Summary
In deze studie wordt het gebruik van een in situ laadinrichting in combinatie met micro-X-ray tomografie vezelachtige gemeenschappelijke biomechanica besproken. Experimentele uitlezingen identificeerbaar met een totale verandering in joint biomechanica omvatten: 1) reactionaire kracht versus verplaatsing, namelijk tand verplaatsing binnen de alveolaire stopcontact en de reactionaire reactie op belasting, 2) drie-dimensionale (3D) ruimtelijke configuratie en morfometrie, dwz geometrische relatie van de tand met de alveolaire aansluiting en 3) veranderingen in uitlezingen 1 en 2 door een verandering in lading as, dwz concentrische of excentrische belastingen.
Abstract
Deze studie toont een roman biomechanica testprotocol. Het voordeel van dit protocol omvat het gebruik van een in situ laadinrichting gekoppeld met een hoge resolutie röntgenmicroscoop, waardoor visualisatie van inwendige constructiedelen onder gesimuleerde fysiologische belastingen en natte omstandigheden. Experimentele exemplaren zal intact bot-parodontale ligament (PDL)-tand vezelige gewrichten. De resultaten zullen illustreren drie belangrijke eigenschappen van het protocol als ze kunnen worden toegepast op orgel niveau biomechanica: 1) reactionaire kracht versus verplaatsing: tand verplaatsing binnen de alveolaire stopcontact en haar reactionaire reactie op het laden, 2) drie-dimensionale (3D) ruimtelijke configuratie en morfometrie: geometrische relatie van de tand met de alveolaire aansluiting en 3) veranderingen in uitlezingen 1 en 2 door een verandering in lading as, namelijk van concentrisch met excentrische belastingen. Werkzaamheid van het voorgestelde protocol zal geëvalueerd worden door het koppelen van mechanisch testing aanwijzingen naar 3D morfometrie en de algehele biomechanica van het gewricht. Daarnaast zal deze techniek de nadruk leggen op de noodzaak om de experimentele condities in evenwicht, met name reactionaire lasten vóór het verwerven tomograms van vezelig gewrichten. Opgemerkt wordt dat de voorgestelde protocol beperkt tot testen monsters onder ex vivo omstandigheden en dat het gebruik van contrastmiddelen zachte weefsel mechanische respons visualiseren kan leiden tot verkeerde conclusies weefsel en orgaan-niveau biomechanica.
Introduction
Verschillende experimentele methoden verder worden gebruikt om de biomechanica van diarthrodial en vezelig gewrichten onderzoeken. Methoden voor de tand orgel biomechanica omvatten het gebruik van rekstrookjes 1-3, Photoelasticity methoden 4, 5, Moire interferometrie 6, 7, elektronische spikkelpatroon interferometrie 8, en digital image correlation (DIC) 9-14. In deze studie, de innovatieve aanpak omvat invasieve beeldvorming met röntgenstraling om de interne structuur van een vezelig gezamenlijke bloot (gemineraliseerde weefsels en hun interfaces bestaan uit zachter zones en interfacing weefsels zoals gewrichtsbanden) tegen belasting gelijk aan de in vivo omstandigheden. Een in situ laadinrichting gekoppeld met een micro-röntgenmicroscoop wordt gebruikt. De belasting-tijd en de belasting-verplaatsing curves worden verzameld als de molaire van belang in een vers geoogste rat hemi-onderkaak wordt geladen. De main doel van de in deze studie benadering is het effect van driedimensionale morfologie van tand-been benadrukken door aandoeningen vergelijking op: 1) nullast en bij belasting, en wanneer 2) concentrisch en excentrisch geplaatst. Waardoor de noodzaak voor gesneden exemplaren, en experimenten uit te voeren op geheel intacte organen onder natte omstandigheden zal zorgen voor maximaal behoud van de 3D spanningstoestand. Dit opent een nieuw gebied van onderzoek in het begrijpen van onder verschillende laad-scenario dynamische processen van het complex.
In deze studie, de methoden voor het testen van PDL biomechanica binnen een intacte vezelachtige gewricht van een Sprague Dawley rat, een gezamenlijk beschouwd als een optimale biotechniek modelsysteem, zal worden opgenomen. Experimenten zal simulatie van kauwen lasten onder gehydrateerd voorwaarden om tot drie belangrijke kenmerken van het gewricht te benadrukken als ze betrekking hebben op orgel niveau biomechanica. De drie punten zijn onder andere: 1) reactionaire kracht versus verplaatsing:tand verplaatsing binnen de alveolaire stopcontact en de reactionaire reactie op belasting, 2) drie-dimensionale (3D) ruimtelijke configuratie en morfometrie: geometrische relatie van de tand met de alveolaire aansluiting en 3) veranderingen in uitlezingen 1 en 2 door een verandering in laden as, dwz van concentrische naar excentrische belastingen. De drie fundamentele uitlezingen van de voorgestelde techniek kan worden toegepast op de adaptieve aard verbindingen in vertebraten ofwel te wijten aan veranderingen in functionele eisen en / of ziekte. Veranderingen in bovengenoemde uitlezingen bijzonder de correlatie tussen reactionaire belastingen met verplaatsing en verkregen reactionaire load-tijd en load-verplaatsingscurven bij verschillende beladingsgraad kan op algemene wijzigingen in joint biomechanica markeren. Werkzaamheid van het voorgestelde protocol zal geëvalueerd worden door het koppelen van mechanische testen aanwijzingen naar 3D morfometrie en de algehele biomechanica van het gewricht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Stalruimte en euthanasie: Alle dieren die worden gebruikt in deze demonstratie werden gehuisvest onder kiemvrije omstandigheden in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) en het National Institute of Health (NIH).
