Summary
I denne undersøgelse, vil brugen af en in situ loading koblet med mikro-X-ray computertomografi for fiber joint biomekanik blive diskuteret. Eksperimentelle udlæsninger identificerbare med en generel ændring i fælles biomekanik vil omfatte: 1) reaktionær kraft vs forskydning, dvs tand slagvolumen i alveolære sokkel og dens reaktionære reaktion på belastning, 2) tre-dimensionelle (3D) rumlig konfiguration og morphometrics, dvs geometriske Forholdet af tanden med den alveolære soklen, og 3) ændringer i udlæsninger 1 og 2 på grund af en ændring i lastning akse, dvs, koncentriske eller excentriske belastninger.
Abstract
Denne undersøgelse viser en roman biomekanik prøvningsprotokol. Fordelen ved denne protokol indbefatter anvendelsen af en in situ loading koblet til en høj opløsning røntgenmikroskop, hvilket muliggør visualisering af interne strukturelle elementer under simulerede fysiologiske belastninger og våde forhold. Eksperimentelle prøver vil omfatte intakt knogle-parodontal ligament (PDL)-tand fiber leddene. Resultaterne vil illustrere tre vigtige elementer i protokollen, da de kan anvendes til orgel niveau biomekanik: 1) reaktionær kraft vs forskydning: tand slagvolumen i alveolære sokkel og dens reaktionære reaktion på belastning, 2) tre-dimensionelle (3D) rumlige konfiguration og morphometrics: geometriske forhold af tanden med den alveolære soklen, og 3) ændringer i aflæsning 1 og 2 på grund af en ændring i lastning akse, nemlig fra koncentrisk excentriske laster. Effekten af den foreslåede protokol vil blive evalueret ved at koble mekanisk testing udlæsninger til 3D morphometrics og overordnede biomekanik af samlingen. Desuden vil denne teknik understrege behovet for at komme i ligevægt eksperimentelle betingelser, specielt reaktionære belastninger forud for erhvervelse tomogrammer fiberholdigt leddene. Det skal bemærkes, at den foreslåede protokol er begrænset til afprøvning præparater under ex vivo-betingelser, og at anvendelse af kontrastmidler til at visualisere blødt væv mekanisk reaktion kan føre til fejlagtige konklusioner om vævs-og organ-niveau biomekanik.
Introduction
Adskillige eksperimentelle metoder fortsat anvendes til at undersøge biomekanik diarthrodial og fiber leddene. Specifikke metoder til tand orgel biomekanik omfatter anvendelse af strain gauges 1-3, photoelasticity metoder 4, 5, Moiré interferometri 6, 7, elektronisk pletmønster interferometri 8 og digitalt billede korrelation (DIC) 9-14. I denne undersøgelse, den innovative tilgang omfatter invasiv billeddannelse ved hjælp af røntgenstråler til at afsløre de interne strukturer i et fiberholdigt joint (mineraliseret væv og deres grænseflader består af blødere zoner, og interfacing væv såsom ledbånd) ved belastninger svarende til in vivo. En in situ loading koblet til en mikro-røntgenmikroskop vil blive anvendt. Belastningen tid og load-forskydning kurver vil blive indsamlet som den molære af interesse inden for en frisk høstet rotte hemi-underkæbe er indlæst. Den main mål for den tilgang, der præsenteres i denne undersøgelse er at understrege effekten af tre-dimensionelle morfologi tand-bone ved at sammenligne forholdene på: 1) uden belastning, og når det er indlæst, og når 2) koncentrisk og excentrisk belastet. Eliminerer behovet for afskårne prøver, og til at udføre eksperimenter på hele intakte organer på våd vej vil give mulighed for maksimal bevarelse af 3D stress tilstand. Dette åbner et nyt område for efterforskning i forståelsen dynamiske processer af komplekset under forskellige belastningsforhold scenarier.
I denne undersøgelse er de metoder til testning af PDL biomekanik indenfor en intakt fibrøst fælles af en Sprague Dawley rotte, en fælles betragtes som en optimal bioteknik modelsystem vil blive nærmere. Eksperimenter vil omfatte simulering af tygning belastninger under hydreret betingelser for at fremhæve tre vigtige elementer i det fælles, som de vedrører orgel niveau biomekanik. De tre punkter vil omfatte: 1) reaktionær kraft vs forskydning:tand slagvolumen i alveolære sokkel og dens reaktionære reaktion på belastning, 2) tre-dimensionelle (3D) rumlig konfiguration og morphometrics: geometriske forhold af tanden med den alveolære soklen, og 3) ændringer i aflæsning 1 og 2 på grund af en ændring i lastning akse, nemlig fra koncentrisk excentriske belastninger. De tre grundlæggende udlæsninger af den foreslåede teknik kan anvendes til at undersøge den adaptive karakter af fuger i hvirveldyr enten som følge af ændringer i funktionelle krav og / eller sygdom. Ændringer i de førnævnte udlæsninger, specielt sammenhængen mellem reaktionære belastninger med forskydning, og deraf reaktionære load-tids-og load-forskydningskurver ved forskellige Belastningen kan anvendes til at fremhæve de overordnede ændringer i joint biomekanik. Effekten af den foreslåede protokol vil blive evalueret ved at koble mekanisk prøvning udlæsninger til 3D morphometrics og overordnede biomekanik af joint.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Stalde og eutanasi: Alle dyr, der anvendes i denne demonstration blev huset under patogenfrie betingelser i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) og National Institute of Health (NIH).
