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Biology

分段微管的制备研究运动驱动的微管拆解完

Published: March 15, 2014 doi: 10.3791/51150
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 2Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow, Russia, 3Physiology Department, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

微管本质上是不稳定的聚合物，以及生长和缩短之间的切换是随机的并且难以控制。在这里，我们将介绍使用分段微管与photoablatable稳定上限协议。分割的微管的解聚可以以高的时间和空间分辨率被触发，从而协助运动与拆卸的微管末端的分析。

Abstract

微管解聚能提供力输送不同的蛋白质复合物和蛋白包被的磁珠体外 。基本的机制被认为在细胞分裂过程中微管相关的染色体运动起到了至关重要的作用，但相关的蛋白质和它们的确切角色不明确。因此，人们越来越需要开发实验与用纯化的元件和限定的生化环境研究这些蠕动体外 。微管，但是，本质上是不稳定的聚合物;生长及缩短之间的切换是随机的并且难以控制。我们在这里描述的协议采取的均采用photoablatable稳定上限分段微管的优点。这样分割的微管的解聚可以以高的时间和空间分辨率被触发，从而协助蠕动的研究在拆卸微管末端。这种技术可用于约RRY出分子中的荧光标记的蛋白复合物，processively动态微管端部的移动的数量的定量分析。优化一个信号 - 噪声比在这个和其他定量荧光测定法，盖玻片应该被处理以减少水溶性荧光标记蛋白的非特异性吸收。所提供的详细方案考虑到荧光灯照明的不均匀性，并确定使用等距离高斯拟合单个荧光的强度。最后，我们描述了使用分段的微管来研究蛋白质包被的微珠的微管依赖性的运动，提供了见解不同的电机和非机动蛋白偶联的微管解聚到的processive货物运动的能力。

Introduction

微管是高度保守的细胞骨架结构，是对细胞结构，细胞运动，细胞分裂，和胞内运输1重要。这些动态的聚合物从微管蛋白组装在GTP存在下，和它们的开关自发生长，缩短2之间。微管是非常薄的（在直径只有25纳米），因此特殊的光学技术来提高对比度，应使用以观察微管，用光学显微镜。利用微分干涉对比（DIC）3以前的工作与这些聚合物研究它们的动态特性。这和类似的研究在体外发现，典型的实验条件下，微管发生灾难并切换到解聚很少，连用5-15分钟（这个频率是7-15毫米微管蛋白的可溶性检测浓度在28-32°C ）4。不同的技术因而被提出来电感ê微管解聚以受控的方式。微管的缩短可以洗去可溶性微管5,6，切割微管的激光束7，或者使用分段微管8，如这里描述的触发。使用分段的微管，以及随机切换聚合物以前的工作，已经发现，小的细胞内货物，如染色体，囊泡，和蛋白包被的磁珠，可以在缩短微管9-13的端部移动。这种现象被认为是有直接的含义在有丝分裂细胞的染色体运动，以及相关的机制目前正在积极调查14-16。

最近，基于荧光的技术，包括全内反射荧光（TIRF）显微镜，已被用来研究运动 ​​与动态微管端部17-24。这种方法的优点在于，它允许检查相互作用的微管与微管结合蛋白在实时使用标记有不同的荧光基团的蛋白质之间的第几种蛋白质复合物发现与伸长和/或缩短微管两端processively移动。它们包括微管相关蛋白DAM1 10,12,18，SKA1 19，和XMAP215 20，以及驱动蛋白马达KIF18A 21,22，MCAK 23和CENP-E 24。这些蛋白质表现的processive尖端跟踪，这是从经典的尖端跟踪蛋白质如EB1 25的根本不同。虽然EB1分子和相关联的伙伴会保持稳定地与微管 ​​的动态结束时，各个分子仍结合于微管尖只〜0.8秒，与可溶性池26迅速地交换有关。相比之下，的processive尖纤夫一样DAM1，旅游与微管了许多微米​​结束，并与微管尖端的关联可以持续数米任何秒钟。尖端关联的时间，以及所得到的跟踪速度，强烈地依赖于分子的形成尖部-跟踪复杂27的数量。更大的蛋白质合奏通常是更好的尖端跟踪。例如，这种复杂的组件作为分离的酵母着丝粒可以保持连接到微管两端为28小时。一些微管结合蛋白， 例如 NDC80复合动粒蛋白复合物，已发现结束于一个单分子水平到无法跟踪与微管 ​​，但NDC80复合是非常有效的联接器的珠货物19,29-31动议。因此，要理解的尖端跟踪由不同的蛋白质复合物，以及它们的生物学作用的机制，重要的是检查针尖跟踪作为分子在尖端跟踪复杂的数目的函数，以及确定是很重要的这些配合物表现出的货物珠表面上的集体运动的能力。