Zorg voor dieren met een standaard harde-pellet rattenvoer en water ad lib. Euthanaseren dieren via een twee-staps methode van kooldioxide stikken, bilaterale thoracotomie in overeenstemming met het standaard protocol van UCSF zoals goedgekeurd door IACUC. Voer biomechanische testen binnen 24 uur van dierenoffers om weefsel degradatie te voorkomen.
1. Voorbereiding en Dissectie van een Rat Kaak of Maxilla
- Verwijder onderkaken rat door voorzichtig doorsnijden membraneuze weefsel en spierweefsel bijlagen behoud van de gehele onderkaak, inclusief coronoideus proces en condylaire werkwijze (figuur 1) 15.
- Aparte hemimandibles met de autoefully snijden van het bindweefsel van de onderkaak symphysis met een scalpel.
Opmerking: De coronaire en condylaire processen en ramus van de onderkaak (figuur 1) worden verwijderd als ze fysiek biomechanische testen van de 2e molaire belemmeren. - Snijd de snijtanden zonder dat de pulpakamer niet te laden van de molaire belemmeren.
2. Specimen Voorbereiding voor in situ drukbelasting (figuur 2)
- Immobiliseer het monster op een stalen strook met een materiaal dat aanzienlijk stijver dan het experimentele monster vóór het laden in een in situ laadinrichting (Figuur 2A).
Opmerking: Polymethylmethacrylaat (PMMA) werd gebruikt om het model in deze studie en overmaat immobiliseren eventuele werd verwijderd met een tandheelkundig. - Lijn de occlusale oppervlak van de mol (s) van belang parallel met de AFM metalen objectplaatje met behulp van een rechte rand in zowelvliegtuigen (dwz mesiale-distale en buccale-lingual).
- Maak een trog met een stomp voorwerp rondom de kiezen.
Opmerking: Deze ruimte dient als een "gracht" om overtollige vloeistof te bevatten en weefsel hydratatie tijdens in situ laden dienen. - Bereid het tandoppervlak te bouwen voor concentrische (Figuur 2B) of excentrische (figuur 2C) inladen met een tandheelkundige composiet. Ets het oppervlak van de tanden plaats met 35% fosforzuur gel op occlusale oppervlak voor 15 sec.
- Spoel het etsmiddel grondig met gedeïoniseerd water en droog het oppervlak met behulp van een lucht / water spuit of een perslucht bus. Met een ontdekkingsreiziger, verspreid een daling van het bindmiddel in open knobbels in een dunne laag. Cure de composiet met een polymerisatielamp.
Opmerking: Alle stappen met betrekking tot composieten moet worden uitgevoerd zonder direct licht van een lamp. Dergelijke voorwaarden zouden ongewenst versnellen het polymerisatieproces en Could voorkomen juiste plaatsing van de composiet. Verlichting is aanvaardbaar. - Verwijder overtollig bindmiddel van de aangrenzende tanden met een fijne scalpel of scheermesje.
- Plaats vloeibaar tandheelkundige composiet op het oppervlak na de bereiding van het oppervlak verspreiden in de groeven van de molaire (s) plaats via een tandheelkundig.
- Expose de composiet polymerisatielamp gedurende 30 sec.
- Mold een occlusale opbouw van ongeveer 3-4 mm met behulp van een tandheelkundige composiet, van het occlusale vlak van de mol (s) van belang en licht gedurende 30 sec.
- Verminder de top van de composiet opbouw op een plat oppervlak en evenwijdig aan een consistent laad regeling in alle exemplaren in staat met behulp van een rechte rand en een hoge snelheid handstuk.
Opmerking: Tijdens biomechanisch onderzoek moeten andere monsters worden opgeslagen in tris-fosfaat-gebufferde oplossing (TBS) met 50 mg / ml penicilline en streptomycine 15.
3. Laadinrichting Drift enStijfheid, Materiaal Property Onderscheidende Capability, in situ Laden van de Stapel-Joint
- Bevestig het monster met de samengestelde opbouw op het aambeeld van het laden fase en test gelijkmatige belasting zoals weergegeven in figuur 2B.
- Een scharnierende papier op het oppervlak van de samengestelde gevolgd door het laden van het monster tot een eindige lading te controleren op concentrische of excentrische belasting (figuren 2B en 2C).
- Plaats TBS-doordrenkte Kimwipe rond het monster tot monster hydratatie te waarborgen. Maak een dal rond het model en vul het met TBS om het orgel gehydrateerd tijdens de beeldvorming te houden.
- Input piekbelasting en verplaatsing tarief in de Deben software om de molaire comprimeren tot een gewenste piekbelasting bij een verplaatsing tarief na immobilisatie van de hemimandible.
Opmerking: Typisch readouts moet een reactionaire last nemen als het materiaal wordt samengeperst in de tijd (beladingstransducer gevoeligheid = 0,1N). Van load-tijd en verplaatsing-tijd, moet een belasting-verplaatsing curve voor het geperste materiaal worden verkregen 16-18. De vanuit het laadcycli gegevens kunnen diverse eigenschappen van de verbinding worden bepaald. De stijfheid van de verbinding worden berekend door de helling van het lineaire gedeelte (ongeveer de laatste 30% van de gegevens) van de oplaadfase van de belasting versus verplaatsing curve 19.
4. Kleuring van zacht weefsel, de PDL, met fosfowolfraamzuur (PTA)
Opmerking: Om X-ray demping contrast verbeteren, moet de PDL worden gekleurd met 5% PTA oplossing 20.
- Backfill PTA kleuring oplossing in een schone 1,8 ml glazen carpule en plaats geladen carpule in spuit.
- Injecteren oplossing langzaam (5 min / carpule) in de PDL-ruimte van de aangrenzende tanden naar structurele schade aan parodontale weefsels rond molaire van belang te voorkomen.
