Summary
במחקר זה, השימוש במכשיר טעינת אתרו בשילוב עם טומוגרפיה מיקרו רנטגן שחושב לביומכניקה המשותפת סיבית יידון. קריאות ניסיוניות לזיהוי עם שינוי כולל ביומכניקה המשותפת תכלול: 1) כוח הריאקציוני לעומת עקירה, כלומר עקירת שן בתוך שקע מכתשיים והתגובה ריאקציונרית שלה לטעינה, 2) תלת ממדים (3D) בתצורה וmorphometrics מרחבית, כלומר גיאומטרי מערכת יחסים של השן עם שקע מכתשיים, ו3) שינויים בקריאות 1 ו -2 עקב שינוי בציר טעינה, כלומר המון קונצנטריים או אקסצנטרי.
Abstract
מחקר זה מדגים פרוטוקול בדיקת ביומכניקה רומן. היתרון של פרוטוקול זה כולל את השימוש במכשיר טעינת אתרו מצמידים את מיקרוסקופ רנטגן ברזולוציה גבוהה, ובכך לאפשר הדמיה של אלמנטים מבניים פנימיים תחת עומסים פיסיולוגיים מדומים ותנאים רטובים. דגימות ניסוי תכלול ברצועות עצם חניכיים בשלמות מפרקים סיביים (PDL) שן. תוצאות תמחשנה שלוש תכונות חשובות של הפרוטוקול כפי שהם יכולים להיות מיושמים לביומכניקה של רמת איברים: 1) כוח הריאקציוני לעומת עקירה: עקירת שן בתוך שקע מכתשיים והתגובה ריאקציונרית שלה לטעינה, 2) תלת ממדים (3D) בתצורה המרחבית וmorphometrics: יחסים גיאומטריים של השן עם שקע מכתשיים, ו3) שינויים בקריאות 1 ו -2 עקב שינוי בציר טעינה, כלומר מקונצנטריים לעומסים אקסצנטריים. יעילות של הפרוטוקול המוצע תוערך על ידי צימוד te המכניקריאות עוקץ לmorphometrics 3D וביומכניקה הכוללת של המפרק. בנוסף, טכניקה זו יושמה דגש על הצורך לאזן תנאי ניסוי, המון במיוחד ריאקציוני לפני רכישת tomograms של מפרקים סיביים. יש לציין כי הפרוטוקול המוצע מוגבל לבדיקת דגימות בתנאי vivo לשעבר, וכי השימוש בסוכנים בניגוד לדמיין תגובה מכאנית של רקמות רכות עלולים להוביל למסקנות שגויות על ביומכניקה של רקמות ורמת איברים.
Introduction
מספר שיטות ניסיוניות ימשיכו לשמש כדי לחקור ביומכניקה של מפרקי diarthrodial והסיביים. שיטות ספציפיות לביומכניקה איבר השן לכלול את השימוש של מודד מתח 1-3, שיטות photoelasticity 4, 5, אינטרפרומטריה moire 6, 7, אינטרפרומטריה דפוס רבב האלקטרונית 8, ומתאם דיגיטלי תמונה (DIC) 9-14. במחקר זה, הגישה החדשנית כוללת הדמיה לא פולשנית באמצעות קרני רנטגן על מנת לחשוף את המבנים הפנימיים של מפרק סיבי (רקמות mineralized והממשקים שלהם מורכבות מאזורים רכים יותר, וממשק רקמות כגון רצועות) בעומסים שווי ערך לin vivo תנאים. מכשיר טעינת אתר במצמיד מיקרוסקופ מיקרו-X-Ray יהיה בשימוש. עומס הזמן ועקומות עומס עקירה ייאספו כטוחן של ריבית בחמים-לסת תחתונה עכברוש טרי שנקטפו נטען. מ 'מטרת עין של הגישה שהוצגה במחקר זה היא להדגיש את ההשפעה של מורפולוגיה תלת ממדית של שיניים עצם על ידי השוואת תנאים ב: 1) אין עומס וכאשר היא עמוסה, וכאשר 2) טעונה מעגלית ואקסצנטרית. ביטול הצורך בדגימות לחתוך, ולבצע ניסויים באיברים שלמים שלמים בתנאים רטובים יאפשר שימור מרבי של מדינת מתח 3D. זה מפותח תחום חדש של חקירה בהבנת תהליכים דינמיים של המתחם בתרחישי טעינה שונים.
במחקר זה, השיטות לביומכניקה PDL בדיקות בתוך מפרק סיבי שלם של עכברוש ספראג Dawley, משותפות נחשב כמערכת מודל bioengineering אופטימלית שיפורטו. ניסויים יכללו סימולציה של עומסי לעיסה בתנאי התייבשות על מנת להדגיש שלוש תכונות חשובות של המפרק ככל שהם מתייחסים לביומכניקה של רמת איברים. שלוש נקודות יכללו: 1) כוח הריאקציוני לעומת עקירה:עקירת שן בתוך שקע מכתשיים והתגובה ריאקציונרית שלה לטעינה, 2) () תצורה תלת ממדי 3D במרחב ובmorphometrics: יחסים גיאומטריים של השן עם שקע מכתשיים, ו3) שינויים בקריאות 1 ו -2 עקב שינוי ב ציר טעינה, כלומר מקונצנטריים לעומסים אקסצנטריים. שלוש קריאות הבסיסיות של הטכניקה המוצעת ניתן ליישם כדי לחקור את טבע ההסתגלות של מפרקי חוליות או בשל שינויים בדרישות פונקציונליות, ו / או מחלה. שינויים בקריאות הנ"ל, במיוחד המתאם בין עומסי ריאקציוני עם עקירה, וכתוצאה מכך עיקולים ריאקציוני עומס זמן ועומס תזוזה בשיעורי העמסה שונים יכולים להיות מיושמים על מנת להדגיש סך שינויים במפרק ביומכניקה. יעילות של הפרוטוקול המוצע תוערך על ידי צימוד readouts בדיקות המכני לmorphometrics 3D וביומכניקה הכוללת של המפרק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דיור בבעלי חיים ובהמתת חסד: כל בעלי החיים המשמשים בהפגנה זו שוכנו בתנאי הפתוגן ללא בהתאם להנחיותיה של הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) והמכון הלאומי לבריאות (NIH).
