torka ytan med användning av en spruta luft / vatten eller ett tryckluftskapseln. Med en upptäcktsresande, spred en droppe av bindemedlet i öppna spetsar i ett tunt lager. Cure kompositen med en dental härdningslampa.
OBS: Alla steg som involverar kompositer bör utföras utan direkt ljus från en lampa. Sådana betingelser skulle på oönskat accelerera polymerisationsprocessen och Could förhindrar korrekt placering av komposit. Rummet belysning är acceptabelt. - Ta bort överflödigt bindemedel från intilliggande tänder med en fin skalpell eller rakblad.
- Placera flytande tandkomposit på ytan efter behandling av beläggningen och sprida det i spåren på molar (er) av intresse med hjälp av en tand Explorer.
- Exponera kompositen att dental härdningslampa under 30 sek.
- Mögel ett ocklusalt uppbyggd av ca 3-4 mm med hjälp av en dental hartskomposit, från det ocklusala planet för den molära (er) av intresse och ljushärda i 30 sek.
- Reducera den övre delen av komposituppbyggnad till en plan yta parallell att möjliggöra en enhetlig lastningsschema över alla prover genom användning av en rak kant och en höghastighetshandstycke.
Obs: Under biomekanisk testning, bör andra exemplar förvaras i tris-fosfatbuffrad lösning (TBS) med 50 mg / ml penicillin och streptomycin 15.
3. Loading Device Drift ochStelhet, Material Property Skilja Capability, in situ Laddar Gemensamma Fibrer
- Fixera prov med komposituppbyggnad på städet av laddningsfasen och test för likformig belastning, såsom visas i figur 2B.
- Placera en ledad papper på ytan av det sammansatta följt av lastning provet till en ändlig belastning för att kontrollera om koncentrisk eller excentrisk belastning (figur 2B och 2C).
- Placera TBS-indränkt Kimwipe runt provet för att säkerställa exemplar hydrering. Gör en ränna runt provet och fyll den med TBS för att hålla organ hydrerad under avbildning.
- Ingångstoppbelastning och förskjutningshastighet i Deben programvara för att komprimera molar till en önskad toppbelastning vid en förskjutningshastighet efter immobilisering av hemimandible.
Obs: Typiska avläsningar bör innehålla en reaktionär belastning som materialet komprimeras över tid (lastgivare känslighet = 0,1N). Från last tid och förskjutning-tid, bör en lastförskjutningskurva för den komprimerade materialet erhållas 16-18. Med hjälp av data som samlats in från laddningscykler, kan olika egenskaper hos leden också bestämmas. Styvheten hos fogen bör beräknas genom att ta lutningen på den linjära delen (ungefär de sista 30% av data) av laddningsfasen av lasten mot förskjutningskurvan 19.
4. Färgning av mjuk vävnad, PDL, med fosforvolframsyra (PTA)
OBS: För att förbättra röntgendämpning bör däremot den PDL färgas med 5% PTA lösning 20.
- Återfyllning PTA färglösningen till ett rent 1,8 ml glas ampullen och placera lastas ampullen i sprutan.
- Injicera lösningen långsamt (5 min / ampullen) i PDL-utrymmet av angränsande tänder för att förhindra strukturell skada på parodontala vävnader som omger molar av intresse.
OBS: Ovanstående åtgärder bör be upprepas tills ca 5 fulla carpules (9 ml) av lösningen injiceras och får flyta in i de omgivande vävnaderna. De prepped exemplar kan också läggas i blöt över natten i den kvarvarande PTA lösningen (8 tim).
5. Rekommenderade μ-XCT scanning inställningar
Utför m-XCT med följande skanningsinställningar:
| Mål Förstoring | 4X, 10X |
| 1800 bilder | |
| Röntgenrörets spänning | 75 kVp (50 kVp för färgade PTA prover) |
| 8 W | |
| Exponeringstid | ~ 8-25 sek * |
| ~ 4 m (4X mål), ~ 2 pm (10X objektiv) ** |
* Exponeringstid kan variera beroende på geometri och optiska densiteten av provet och röntgenröret voltage.