图1A）。首先，将市售的载玻片被修改附加短的聚乙烯管（方案1）。可重复使用的显微镜流动室，然后从这样一个滑动装配和化学或等离子体清洗和硅烷化的盖玻片（方案2）32-34。所得到的腔室体积只有20-25微升（或小至15微升，见注3在方案1），其中所述入口管的容积。市售的流动室，也可以使用，但它们的体积通常较大，从而导致蛋白质的不必要的浪费。如果一个较大的腔采用，在下面的协议，所有溶液的体积应该按比例缩放。微管的种子然后制备，例如用缓慢水解的GTP类似物，GMPCPP（鸟苷-5'-[（α，β） - methyleno]三磷酸）（协议3，参见海曼<EM>等35）。种子被固定在清洗盖玻片和表面随后被阻断，以防止其它蛋白质的非特异性吸附32（使用洋地黄毒苷协议4描述了种子的固定化）。分段的微管然后可以使用协议5制备。这种方法的主要理由是，动态微管聚合体，在GTP的存在构成，可以暂时通过添加稳定微管蛋白片段，其中包含GMPCPP短“帽子”稳定。这些帽还含有罗丹明标记的微管蛋白，所以它们可以简单地通过照明视场用530-550纳米的激光或汞弧灯（协议6）36被除去。尖端跟踪信号的荧光强度可以被用来估计分子与微管拆卸端行进的数量，同时考虑到在显微镜视场照明（协议7）的不均匀性。类似的方法可以用研究解聚微管蛋白包被的珠之间的相互作用，如在27（协议8）所述的方法制备。某些蛋白质会容易结合到分割的微管的壁，但激光镊子还可以用来保持接近微管壁上的胎圈，从而促进其结合。

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Protocol

所需设备：下面描述的实验需要一个光学显微镜配备的DIC和荧光成像（ 表1）。明场照明的LED可用于显著提高盖玻片-微管附着的种子37，这是难以观察到与常规的卤素灯的检测。以控制液体流动在显微镜室，该溶液应具有能够从10-100微升/分钟的速度流动的蠕动泵进行交换。一种注射器泵，也可以使用，但必须小心，以避免产生气泡，可能形成时的流动速度急剧变化。处理蛋白包被的珠，例如，使它们靠近分段微管壁，1064纳米连续波激光束可以被引入到显微镜的光轴和聚焦，具有高数值孔径的物镜（1.3或更高），以产生一个陷阱。对于荧光定量分析单个分子的激发光应用激光碱源，因为该光源的强度来提供的强度比由汞灯产生更稳定。为了最大限度地减少机械振动，在显微镜应放置在光学平台上。更先进的设备是需要研究的珠下一个恒定的力的微管解聚的结束动作，并测量单发力信号11,38,39，这些方法将在其他地方描述。