Opmerking: De bovenstaande stappen moet be herhaald tot ongeveer 5 vol carpules (9 ml) oplossing geïnjecteerd en toegestaan te stromen in de omringende weefsels. De geprepareerde exemplaren kan ook 's nachts worden geweekt in de resterende PTA oplossing (8 uur).
5. Aanbevolen μ-XCT Scaninstellingen
Voer m-XCT met de volgende scaninstellingen:
| Doelstelling Vergroting | 4X, 10X |
| 1800 beelden | |
| X-ray tube voltage | 75 kVp (50 kVp voor PTA gekleurd monsters) |
| 8 W | |
| Exposure Time | ~ 8-25 sec * |
| ~ 4 micrometer (4X doelstelling), ~ 2 micrometer (10X objectief) ** |
* Belichtingstijd kunnen variëren op basis van de geometrie en de optische dichtheid van het monster en de röntgenbuis voltage.
** Werkelijke pixelresolutie enigszins afwijken basis van de configuratie van de bron monster en detector.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schatting van het laden apparaat "terugslag", "pushback", stijfheid, en het systeem drift onder een constante belasting
Backlash: Tussen laden en lossen delen van de cyclus bestaat er een pauze van 3 seconden gedurende welke versnellingen achteruit in de motor voordat ware lossen begint, dwz als het monster trekt weg van de bovenkaak (figuur 3). Deze periode wordt aangeduid als een speling in het systeem, dat een segment van tijd vertegenwoordigt wanneer het systeem probeert te schakelen sluiten van het openen van de kaken. Opgemerkt zij dat alle belastingscycli vergelijkbare terugslag reactie ongeacht monster of belastingstoestanden (figuur 4) zal bevatten. Een normale belasting tijd-curve verkregen met een star lichaam is weergegeven in figuren 3A en 3B benadrukken het laden, lossen en speling regio op twee verschillende lOADs van 6 N en 16 N Een normale belasting versus verplaatsingscurve de overeenstemmende drie segmenten is weergegeven in figuur 3C.
Pushback: Terwijl alle periodes speling binnen dezelfde 3 sec tijdsbestek, de reactionaire respons en als gevolg van de vorm van het verzet regio kan veranderen, afhankelijk van het model. Door het testen van het systeem door een star lichaam (Figuur 3), werd de hoogste en steilste daling reactionaire belasting waargenomen vergeleken met het been PDL-tooth complex en polydimethlysiloxane (PDMS). De vezelige gezamenlijke geïllustreerde een aanzienlijke daling reactionaire belasting tijdens terugslag fase opzichte PDMS. PDMS (figuur 4) specimens bleek de minst druppel (geen verschil tussen 1:05 en 01:25 crosslinker dichtheden - Figuur 4A) hebben.
Stijfheid: stijfheid van de laad-apparaat bij testen against star lichaam was significant hoger dan die van het complex en PDMS specimens. Deze gegevens bevestigen de doeltreffendheid van de laadinrichting veranderingen in biomechanica van het been PDL-tooth complex en zachtere materialen (Figuur 4B) te markeren.
Het visualiseren van zacht en hard weefsel structuren binnen de intacte bot-PDL-tooth complex gebruik μ-XCT: In een ongekleurde, maar gehydrateerd vezelig gezamenlijke, demping van hard weefsel functies, waaronder alveolaire bot, cement, email en dentine werden belicht (figuren 5A en 5B). Echter, ruimten die voornamelijk zachtere biologische weefsels waren transparant voor X-stralen, waardoor de PDL-ruimte relatief "leeg" (zwart). Monsters behandeld met PTA toonde verhoogde contrast binnen de PDL-ruimte, waardoor de aandacht kenmerken vertegenwoordiger van de PDL en tandvleesweefsels (figuren 5C-F). Scannen met een hogere magnificatie bleek PDL als vezelachtige netwerk tussen de tanden en beenderen.
Reactionaire kracht versus verplaatsing: biomechanische respons van de vezelachtige gewricht tijdens in situ laden: Vergeleken met concentrische laden, excentrische belasting patroon op een vergelijkbaar exemplaar toonde toegenomen verplaatsing van de tand in het gewricht voor een bepaalde reactionaire belasting (figuur 6A). Voor vezelige gewrichten behandeld met PTA geen significante verschillen in de totale biomechanica waargenomen ongeacht de beladingstoestand (figuur 6B). In de onbehandelde maar excentrisch belast systeem kan de toegenomen verplaatsing van de wortel in de alveolaire aansluiting gecorreleerd lagere stijfheid zoals in de belasting-verplaatsing curves (figuur 6C). Hoewel er een natuurlijke variatie leidt tot een reeks biomechanische reacties vezelachtig gewrichten geoogst in controlegroepen kan, PTA-behandelde vezeligeverbindingen vertoonden verhoogde stijfheid en minder in de mof vergelijking met onbehandelde tegenhangers een bepaalde reactionaire piekbelasting verplaatst. Er was geen detecteerbare verandering in de vorm of duur van de speling fase van de laadcyclus tussen onbehandelde en behandelde monsters PTA.
Drie-dimensionale ruimtelijke configuratie en morfometrie: kaart brengen van de bot-tand configuratie onder belaste omstandigheden met μ-XCT: virtuele plakken uit tomograms vergeleken illustreren 1) tandverplaatsing binnen de mof, 2) tand-been vereniging zowel in 2D en 3D , 3) de mate van beweging als gevolg van excentrische vergelijking met concentrische laden. Tandverplaatsing werd benadrukt door superpositie van soortgelijke virtuele plakjes bij nullast en bij belasting en het genereren van gif films. Hoewel beide laden regelingen veroorzaakt de tand verticaal verplaatsen in het gewricht, een excentrische belasting configuratie (figuren 7B en 7C) caused extra rotatie effect van de tand met de wortels roterende distaal resulteert in verminderde PDL ruimte aan de distale zijde van de wortels vergeleken met concentrische loading scans (figuren 7 en 8). Hoewel de PTA-gekleurde PDL was verzachtende (figuur 5), de beweging van de tand in alveolaire aansluiting in de PTA behandelde gewrichten minder uitgesproken en gecorreleerd met de biomechanische data (figuren 6B en 6C).