** Faktiska upplösning pixel kommer skilja sig något baserat på konfigurationen av källan, provet och detektorn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uppskattning av lastningsanordningen "dödgång", "stift", stelhet och systemets avdrift under en konstant belastning
Glapp: Mellan-och avlastning av delarna av cykeln, det finns en paus på 3 sek under vilken kugghjulen omvända inuti motorn innan sann lossning påbörjas, det vill säga som preparat drar sig undan från den övre klämbacken (Figur 3). Denna period kallas en motreaktion i systemet, vilket utgör en del av tiden när systemet försöker växla från stängning till öppning av käftarna. Det bör noteras att alla belastningscykler kommer att innehålla en liknande motreaktion svar oberoende av provet eller lastförhållanden (Figur 4). En normal belastning vs tidskurvan erhölls med användning av en stel kropp visas i figurerna 3A och 3B belyser lastning, lossning, och glapp regioner vid två olika lOADs av 6 N och 16 N. En normal belastning kontra förskjutningskurvan belyser de motsvarande tre segment visas i figur 3C.
Pushback: Medan alla glapp perioder förekommer inom samma 3 sek tidsramen, den reaktionära svar och som ett resultat formen på bakslag regionen kan ändras beroende på provet. Genom att testa systemet med hjälp av en stel kropp (Figur 3), var den brantaste och högsta minskning av reaktionära belastning observeras jämfört med ben-PDL-tand komplex och polydimethlysiloxane (PDMS). Men den fibrösa gemensamma illustrerade en betydande nedgång i reaktionära belastning under backlash fas jämfört med PDMS. PDMS (Figur 4) prover visade sig ha den minsta droppe (ingen skillnad mellan 01:05 och 01:25 tvärbindningstäthet - Figur 4A).
Styvhet: Styvhet hos lastanordningen vid testning against stel kropp var betydligt högre än för de komplexa och PDMS exemplar. Dessa data validera effektiviteten av laddningsanordningen för att markera förändringar i biomekanik i ben-PDL-tooth komplex och mjukare material (Figur 4B).
Visualisera mjuka och hårda vävnadsstrukturer inom den intakta ben PDL-tand komplex med hjälp av μ-XCT: I en ofärgade, men hydrerad fibrösa gemensamma ades dämpning av hårda vävnad funktioner, inklusive käkbenet, cement, emalj och dentin markerat (fig. 5A och 5B). Men utrymmen som innehöll övervägande mjukare organiska tyger var transparent för röntgenstrålar, lämnar PDL-utrymmet relativt "tom" (svart). Prover som behandlas med PTA visade ökad kontrast i PDL-utrymme, vilket belyser egenskaper representativa för PDL och gingival vävnad (figur 5C-F). Skanning med en högre magnification avslöjade PDL som ett fibröst nätverk mellan tanden och benet.
Reaktionär kraft kontra förskjutning: biomekanisk svar av den fibrösa gemensamma under in situ lastning: Jämfört med koncentrisk belastning, excentrisk belastning mönster på en liknande exemplar visade en ökad förskjutning av tanden i skarven för en viss reaktionär last (Figur 6A). Men för fibrösa lederna behandlades med PTA inga signifikanta skillnader i de övergripande biomekanik observerades oberoende av lasttillstånd (figur 6B). I den obehandlade men excentriskt belastad system, kan den ökade förskjutningen av roten in i den alveolära hylsa korreleras med lägre styvhet såsom visas i de lastförskjutningskurvor (fig. 6C). Även om det skulle kunna vara en naturlig varians som leder till en rad olika biomekaniska svar fibrösa lederna som skördats inom kontrollgrupper, PTA-behandlade fibrösafogar uppvisade ökad styvhet och fördrivna mindre i uttaget jämfört med obehandlade motsvarigheter för en viss reaktionär toppbelastning. Emellertid fanns det ingen detekterbar förändring i form eller varaktigheten av den dödgång fasen av belastningscykeln mellan obehandlade och PTA-behandlade prover.
Tredimensionell rumslig konfiguration och Morfometri: kartlägga ben tand konfigurationen i belastade förhållanden med hjälp av μ-XCT: Virtuella skivor tas från tomogram jämfördes för att illustrera 1) tand rörelse i uttaget, 2) tand-ben förening både i 2D och 3D , 3) omfattningen av rörelsen på grund av excentrisk jämfört med koncentrisk belastning. Tandrörelsen betonades lagring av liknande virtuella skivor utan belastning och vid belastning och genere gif-filmer. Även om båda lastsystem orsakade tanden för att tränga undan vertikalt inom leden, en excentrisk lastkonfiguration (figur 7B och 7C) caused en ytterligare rotationseffekten av tanden med rötterna roterande distalt resulterar i minskad PDL utrymme längs de distala sidorna hos rötter jämfört med koncentriska lasten avsökningar (figurerna 7 och 8). Fastän PTA fläckade PDL var mer förmildrande (figur 5), varvid rörelse av tanden inom alveolära uttag i de behandlade PTA lederna var mindre uttalad och korreleras med de biomekaniska data (figurerna 6B och 6C).