Giv dyrene med standard hard-pille rottefoder og vand ad libitum. Aflive dyr via en to-trins metode til kuldioxid kvælning, bilateral thoracotomi i overensstemmelse med den standard-protokol af UCSF som godkendt af IACUC. Udføre biomekaniske test inden for 24 timer dyr offer for at undgå vævsnedbrydning.
1.. Forberedelse og Dissektion af en rotte Mandible eller Maxilla
- Fjern rotte mandibler ved forsigtigt overskæring membranøs væv og muskelvævet vedhæftede samtidig bevare hele underkæben herunder coronoid processen og kondylære proces (figur 1) 15.
- Separate hemimandibles i bilefully skære fibrøst væv af mandibulær symphysis med en skalpel.
Bemærk: De koronar og kondylære processer og ramus af underkæben (figur 1) bør fjernes, hvis de fysisk umulig biomekaniske test af 2. kindtand. - Skær fortænder uden at udsætte pulpakammeret som ikke hindrer belastning af molær.
2. Prøvepræparation til in situ trykbelastning (figur 2)
- Immobilisere prøven på en stål stub ved hjælp af et materiale, der er betydeligt stivere end de eksperimentelle prøve, før det anbringes i en in situ læsseindretning (figur 2A).
Bemærk: Polymethylmethacrylat (PMMA) blev anvendt til at immobilisere vist i denne undersøgelse, og overskud, hvis nogen, blev fjernet ved hjælp af en tand explorer. - Juster okklusale overflade kindtand (r) af interesse parallelt med AFM metal objektpladen ved hjælp af en lineal i bådefly (dvs. mesial-distal og buccal-flersprogede).
- Opret et trug med et stumpt instrument omkring kindtænder.
Bemærk: Dette rum bør tjene som en "voldgrav" til at rumme overskydende væske og vedligeholde vævshydrering under in situ læsning. - Forbered tandoverfladen at opbygge for koncentriske (figur 2B) eller excentrisk (figur 2C) pålæsning med et dental komposit. Ætse tandens overflade af interesse med 35% phosphorsyre gel på okklusale overflade til 15 sek.
- Skyl ætsemidlet grundigt med deioniseret vand og tørres overfladen ved hjælp af en luft / vand sprøjte eller en komprimeret luft beholderen. Med en opdagelsesrejsende, sprede en dråbe af bindemidlet i åbne Spidser i et tyndt lag. Cure kompositmaterialet med en tand hærdelyset.
Bemærk: Alle trin, der involverer kompositmaterialer bør udføres uden direkte lys fra en lampe. Sådanne betingelser ville uønsket accelerere polymerisationsprocessen og could forhindre korrekt placering af kompositten. Rumbelysning er acceptabel. - Fjern overskydende bindemiddel fra tilstødende tænder med en fin skalpel eller barberblad.
- Placer strømbar dental komposit på overfladen efter forberedelsen af overfladen og sprede det i rillerne i kindtand (r) af interesse ved hjælp af en tand explorer.
- Bring det sammensatte dental hærdende lys for 30 sek.
- Mold en occlusal ophobning af omkring 3-4 mm ved hjælp af en tand harpiks komposit, fra den okklusale plan kindtand (r) af interesse og lys kur for 30 sek.
- Reducer toppen af sammensatte opbygning til en flad overflade parallel for at muliggøre en ensartet loadingskemaet i alle prøver ved anvendelse af en lineal og en høj hastighed håndstykke.
Bemærk: Under biomekanisk testning bør andre prøver opbevares i tris-phosphat bufret opløsning (TBS) med 50 mg / ml penicillin og streptomycin 15.
3. Læsseindretning Drift ogStivhed, Materiale Property Differentiering Capability in situ Loading af det fælles Fiber
- Fastgør prøven med den sammensatte oprustning på ambolten af læsning scenen, og test for ensartet belastning som vist i figur 2B.
- Placer en artikulerende papir på overfladen af det sammensatte efterfulgt af lastning prøven til en endelig belastning for at kontrollere koncentrisk eller excentrisk belastning (figur 2B og 2C).
- Placer TBS-gennemblødt Kimwipe omkring prøven for at sikre prøven hydrering. Lav et trug omkring prøven og fyld den med TBS at holde orglet hydreret under billedbehandling.
- Input spidsbelastning og fordrivelse rate i Deben software til at komprimere den molære af en ønsket spidsbelastninger ved en forskydning kursen efter immobilisering af hemimandible.
Bemærk: Typiske udlæsninger bør omfatte en reaktionær belastning som materialet er komprimeret med tiden (belastningstransducer følsomhed = 0,1N). Fra load-tid og fordrivelse-tid, bør en load-forskydning kurve for det komprimerede materiale opnås 16-18. Brug af indsamlet fra læssecyklusser data, kan forskellige egenskaber af joint også bestemmes. Stivheden af samlingen skal beregnes ved at tage hældningen af den lineære del (ca. de sidste 30% af data) af loading-fase af lasten vs forskydningskurven 19.
4.. Farvning af blødt væv, PDL, med phosphorwolframatsyre (PTA)
Bemærk: For at forbedre røntgen dæmpning bør derimod PDL farves med 5% PTA løsning 20.
- Opfyldning PTA farveopløsning i et rent 1,8 ml glas karpule og placere indlæst karpule i sprøjten.