לספק חיות עם אוכל סטנדרטי קשה גלולה חולדה וlib מודעות מים. להרדים בעלי חיים באמצעות שיטת שני שלבים של מחנק פחמן דו חמצני, פתיחת בית החזה בין שתי המדינות בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי של קליפורניה בסן פרנסיסקו, כפי שאושר על ידי IACUC. לבצע בדיקה ביומכנית בתוך 24 שעות של הקרבת בעלי חיים כדי למנוע ניוון רקמות.
1. הכנה וDissection של לסת תחתונה או לסת עליונה עכברוש
- הסר לסתות עכברוש בעדינות על ידי ניתוק קבצים מצורפים רקמה ורקמת שריר קרומיים תוך שמירה על כל הלסת התחתונה, כולל התהליך coronoid ותהליך condylar (איור 1) 15.
- hemimandibles הנפרד ברכבefully חיתוך הרקמה הסיבית של מאחה mandibular עם להב סכין מנתחים.
הערה: התהליכים כלילית וcondylar, וRamus של הלסת התחתונה (איור 1) יש להוציא אם הם פיזי להכשיל בדיקה ביומכנית של טוחנת 2 nd. - חותכים את השיניים החותכות בלי לחשוף את חדר העיסה שלא לעכב את הטעינה של השן הטוחנת.
2. הכנת דגימה באתר טוען דחיסה (איור 2)
- לשתק את הדגימה על בדל פלדה באמצעות חומר שהוא נוקשה באופן משמעותי מהדגימה הניסיונית לפני טעינתה במכשיר טעינת אתרו (איור 2 א).
הערה: polymethylmethacrylate (PMMA) שימש כדי לשתק את הדגימה במחקר זה ועודף, אם בכלל, הוסר באמצעות חוקר שיניים. - יישר את שטח הסגרים של הטוחנות (ים) של עניין במקביל עם דיסק דגימת AFM מתכת באמצעות קצה ישר בשנימטוסים (כלומר mesial-דיסטלי וbuccal לשוני).
- צור שוקת עם מכשיר קהה המקיף את השיניים הטוחנות.
הערה: שטח זה צריך לשמש "חפיר" להכיל נוזל עודף ולשמור על לחות ברקמות במהלך טעינת אתר. - הכן את משטח השן לבנות לטעינה (איור 2) או אקסצנטרי (איור 2C) קונצנטריים באמצעות מרוכבים שיניים. לחרוט את פני השטח של השן של עניין עם 35% ג'ל חומצה זרחתית על פני השטח סגרים ל15 שניות.
- יש לשטוף ביסודיות עם מים etchant deionized ולייבש את המשטח באמצעות מזרק אוויר / מים או מיכל אוויר דחוס. עם חוקר, התפשט טיפת הסוכן המליטה של לcusps הפתוח בשכבה דקה. לרפא מורכב עם ריפוי אור שיניים.
שימו לב: יש לבצע את כל הצעדים כרוכים במרוכבים ללא אור ישיר ממנורה. בתנאים כאלה היינו undesirably להאיץ את תהליך פילמור, וcoulד למנוע מיקום נכון של מרוכבים. תאורה בחדר הוא מקובלת. - הסר סוכן מליטה עודף משיניים סמוכות עם אזמל קנס או סכין גילוח.
- הנח מרוכבים שיניים flowable על פני השטח לאחר הכנת פני השטח ולהפיץ אותו לחריצים של השן הטוחנת (ים) של עניין באמצעות חוקר שיניים.
- לחשוף את מרוכבים לריפוי אור שיניים ל30 שניות.
- עובש הצטברות סגרים של כ 3-4 מ"מ באמצעות מרוכבים שרף שיניים, ממטוס הסגרים של הטוחנות (ים) של עניין וריפוי אור ל30 שניות.
- מנמיך את החלק העליון של ההצטברות מרוכבים למקביל משטח שטוח כדי לאפשר ערכת טעינה עקבית בכל הדגימות באמצעות קצה ישר ויד במהירות גבוהה חתיכה.
הערה: במהלך הבדיקה ביומכנית, יש לאחסן דגימות אחרות בפתרון שנאגרו טריס פוספט (TBS) עם 50 מ"ג / מיליליטר פניצילין, וסטרפטומיצין 15.
3. הסחף התקן טעינה ונוקשות, יכולת חומר נכס ההתמיינות, בטוען באתרו של הג'וינט סיבי
- אבטח את הדגימה עם ההצטברות מרוכבים על הסדן של שלב הטעינה, ומבחן לטעינה אחידה כפי שמוצג באיור 2.
- מניחים נייר לבטא על פני השטח של מרוכבים ואחרי טעינת הדגימה לעומס סופי כדי לבדוק לטעינה קונצנטריים או אקסצנטרית (2B דמויות ו2C).
- הנח Kimwipe הספוג TBS סביב הדגימה כדי להבטיח לחות דגימה. הפוך שוקת סביב הדגימה ולמלא אותו עם TBS כדי לשמור על איבר התייבשות במהלך הדמיה.
- עומס שיא קלט וקצב תזוזה לתוך תוכנת Deben לדחוס הטוחנות לרצוי עומס שיא בקצב תזוזה הבא קיבוע של hemimandible.
הערה: קריאות אופייניות צריכה לכלול עומס ריאקציוני כחומר דחוס לאורך זמן (רגישות מתמר עומס = 0.1N). מעומס זמן ותזוזה בזמן, יש לקבל עקומת עומס עקירה לחומר הדחוס 16-18. שימוש בנתונים שנאספו ממחזורי הטעינה, מאפיינים שונים של המפרק יכולים גם להיות נחושים. הנוקשות של המפרק צריכים להיות מחושבים על ידי לקיחת שיפוע החלק ליניארי (כ 30% האחרונים של נתונים) של שלב ההעמסה של העומס לעומת עקומת עקירת 19.
4. הכתמה של רקמות רכות, PDL, עם Phosphotungstic חומצה (PTA)
הערה: כדי לשפר את ניגוד הנחתה רנטגן, PDL צריך להיות מוכתם בפתרון 5% ועד הורים 20.
- פתרון למילוי ועד הורים צביעה לcarpule זכוכית 1.8 מיליליטר נקי ומניחים carpule נטען לתוך מזרק.