Figur 1. En anpassad 15 illustration av viktiga platser vid upprättande av hemimandible för biomekaniska tester. Visas i infällda bilden är en hemimandible.
Figur 2. Konfiguration av en in situ lastenhet och μ-XCT-systemet. (A) En bild av en in situ lastningsanordning på en anpassad hållare inom mikro-röntgen datortomografi (μ-XCT) enhet. Concentric (B) och excentriska (C) belastningsförhållanden bestäms av vilken typ av kontakt mellan städet och den sammansatta ytan illustreras i form av scheman, och motsvarande experimentella uppställningar (region motsvarar den som markeras med den vita rutan i (A ) resp. Marks från artikulera papper bekräfta initial kontaktyta mellan städet och den dentala komposit. Klicka här för att visa en större bild. </ A>
Figur 3. Representant last-tidskurvan illustrerar systemet "backlash". Load vs tid med hjälp av en stel kropp illustrerar backlash period som en händelse mellan stängning och öppning av städ. Den gröna regionen indikerar laddningsperioden där städ närmar (grön region) för att ladda en stel kropp till 15 N (A) och 5 N (B, inlägg). Det blå området visar en avlastningsperiod där städ är tillbakadragning från varandra. Men på grund av bristen av momentana motor reaktion på grund av den tid det tar växel omkastning, det ligger en back lash period av ~ 3 sek. Under denna tid belastningen minskar med ungefär 2 N innan sann landningen sker. Lastning och lossning händelser kan relateras till belastning mot förflyttning grafs (C) som visar minimal förskjutning under bakslag perioden. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Representativa lastförskjutningskurvor och "pushback"-effekt med hjälp av PDMS Bottom kurvor:. Lasttidsförhållanden mellan PDMS med minskande monomer till tvärbindningsförhållanden avslöjar möjligheten för in situ laddningsenheten för att upptäcka skillnader i materialegenskaper. Topp kurvor, vänster och höger illustrerar förändringen i bakslag i systemet på grund av materialåtervinning. Vänster och höger jämfört illustrera samma effekt, vilket tyder på att återhämtningen skillnaden 1:25 till 01:05 PDMS är minimal eller inte är inomdetektionsgränser av lastanordningen. B) Load-förskjutningskurvor för olika material, inklusive stel kropp aluminium, experimentella prov, och de tre PDMS prover. Det är lutningen på 30% linjära delen av laddningskurva som användes för att beräkna styvheten i materialet. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 5. Röntgen virtuella delar av underkäken andra kindtänderna färgas för PDL struktur förbättring. (A, B) Grå skalvärden inom obehandlade molarer indikerar röntgen dämpning av olika vävnader, inklusive de mjukare områdena inom komplexet. Dock var icke-mineraliserad vävnader såsom PDL inte markerat på grund av dess minimal dämpande egenskaper röntgenenergi vid 75 kVp. (CF) Efter PTA färgning dämpningsegenskaper mjukare PDL förhöjdes och detaljerna inom PDL visualiserades med användning av ett röntgenmikroskop. Således 2D virtuella sagittal (C-4X förstoring, E-10x förstoring) och tvärgående (D-4X förstoring, F-10X förstoring) avsnitt avslöjade PDL fiberorientering (gula pilar). Den lumen av blodkärl inom endostala utrymmen (orange pil) och PDL (vita pilar) visas som mörka cirkulära strukturer, medan det pulpal utrymmet förblir ofärgade. Artefakter som skapats under färgningsproceduren också noteras (D, röd asterisk). Klicka här för att visa en större bild.
fo: src = "/ files/ftp_upload/51147/51147fig6highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51147/51147fig6.jpg" />
Figur 6. Koncentriskt och excentriskt belastade prover. Topp (A) och bottenpaneler (B) visar snabba tids filmer av tand-ben förhållandet vid tomgång och vid belastning på 15 N, koncentriskt och excentriskt respektive. Topp-och bottenpaneler visar ben tand association när obehandlade (A) och färgade (B) förhållanden. Mittpanelen (C) illustrerar olika lastförskjutning beteenden mellan excentriskt och koncentriskt (vänster kurvor) laddade komplex, och färgade och ofärgade (höger kurvor) komplex. Klicka här för att visa en större bild.