- Injicere opløsningen langsomt (5 min / karpulens) i PDL-rum af tilstødende tænder for at forhindre strukturelle skader på parodontale væv omkring kindtand af interesse.
Bemærk: Ovenstående trin skal be gentages, indtil omkring 5 fulde carpules (9 ml) opløsning injiceres og får lov til at strømme ind i de omgivende væv. De prepped prøver kan også lægges i blød natten over i den resterende PTA løsning (8 timer).
5.. Anbefalet μ-XCT Scann.indst
Udfør m-XCT med følgende scanningsindstillinger:
| Objektivforstørrelse | 4X, 10X |
| 1.800 billeder | |
| Røntgenrør spænding | 75 kVp (50 kVp for PTA farvede prøver) |
| 8 W | |
| Exposure Time | ~ 8-25 sek * |
| ~ 4 mM (4X objektiv) ~ 2 m (10X objektiv) ** |
* Eksponeringstid kan variere baseret på geometri og optiske densitet af prøven og X-ray tube voltage.
** Faktiske pixel opløsning vil være lidt anderledes baseret på konfigurationen af kilden, prøve, og detektor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Estimering af lastning enhed "backlash", "pushback", stivhed og systemet afdrift under en konstant belastning
Backlash: Mellem lastning og losning dele af cyklen, findes der en pause på 3 sek hvorunder gear omvendt i motoren før sand aflæsning påbegyndes, nemlig som prøven trækker sig væk fra den øverste kæbe (Figur 3). Denne periode kaldes et tilbageslag i systemet, som udgør et segment af tid, når systemet forsøger at skifte fra lukning til åbning af kæberne. Det skal bemærkes, at alle belastningsperioder vil indeholde en lignende tilbageslag reaktion uanset prøve eller belastningstilstande (figur 4). En normal belastning vs tid kurve opnået ved hjælp af en stiv krop er vist i figur 3A og 3B fremhæver lastning, losning, og slør regioner på to forskellige ltabletform 6 N og 16 N. En normal belastning vs forskydningskurve fremhæve de tilsvarende tre segmenter er vist i figur 3C.
Pushback: Mens alle slør perioder sted inden for samme 3 sek frame tid, den reaktionære reaktion, og som følge formen af modreaktion regionen kunne ændre sig afhængigt af prøven. Ved at teste systemet ved hjælp af et stift legeme (figur 3) blev stejleste og højeste fald i reaktionær belastning iagttaget i forhold til knogle-PDL tand kompleks og polydimethlysiloxane (PDMS). Men den fiberholdige fælles illustrerede et markant fald i reaktionær belastning under modreaktion fase i forhold til PDMS. PDMS (figur 4) prøver viste sig at have den mindste dråbe (ingen forskel mellem 01:05 og 01:25 tværbinder tætheder - figur 4A).
Stivhed: Stivhed i læsning enhed ved test against stive krop var betydeligt højere end i de komplekse og PDMS prøver. Disse data validere effektiviteten af læsseindretningen at fremhæve ændringer i biomekanik knogle-PDL tand kompleks og blødere materialer (figur 4B).
Visualisering bløde og hårde væv strukturer i intakt knogle-PDL-tand kompleks bruge μ-XCT: I en uplettet, men hydreret fiberholdigt joint blev dæmpning af hårdt væv funktioner, inklusive alveoleknoglen, cementum, emalje og dentin fremhævet (figur 5A og 5B). Dog rum, der indeholdt overvejende blødere organisk væv var gennemsigtige for røntgenstråler, forlader PDL-space relativt "tom" (sort). Prøver behandlet med PTA viste øget kontrast i PDL-rummet, hvilket understreger træk repræsentative for PDL og gingival væv (figur 5C-F). Scanning ved en højere magnification afslørede PDL som et fibernetværk mellem tand og ben.
Reaktionær kraft vs forskydning: biomekaniske respons af det fibrøse joint under in situ læsning: Sammenlignet med koncentriske belastning, excentrisk belastning mønster på en lignende prøve viste øget fortrængning af tanden i joint for en given reaktionær belastning (figur 6A). Men for fiber leddene behandlet med PTA sås ingen signifikante forskelle i den overordnede biomekanik uanset belæsning (figur 6B). I den ubehandlede, men forskudt i systemet, kan den forøgede fortrængning af roden i alveolar socket korreleres til lavere stivhed som set i load-forskydning kurver (figur 6C). Mens der kan være en naturlig varians, der fører til en række biomekaniske reaktioner fiberholdigt leddene høstet i kontrolgrupper, PTA-behandlet fibrøstsamlinger udstillet øget stivhed og fordrevne mindre i soklen i forhold til ubehandlede modstykker for en given reaktionær spidsbelastning. Imidlertid var der ingen detekterbar ændring i form eller varighed af slør fase af belastningscyklus mellem ubehandlede og PTA behandlede prøver.
Tre-dimensionel rumlige konfiguration og morphometrics: kortlægning af knogle-tandkonfiguration under belastede forhold ved hjælp af μ-XCT: Virtuelle skiver taget fra tomogrammer blev sammenlignet for at illustrere 1) tand bevægelighed inden for sokkel, 2) tand-bone forening både i 2D og 3D , 3) omfanget af bevægelse på grund af excentrisk i forhold til koncentriske belastning. Tand bevægelse blev fremhævet ved overlejring af lignende virtuelle skiver uden belastning og ved belastning og skabe gif film. Mens både lastning ordninger forårsagede tanden til at fortrænge lodret i samlingen, en excentrisk belastning konfiguration (figur 7B og 7C) caused en yderligere roterende virkning af tanden med rødderne roterende distalt resulterer i nedsat PDL plads langs de distale sider af rødder sammenlignet med koncentriske loading scanninger (fig. 7 og 8). Selv PTA-farvede PDL var mere formildende (figur 5), bevægelsen af tanden inden alveolær socket i PTA behandlet leddene var mindre udtalt og korreleret med de biomekaniske data (figur 6B og 6C).