- הזרק פתרון לאט (5 דקות / carpule) לPDL החלל של שיניים סמוכות כדי למנוע נזק מבני לרקמות חניכיים המקיפות את השן הטוחנת של עניין.
הערה: הצעדים הנ"ל צריכים bהדואר חוזר ונשנה עד כ -5 carpules מלא (9 מיליליטר) של תמיסה מוזרקים ואיפשר לזרום לתוך הרקמות הסובבות. יכולות גם להיות טבולים הדגימות הכינו לילה בפתרון שנותר עד ההורים (8 שעות).
5. הגדרות סריקת μ-XCT מומלצות
לבצע מ-XCT עם הגדרות הסריקה הבאות:
| הגדלה אובייקטיבית | 4X, 10X |
| 1,800 תמונות | |
| מתח שפופרת רנטגן | 75 kVp (50 kVp עבור דגימות עד הורים מוכתמים) |
| 8 W | |
| זמן חשיפה | ~ 8-25 שניות * |
| ~ 4 מיקרומטר (אובייקטיבי 4X), ~ 2 מיקרומטר (אובייקטיבי 10X) ** |
* זמן חשיפה יכול להשתנות על בסיס הגיאומטריה והצפיפות אופטית של הדגימה וvo שפופרת רנטגןltage.
** פיקסלים ברזולוציה בפועל תהיה מעט שונה המבוססת על התצורה של המקור, דגימה, וגלאי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הערכה של "רתיעה" מכשיר טעינה, "pushback", נוקשות, ולהיסחף מערכת תחת עומס קבוע
תגובה: בין מנות העמסה ופריקה של מחזור, קיימת הפסקה של 3 שניות שבמהלך הילוכים הפוך בתוך המנוע לפני הפריקה אמיתית מתחילה, כלומר כדגימה מתרחקת מהלסת העליונה (איור 3). תקופה זו מכונות תגובה במערכת, המייצגת את קטע של זמן שבו המערכת מנסה לעבור מסגירה לפתיחה של הלסתות. יש לציין כי כל מחזורי הטעינה יכילו תגובה חריפה דומה ללא קשר לדגימה או תנאי טעינה (איור 4). עומס רגיל לעומת עקומת זמן שהושגה באמצעות גוף נוקשה מוצג ב3A דמויות ו3B המדגיש את הטעינה, פריקה, ואזורי חריפה בשני ליטר שונהOADs של 6 N ו16 נ עומס רגיל לעומת עקומת עקירת הדגשת שלושה המגזרים המקבילים מוצג באיור 3 ג.
Pushback: בעוד כל תקופות התגובה להתרחש בתוך אותה מסגרת 3 שניות זמן, התגובה ריאקציונית וכתוצאה מכך את הצורה של אזור תגובת הנגד יכולה להשתנות בהתאם לדגימה. על ידי בדיקת המערכת באמצעות גוף נוקשה (איור 3), הירידה החדה ביותר והגבוהה ביותר בעומס ריאקציוני נצפתה בהשוואה למתחם עצם PDL השן וpolydimethlysiloxane (PDMS). עם זאת, המשותף הסיבי מאויר ירידה משמעותית בעומס ריאקציוני בשלב חריפה בהשוואה לPDMS. דגימות PDMS (איור 4) נראית לי הטיפה לפחות (אין הבדל בין צפיפויות 1:05 ו1:25 crosslinker - איור 4 א).
AG נוקשות של מכשיר הטעינה בעת שנבדקו: נוקשותגוף ainst הנוקשה היה גבוה באופן משמעותי מזה של הדגימות מורכבות וPDMS. נתונים אלה לאמת את היעילות של מכשיר הטעינה כדי להדגיש את השינויים בביומכניקה של עצם המורכב PDL השן וחומרים רכים יותר (איור 4).
(5A דמויות במפרק סיבי ללא רבב, אבל התייבשות, הנחתה של תכונות רקמות קשות, כוללים עצם מכתשיים, cementum, אמייל, ודנטין היו מודגשות: חזותי מבני רקמות רכים וקשים במתחם עצם PDL השן בשלמותה באמצעות μ-XCT ו5 ב). עם זאת, רווחים שהכילו רקמות אורגניות בעיקר רכות יותר היו שקופים לקרן רנטגן, ומשאירים את PDL החלל יחסית "ריק" (שחור). דגימות שטופלו עם ועד ההורים הראו ניגוד מוגבר בתוך PDL החלל, ובכך מדגישים נציג תכונות של PDL ורקמות חניכיים (איורים 5 ג-F). סריקה בmagnific גבוה יותרation חשף PDL כרשת סיבית בין השן והעצם.
כוח הריאקציוני לעומת עקירה: תגובת יומכנית של המפרק הסיבי במהלך טעינה באתרו: בהשוואה לטעינה קונצנטריים, דפוס העמסה אקסצנטרי על דגימה דומה הראה תזוזה מוגברת של השן בתוך המפרק לניתן עומס ריאקציוני (איור 6 א). עם זאת, למפרקים סיביים מטופלים עם ועד הורים לא נמצאה הבדלים משמעותיים ביומכניקה הכוללת נצפו ללא קשר למצב הטעינה (איור 6). במערכת שלא טופלה, אך אקסצנטרי טעונה, התזוזה המוגברת של השורש לתוך שקע מכתשיים יכולה להיות מתואמת לקשיחות נמוכה יותר כפי שניתן לראות בעקומות עומס עקירה (איור 6 ג). אמנם יכולים להיות שיש שונות טבעיות שמובילות למגוון של תגובות ביומכנית של מפרקים סיביים שנקטפו בתוך קבוצות שליטה, שטופלו עד ההורים סיבייםמפרקים הפגינו קשיחות מוגברת ועקורים פחות בתוך השקע בהשוואה לעמיתיהם שלא טופלו לניתן עומס שיא ריאקציונר. עם זאת, לא חל שינוי לזיהוי בצורה או משך זמן של השלב חריפה של מחזור העומס בין דגימות שטופלו שלא טופלו ועד הורים.