Figuur 1. Een aangepaste 15 illustratie van de belangrijkste locaties bij de voorbereiding van de hemimandible voor biomechanische testen. Getoond in de inzet is een hemimandible.
Figuur 2. Configuratie van een in situ laadeenheid en μ-XCT-systeem. (A) Een beeld van een in situ laden apparaat op een aangepaste houder binnen de micro-X-ray tomografie (μ-XCT) unit. Concentrische (B) en excentriek (C) loading voorwaarden bepaald door de aard van het contact tussen het aambeeld en het samengestelde oppervlak worden geïllustreerd in de vorm van schema's, en de bijbehorende experimentele opstellingen (regio overeenkomt met die benadrukt door de witte doos in (A ) respectievelijk. Marks uit articulatiepapier bevestigen eerste contact tussen het aambeeld en de tandheelkundige composiet. Klik hier voor grotere afbeelding. </ A>
Figuur 3. Vertegenwoordiger load-tijd curve illustreert systeem "backlash". Load versus tijd met behulp van een star lichaam illustreert terugslag periode als een gebeurtenis tussen sluiten en openen van de aambeelden. De groene gebied geeft oplaadfase waarbij aambeelden naderen (groene gebied) een star lichaam laden 15 N (A) en 5 N (B, bijvoegsel). Het blauwe gebied geeft een lossing periode waarin de aambeelden zijn terugtrekken uit elkaar. Echter door het ontbreken van onmiddellijke motorische respons te wijten aan de tijd genomen door versnelling omkering, ligt er een terugslag periode van 3 sec. Gedurende deze tijd vermindert de belasting ongeveer met 2 N voor ware lossen plaatsvindt. Het laden en lossen gebeurtenissen kunnen worden gerelateerd aan laden vs verplaatsing grafieks (C) die een minimale verplaatsing shows tijdens de terugslag periode. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 4. Representatieve belasting-verplaatsing curves en "pushback" effect met PDMS Onder curves. Laad-tijd relaties tussen PDMS afnemende monomeer crosslinker's tonen het vermogen van de in situ laadeenheid verschillen in materiaaleigenschappen detecteren. Top krommen, links en rechts tonen de verandering in speling van het systeem als gevolg materiaalterugwinning. De linker en rechter in vergelijking illustreren hetzelfde effect, wat aangeeft dat het herstel verschil 1:25-01:05 PDMS is minimaal of niet binnen dedetectielimieten van de laadinrichting. B) Load-verplaatsingscurven om uiteenlopende materialen waaronder star lichaam aluminium, experimenteel model, en de 3 PDMS monsters. Het is de helling van het lineaire gedeelte 30% van de belasting curve die werd gebruikt om de stijfheid van het materiaal te berekenen. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 5. X-ray virtuele delen van mandibulaire tweede molaren gekleurd voor PDL structuurversterking. (A, B) Grijs schaal waarden binnen onbehandeld molaren geven X-ray demping van diverse weefsels waaronder de zachtere regio's binnen het complex. Er werden echter nonmineralized weefsels zoals PDL niet gemarkeerd door zijn minimal verzachtende eigenschappen van X-ray energie op 75 kVp. (CF) Na kleuring PTA verzachtende eigenschappen van de zachtere PDL werden uitgebreid en details in de PDL werden gevisualiseerd met een röntgen microscopie. Zo 2D virtuele sagittale (C-4X vergroting, E-10X vergroting) en transversale (D-4X vergroting, F-10X vergroting) secties onthuld PDL vezeloriëntatie (gele pijlen). Het lumen van bloedvaten in endostale ruimtes (oranje pijlen) en de PDL (witte pijlen) verschijnen als donkere cirkelvormige structuren, terwijl de pulpale ruimte blijft ongekleurd. Artefacten gemaakt tijdens de kleuring procedure worden ook opgemerkt (D, rode sterretjes). Klik hier voor grotere afbeelding.
fo: src = "/ files/ftp_upload/51147/51147fig6highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51147/51147fig6.jpg" />
Figuur 6. Concentrisch en excentrisch geladen exemplaren. Top (A) en onderste panelen (B) illustreren quick time films van tand-bot relatie bij nullast en toen tot 15 N, concentrisch en excentrisch respectievelijk geladen. Bovenste en onderste panelen illustreren bot-tooth vereniging wanneer onbehandeld (A) en gekleurd (B) omstandigheden. Middenpaneel (C) illustreert verschillende load-displacement gedrag tussen excentrisch en concentrisch (links bochten) geladen complexen, en gekleurd, en onbesmet (juiste rondingen) complexen. Klik hier voor grotere afbeelding.