Figur 1. En tilpasset 15 illustration af de vigtigste steder, når de forbereder hemimandible for biomekaniske test. Vist inden det indsatte er en hemimandible.
Figur 2. Konfiguration af en in situ lasteenhed og μ-XCT-systemet. (A) Et billede af en in situ lastning enhed på en brugerdefineret indehaver inden for mikro-X-ray computertomografi (μ-XCT) enhed. Concentric (B) og excentrisk (C) belastningsforhold bestemt af typen af kontakt mellem ambolten og den sammensatte overflade er illustreret i form af skemaer, og de tilsvarende forsøgsopstillinger (område svarer til det understreges af den hvide boks i (A ) hhv. Marks fra artikulere papir bekræfte indledende kontakt området mellem ambolten og dental komposit. Klik her for at se større billede. </ A>
Figur 3. Repræsentant load-tid-kurven illustrerer systemet "tilbageslag". Load vs tid ved hjælp af et stift legeme illustrerer backlash periode som en begivenhed mellem lukning og åbning af amboltene. Den grønne region indikerer lastning periode, hvor ambolte nærmer (grøn region) for at indlæse et stift legeme til 15 N (A) og 5 N (B, indsat). Det blå område angiver en aflæsning periode, hvor de ambolte udkørsel fra hinanden. Men på grund af mangel på øjeblikkelig motor respons på grund af tid, som gear vending, der ligger en back øjenvippe periode på ~ 3 sek. I løbet af denne tid belastningen falder omtrent ved 2 N før sand aflæsning opstår. Lastning og losning begivenheder kan være relateret til at indlæse vs graf forskydnings (C), der viser minimal forskydning i den modreaktion periode. Klik her for at se større billede.
Figur 4.. Repræsentative load-forskydning kurver og "pushback" effekt ved hjælp af PDMS Bottom kurver:. Load tid relationer mellem PDMS med faldende monomer tværbinder forhold afsløre evne til in situ lasteenhed at detektere forskelle i materialeegenskaber. Top kurver, venstre og højre illustrerer ændringen i slør af systemet på grund af væsentlig bedring. Den venstre og højre i forhold illustrerer den samme effekt, hvilket indikerer, at opsvinget forskel fra 1:25 til 01:05 PDMS er minimal eller ikke er inden fordetektionsgrænser læsseindretningens. B) kurver Load-forskydning for varierende materialer, herunder stive krop aluminium, eksperimentelle prøve, og de 3 PDMS prøver. Det er hældningen af de 30% lineære del af lastning kurve, der blev brugt til at beregne stivhed i materialet. Klik her for at se større billede.
Figur 5. X-ray virtuelle sektioner af mandibulære kindtænder anden farvet for PDL struktur ekstraudstyr. (A, B) Grå skala værdier inden ubehandlede kindtænder indikerer røntgen dæmpning af forskellige væv, herunder de blødere områder i komplekset. Imidlertid blev nonmineralized væv, såsom PDL fremhæves ikke på grund af sin minimal formildende egenskaber ved X-ray energi ved 75 kVp. (CF) Efter PTA farvning svækkende egenskaber blødere PDL blev forbedret og detaljer inden PDL blev visualiseret ved hjælp af en røntgen-mikroskopi. Således 2D virtuelle sagittale (C-4X forstørrelse, E-10x forstørrelse) og tværgående (D-4X forstørrelse, F-10X forstørrelse) sektioner afslørede PDL fiberorienteringen (gule pile). Lumen af blodkar i endosteale rum (orange pile) og PDL (hvide pile) fremstår som mørke cirkulære strukturer, mens den pulpale rum forbliver uplettet. Artefakter skabt under farvningsproceduren er også noteret (D, rød asterisk). Klik her for at se større billede.
fo: src = "/ files/ftp_upload/51147/51147fig6highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51147/51147fig6.jpg" />
Figur 6. Koncentrisk og excentrisk indlæst prøver. Top (A) og bundpaneler (B) illustrerer Quick Time film af tand-bone forholdet uden belastning, og når lastet til 15 N, koncentrisk og excentrisk hhv. Top og bund paneler illustrerer knogle-tooth forening når ubehandlede (A) og farves (B) betingelser. Center panel (C) illustrerer forskellige load-forskydning adfærd mellem excentrisk og koncentrisk (venstre kurver) lastet komplekser og farvede og ufarvede (højre kurver) komplekser. Klik her for at se større billede.
147/51147fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51147/51147fig7.jpg "/>
Figur 7.. Sagittal sektion af 2. kindtand illustrerer foreningen af tanden med den alveolære stikkontakten, når læsset koncentrisk (A) og excentrisk (B). Flertal af kompression blev set inden interradicular (pilespidser) og apikale (pile) regioner. Sammenlignet med virtuelle dele af tanden i excentrisk belastning (B), den yderligere roterende element tand bevægelse forårsager forøget kompression til den distale side af mesial rod. Overlejret tværsektioner afslørede distale oversættelse og med uret roterende bevægelse af tanden (grønne rødder) i forhold til et koncentrisk indlæst tand (grå). Klik her for at se større billede.