תצורה מרחבית תלת ממדים וmorphometrics: מיפוי תצורת עצם השן בתנאים שנטענו באמצעות μ-XCT: פרוסות וירטואליות נלקחו מtomograms הושוו כדי להמחיש 1 תזוזת שיניים) בתוך השקע, 2) עמותת שיניים עצם הן ב2D and 3D , 3) בשל אקסצנטרי היקף התנועה בהשוואה לטעינה קונצנטריים. תזוזת שיניים הייתה מסומנת על ידי חפיפה של פרוסות וירטואליות דומות ללא עומס ובסרטי gif עומס ומניבה. בעוד שתי תוכניות הטעינה גרמו לשן לעקור אנכית בתוך המפרק, תצורת העמסה אקסצנטרית (7 ב דמויות ו7C) ג aused אפקט סיבוב נוסף של השן עם השורשים מסתובבים distally וכתוצאה מכך שטח PDL ירד לאורך הצדדים הדיסטלי של השורשים בהשוואה לסריקות קונצנטריים טעינה (איורים 7 ו -8). למרות PDL מוכתם ועד ההורים היה יותר ניחות (איור 5), התנועה של השן בתוך שקע מכתשיים במפרקים ועד ההורים שטופלו הייתה פחות מובהק ומתואם עם הנתונים ביומכנית (6B דמויות ו6C).
איור 1. 15 המחשה מותאמת של מקומות מרכזיים בעת הכנת hemimandible לבדיקה ביומכנית. מוצגת בתוך הבלעה היא hemimandible.
together.within-page = "תמיד"> 
איור 2. תצורה במערכת μ-XCT יחידה וטעינת אתר. () תמונה של מכשיר בטעינת אתר על בעל מותאם אישית בתוך טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו רנטגן היחידה (μ-XCT). קונצנטריות (ב ') ותנאי העמסה (C) אקסצנטריים שנקבעו על ידי הסוג של מגע בין הסדן והמשטח מרוכבים באים לידי ביטוי בצורה של שרטוטים, ומערכי הניסוי המתאימים (באזור מתאים לזה מודגש על ידי התיבה הלבנה ב( ) בהתאמה. מרקס מניסוח נייר לאשר שטח מגע ראשוני בין הסדן ומרוכבים שיניים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. </>
איור 3. עקומת נציג עומס פעמית הממחיש מערכת "תגובה חריפה". טען לעומת זמן באמצעות גוף נוקשה ממחיש תקופה חריפה כאירוע בין הסגירה ופתיחה של הסדנים. האזור הירוק מציין תקופה טעינה בי סדנים מתקרבים (אזור ירוק) כדי לטעון את גוף נוקשה 15 N (א) ו 5 N (B, הבלעה). האזור הכחול מציין תקופה פריקה בי הסדנים הם חוזרים בה אחד מהשני. עם זאת, בשל חוסר התגובה מוטורית מיידית בשל זמן שלקח להיפוך הילוך, יש שקרים תקופה ריסים אחורי של ~ 3 שניות. במהלך תקופה זו העומס יורד כ -2 N לפני פריקה אמיתית מתרחשת. יכולים להיות קשורים אירועים פריקה וטעינה לטעינה לעומת גרף עקירהs (C) אשר מציג תזוזה מינימאלית במהלך התקופה חריפה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. עקומות עומס העקירה נציג והשפעה "pushback" באמצעות PDMS עקומות תחתונים:. יחסי משא בזמן בין PDMS של ירידת מונומר ליחסי crosslinker לחשוף את היכולת של ביחידת טעינת אתרו כדי לזהות הבדלים בתכונות חומר. עקומות למעלה, שמאל וימין ממחישות את השינוי בתגובת נגד של המערכת עקב התאוששות מהותית. השמאל וימין בהשוואה להמחיש את אותו האפקט, מה שמצביעים על כך שהתאוששות הבדל 1:25-01:05 PDMS הוא מזערי או שאינו בתוךמגבלות זיהוי של מכשיר הטעינה. ב ') עקומות עומס עקירה לחומרים שונים, כולל אלומיניום נוקשה גוף, דגימה ניסיונית, ו3 דגימות PDMS. זהו המדרון של 30% החלק ליניארי של עקומת ההעמסה ששימשה לחישוב קשיחות של החומר. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 5. סעיפי רנטגן וירטואליים של טוחנות השניה mandibular המוכתם לשיפור מבנה PDL. (A, B) ערכים בקנה מידה אפורה בתוך טוחנות מטופל מצביעים על הנחתה רנטגן של רקמות שונות, כולל אזורים רכים יותר בתוך המתחם. עם זאת, רקמות nonmineralized כגון PDL לא מודגשות בשל מ 'שלהinimal הפחתת מאפיינים של אנרגיית קרני ה-X ב75 kVp. (CF) ועד הורים בעקבות מכתימים את מאפייני הפחתה של PDL הרך יותר היו משופרים ופרטים בתוך PDL היו דמיינו באמצעות מיקרוסקופ רנטגן. לפיכך, (הגדלה D-4X, הגדלת ה-F-10X) סעיפי sagittal 2D הווירטואלי (הגדלה C-4X, הגדלה E-10X) ורוחביים גילו נטייה PDL סיבים (חיצים צהובים). לומן של כלי דם בתוך חללי endosteal (חצים כתומים) וPDL (חצים לבנים) יופיע מבנים עגולים כהים, ואילו שטח pulpal נותר ללא רבב. חפצים שנוצרו במהלך ההליך מכתים גם ציינו (ד ', כוכביות אדומות). לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
עבור: src = /> "/ files/ftp_upload/51147/51147fig6highres.jpg" = "/ files/ftp_upload/51147/51147fig6.jpg" src
איור 6. דגימות טעונות מעגלי ואקסצנטרי. למעלה () ופנלים תחתון (B) להמחיש סרטי זמן מהירים של מערכת יחסים של שן עצם ללא עומס וכאשר היא עמוסה ל15 N, מעגלי ואקסצנטרי בהתאמה. פנלים העליונים ותחתונים ממחישים עמותת עצם שן כאשר תנאים שלא טופלו () ומוכתמים (ב '). פנל מרכז (C) ממחיש התנהגויות עומס עקירה שונות בין אקסצנטרי ומעגלי (עקומות שמאליות) קומפלקסים טעונים, ו( עקומות ימין) מוכתמים ובלא כתם מתחמים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
"Src =" 147/51147fig7highres.jpg / files/ftp_upload/51147/51147fig7.jpg "/>