147/51147fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51147/51147fig7.jpg "/>
Figuur 7. Sagittale doorsnede van 2 e molaire illustreert de associatie van de tand met de alveolaire stopcontact als concentrisch geplaatst is (A) en excentrisch (B). Meerderheid van de compressie werd gezien binnen interradiculaire (pijlpunten) en apicale (pijlen) regio's. In vergelijking met virtuele delen van de tand in excentrische belasting (B), de extra rotationele component van de tand beweging veroorzaakt een verhoogde druk naar de distale zijde van de mesiale wortel. Overlay dwarsdoorsneden onthuld distale vertaling en rechtsom draaiende beweging van de tand (groene wortels) ten opzichte van een concentrisch geladen tand (grijs). Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 8. Gereconstrueerde 3D-films tonen een verminderde PDL-ruimte in de distale zijde van de wortel wanneer excentrisch belaste (E) ten opzichte van een concentrisch geplaatst complex (D). Klik hier om de excentrische belasting bekijken en klik hier om concentrische belasting weer te geven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eerste stap bij het vaststellen van dit protocol betrokken evaluatie van de stijfheid van de laadbrug door een star lichaam. Op basis van de resultaten, de stijfheid significant hoger waardoor het gebruik van de laadinrichting voor het verdere testen van specimens met aanzienlijk lagere stijfheid waarden. De tweede stap gewezen op de mogelijkheid van het instrument om verschillende stijfheid waarden onderscheiden door twee fasen van de laad-lossen kromme gegenereerd door een star lichaam, PDMS materialen van verschillende dichtheden verknopen en vezelige gewrichten. De stijfheid van de oplaadfase en pushback tijdens de terugslag fase werden gebruikt om de weerstand van het materiaal te laden en terugwinning van het materiaal identificeren na het lossen (figuren 3 en 4). De derde en vierde stap van het protocol zouden de veranderingen in de belasting-verplaatsing curves verkregen uit de laadinrichting voor de in situ beeldvorming gedaan met t correlerenhij gebruik van X-stralen (figuur 5). Dit betrof het laden van de gewrichten en respectievelijk het verkrijgen tomograms bij nullast en belasting die in concentrische en excentrische voorwaarden. Het protocol aangetoond dat, door het veranderen van de lading as verschillen in PDL-compressie kan worden gemarkeerd (figuren 6 en 7). In deze discussie zullen we eerst instrument kenmerken en uitdagingen die op adequate wijze moeten worden begrepen en voorafgaand aan biomechanische testen van het bot-PDL-tooth complex voldaan te markeren.
Uitdagingen van de experimentele opstelling
Composiet opbouw: Terwijl het protocol zelf is relatief eenvoudig, zijn er verschillende stappen die gedaan moet worden met grote zorg. Een van de grootste uitdagingen was om ervoor te zorgen dat overtollige composietmateriaal niet overloop naar aangrenzende tanden, die vervolgens mechanisch meerdere tanden zou verbinden en verkeerd voor de gezamenlijke mechaics van een enkele tand. Aangezien belangrijke handigheid en kennis van de tandheelkundige instrumenten nuttig gebleken voor deze procedure te zijn, werd de voorbereiding van de monsters voor het laden in de eerste plaats uitgevoerd door tandheelkundige studenten en tandartsen met de hulp van optische vergroting.
Consistent laden regeling: Een ander belangrijk detail voor biomechanische testen was om een consistente laad regeling te garanderen. Het contactgebied tussen de kaak van de in situ laadinrichting en tegengestelde oppervlak van de samengestelde bleek zeer cruciaal voor het experiment zijn. Dit komt omdat mechanica van de vezelige verbinding kan veranderen als gevolg van het contactgebied, dat in dit onderzoek werd gesimuleerd door concentrische en excentrische (ongebalanceerd) belastingen. De scenario in deze studie bootst mogelijke wijzigingen van occlusie van zoogdieren tanden, die kunnen leiden tot een verandering in tandverplaatsing binnen de alveolaire aansluiting (Figuur 5). Hoewel het duidelijk is that de voorgestelde testen mechanisme niet fysiologische kauwen cyclus na te bootsen, het zich presenteert als een standaard testmethode. Door een samengestelde opbouw met een vlak evenwijdig aan de kaak van de lading fase konden we een consistent beladingspatroon genereren. Deze standaard testmethode kan worden gebruikt om wijzigingen in biomechanica van het been PDL-tooth complexen van verschillende experimentele groepen identificeren.
Gevoeligheid van de in situ laadinrichting: Het experimentele protocol beschrijft werkwijzen voor het valideren detectielimieten van de in situ laadinrichting drie verschillende monsters, waarvan er twee kunnen worden beschouwd als standaard materialen. De stijfheid van de laadbrug, wanneer daarop aluminium was significant hoger met verwaarloosbare bijdrage aan de waargenomen mechanisch gedrag van verschillende PDMS specimens, en de biomechanische respons van een vezelig gewricht. Terwijl alle geteste monsters hadden een terugslag periode van~ 3 sec, de vorm van het verzet deel varieerde licht (Figuur 4A) met het soort specimens. Stijve exemplaren vertoonden een scherpe daling van reactionaire belasting (Figuren 3A en 4A), terwijl zachtere exemplaren vertoonden geen een scherpe daling (Figuur 4A). Kan worden gesteld dat het verschil in speling gedrag wordt toegeschreven aan het vermogen van het model terug te dringen op de tandwielen tijdens het schakelen omkering. De push back effect op de tandwielen kan manifesteren in een lagere daling van de piek reactionaire respons van het materiaal als de kaak begint weg van het monster bewegen. Aldus kan de speling segment worden benut inzichten materiaaleigenschap krijgen. Stijfheid waarden berekend uit PDMS lading curven waren in overeenstemming met literatuur-waarden 22 en de stijfheid daarvan van de verknoopte PDMS was binnen het bereik van het been PDL-tooth complex. Vandaar dat de in situ loading device is geschikt voor het meten van de verplaatsing en reactionaire reactie van de tand als het wordt samengeperst in de alveolaire stopcontact. De reactionaire respons kan worden van zachter en / of harder bestanddelen. De dominantie van de zachtere bestanddeel via harder kan worden geïdentificeerd door het laden stapsgewijs en imaging, gevolgd door digitaal correleren van de onbelaste naar belaste omstandigheden-stam gedomineerde gebieden te identificeren binnen het been PDL-tooth complex 13.