147/51147fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51147/51147fig7.jpg "/>
Figur 7. Sagittalsnitt av 2: a molar illustrerar sammanslutning av tanden med den alveolära uttag vid belastning koncentriskt (A) och excentriskt (B). Majoriteten av kompression sågs inom interradikulära (pilspetsar) och apikala (pilar) regioner. Vid jämförelse med virtuella sektioner av tanden i excentrisk belastning (B), den ytterligare rotationskomponent i tand rörelse orsakar ökad kompression till den distala sidan av den mesiala rot. Lagrade tvärsektioner visade distala översättning och medurs vridrörelse av tanden (gröna rötter) i förhållande till ett koncentriskt laddat tand (grå). Klicka här för att visa en större bild.
Figur 8. Rekonstruerade 3D-filmer avslöjar en minskad PDL-utrymmet i den distala sidan av roten vid excentriskt belastad (E) jämfört med en koncentriskt loaded komplex (D). Klicka här för att se den excentriska lastning och klicka här för att se koncentrisk belastning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det första steget i upprättandet av detta protokoll inblandade utvärdera styvhet av lastramen med hjälp av en stel kropp. Baserat på resultaten, styvheten var signifikant högre möjliggör användning av laddningsanordningen för ytterligare testning av prover med betydligt lägre styvhetsvärden. Det andra steget markerat förmåga instrumentet för att skilja olika styvhetsvärden med hjälp av två faser kurvan lastning-lossning som genereras med hjälp av en stel kropp, PDMS material av olika tvär densiteter, och fibrösa lederna. Styv från laddningsfasen och stift under dödgång fas användes för att identifiera motståndet hos det material, som lastning och återvinning av materialet efter avlastning (figurerna 3 och 4). Den tredje och fjärde stegen i protokollet var att korrelera förändringar i lastförskjutningskurvor som erhållits från laddningsenheten till in situ avbildning görs med than använder för röntgenstrålning (Figur 5). Detta innebar laddar lederna och få tomogram utan belastning och belastning under koncentriska och excentriska villkor respektive. Protokollet visade att genom att ändra lastaxel skillnader i PDL-komprimering kan belysas (figur 6 och 7). I denna diskussion kommer vi först lyfta fram instrumentfunktioner och utmaningar som ska vara adekvat förstås och träffat innan biomekanisk testning av ben-PDL-tand-komplex.
Utmaningar av experimentuppställning
Komposit uppbyggd: Medan själva protokollet är relativt enkelt, det finns flera steg som måste göras med stor försiktighet. En av de största utmaningarna var att se till att överskjutande kompositmaterial inte spill till intilliggande tänder, som sedan mekaniskt skulle länka flera tänder och förvränga den gemensamma mekaics av en enda tand. Eftersom betydande manuell skicklighet och kunskap om dentala verktyg visat sig vara användbara för detta förfarande, beredning av prover för lastades i första hand av tandläkarstudenter och tandläkare med hjälp av optisk förstoring.
Konsekvent lastschema: En annan viktig detalj för biomekaniska tester var att säkerställa en enhetlig lastningsschema. Kontaktytan mellan käken av in situ-belastningsanordningen och motsatta ytan av det sammansatta visat sig vara mycket avgörande för experimentet. Detta beror på att mekaniken i den fibrösa gemensamt kan förändras som ett resultat av kontaktytan, som simulerades i denna studie genom att använda koncentriska och excentriska (obalanserade) laster. Det scenario som presenteras i denna studie efterliknar möjliga förändringar i ocklusion av däggdjurständer, vilket kan leda till en förändring av tand rörelse inom alveolära uttag (Figur 5). Även om det är underförstått that den föreslagna testmekanismen inte härma fysiologiska tuggcykeln, det presenterar sig som en vanlig testmetod. Genom att skapa en sammansatt uppbyggnad med en yta som är parallell med klämbacken av laddningsstadiet, var vi i stånd att generera en jämn lastning mönster. Denna standard testmetod kan användas för att identifiera förändringar i biomekanik av ben-PDL-tand-komplex från olika experimentella grupper.