1。生产可重复使用的流量钱伯斯

玻片为可重复使用的流量室可以从本地玻璃制造工厂用图 1原理图进行排序（ 见表2关于我们的供应商的详细信息）。超声铣削定期修改显微镜载玻片（75毫米x 25毫米，1.0毫米厚），使两个凹槽15±1毫米长，1.0±0.1毫米宽，0.8±0.05毫米深。最近的端部之间的距离应为14±1毫米，这个距离​​是最佳的组装22毫米×22毫米的盖玻片的腔室。 见表2其他材料的清单。

  1. 放置一个长100毫米的聚乙烯管（外径0.61毫米， 表2）中的每个凹槽中滑动，留下〜5毫米悬在凹槽的内端。固定沟与氰基丙烯酸酯类粘合剂内的管，完全嵌入管的凹槽内。
  2. 填充槽用环氧树脂胶，同时避免溢出的胶水在管内。待胶水晾干〜1天。
  3. 用锋利的剃刀刀片切固化胶块3-4毫米从每个附着位点的远端，近端拆卸部件，以滑动的中心。管应保持他们的凹槽内。去除近端部分也将削减和删除内出挑，创造一个平坦的表面上有两个管口。
  4. 填的注射器与水和测试管是否正常工作。如果液体流动自如，把一滴环氧树脂胶（〜5毫米直径）在小树林的外端，干燥1天（ 图1D）。这将使室更耐用，因此它们可以反复用于多月。
    注1：为使倒置显微镜的腔室，载玻片应附加地修改，以使两个小孔处的凹槽（ 图1C）的相对端部。插入管通过幻灯片中的孔，弯曲管和紧密贴合他们的凹槽（ 图1E）内。按照步骤1.2-1.4，而是从整个表面上，这将被用于使一个流室取出环氧胶。
    注2：为了减少腔室容积，可以使用球磨，使两个凹槽0.050±0.005毫米深，而使滑动的中央部分5.0±0.5毫米宽和稍微升高（参见图1B和1C“蚀刻区域”）。当t他流室被组装（如下文所述），将双面胶带这些凹槽内。
    注3：要重用这些修改的幻灯片，整理实验用刀片去掉盖玻片，双面胶带后。通过剥离其关闭，并通过擦拭用70％乙醇的滑动取出密封剂。将幻灯片在容器实验室餐具洗涤剂的1-2％，附加油管蠕动泵和灌注50-70毫升，遵循与等体积的去离子水，干燥，存放在无尘室中。

2。盖玻片的制备

该协议需要6-8小时，将有助于准备12盖玻片。您将需要一个陶瓷盖玻片架和3盖玻片染色罐子，盖子;罐容积应不超过15毫升，因此每次将举行4盖玻片堆叠在一起。用盖（250毫升）的玻璃瓶中，应使用孵育盖玻片用硅烷。使用常规的1号盖玻片（22毫米x 22毫米或22毫米x 30毫米， 见表2和3的材料清单）。所有步骤都要进行在通风橱中，同时佩戴手套。