Hoofdbestanddeel van kauwen in de axiale richting: Vergelijkbaar mens, het kauwen cyclus van ratten omvatten de beweging van de onderkaak om voedsel 23, 24 kauwen. Hoewel deze beweging is toegewezen aan verschillende richtingen zoals zijwaartse bewegingen bevatten is de hoofdcomponent van de belasting gedacht dat in de axiale richting 23. Daarom is de gesimuleerde in situ belastingen in axiale richting werden ofwel concentrisch geplaatstly of excentrisch (figuur 2).
Experimentele factoren die resultaten met betrekking tot orgaan niveau biomechanica van invloed kunnen zijn: Het voordeel van het koppelen van X-ray microscopie met in situ laden is dat de belasting-verplaatsing curve kan worden gecorreleerd aan de ruimtelijke associatie van de tand met de alveolaire socket, vorm van de wortel en het alveolaire oppervlak en de vernauwing en verbreding van de PDL-ruimte onder belasting. De correlatie en aanvullende evaluatie biedt een holistische benadering van het orgel biomechanica bepalen. Vroeger was het alleen gepostuleerd dat de mechanica van een orgaan en / of weefsels de last-vervormingsgedrag kan aanzetten. Dit protocol blijkt dat de vereniging van de bewegende lichamen onder belasting ook een kenmerk van de waargenomen stijfheid kan zijn. Elke waargenomen binnen de eerste 5-8 N veranderingen wordt gedacht te worden bijgedragen door de kwaliteit van de PDL een eerste conformationele verandering binnen decollageen en interstitiële vloeistof uitwisseling met minimale weerstand te laden, heeft deze regio aangeduid als de "uncrimping" regio 26. Ladingen hoger dan 7 N kan worden bijgedragen door tand, bot, de-stam verharding effecten van het parodontale ligament, en de interfaces bevestigen van de weefsels. Zodra de PDL-ruimte wordt geminimaliseerd en als het PDL ondergaat rekverharding, hard weefsel interacties tussen de tand en benige aansluiting ontstaat op het interradiculaire regio resulteert in een steilere belasting helling verplaatsing. Naast materiaal herstel, kan de speling van de laad-apparaat worden benut om de visco-elastische karakter van de PDL te onderzoeken zonder dat het gewricht zoals werd gedaan in andere studies 16, 25.
De algemene regio's binnen de lading van bochten correleren aan een aantal evenementen in het gewricht. De bovenstaande gebeurtenissen zijn de gemene deler tussen de twee laad-regelingen. De verschillentussen concentrische en excentrische belasting-verplaatsing profielen en bijbehorende tomograms gewezen op de invloed van de belasting richting op het totale orgel biomechanica. De belangrijkste bron van deze verschillen was de invoering van een tand draaiing als het verplaatst in het gewricht, waardoor de compressie van PDL zijn op specifieke gebieden. Het is duidelijk dat de normale fysiologische belasting worden aangebracht op de tanden in verschillende richtingen met inbegrip van die die roterende tandbeweging voeren. Er wordt aanbevolen dat een concentrische laden programma worden gebruikt als een standaard laad regeling vanwege de moeilijke toepassing van een "standaard" excentrische belasting over alle monsters. Als zodanig deze experimentele protocol kan worden gebruikt voor biomechanische verschillen aangepast en nonadapted systemen onderscheiden.
Een van de nadelen van het gebruik van hogere energie röntgenstralen is dat ze minimaal worden geabsorbeerd door zachte weefsels en geproduceerd onvoldoende contrast. De PDL is Transparent röntgenstraling en daardoor is het gebruik van contrastmiddelen. PTA versterkt de contrasten van zachte weefsels door direct kleuring 27-29 en waardoor voor visualisatie met behulp van X-stralen. Derhalve, door de contrastmiddelen toegankelijk vervorming binnen gekleurd zacht weefsel gebieden tussen geladen en gelost tomografie waargenomen, maar hogere vergroting (tenminste 10X) aanbevolen voor analyse (gegevens niet getoond). Een beperking van de kleuring protocol omvatte het gebruik van ethanol, een milde fixeermiddel 29 die de stijfheid van de PDL en de algehele gewrichtsmechanisme leidt tot verkeerde conclusies kunnen veranderd.
CONCLUSIES
Deze studie benadrukt een nieuwe testprotocol om de biomechanische respons van een intact bot-PDL-tooth vezelige gezamenlijke analyseren, maar onder ex vivo omstandigheden. De beschreven experimentele werkwijze die na analyse van gegevens kunnen worden gebruikt om de effecten van expertise metenimental (ie ziekte, groeifactoren, leeftijd en therapeutische moleculen) op de werking van het been PDL-tooth vezelige gewricht. Daarnaast zullen de resultaten van deze experimenten dienen als basislijn waarvoor relaties tussen variaties op macroschaal orgaan niveau worden afgestemd op specifieke veranderingen in het weefsel en cellulaire niveaus. Beperkingen van het protocol omvatten, beeldvorming onder ex vivo omstandigheden, het gebruik van contrastmiddelen, en het verlies in de ruimtelijke nauwkeurigheid tussen oppervlakken van de tand en alveolaire socket vanwege weefsel ontspanning tijdens langere opnametijden nodig voor tomogram generatie.
Aanvullend materiaal
Protocol voor Biomechanische testen van kiezen binnen maxillae:
1. Als maxillae zouden moeten worden getoetst, verwijder de bovenkaak uit elke schedel rat met het ventrale aspect (dak van de mond) naar boven. Sever de spieren en gewrichtsbanden bindweefsel vande laterale aspect van de schedel door te snijden door de vestibule (pocket tussen het tandvlees en de wang).