Figur 8. Reconstructed 3D-film viser en nedsat PDL-rum i den distale side af roden, når forskudt (E) i forhold til en koncentrisk indlæst kompleks (D). Klik her for at se den excentriske lastning og klik her for at se koncentriske belastning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det første skridt i etableringen af denne protokol involveret evaluere stivhed lastrammen ved hjælp af en stiv krop. Baseret på resultaterne, stivhed var signifikant højere muliggør anvendelse af ladeindretningen til yderligere testning af enheder med betydeligt lavere stivhedsværdier. Det andet trin fremhævet evne instrumentet at skelne mellem forskellige stivhedsværdier ved hjælp af to faser af kurven belastning-aflæsning genereres ved brug af et stift legeme, PDMS materialer af forskellige tværbindinger tætheder og fiber leddene. Stivheden fra lastning fase og pushback under modreaktion fase blev brugt til at identificere modstanden i materialet til lastning og genvinding af materialet efter losning (figur 3 og 4). Den tredje og fjerde trin i protokollen skulle korrelere ændringer i kurver load-fortrængning opnået fra lastning enheden til in situ billedbehandling udført med than bruge af røntgenstråler (figur 5). Dette indebar indlæsning leddene og opnåelse tomogrammer uden belastning og belastning, under koncentriske og excentriske betingelser hhv. Den protokol viste, at ved at ændre lastning akse forskelle i PDL-kompression kan fremhæves (figur 6 og 7). I denne diskussion vil vi først fremhæve instrumentets funktioner og udfordringer, der bør være tilstrækkeligt forstås og opfyldes forud for biomekaniske test af knogle-PDL-tand kompleks.
Udfordringer forsøgsopstilling
Composite oprustning: Mens selve protokollen er forholdsvis ligetil, der er flere trin, som skal udføres med stor omhu. En af de største udfordringer var at sikre, at overskydende kompositmateriale ikke overløb til tilstødende tænder, hvilket ville så mekanisk sammenkæde flere tænder og fordreje fælles mekaniskeics af en enkelt tand. Da betydelige håndelag og viden om dental værktøjer vist sig at være nyttige for denne procedure, blev forberedelsen af prøver til lastning primært udført af tandlægestuderende og tandlæger med bistand fra optisk forstørrelse.
Konsekvent lastning ordning: En anden vigtig detalje for biomekanisk test var at sikre en ensartet belastning ordning. Kontaktfladen mellem kæbe in situ læsseindretningen og modstående overflade af det sammensatte viste sig at være meget afgørende for eksperimentet. Dette skyldes, at mekanikken i den fiberholdige fælles kan ændre sig som følge af området for kontakt, som blev simuleret i denne undersøgelse ved hjælp af koncentriske og excentriske (ubalanceret) belastninger. Scenariet præsenteret i denne undersøgelse efterligner mulige ændringer i okklusion af pattedyr tænder, hvilket kan resultere i en ændring i tand bevægelighed inden for alveolær stikket (figur 5). Selv om det er underforstået, that den foreslåede test mekanisme ikke efterligne fysiologiske tygning cyklus, det præsenterer sig selv som en standard testmetode. Ved at skabe en sammensat oprustning med en overflade parallel til kæben af læsning scenen, var vi i stand til at generere en konstant belastning mønster. Denne standard testmetode kan anvendes til at identificere forandringer i biomekanik af knogle-PDL-tand-komplekser fra forskellige eksperimentelle grupper.
Følsomhed in situ læsseindretningen: Den eksperimentelle protokol beskriver fremgangsmåder til validering detektionsgrænser in situ ladeindretningen ved hjælp af tre forskellige prøver, hvoraf to kan betragtes som faste materialer. Stivhed lastrammen når det testes med aluminium var signifikant højere med ubetydeligt bidrag til den observerede mekaniske opførsel af forskellige PDMS prøver og biomekaniske respons på fibrøs joint. Mens alle de testede prøver havde en modreaktion periode~ 3 sek, formen af slør del lidt varieret (figur 4A) med prøvetype. Stive prøver udviste et kraftigt fald i reaktionær belastning (3A og 4A), mens blødere prøver ikke udviste et kraftigt fald (figur 4A). Det kan hævdes, at forskellen i slør adfærd tilskrives evnen af prøven til at skubbe tilbage på de redskaber i løbet af gear vending. Push back effekt på de redskaber kunne manifestere i en lavere fald i peak reaktionære reaktion af materialet som kæben begynder at bevæge sig væk fra prøven. Således kan bagslag segment udnyttes til at opnå indsigt i væsentlig egenskab. Stivhed værdier af PDMS beregnet ud fra forskydningskurver belastning var i aftale med litteratur værdier 22, og den række af stivhed for de tværbundne PDMS var inden for rækkevidde af knogle-PDL-tand kompleks. Derfor in situ loading device er egnet til at måle forskydningen og reaktionære reaktion af tanden, som det er komprimeret i den alveolære stikket. Den reaktionære reaktion kan være fra blødere og / eller hårdere vælgere. Den dominans blødere bestanddel over hårdere kan identificeres ved at indlæse trinvist og billedbehandling, efterfulgt af digitalt korrelere ingen belastning til belastede forhold til at identificere stamme-dominerede regioner i knogle-PDL-tand kompleks 13.