Känsligheten hos de in situ-lastningsanordning: Det experimentella protokoll beskriver metoder för validering av detektionsgränser in situ lastningsanordning med användning av tre olika prover, av vilka två kan betraktas som standardmaterial. Styvheten hos belastningsramen när de testas med aluminium var signifikant högre med försumbart bidrag till den observerade mekaniska beteendet hos olika PDMS exemplar och den biomekaniska svaret hos en fibrös led. Medan alla de testade proverna hade en motreaktion period~ 3 sekunder, formen på bakslag delen varierade (Figur 4A) en aning med den typen av prov. Styva prover uppvisade en kraftig minskning av reaktionära belastning (figurerna 3A och 4A) medan mjukare exemplar inte uppvisade en kraftig minskning (Figur 4A). Det kan hävdas att skillnaden i bakslag beteende tillskrivs förmågan av provet för att trycka tillbaka på växlarna under växel omsvängning. Push back effekt på växlarna kan manifestera i en lägre nedgång i toppen reaktionära svar av materialet som käken börjar röra sig bort från provet. Således kan motreaktion segmentet utnyttjas för att få insikt till materiell egendom. Styvhetsvärden av PDMS beräknade från lastförskjutningskurvor var överens med litteraturen värden 22, och utbudet av styvheten för de tvärbundna PDMS var inom intervallet för ben-PDL-tand-komplex. Därför situ loading d den iEvice är lämplig för mätning av förskjutning och bakåt respons av tanden när den pressas till det alveolära uttag. Den reaktionära svar kan vara från mjukare och / eller hårdare beståndsdelar. Den dominans av mjukare beståndsdelen över hårdare kan identifieras genom att ladda stegvis och bildbehandling, följt av digitalt korrelera ingen belastning för lastade förhållanden att identifiera stamdominerade områden i benet-PDL-tand-komplex 13.
Huvudsakliga komponenten i tuggmotstånd är i den axiella riktningen: Liknar människor föredrages tuggcykeln råttor gälla den fria rörelsen av underkäken för att tugga mat 23, 24. Medan denna rörelse har kartlagts till att inkludera många olika riktningar, såsom sidorörelser, är den huvudsakliga komponenten i lasten tros vara i den axiella riktningen 23. Därför simuleras i situ belastningar i axiell riktning placerades antingen koncentriskaly eller excentriskt (Figur 2).
Experimentella faktorer som kan påverka resultaten i samband med organnivå biomekanik: Fördelen med koppling röntgenmikroskop med in situ belastning är att lastförskjutningskurva kan korreleras till den rumsliga sammanslutning av tanden med den alveolära uttag, formen av roten och den alveolära ytan och förträngning och utvidgning av PDL-utrymmet under belastning. Korrelationen och kompletterande utvärdering ger en helhetssyn för att avgöra biomekanik orgel. I det förflutna har det endast postulerade att mekaniken i ett organ och / eller vävnader kan uppmana den belastningsförskjutnings beteende. Detta protokoll illustrerade att associering av de rörliga elementen när under belastning också kan vara ett kännetecken för observerade styvhet. Eventuella förändringar som observerats inom de första 5-8 N tros skall bidra med kvaliteten på PDL en inledande conformationaländring inomkollagen och interstitiell vätska utbyte med minsta motstånd för att ladda, denna region har kallat "uncrimping" område 26. Laster högre än 7 N skulle kunna bidra med tand, ben, den stam-härdande effekterna av den tandrot-ligamentet, och gränssnitten förenade vävnaderna. När PDL-utrymmet minimeras och eftersom PDL undergår deformationshärdning, hårda vävnadsinteraktioner mellan tanden och beniga uttag inträda vid den interradikulära region vilket resulterar i en brantare belastning till förskjutnings lutning. Förutom materialåtervinningen kan motreaktion av lastanordningen kan utnyttjas för att undersöka den viskoelastiska naturen hos PDL utan att ändra den gemensamma såsom gjordes i andra studier 16, 25.
De allmänna områdena inom lastförskjutningskurvor korrelerar till vissa händelser inom leden. Ovanstående händelser är de gemensamma nämnarna mellan de båda lastsystem. Skillnadernamellan koncentriska och excentriska lastförskjutningsprofiler och motsvarande tomogram betonade påverkan av belastningsriktningen på de övergripande biomekanik orgel. Den främsta källan till dessa skillnader var införandet av en tand bruk eftersom det förskjuter i skarven, vilket gör att kompressionen av PDL utrymmen på specifika områden. Det är underförstått att normala fysiologiska belastningar appliceras på tanden i flera riktningar, även de som introducerar roterande tandrörelse. Dock är det rekommenderat att en koncentrisk lastningsschema användas som en standard lastningsschema på grund av svårigheten av att tillämpa en "standard" excentrisk belastning i alla prover. Som sådan denna experimentella protokoll kan användas för att skilja biomekaniska skillnader mellan anpassade och nonadapted system.