סעיף איור 7. sagittal של 2 nd טוחנת ממחיש את הקשר של השן עם שקע מכתשיים כאשר היא עמוסה מעגלית () ואקסצנטרית (ב '). רוב הדחיסה נתפס בתוך interradicular (ראשי חץ) ופסגה (חיצים) אזורים. בהשוואה לחלקים וירטואליים של השן בהעמסה אקסצנטרית (ב '), המרכיב סיבובי נוסף של הגורמים בתנועת השן גדל דחיסה לצד הדיסטלי של שורש mesial. סעיפים רוחביים מעולפים חשפו תרגום דיסטלי ותנועה סיבובית עם כיוון השעון של השן (שורשים ירוקים) ביחס לשיניים טעונות מעגלי (אפורות). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 8. סרטים המשוחזרים 3D לחשוף PDL חלל ירד בצד הדיסטלי של השורש כאשר אקסצנטרי טעון (E) בהשוואה למורכב (ד ') עמוס מעגלי. לחץ כאן כדי לראות את ההעמסה האקסצנטרית ולחץ כאן כדי להציג טעינה קונצנטריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלב הראשון בהקמת פרוטוקול זה מעורב הערכת הנוקשות של מסגרת הטעינה באמצעות גוף נוקשה. בהתבסס על התוצאות, הנוקשות היו גבוהות באופן משמעותי המאפשרות שימוש במכשיר הטעינה לבדיקה נוספת של דגימות עם ערכי קשיחות נמוכים באופן משמעותי. הצעד השני הדגיש את היכולת של המכשיר להבחין ערכי קשיחות שונים על ידי שימוש בשני שלבים של עקומת העמסה הפריקה שנוצרו על ידי שימוש בגוף נוקשה, חומרי PDMS של צפיפויות Crosslink שונות, ומפרקים סיביים. נוקשות מהשלב ההעמסה pushback במהלך השלב חריפה שימשו כדי לזהות את ההתנגדות של החומר להעמסה והתאוששות של החומר הבא פריקה (איורים 3 ו -4). הצעדים שלישיים והרביעי של הפרוטוקול היו לתאם את השינויים בעקומות עומס עקירה המתקבלות ממכשיר הטעינה בהדמיה באתר נעשתה עם tהוא משתמש בקרן רנטגן (איור 5). זה מעורב טעינת המפרקים וקבלת tomograms ללא עומס ועומס, בתנאים קונצנטריים ואקסצנטריים בהתאמה. הפרוטוקול הראה שעל ידי שינוי הבדלי ציר הטעינה ברמות של PDL-דחיסה יכולה להיות מודגש (איורים 6 ו -7). בדיון זה ידגיש ראשון תכונות מכשיר ואתגרים שצריכים להיות מובן כראוי ונפגשו לפני הבדיקה ביומכנית של מתחם עצם PDL-השן.
אתגרים של התקנה ניסיונית
הצטברות Composite: בעוד הפרוטוקול עצמו הוא פשוט יחסית, יש כמה צעדים שצריכים לעשות בזהירות רבה. אחד האתגרים הגדולים ביותר היה להבטיח כי חומר מרוכב עודף לא עשה בגלישה לשיניים סמוכות, אשר היו אז באופן מכאני לקשר שיניים מרובות ולסלף המשותף mechanics של שן אחת. מאז מיומנות משמעותית ידנית וידע של כלים שיניים הוכיחו להיות שימושי לצורך הליך זה, הכנת דגימות לטעינה בוצעה בעיקר על ידי סטודנטים ורופאי שיניים שיניים בסיוע הגדלה אופטית.
ערכת טעינה עקבית: עוד פרט חשוב לבדיקה ביומכנית הייתה להבטיח ערכת טעינה עקבית. שטח המגע בין הלסת של מכשיר טעינת אתר ובשטח מנוגדים של מרוכבים הוכיח להיות מאוד קריטי לניסוי. זאת, משום שמכניקה של המפרק הסיבי יכולה להשתנות כתוצאה מאזור המגע, שהיה מדומה במחקר זה על ידי שימוש בעומסים קונצנטריים ואקסצנטריים (לא מאוזנים). התרחיש שהוצג במחקר זה מחקה שינויים אפשריים בחסימה של שיניים של יונקים, אשר יכולה לגרום לשינוי בתנועת שן בתוך שקע מכתשיים (איור 5). בזמן שהוא הבין thaלא את מנגנון הבדיקות המוצע אינו לחקות מחזור לעיסה פיסיולוגי, הוא מציג את עצמו כשיטת בדיקה סטנדרטית. על ידי יצירת הצטברות מורכבת עם מקביל פני השטח ללסת של שלב ההעמסה, שהיינו מסוגל לייצר דפוס טעינה עקבי. שיטת בדיקה סטנדרטית זה יכול לשמש כדי לזהות שינויים בביומכניקה של מתחמי עצם PDL שן מקבוצות ניסוי שונות.
רגישות של מכשיר טעינת אתר ב: פרוטוקול הניסוי מתאר שיטות לאימות זיהוי גבולות של מכשיר בטעינת אתרו באמצעות שלוש דגימות שונות, מתוכם שניים יכולים להיחשב כחומרים סטנדרטיים. הנוקשות של מסגרת הטעינה כאשר נבדקו עם אלומיניום היו גבוהות יותר באופן משמעותי עם תרומה זניחה להתנהגות שנצפתה מכאנית של דגימות PDMS שונות, והתגובה ביומכנית של מפרק סיבי. בעוד שכל הדגימות שנבדקו היו תקופה חריפה של~ 3 שניות, בדמותם של חלק התגובה מעט שונה (איור 4 א) עם הסוג של דגימה. דגימות נוקשה הציגו ירידה חדה בעומס ריאקציוני (3A דמויות ו4A) ואילו דגימות רכות לא הציגו ירידה חדה (איור 4 א). אפשר לטעון שההבדל בהתנהגות תגובה מיוחס ליכולת של הדגימה לדחוף בחזרה על ההילוכים במהלך היפוך הילוך. אפקט הדחיפה לאחור על ההילוכים יכול להתבטא בירידה נמוכה יותר בתגובה ריאקציונית השיא של החומר כלסת מתחילה להתרחק מהדגימה. לפיכך, מגזר התגובה יכול להיות מנוצל כדי לקבל תובנות ברכוש חומרי. ערכי קשיחות של PDMS מחושב מעקומות עקירת עומס היו בהסכם עם ספרות ערכי 22, והמגוון של קשיחות לPDMS crosslinked היה בטווח של מתחם עצם PDL-השן. לפיכך, בד טעינת אתרevice הוא מתאים למדידת התזוזה ותגובה ריאקציונרית של השן כפי שהוא דחוס לתוך שקע מכתשיים. התגובה ריאקציונרית יכולה להיות ממרכיבים רכים יותר ו / או קשים יותר. הדומיננטי של המרכיב הרך על פני קשה יותר יכול להיות מזוהה על ידי טעינה באופן הדרגתי והדמיה, ואחריו באופן דיגיטלי correlating ללא עומס לתנאים טעונים לזהות אזורים הנשלט על מתח בתוך מתחם עצם PDL השן 13.