Hovedbestanddelen af tygning er i aksial retning: Svarende til mennesker er tygning cyklus af rotter involverer den frie bevægelse af underkæben til at tygge maden 23, 24. Selvom dette forslag er blevet kortlagt til at omfatte mange forskellige retninger, såsom laterale bevægelser, er hovedbestanddelen i belastning menes at være i den aksiale retning 23. Derfor simuleret in situ belastninger i aksial retning blev anbragt enten koncentriskly eller excentrisk (figur 2).
Eksperimentelle faktorer, der kan påvirke resultater relateret til orgel niveau biomekanik: Fordelen ved at koble røntgen mikroskopi med in situ læsning er, at belastningen-forskydning kurve kan relateres til den rumlige sammenslutning af tanden med den alveolære stik, form, af roden og den alveolære overflade og indsnævring og udvidelse af PDL-plads under belastning. Sammenhængen og supplerende evaluering giver en holistisk tilgang til at bestemme orgel biomekanik. I fortiden, var det kun postuleret, at mekanikken i et organ og / eller væv kan bede load-forskydning adfærd. Denne protokol viste, at sammenslutningen af de bevægelige medlemmer når under belastning også kan være et iboende træk ved observerede stivhed. Eventuelle ændringer observeret inden for de første 5-8 N menes at være medvirkende ved kvaliteten af PDL en indledende konformationsændring ikollagen og væske udveksling interstitielle med minimal modstand til at indlæse, denne region er blevet henvist til som "uncrimping" område 26. Belastninger højere end 7 N kunne bidraget med tand, ben, stamme hærdning virkninger af parodontal ligament, og knyttet væv grænseflader. Når PDL-space er minimeret, og som PDL undergår deformationshærdning, opstår hårdt væv interaktioner mellem tanden og knoklede stikket interradicular region resulterer i en stejlere belastning til fortrængning skråning. I tillæg til materialegenvinding, kan slør læsseindretningens udnyttes til at undersøge viskoelastiske karakter af PDL uden at ændre det fælles som det blev gjort i andre undersøgelser 16, 25.
De generelle regioner inden forskydningskurver belastningen korrelerer til nogle begivenheder i leddet. De ovennævnte begivenheder er de fællesnævnere mellem de to lastning ordninger. Forskellenemellem koncentriske og excentriske profiler load-fortrængning og tilsvarende tomogrammer fremhævet indflydelse retning belastning på de overordnede orgel biomekanik. Den vigtigste kilde til disse forskelle var indførelsen af en tand rotation, da det fortrænger i leddet, der forårsager kompression af PDL rum på specifikke områder. Det er underforstået, at normale fysiologiske belastninger anvendes på tanden i flere retninger, herunder dem, der indfører roterende tand bevægelse. Det anbefales dog, at en koncentrisk belastning ordning bruges som en standard belastning ordning på grund af vanskelighederne ved at anvende en "standard" excentrisk belastning på tværs af alle prøver. Som sådan denne eksperimentelle protokol kan anvendes til at differentiere biomekaniske forskelle mellem tilpassede og nonadapted systemer.
En af ulemperne ved anvendelse af højere røntgenstråler er, at de minimalt absorberes af blødere væv og produceret utilstrækkelig kontrast. PDL er gennemsignt for røntgenstråler og som et resultat nødvendiggør anvendelsen af kontrastmidler. PTA forbedrer kontraster bløde væv ved direkte farvning 27-29 og giver mulighed for visualisering ved hjælp af røntgenstråler. Derfor, ved hjælp af kontraststoffer, synlig deformation inden farvede blødt væv områder mellem og aflæsset tomographies blev observeret, men højere forstørrelse (mindst 10X) anbefales til analyse (data ikke vist). En begrænsning af farvningsprotokol inkluderet brugen af ethanol, en mild fiksativ 29, som kunne have ændret stivheden af PDL og overordnede fælles mekanik, der fører til fejlagtige konklusioner.
KONKLUSIONER
Denne undersøgelse fremhæver en roman test protokol til at analysere den biomekaniske respons af en intakt knogle-PDL-tand fiberholdigt fælles, men under ex vivo. Kan anvendes den beskrevne eksperimentelle metode, herunder post-analyser af data for at måle effekten af ekspertiseimental variabler (dvs. sygdom, vækstfaktorer, alder og terapeutiske molekyler) på mekanikken i knogle-PDL-tand fiberholdigt joint. Derudover vil resultaterne fra disse forsøg tjene som et grundlag for hvilke relationer mellem variationer på Makroskalaplacering organ niveau kan relateres til konkrete ændringer på de vævs-og cellulære niveauer. Begrænsninger i protokollen omfatter, billedbehandling under ex vivo-betingelser, anvendelse af kontrastmidler, og tab i rumlig nøjagtighed mellem overflader af tanden og alveolære sokkel på grund af væv afslapning under længere indfangningstider er nødvendige for tomogram generation.
Supplerende materiale
Protokol for Biomekanisk test af kindtænder inden Kjaever:
1.. Hvis Kjaever skulle afprøves, fjernes maxilla fra hver rotte kranium med den ventrale aspekt (gane) vendende opad. Sever muskler og ledbånd bindevæv fralaterale side af kraniet ved at skære gennem vestibule (lomme mellem gummerne og kinden).