En av nackdelarna med att använda högre energiröntgenstrålning är att de är minimalt absorberas av mjukare vävnader och producerade otillräcklig kontrast. PDL är transpant för röntgenstrålar och som ett resultat leder till användning av kontrastmedel. PTA förbättrar kontrasterna av mjukdelar genom direkt färgning 27-29 och möjliggör visualisering med hjälp av röntgen. Därför, genom användning av kontrastmedlen, synlig deformation inom färgade mjukdels regionerna mellan lastade och olastade tomographies observerades, men högre förstoring (åtminstone 10X) rekommenderas för analys (data ej visade). En begränsning av färgningsprotokollet ingår användning av etanol, en mild fixativ 29 som kunde ha förändrat styvheten i PDL och övergripande gemensamma mekanik som leder till felaktiga slutsatser.
SLUTSATSER
Denna studie belyser ett nytt testprotokoll för att analysera den biomekaniska respons av en intakt ben PDL-tand fibrösa gemensamma, men i ex vivo förhållanden. Den beskrivna experimentella metoden inbegripet post analyser av data kan användas för att mäta effekterna av expertisimental variabler (dvs. sjukdom, tillväxtfaktorer, ålder och terapeutiska molekyler) på mekaniken i ben-PDL-tand fibrösa gemensamt. Dessutom kommer resultaten från dessa experiment tjäna som utgångspunkt för vilka relationer mellan variationer på makroskala organnivå kan relateras till specifika förändringar i vävnaden och cellulära nivåer. Begränsningar av protokollet inkluderar, bildhantering i ex vivo-förhållanden, användning av kontrastmedel, och förlust i rymdnoggrannhet mellan ytor på tanden och alveolära uttag på grund av vävnads avkoppling under längre förvärvstider som behövs för tomogram generation.
Kompletterande materialet
Protokoll för biomekaniska undersökningar av molarer inom maxillae:
1. Om maxillae skulle prövas, avlägsna överkäken från varje råtta skallen med den ventrala aspekten (taket i munnen) vänd uppåt. Sever muskler och ligament bindväv frånden laterala delen av skallen genom att skära genom vestibulen (fickan mellan tandköttet och kinden).
2. Palpera och spräcka zygomatic processen av den maxillary ben i skallen och skilja de zygomatic bågen från maxillary ben.
3. Skär skallen rakt ned med ett par av bulk dissektion sax genom hjärnan med början från den mjuka gommen. Isolera den anteriora aspekten av skallen och skala hårbotten bort från den dorsala aspekten (överst) i skallen.
4. Med ett par fina dissektion sax, separera de högra och vänstra hemimaxillae genom att göra ett snitt som följer en rak linje genom mitten av den hårda gommen och till det interproximala området mellan framtänderna. Kontrollera att skärdjupet är grunt - endast djupt nog för att punktera den hårda gommen.
5. Isolera hemimaxillae genom att göra vinkelrätt (mot den långa axeln av skallen) incisioneranterior till den första molar och posteriort om tredje molar. 1) Klipp inte för nära den första och tredje molarer för detta skulle kunna störa rot struktur, 2) inte slita bort den gingivala vävnaden som omger alla tre kindtänder. Separera hemimaxillae från skallen genom att skära tunna maxillary ben överlägsen varje hemimaxilla. Ta bort eventuella överskjutande vävnad och beniga spicules.
Validering av mekanisk provning enheten:
I syfte att bestämma styvheten hos laddningsramen och avdriften av last / förskjutningsgivare, använd en stel kropp, såsom aluminium, med en elasticitetsmodul av långt högre än den för det experimentella provet.
För att avgöra om instrumentet är i stånd att differentiera olika styvhetsvärden representativa för mjukare element, fabricera PDMS block med olika tvär tätheter (1:05, 1:10, 1:25 tvärbindaren till basen i vikt) och läsa in dem med hjälp av sammain situ-lastningsanordningen.