רכיב עיקרי של לעיסה הוא בכיוון הצירי: בדומה לבני אדם, מחזור הלעיסה של חולדות לערב את התנועה החופשית של הלסת התחתונה ללעוס מזון 23, 24. בעוד תנועה זו מופתה לכוללת כיוונים רבים ושונים כגון תנועות לרוחב, הוא חשב המרכיב העיקרי של עומס להיות בכיוון הצירי 23. לכן, מדומה בהמון אתרם בכיוון צירי הונחו גם concentrically או אקסצנטרי (איור 2).
גורמים ניסיוניים שיכול להשפיע על תוצאות הקשורות לביומכניקה של רמת איברים: היתרון של צימוד מיקרוסקופיה X-ray עם בטעינת אתר הוא שעקומת עומס עקירה יכולה להיות מתואמת לעמותת מרחבי של השן עם שקע מכתשיים, צורה של השורש ועל פני השטח מכתשיים, והצמצום והרחבת PDL החלל תחת עומס. המתאם וההערכה משלימה מספק גישה הוליסטית כדי לקבוע ביומכניקה איברים. בעבר, זה היה רק הניח שהמכניקה של איברים ו / או רקמות יכולה להנחות את התנהגות עומס עקירה. פרוטוקול זה מאויר כי הקשר של החברים נעו כאשר תחת עומס גם יכול להיות מאפיין מגדיר של נוקשות נצפות. הוא חשב כל שינויים שנצפו בתוך 5-8 N הראשון שנתרמו על ידי האיכות של PDL שינוי קונפורמציה ראשוני בתוךקולגן והחלפת נוזל ביניים עם התנגדות מינימאלית כדי לטעון; אזור זה כבר המכונה האזור "uncrimping" 26. עומסים גבוהים יותר מאשר 7 N יכולים להיות שנתרמו על ידי שיניים, עצמות, השפעות התקשות הזן של רצועת החניכיים, וממשקי חיבור הרקמות. ברגע שPDL החלל ממוזער וכPDL עובר התקשות מתח, אינטראקציות רקמות קשות בין השן והשקע גרמי להתעורר באזור interradicular וכתוצאה מכך עומס תלול יותר לעקירת מדרון. בנוסף להתאוששות מהותית, את התגובה של מכשיר הטעינה ניתן לנצל כדי לחקור את טבע viscoelastic של PDL מבלי לשנות המשותף כפי שנעשה במחקרים אחרים 16, 25.
האזורים הכלליים בתוך עקומות עקירת העומס לתאם לכמה אירועים בתוך המפרק. האירועים הנ"ל הם המכנה המשותף בין שתי תוכניות הטעינה. עם זאת, ההבדליםבין פרופילי עומס עקירה קונצנטריים ואקסצנטריים וtomograms המקביל הדגיש את ההשפעה של כיוון עומס על ביומכניקה האיבר הכללית. המקור העיקרי להבדלים אלה היה המבוא של סיבוב שן כפי שהוא מחליף בתוך המפרק, וגורם דחיסה של חללי PDL בתחומים ספציפיים. מובן כי עומסים פיסיולוגיים נורמלים מוחלים על השן בכמה כיוונים, כולל אלה שמציגים את תזוזת שיני סיבוב. עם זאת, מומלץ שערכת טעינה קונצנטריים לשמש כערכת טעינה סטנדרטית בשל הקושי של החלת עומס אקסצנטרי "רגיל" על פני כל הדגימות. כפרוטוקול ניסוי כגון זה יכול לשמש כדי להבחין בהבדלים ביומכנית בין מערכות מותאמות וnonadapted.
אחד החסרונות של שימוש בקרן רנטגן באנרגיה גבוהה יותר הוא שהם נספגים באופן מינימאלי על ידי רקמות רכות והופקו ניגוד לקוי. PDL הוא transpareNT לצילומי רנטגן וכתוצאה מכך מחייב את השימוש של סוכנים בניגוד. ועד ההורים משפר את הניגודים של רקמות רכות ישירות על ידי מכתים 27-29 ומאפשר להדמיה באמצעות קרני רנטגן. לפיכך, על ידי שימוש בסוכנים בניגוד, העיוותים נראות לעין בתוך אזורי רקמות רכים מוכתמים בין tomographies נפרק ונטען נצפה; ההגדלה לעומת זאת גבוהה יותר (לפחות 10X) מומלצת לניתוח (מידע לא מוצג). הגבלה של הפרוטוקול מכתים כללה השימוש באתנול, מקבע קל 29 שיכולים היה לשנות את הנוקשות של PDL ומכניקה משותפת כוללת שמובילות למסקנות שגויות.
מסקנות
מחקר זה מדגיש פרוטוקול בדיקה חדשה כדי לנתח את התגובה ביומכנית של מפרק סיבי עצם PDL שן בשלמותה, אבל בתנאי vivo לשעבר. השיטה הניסיונית שתוארה כולל הודעה ניתוחים של הנתונים יכול לשמש כדי למדוד את ההשפעות של experמשתני imental (כלומר מחלה, גורמי גדילה, גיל, ומולקולות טיפוליות) על המכניקה של המפרק הסיבי עצם PDL-השן. בנוסף, תוצאות מניסויים אלו ישמשו כבסיס למערכות יחסים שבין וריאציות ברמת האיבר macroscale יכולות להיות קשורות לשינויים ספציפיים ברמות הרקמות ותאים. מגבלות של הפרוטוקול כוללות, הדמיה בתנאי vivo לשעבר, שימוש בסוכנים בניגוד, והפסד בדיוק מרחבי בין המשטחים של השן ושקע מכתשיים בשל רגיעה רקמות במהלך פעמים רכישה עוד צורך לדור tomogram.