2. Palpere og fraktur zygomatic proces kæbebenet af kraniet og afskære Kindbuen fra kæbebenet.
3. Skær kraniet lige ned med et par af bulk dissektion saks gennem hjernen startende fra den bløde gane. Isoler den forreste del af kraniet og skræl hovedbunden væk fra den dorsale aspekt (øverst) af kraniet.
4.. Med et par fine dissektion saks, adskille højre og venstre hemimaxillae ved at lave et snit, der følger en lige linie gennem midten af den hårde gane og de interproximale område mellem fortænderne. Sørg for, at dybden af snittet er lavvandet - kun dyb nok til at punktere den hårde gane.
5.. Isoler hemimaxillae ved at gøre vinkelret (på den lange akse af kraniet) indsnitforreste til den første molære og posteriort for tredje molær. 1) Må ikke skære for tæt på den første og tredje molarer for dette kan forstyrre rod struktur, 2) Må ikke rippe væk gingival væv omkring alle tre kindtænder. Adskil hemimaxillae fra kraniet ved at skære den tynde kæbebenet overlegen hver hemimaxilla. Fjern eventuelle overskydende væv og knoklede spikler.
Validering af den mekaniske testindretningen:
For at bestemme stivheden af påsætningsramme og drift af transducere belastningen / forskydning, bruge et stift legeme, såsom aluminium med et elasticitetsmodul langt højere end de eksperimentelle prøve.
At afgøre, om instrumentet er i stand til at skelne forskellige stivhedsværdier repræsentative for blødere elementer, fabrikere PDMS blokke med forskellige tværbindinger tætheder (1:5, 1:10 01:25 tværbinder til basen efter vægt) og indlæse disse ved at bruge den sammein situ læsseindretning.
Fasekontrast tilstand til kontrastforbedring blødere elementer: Kontrastforbedring af PDL kan gøres ved at udnytte fasekontrast tilstand af scanneren. Grundlæggende fasekontrast udnytter scanner sporingskapaciteten af et skift i fase ved kanterne af væv og giver øget strukturel detalje. Som et resultat, i denne undersøgelse, manglerne i cementocyte-huller og osteocyt-huller viste sig som porøsiteter indenfor respektive mineraliseret væv. Disse strukturer blev tidligere uopdaget i en standard scanning under absorption mode. Tomogrammer erhvervet under transmissionstilstand tilladt for visualisering af strukturer i det negative rum, nemlig PDL-rum og endosteale rum, herunder Haverske kanalsystem (for 3D-model se figur S1). Yderligere strukturer i PDL-rum kan visualiseres så godt, som vaskulaturen, der er kontinuert med at jegn knogle.
Ækvilibrerede belastninger for tomogram erhvervelse og systemets drift:. Denne del kan forklares bedst ved at henvise til Supplemental Figur 2 Figur S2A viser behovet for at udligne spidsbelastninger før erhverve tomogrammer. Spidsbelastninger uvægerligt henfalde til en lavere størrelsesorden og systemet skal afbalanceres mindst en time før en 6-8 timers tomogram er erhvervet. Det skal bemærkes, at tomogram erhvervet ikke er repræsentativt for knogle-tand forening ved spidsbelastning, men ved en belastning 2-3 N lavere end spidsbelastning. Desuden blev målt systemet afdrift identificeres ved hjælp af en stiv aluminium stub fundet at ændre sig med deplacement sats og / eller spidsbelastninger (Figur S2B og S2C). Tilnærmet forskydninger varierede fra + 1 N / time.
Efter mekanisk afprøvning blev en tomogram af det fibrøse fælles taget uden belastning, og til en spidsbelastning på en ønsket forskydning sats. Forud for at erhverve en tomogram under lastet forhold, bør man sørge for at gøre det muligt for systemet at komme til en ligevægt (stabilitet), hvorefter scanningen skal fortsætte. Tilsvarende forhold blev gentaget for excentrisk belastede og PTA farvede komplekser. Fra tomogrammer blev virtuelle skiver sammenlignet uden belastning for belastede forhold for at identificere tand-bone forening både i to-og tre-dimensioner.
Supplerende Figur 1. 3D rekonstruktion af negativ rummet ved hjælp af fasekontrast forbedret røntgen mikroskopi. Under fase kontrast ekstraudstyr tilstand faseskift, der opstår på kanten af væv blev udnyttet til at fremhæve blodkar i PDL. Konkret absorption mode (til venstre) fremhævede mineraliseret væv inden for synsfeltet, mens transmissionstilstand (til højre) fremhævede blodkarrene i PDL rum samt endosteale rum.
telt "> Supplerende fig. 2. Decay af peak reaktionære kræfter til en ligevægtstilstand inden CT-scanning. Kurver angiver forskellige henfaldshastigheder reaktionær reaktion af et fibrøst joint (øverste panel), og et stift legeme (nederste panel).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkender finansieringsstøtte NIH / NIDCR R00DE018212 (SPH), NIH/NIDCR-R01DE022032 (SPH), NIH / NIDCR T32 DE07306 (AJ, JDL), NIH / NCRR S10RR026645, (SPH) og afdelinger for Forebyggende og genoprettende Dental Sciences og orofacial Sciences, UCSF. Desuden Forfatterne erkender Xradia dimittendstipendium (AJ) Xradia Inc., Pleasanton, CA.