Fas Läge Kontrast för kontrastförbättring av mjukare delar: Kontrastförbättring av PDL kan göras genom att utnyttja den faskontrast sättet skannern. I grund och utnyttjar fas kontrast scanner detekteringsfunktioner i ett skifte i fas vid kanterna av vävnader, och ger förbättrad strukturell detalj. Som ett resultat, i denna studie, med luckor av cementocyte-luckor och osteocyte-luckor verkade som porositet inom respektive mineraliserade vävnader. Dessa strukturer har tidigare oupptäckt i en vanlig genomsökning i absorption läge. Tomogram förvärvats enligt överföringsläge tillåts för visualisering av strukturer inom det negativa utrymmet, nämligen PDL-utrymme och endostala utrymmen inklusive Haversian kanalsystem (för 3D-modell se figur S1). Ytterligare strukturer inom PDL-utrymmet kan visualiseras också, till exempel kärlsystemet som är kontinuerligt med att jagn ben.
Jämviktade laster för tomogram förvärv och systemdrift:. Detta avsnitt kan bäst förklaras med hänvisning till Supple Figur 2 Figur S2A visar behovet av att jämvikt toppbelastningar före förvärva tomogram. Toppbelastningar alltid sjunka till en lägre magnitud och systemet ska vara utjämnat i minst en timme innan en 6-8 timmars tomogram förvärvas. Det bör noteras att tomogram förvärvas är inte representativ för ben-tanden sammanslutningen vid toppbelastning, men vid en belastning 2-3 N lägre än toppbelastning. Dessutom var det uppmätta systemet drift identifieras med hjälp av en styv aluminium påbörjad fann att ändras med förskjutningshastighet och / eller belastningstoppar (figur S2B och S2C). Approximeras driftvärden varierade från + 1 N / timme.
Efter mekanisk provning, var en tomogram av fiber gemensamt tagit utan last, och en toppbelastning vid en önskad förskjutningshastighet. Innan skaffa ett tomogram i laddade förhållanden, bör man vara noga så att systemet för att komma till en jämvikt (stabilitet) fter skanning ska gå tillväga. Liknande villkor upprepades för excentriskt belastade och PTA färgade komplex. Från tomogram ades virtuella skivor jämfört utan belastning för lastade förhållanden för att identifiera tand-ben förening både två och tre dimensioner.
Supple Figur 1. 3D-rekonstruktion av negativ rymden med hjälp av fas kontrastförstärkt röntgenmikroskop. Under fas kontrastförbättring läget den fasförskjutning som uppstår vid kanterna av vävnader utnyttjades för att markera blodkärl i PDL. Specifikt absorption läge (vänster) markerade mineraliserade vävnader inom synfältet, medan sändningsläge (höger) markerade blodkärlen i PDL utrymme samt de endostala utrymmen.
tält "> Supple Figur 2. Decay av topp reaktionära krafter till ett jämviktstillstånd före CT-scanning. Kurvorna anger olika dämpfaktorer reaktionär svaret hos en fibrös led (övre panel) och en stel kropp (nedre panelen).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna erkänner finansieringsstöd NIH / NIDCR R00DE018212 (SPH), NIH/NIDCR-R01DE022032 (SPH), NIH / NIDCR T32 DE07306 (AJ, JDL), NIH / NCRR S10RR026645, (SPH) och institutionerna för förebyggande och reparativ tandvård vetenskap och Orofaciala Sciences, UCSF. Dessutom Författarna erkänner Xradia Graduate gemenskap (AJ), Xradia Inc., Pleasanton, CA.
Författarna tackar Dr Kathryn Grandfield, UCSF för hennes hjälp med efterbearbetning av data, Dr. Stephen Weiner och Gili Naveh, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel, Dr Ron Shahar, The Hebrew University i Jerusalem, Israel för deras insiktsfulla diskussioner specifika för in situ lastningsanordning. Författarna vill också tacka Biomaterial och Bioteknik microCT Imaging Facility vid UCSF för användning av Micro XCT och in situ lastningsanordning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bard Parker Blade | BD | MEDC-001054 | |
| AFM metal disk | Ted Pella | 16218 | |
| Polymethyl methacrylate | GC America | N/A | |
| Uni-Etch | Bisco | E5502EBM | |
| Optibond Solo Plus | Kerr Corp | N/A | |
| Filtek Flow | 3M | N/A | |
| Hurculite Ultra | Kerr | 34346 | |
| Tris buffer | Mediatech Inc. | N/A | |
| Articulating paper | Parkell Inc. | ||
| Phosphotungstic Acid | Sigma Aldrich | HT152 |
References
- Popowics, T. E., Rensberger, J. M., Herring, S. W. Enamel microstructure and microstrain in the fracture of human and pig molar cusps. Arch. Oral Biol. 49, 595-605 (2004).