השלמות
פרוטוקול לבדיקת Biomechanical של טוחנות בתוך maxillae:
1. אם maxillae היו להיבדק, להסיר את הלסת העליונה מגולגולת עכברוש עם היבט הגחון (גג של הפה) פונה כלפי מעלה. לנתק את השריר ורקמות חיבור ברצועות מההיבט לרוחב של הגולגולת על ידי חיתוך דרך הפרוזדור (כיס בין החניכיים והלחי).
2. למשש ולשבר את התהליך הזיגומטית של עצם הלסת של הגולגולת ולנתק את קשת הזיגומטית מעצם הלסת.
3. חותכים את הגולגולת ישר למטה עם זוג מספריים לנתיחה בתפזורת דרך המוח החל מהחיך הרך. לבודד את ההיבט הקדמי של הגולגולת ולקלף את עור הקרקפת מהיבט הגב (העליון) של הגולגולת.
4. עם מספריים לנתיחה בסדר, להפריד את הזכות וhemimaxillae השאיר על ידי ביצוע חתך העוקב קו ישר דרך מרכז החיך הקשה ולאזור interproximal בין השיניים החותכות. ודא שהעומק של החתך הוא רדוד - רק עמוק מספיק כדי לנקב את החיך הקשה.
5. לבודד את hemimaxillae על ידי ביצוע בניצב (על הציר של הגולגולת הארוך) חתכיםקדמי לטוחנת הראשונה והאחורי לטוחנת השלישית. 1) לא לחתוך קרוב מדי לטוחנות הראשונות ושלישית לכך עשוי לשבש את מבנה שורש; 2) אל לקרוע את רקמת החניכיים המקיפה את כל שלוש שיניים טוחנות. הפרד את hemimaxillae מהגולגולת על ידי חיתוך עצם הלסת הדק עדיף על כל hemimaxilla. הסר את כל רסיסי רקמה גרמיים ועודפים.
אימות של מכשיר הבדיקה המכני:
על מנת לקבוע את הנוקשות של מסגרת הטעינה והסחיפה של מתמרי עומס / עקירה, שימוש בגוף קשיח כגון אלומיניום עם מודולוס אלסטיות על ידי גבוה בהרבה מזה של הדגימה הניסיונית.
כדי לקבוע אם המכשיר הוא מסוגל להבדיל נציג ערכי קשיחות שונים של אלמנטים רכים יותר, לפברק לוקי PDMS עם צפיפות crosslink שונה (1:5, 1:10, 1:25 crosslinker לבסיס לפי משקל) ולטעון את אלה תוך שימוש באותהבמכשיר טעינת אתר.
מצב ניגודיות שלב להגברת הניגודיות של אלמנטים רכים יותר: שיפור לעומת של PDL ניתן לעשות זאת על ידי ניצול מצב ניגוד השלב של הסורק. ביסודו, בניגוד השלב מנצל יכולות זיהוי סורק של שינוי בשלב בקצוות של רקמות, ומספק פירוט מבני משופר. כתוצאה מכך, במחקר זה, לקונות של cementocyte-קונות וקונות osteocyte-הופיעו כporosities בתוך רקמות mineralized בהתאמה. מבנים אלה מבלי שיבחינו בעבר בסריקה סטנדרטית תחת מצב קליטה. Tomograms רכש תחת מצב שידור אפשר להדמיה של מבנים בתוך השטח השלילי, כלומר PDL-המרחב ומרחבי endosteal כוללים מערכת התעלה Haversian (עבור מודל 3D ראה איור S1). מבנים נוספים במסגרת PDL החלל עשויים להיות דמיינו כמו גם, כגון כלי דם שהוא רציף עם i כיעצם n.
המון equilibrated לרכישת tomogram ולהיסחף מערכת:. סעיף זה יכול להיות מוסבר על ידי המיטב המתייחס לתוספת האיור 2 איור S2A ממחיש את הצורך לאזן עומסי שיא לפני רכישת tomograms. עומסי שיא תמיד ריקבון לגודל נמוך והמערכת צריכה להיות equilibrated לפחות לשעה לפני tomogram 6-8 שעה הוא רכשה. יש לציין כי tomogram הנרכש אינו נציג של עמותת עצם השן בעומס השיא, אבל בעומס 2-3 N נמוך מעומס השיא. בנוסף, להיסחף המערכת נמדד זוהה באמצעות בדל אלומיניום נוקשה נמצא להשתנות עם קצב תזוזה ו / או עומסי שיא (איור S2B וS2C). ערכים להיסחף מקורבים נעו בין 1 + N / שעה.
בעקבות בדיקות מכאניות, tomogram של המפרק הסיבי נלקח ללא עומס, ושיא עומס בקצב תזוזה רצוי. לפני רכישת tomogram בתנאים טעונים, יש להיזהר כדי לאפשר למערכת להגיע לשיווי משקל הבא (יציבות) אשר סריקה צריכה להמשיך. תנאים דומים חזרו על עצמם למתחמים מוכתמים אקסצנטרית טעונים ועד הורים. מtomograms, פרוסות וירטואליות הושוו ללא עומס לתנאים טעונים על מנת לזהות עמותת שיניים עצם הן בשניים ושלושה ממדים.
איור משלימה 1. שחזור 3D של שטח שלילי באמצעות מיקרוסקופ רנטגן המשופר לעומת שלב. תחת שיפור במצב לעומת שלב פאזה המתרחשת בשולי רקמות נוצלה כדי להדגיש את כלי דם בתוך PDL. באופן ספציפי למצב קליטה (משמאל) הדגיש רקמות mineralized בתוך שדה הראייה, ואילו מצב הולכה (מימין) הדגיש את כלי הדם בתוך המרחב PDL, כמו גם חללי endosteal.