Forfatterne takker Dr. Kathryn Grandfield, UCSF for hendes hjælp med efterbehandling af data; Drs. Stephen Weiner og Gili Naveh, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel, Dr. Ron Shahar, The Hebrew University of Jerusalem, Israel for deres indsigtsfulde diskussioner specifikke for in situ læsning enhed. Forfatterne vil også gerne takke biomaterialer og Bioengineering MicroCT Imaging Facility på UCSF for brug af Micro XCT og in situ læsning enhed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bard Parker Blade | BD | MEDC-001054 | |
| AFM metal disk | Ted Pella | 16218 | |
| Polymethyl methacrylate | GC America | N/A | |
| Uni-Etch | Bisco | E5502EBM | |
| Optibond Solo Plus | Kerr Corp | N/A | |
| Filtek Flow | 3M | N/A | |
| Hurculite Ultra | Kerr | 34346 | |
| Tris buffer | Mediatech Inc. | N/A | |
| Articulating paper | Parkell Inc. | ||
| Phosphotungstic Acid | Sigma Aldrich | HT152 |
References
- Popowics, T. E., Rensberger, J. M., Herring, S. W. Enamel microstructure and microstrain in the fracture of human and pig molar cusps. Arch. Oral Biol. 49, 595-605 (2004).
- Jantarat, J., Palamara, J. E., Messer, H. H. An investigation of cuspal deformation and delayed recovery after occlusal loading. J. Dent. 29, 363-370 (2001).
- Jantarat, J., Panitvisai, P., Palamara, J. E., Messer, H. H. Comparison of methods for measuring cuspal deformation in teeth. J. Dent. 29, 75-82 (2001).
- Asundi, A., Kishen, A. A strain gauge and photoelastic analysis of in vivo strain and in vitro stress distribution in human dental supporting structures. Arch. Oral Biol. 45, 543-550 (2000).
- Asundi, A., Kishen, A. Advanced digital photoelastic investigations on the tooth-bone interface. J. Biomed. Opt. 6, 224-230 (2001).
- Wang, R. Z., Weiner, S. Strain-structure relations in human teeth using Moire fringes. J. Biomech. 31, 135-141 (1998).
- Wood, J. D., Wang, R., Weiner, S., Pashley, D. H. Mapping of tooth deformation caused by moisture change using moire interferometry. Dent. Mater. 19, 159-166 (2003).
- Dong-Xu, L., et al. Modulus of elasticity of human periodontal ligament by optical measurement and numerical simulation. Angle Orthod. 81, 229-236 (2011).
- Li, J., Li, H., Fok, A. S., Watts, D. C. Multiple correlations of material parameters of light-cured dental composites. 25, 829-836 (2009).
- Zhang, D., Arola, D. D. Applications of digital image correlation to biological tissues. J. Biomed. Opt. 9, 691-699 (2004).
- Zhang, D., Mao, S., Lu, C., Romberg, E., Arola, D. Dehydration and the dynamic dimensional changes within dentin and and enamel. Dent. Mater. 25, 937-945 (2009).
- Qian, L., Todo, M., Morita, Y., Matsushita, Y., Koyano, K. Deformation analysis of the periodontium considering the viscoelasticity of the periodontal. 25, 1285-1292 (2009).
- Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. , (2012).
- Qian, L., Todo, M., Morita, Y., Matsushita, Y., Koyano, K. Deformation analysis of the periodontium considering the viscoelasticity of the periodontal. 25, 1285-1292 (2009).
- Huelke, D. F., Castelli, W. A. The blood supply of the rat mandible. Anat. Rec. 153, 335-341 (1965).
- Chiba, M., Komatsu, K. Mechanical responses of the periodontal ligament in the transverse section of the rat mandibular incisor at various velocities of loading in vitro. J. Biomech. 26, 561-570 (1993).
- Natali, A. N., et al. A visco-hyperelastic-damage constitutive model for the analysis of the biomechanical response of the periodontal ligament. J. Biomech. Eng. 130, (2008).
- Naveh, G. R., Shahar, R., Brumfeld, V., Weiner, S. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone: A dynamic 3D microCT study of the rat molar. J. Struct. Biol. 177, 477-483 (2012).
- Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. 46, 443-449 (2013).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
- Carrillo, F., et al. Nanoindentation of polydimethylsiloxane elastomers: Effect of crosslinking, work of adhesion, and fluid environment on elastic modulus (vol 20, pg 2820). J. Mater. Res. 21, 535-537 (2006).
- Hiiemae, K. M. Masticatory function in the mammals. J. Dent. Res. 46, 883-893 (1967).
- Hunt, H. R., Rosen, S., Hoppert, C. A. Morphology of molar teeth and occlusion in young rats. J. Dent. Res. 49, 508-514 (1970).
- Komatsu, K., Sanctuary, C., Shibata, T., Shimada, A., Botsis, J. Stress-relaxation and microscopic dynamics of rabbit periodontal ligament. J. Biomech. 40, 634-644 (2007).
- Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. 46, 443-449 (2013).
- Quintarelli, G., Zito, R., Cifonelli, J. A. On phosphotungstic acid staining. I. J. Histochem. Cytochem. 19, 641-647 (1971).
- Quintarelli, G., Cifonelli, J. A., Zito, R. On phosphotungstic acid staining. II. J. Histochem. Cytochem. 19, 648-653 (1971).
- Quintarelli, G., Bellocci, M., Geremia, R. On phosphotungstic acid staining. IV. Selectivity of the staining reaction. J. Histochem. Cytochem. 21, 155-160 (1973).
- Crabtree, W. N., Murphy, W. M. The value of ethanol as a fixative in urinary cytology. Acta Cytol. 24, 452-455 (1980).