2. Betasten en breken het jukbeen proces van de bovenkaak bot van de schedel en verbreken de jukbeenboog van de bovenkaak bot.
3. Snijd de schedel recht naar beneden met een paar van bulk dissectie schaar door de hersenen vanaf het zachte gehemelte. Isoleer de voorste aspect van de schedel en schil de hoofdhuid verwijderd van het dorsale aspect (bovenkant) van de schedel.
4. Met een paar fijne dissectie scharen, scheid de rechter en linker hemimaxillae door een incisie die een rechte lijn door het midden van het harde gehemelte en de interproximale gebied tussen de snijtanden volgt. Zorg ervoor dat de diepte van de snede is ondiep - slechts diep genoeg om het harde gehemelte prikken.
5. Isoleer de hemimaxillae door loodrecht (op de lengteas van de schedel) incisiesjuist voor de eerste kies en posterieure de derde molaar. 1) Wees niet te nauw gesneden om de eerste en de derde kiezen hiervoor kan wortel structuur verstoren; 2) Gebruik geen rip weg het tandvlees rondom alle drie kiezen. Scheid de hemimaxillae van de schedel door het snijden van de dunne bovenkaak bot superieur aan elk hemimaxilla. Verwijder overtollig weefsel en benige spicules.
Validatie van de mechanische testen apparaat:
Om de stijfheid van de laadbrug en de drift van de belasting / transductor bepalen, gebruikt een star lichaam zoals aluminium met een elasticiteitsmodulus verreweg hoger dan die van het experimentele monster.
Om te bepalen of het instrument kan onderscheiden verschillende stijfheid waarden representatief zachtere elementen fabriceren PDMS blokken met verschillende crosslink dichtheid (01:05, 01:10, 01:25 verknopingsmiddel te baseren op gewichtsbasis) en plaats deze met dezelfdein situ laadinrichting.
Fase contrast wijze voor contrastverbetering zachtere elementen: Contrastverbetering van de PDL kan door het benutten van de fasecontrast modus van de scanner. Fundamenteel, fasecontrast benut scanner detectiemogelijkheden van een verschuiving in fase aan de randen van weefsels en biedt verbeterde constructieve details. Als gevolg hiervan, in deze studie, de lacunes van cementocyte-lacunes en osteocyt-lacunes verscheen als porositeit binnen de onderscheiden gemineraliseerde weefsels. Deze structuren werden voorheen onopgemerkt in een standaard scan onder opname modus. Tomograms verworven onder transmissie toegestaan voor de visualisatie van structuren binnen de negatieve ruimte, namelijk de PDL-ruimte en endostale ruimtes, waaronder de Havers kanaal systeem (voor 3D-model zie figuur S1). Aanvullende structuren binnen de PDL-ruimte kan ook worden gevisualiseerd, zoals de vasculatuur die continu met die in bot.
Evenwicht gebracht lasten voor tomogram acquisitie en systeem drift:. Dit gedeelte kan het best worden verklaard door te verwijzen naar aanvullende Figuur 2 Figuur S2A toont de noodzaak om piekbelastingen vóór het verwerven tomograms evenwicht. Piekbelastingen steevast vervallen tot een lagere omvang en het systeem moet worden in evenwicht gebracht in ieder geval voor een uur voor een 6-8 uur tomogram wordt verworven. Opgemerkt wordt dat de verkregen tomogram is niet representatief voor de been tand vereniging op de piekbelasting, maar bij een belasting 2-3 N hoger dan de piekbelasting. Daarnaast is de gemeten systeem drift geïdentificeerd met behulp van een stevig aluminium stub bleek te veranderen met verplaatsing tarief en / of piekbelastingen (Figuur S2 B en S2C). Benaderd drift waarden varieerden van + 1 N / uur.
Na mechanische testen, werd een tomogram van de vezelachtige gezamenlijke genomen bij nullast, en een piekbelasting op een gewenste verplaatsingssnelheid. Voorafgaand aan het verwerven van een tomogram onder geladen omstandigheden, moet ervoor worden gezorgd, zodat het systeem naar een evenwicht (stabiliteit), waarna het scannen te werk moeten gaan komen. Vergelijkbare omstandigheden werden herhaald voor excentrisch belaste en PTA gekleurd complexen. Van de tomograms, werden virtuele plakjes vergeleken bij nullast te beladen voorwaarden om te tand-bot vereniging te identificeren, zowel in twee-en drie-dimensies.
Aanvullende Figuur 1. 3D reconstructie negatieve ruimte met fasecontrast versterkte röntgen microscopie. Onder fasecontrast versterkingsmodus de faseverschuiving die optreedt aan de randen van weefsels werd benut bloedvaten in de PDL markeren. Specifiek absorptie modus (links) gemarkeerd gemineraliseerde weefsels in het gezichtsveld, terwijl de transmissie mode (rechts) benadrukte de bloedvaten in de PDL ruimte en de endostale ruimtes.
tent "> Aanvullende Figuur 2. Decay van piek reactionaire krachten om een evenwicht toestand voorafgaand aan de CT-scan. Curves geven verschillende verval tarieven van de reactionaire reactie van een vezelige gezamenlijke (bovenste paneel), en een star lichaam (onderste paneel).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen financiële steun NIH / NIDCR R00DE018212 (SPH), NIH/NIDCR-R01DE022032 (SPH), NIH / NIDCR T32 DE07306 (AJ, JDL), NIH / NCRR S10RR026645, (SPH) en departementen van preventieve en herstellende Dental Sciences en orofaciale Wetenschappen, UCSF. Bovendien, de auteurs erkennen Xradia Graduate Fellowship (AJ), Xradia Inc, Pleasanton.