- Jantarat, J., Palamara, J. E., Messer, H. H. An investigation of cuspal deformation and delayed recovery after occlusal loading. J. Dent. 29, 363-370 (2001).
- Jantarat, J., Panitvisai, P., Palamara, J. E., Messer, H. H. Comparison of methods for measuring cuspal deformation in teeth. J. Dent. 29, 75-82 (2001).
- Asundi, A., Kishen, A. A strain gauge and photoelastic analysis of in vivo strain and in vitro stress distribution in human dental supporting structures. Arch. Oral Biol. 45, 543-550 (2000).
- Asundi, A., Kishen, A. Advanced digital photoelastic investigations on the tooth-bone interface. J. Biomed. Opt. 6, 224-230 (2001).
- Wang, R. Z., Weiner, S. Strain-structure relations in human teeth using Moire fringes. J. Biomech. 31, 135-141 (1998).
- Wood, J. D., Wang, R., Weiner, S., Pashley, D. H. Mapping of tooth deformation caused by moisture change using moire interferometry. Dent. Mater. 19, 159-166 (2003).
- Dong-Xu, L., et al. Modulus of elasticity of human periodontal ligament by optical measurement and numerical simulation. Angle Orthod. 81, 229-236 (2011).
- Li, J., Li, H., Fok, A. S., Watts, D. C. Multiple correlations of material parameters of light-cured dental composites. 25, 829-836 (2009).
- Zhang, D., Arola, D. D. Applications of digital image correlation to biological tissues. J. Biomed. Opt. 9, 691-699 (2004).
- Zhang, D., Mao, S., Lu, C., Romberg, E., Arola, D. Dehydration and the dynamic dimensional changes within dentin and and enamel. Dent. Mater. 25, 937-945 (2009).
- Qian, L., Todo, M., Morita, Y., Matsushita, Y., Koyano, K. Deformation analysis of the periodontium considering the viscoelasticity of the periodontal. 25, 1285-1292 (2009).
- Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. , (2012).
- Qian, L., Todo, M., Morita, Y., Matsushita, Y., Koyano, K. Deformation analysis of the periodontium considering the viscoelasticity of the periodontal. 25, 1285-1292 (2009).
- Huelke, D. F., Castelli, W. A. The blood supply of the rat mandible. Anat. Rec. 153, 335-341 (1965).
- Chiba, M., Komatsu, K. Mechanical responses of the periodontal ligament in the transverse section of the rat mandibular incisor at various velocities of loading in vitro. J. Biomech. 26, 561-570 (1993).
- Natali, A. N., et al. A visco-hyperelastic-damage constitutive model for the analysis of the biomechanical response of the periodontal ligament. J. Biomech. Eng. 130, (2008).
- Naveh, G. R., Shahar, R., Brumfeld, V., Weiner, S. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone: A dynamic 3D microCT study of the rat molar. J. Struct. Biol. 177, 477-483 (2012).
- Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. 46, 443-449 (2013).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
- Carrillo, F., et al. Nanoindentation of polydimethylsiloxane elastomers: Effect of crosslinking, work of adhesion, and fluid environment on elastic modulus (vol 20, pg 2820). J. Mater. Res. 21, 535-537 (2006).
- Hiiemae, K. M. Masticatory function in the mammals. J. Dent. Res. 46, 883-893 (1967).
- Hunt, H. R., Rosen, S., Hoppert, C. A. Morphology of molar teeth and occlusion in young rats. J. Dent. Res. 49, 508-514 (1970).
- Komatsu, K., Sanctuary, C., Shibata, T., Shimada, A., Botsis, J. Stress-relaxation and microscopic dynamics of rabbit periodontal ligament. J. Biomech. 40, 634-644 (2007).
- Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. 46, 443-449 (2013).
- Quintarelli, G., Zito, R., Cifonelli, J. A. On phosphotungstic acid staining. I. J. Histochem. Cytochem. 19, 641-647 (1971).
- Quintarelli, G., Cifonelli, J. A., Zito, R. On phosphotungstic acid staining. II. J. Histochem. Cytochem. 19, 648-653 (1971).
- Quintarelli, G., Bellocci, M., Geremia, R. On phosphotungstic acid staining. IV. Selectivity of the staining reaction. J. Histochem. Cytochem. 21, 155-160 (1973).
- Crabtree, W. N., Murphy, W. M. The value of ethanol as a fixative in urinary cytology. Acta Cytol. 24, 452-455 (1980).