אוהל "> איור משלים 2. ריקבון של כוחות הריאקציוניים שיא למצב שיווי משקל לפני CT-סריקה. עקומות מצביעות על שיעורי ריקבון שונים של תגובה ריאקציונרית של מפרק סיבי (פנל עליון), וגוף קשיח (פנל תחתון).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים תמיכה במימון NIH / NIDCR R00DE018212 (SPH), NIH/NIDCR-R01DE022032 (SPH), NIH / NIDCR T32 DE07306 (AJ, הליגה להגנה יהודית), NIH / NCRR S10RR026645, (SPH) ומחלקות למדעי שיניים מונעים ומאחים ו Orofacial מדעים, קליפורניה בסן פרנסיסקו. בנוסף, המחברים מודים Xradia בוגר מלגה (AJ), Xradia Inc, Pleasanton, קליפורניה.
המחברים מודים לד"ר קתרין Grandfield, קליפורניה בסן פרנסיסקו על הסיוע שבלאחר עיבוד של נתונים; בני הזוג. סטיבן ויינר וגילי נוה, מכון ויצמן למדע, רחובות, ישראל, ד"ר רון שחר, אוניברסיטת עברית בירושלים לדיונים המעמיקים ספציפיים להתקן טעינת אתר ב. המחברים גם רוצים להודות לBiomaterials ומתקן Bioengineering microCT הדמיה בקליפורניה בסן פרנסיסקו לשימוש במייקרו XCT והתקן טעינת אתר ב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bard Parker Blade | BD | MEDC-001054 | |
| AFM metal disk | Ted Pella | 16218 | |
| Polymethyl methacrylate | GC America | N/A | |
| Uni-Etch | Bisco | E5502EBM | |
| Optibond Solo Plus | Kerr Corp | N/A | |
| Filtek Flow | 3M | N/A | |
| Hurculite Ultra | Kerr | 34346 | |
| Tris buffer | Mediatech Inc. | N/A | |
| Articulating paper | Parkell Inc. | ||
| Phosphotungstic Acid | Sigma Aldrich | HT152 |
References
- Popowics, T. E., Rensberger, J. M., Herring, S. W. Enamel microstructure and microstrain in the fracture of human and pig molar cusps. Arch. Oral Biol. 49, 595-605 (2004).
- Jantarat, J., Palamara, J. E., Messer, H. H. An investigation of cuspal deformation and delayed recovery after occlusal loading. J. Dent. 29, 363-370 (2001).
- Jantarat, J., Panitvisai, P., Palamara, J. E., Messer, H. H. Comparison of methods for measuring cuspal deformation in teeth. J. Dent. 29, 75-82 (2001).
- Asundi, A., Kishen, A. A strain gauge and photoelastic analysis of in vivo strain and in vitro stress distribution in human dental supporting structures. Arch. Oral Biol. 45, 543-550 (2000).
- Asundi, A., Kishen, A. Advanced digital photoelastic investigations on the tooth-bone interface. J. Biomed. Opt. 6, 224-230 (2001).
- Wang, R. Z., Weiner, S. Strain-structure relations in human teeth using Moire fringes. J. Biomech. 31, 135-141 (1998).
- Wood, J. D., Wang, R., Weiner, S., Pashley, D. H. Mapping of tooth deformation caused by moisture change using moire interferometry. Dent. Mater. 19, 159-166 (2003).
- Dong-Xu, L., et al. Modulus of elasticity of human periodontal ligament by optical measurement and numerical simulation. Angle Orthod. 81, 229-236 (2011).
- Li, J., Li, H., Fok, A. S., Watts, D. C. Multiple correlations of material parameters of light-cured dental composites. 25, 829-836 (2009).
- Zhang, D., Arola, D. D. Applications of digital image correlation to biological tissues. J. Biomed. Opt. 9, 691-699 (2004).
- Zhang, D., Mao, S., Lu, C., Romberg, E., Arola, D. Dehydration and the dynamic dimensional changes within dentin and and enamel. Dent. Mater. 25, 937-945 (2009).
- Qian, L., Todo, M., Morita, Y., Matsushita, Y., Koyano, K. Deformation analysis of the periodontium considering the viscoelasticity of the periodontal. 25, 1285-1292 (2009).
- Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. , (2012).
- Qian, L., Todo, M., Morita, Y., Matsushita, Y., Koyano, K. Deformation analysis of the periodontium considering the viscoelasticity of the periodontal. 25, 1285-1292 (2009).
- Huelke, D. F., Castelli, W. A. The blood supply of the rat mandible. Anat. Rec. 153, 335-341 (1965).
- Chiba, M., Komatsu, K. Mechanical responses of the periodontal ligament in the transverse section of the rat mandibular incisor at various velocities of loading in vitro. J. Biomech. 26, 561-570 (1993).
- Natali, A. N., et al. A visco-hyperelastic-damage constitutive model for the analysis of the biomechanical response of the periodontal ligament. J. Biomech. Eng. 130, (2008).
- Naveh, G. R., Shahar, R., Brumfeld, V., Weiner, S. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone: A dynamic 3D microCT study of the rat molar. J. Struct. Biol. 177, 477-483 (2012).
- Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. 46, 443-449 (2013).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
- Carrillo, F., et al. Nanoindentation of polydimethylsiloxane elastomers: Effect of crosslinking, work of adhesion, and fluid environment on elastic modulus (vol 20, pg 2820). J. Mater. Res. 21, 535-537 (2006).
- Hiiemae, K. M. Masticatory function in the mammals. J. Dent. Res. 46, 883-893 (1967).
- Hunt, H. R., Rosen, S., Hoppert, C. A. Morphology of molar teeth and occlusion in young rats. J. Dent. Res. 49, 508-514 (1970).
- Komatsu, K., Sanctuary, C., Shibata, T., Shimada, A., Botsis, J. Stress-relaxation and microscopic dynamics of rabbit periodontal ligament. J. Biomech. 40, 634-644 (2007).
- Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. 46, 443-449 (2013).
- Quintarelli, G., Zito, R., Cifonelli, J. A. On phosphotungstic acid staining. I. J. Histochem. Cytochem. 19, 641-647 (1971).
- Quintarelli, G., Cifonelli, J. A., Zito, R. On phosphotungstic acid staining. II. J. Histochem. Cytochem. 19, 648-653 (1971).
- Quintarelli, G., Bellocci, M., Geremia, R. On phosphotungstic acid staining. IV. Selectivity of the staining reaction. J. Histochem. Cytochem. 21, 155-160 (1973).
- Crabtree, W. N., Murphy, W. M. The value of ethanol as a fixative in urinary cytology. Acta Cytol. 24, 452-455 (1980).