De auteurs danken dr. Kathryn Grandfield, UCSF voor haar hulp met post verwerking van gegevens; Drs. Stephen Weiner en Gili Naveh, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israël, dr. Ron Shahar, de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem, Israël voor hun inzichtelijke discussies die specifiek zijn voor de in situ laden apparaat. De auteurs willen ook graag Biomaterialen en Biotechniek MicroCT Imaging Facility op UCSF bedanken voor het gebruik van Micro XCT en de in situ laden apparaat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bard Parker Blade | BD | MEDC-001054 | |
| AFM metal disk | Ted Pella | 16218 | |
| Polymethyl methacrylate | GC America | N/A | |
| Uni-Etch | Bisco | E5502EBM | |
| Optibond Solo Plus | Kerr Corp | N/A | |
| Filtek Flow | 3M | N/A | |
| Hurculite Ultra | Kerr | 34346 | |
| Tris buffer | Mediatech Inc. | N/A | |
| Articulating paper | Parkell Inc. | ||
| Phosphotungstic Acid | Sigma Aldrich | HT152 |
References
- Popowics, T. E., Rensberger, J. M., Herring, S. W. Enamel microstructure and microstrain in the fracture of human and pig molar cusps. Arch. Oral Biol. 49, 595-605 (2004).
- Jantarat, J., Palamara, J. E., Messer, H. H. An investigation of cuspal deformation and delayed recovery after occlusal loading. J. Dent. 29, 363-370 (2001).
- Jantarat, J., Panitvisai, P., Palamara, J. E., Messer, H. H. Comparison of methods for measuring cuspal deformation in teeth. J. Dent. 29, 75-82 (2001).
- Asundi, A., Kishen, A. A strain gauge and photoelastic analysis of in vivo strain and in vitro stress distribution in human dental supporting structures. Arch. Oral Biol. 45, 543-550 (2000).
- Asundi, A., Kishen, A. Advanced digital photoelastic investigations on the tooth-bone interface. J. Biomed. Opt. 6, 224-230 (2001).
- Wang, R. Z., Weiner, S. Strain-structure relations in human teeth using Moire fringes. J. Biomech. 31, 135-141 (1998).
- Wood, J. D., Wang, R., Weiner, S., Pashley, D. H. Mapping of tooth deformation caused by moisture change using moire interferometry. Dent. Mater. 19, 159-166 (2003).
- Dong-Xu, L., et al. Modulus of elasticity of human periodontal ligament by optical measurement and numerical simulation. Angle Orthod. 81, 229-236 (2011).
- Li, J., Li, H., Fok, A. S., Watts, D. C. Multiple correlations of material parameters of light-cured dental composites. 25, 829-836 (2009).
- Zhang, D., Arola, D. D. Applications of digital image correlation to biological tissues. J. Biomed. Opt. 9, 691-699 (2004).
- Zhang, D., Mao, S., Lu, C., Romberg, E., Arola, D. Dehydration and the dynamic dimensional changes within dentin and and enamel. Dent. Mater. 25, 937-945 (2009).
- Qian, L., Todo, M., Morita, Y., Matsushita, Y., Koyano, K. Deformation analysis of the periodontium considering the viscoelasticity of the periodontal. 25, 1285-1292 (2009).
- Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. , (2012).
- Qian, L., Todo, M., Morita, Y., Matsushita, Y., Koyano, K. Deformation analysis of the periodontium considering the viscoelasticity of the periodontal. 25, 1285-1292 (2009).
- Huelke, D. F., Castelli, W. A. The blood supply of the rat mandible. Anat. Rec. 153, 335-341 (1965).
- Chiba, M., Komatsu, K. Mechanical responses of the periodontal ligament in the transverse section of the rat mandibular incisor at various velocities of loading in vitro. J. Biomech. 26, 561-570 (1993).
- Natali, A. N., et al. A visco-hyperelastic-damage constitutive model for the analysis of the biomechanical response of the periodontal ligament. J. Biomech. Eng. 130, (2008).
- Naveh, G. R., Shahar, R., Brumfeld, V., Weiner, S. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone: A dynamic 3D microCT study of the rat molar. J. Struct. Biol. 177, 477-483 (2012).
- Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. 46, 443-449 (2013).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
- Carrillo, F., et al. Nanoindentation of polydimethylsiloxane elastomers: Effect of crosslinking, work of adhesion, and fluid environment on elastic modulus (vol 20, pg 2820). J. Mater. Res. 21, 535-537 (2006).
- Hiiemae, K. M. Masticatory function in the mammals. J. Dent. Res. 46, 883-893 (1967).
- Hunt, H. R., Rosen, S., Hoppert, C. A. Morphology of molar teeth and occlusion in young rats. J. Dent. Res. 49, 508-514 (1970).
- Komatsu, K., Sanctuary, C., Shibata, T., Shimada, A., Botsis, J. Stress-relaxation and microscopic dynamics of rabbit periodontal ligament. J. Biomech. 40, 634-644 (2007).
- Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. 46, 443-449 (2013).
- Quintarelli, G., Zito, R., Cifonelli, J. A. On phosphotungstic acid staining. I. J. Histochem. Cytochem. 19, 641-647 (1971).
- Quintarelli, G., Cifonelli, J. A., Zito, R. On phosphotungstic acid staining. II. J. Histochem. Cytochem. 19, 648-653 (1971).
- Quintarelli, G., Bellocci, M., Geremia, R. On phosphotungstic acid staining. IV. Selectivity of the staining reaction. J. Histochem. Cytochem. 21, 155-160 (1973).
- Crabtree, W. N., Murphy, W. M. The value of ethanol as a fixative in urinary cytology. Acta Cytol. 24, 452-455 (1980).