  1. 把盖玻片放入玻璃盖玻片染色罐，并填写罐子用丙酮。孵育1小时后，用去离子水冲洗10倍。
  2. 孵育的盖玻片10分钟，用乙醇和去离子水再次洗涤10倍。
  3. 准备“食人鱼”的解决方案。放将60ml过氧化氢溶液（在水中30％）中的耐热玻璃容器中，并慢慢地加入100 ml的硫酸（磺酸最终比例为过氧化氢溶液是5:3）。解决方案也热了起来，这是正常的，但谨慎使用。 Piranha溶液是腐蚀性极强！用厚厚的实验室外套，手套和护目镜！
  4. 填写盖玻片染色罐子，“食人鱼”的解决方案，关闭盖子，然后将罐子在水浴中预热至90℃1小时。
  5. 倒掉的“食人鱼”SOLUTI并丢弃于您的工作场所指示的安全法规。洗涤盖玻片10倍的去离子水。
  6. 填盖玻片染色罐用0.1M KOH，孵育10分钟，并用去离子水冲洗10倍。这将抵消后，“食人鱼”处理遗留在盖玻片任何氨基酸残基。
  7. 干盖玻片一次通过保持每个盖玻片用特氟隆涂层扁平刃镊子（以减少损坏的玻璃表面），并同时吹入压缩空气干燥氮气。确保盖玻片完全干燥，因为硅烷溶液与水反应性高。
  8. 堆叠干盖玻片陶瓷持有人（持有人每12盖玻片），应与氮彻底预干燥。保持覆盖，以避免灰尘粘附在盖玻片表面陶瓷持有人。
  9. 涵盖250毫升玻璃瓶（直径6厘米）与分子筛，564级，吸水率底。
  10. 用200毫升填补罐子PLUSONE排斥硅烷溶液，慢慢地浸入陶瓷支架在一个罐子盖玻片，盖上盖子，静置5分钟，在室温下。这将在盖玻片表面产生疏水涂层。
  11. 慢慢用盖玻片从罐取出保持架和转移盖玻片一次一个地进盖玻片染色罐子装满甲醇。
  12. 放置一个金属或玻璃座入的声波浴，使得盖玻片染色缸浸渍为其高度的2/3的水容器。超声处理在70 W 20分钟，改变甲醇溶液，每5分钟，然后漂洗10倍的去离子水。如果硅烷化工作正常，从水中取出时，盖玻片会出现干涩。
  13. 彻底清除使用氮残留的水，如上述。
  14. 夹层用的Kimwipes的盖玻片，以避免盖玻片之间的表面对表面的接触。盖玻片可以存储在一个密封的容器中几个星期室温。
    Ñ注1：步骤2.1-2.6可以通过清洗盖玻片与电浆清洗机15分钟，30瓦，大大缩短了总的准备时间进行更换。压力清洗室内部被设定在100〜200毫乇。大气和压缩氧气都可以使用。堆叠陶瓷持有人血浆清洗盖玻片，并继续执行步骤2.7。

3。的GMPCPP稳定微管的制备种子

这个过程将需要约1小时，将所得微管的种子是稳定的1-2天，在室温下进行。 见表4的试剂的列表。

  1. 混合冰：
    • 10微升未标记的微管蛋白（100μM， 见表4）在BRB-80缓冲液（80mM的管道，1mM的EGTA，4毫摩尔MgCl 2，pH值6.9，用KOH;补充用1-2 1mM DTT的使用新鲜的等分试样用于每个试验）。
    • 2.6微升地高辛标记的微管蛋白（ 表4）。根据制剂调节音量，这样的最终比例标记未标记的微管蛋白是〜1:10的范围。通过移液拌匀。
    • 1.4微升的10mM GMPCPP（终浓度为1mM）
  2. 孵育15分钟，在35℃时，种子会成长2-3微米长。调整的时间，如果不同的微管的长度是需要的。
  3. 加入35微升BRB-80（预热至35°C），吹打混匀，离心15分钟，在25000×g离心沉淀的种子在室温下。
  4. 弃上清，轻轻地添加和删除50微升温暖BRB-80的洗涤沉淀。
  5. 重新悬浮颗粒以及在25微升BRB-80。

4。微管种子的盖玻片的附件

方案4和5将需要2-3小时，所以两个流动腔每天使用。

  1. 组装流室按使用硅烷盖玻片制造商的指示，并继续执行步骤4.2。如果使用定制的盖玻片（协议1），按照步骤BELOW。
    1. 附上两片双面胶带（5毫米×30毫米）沿中心约5毫米宽的区域，把硅烷化玻片上盖的磁带，用力按压。
    2. 与BRB-80通过管中的一个填充的腔室和插入两个管与圆形牙签。
    3. 挤一小滴两色佳柏演员密封在一个小塑料培养皿的顶部，混匀很快，但彻底地用牙签。该密封剂会变成绿色;立即应用，仔细密封盖玻片的所有边缘。如果密封剂渗透得太深盖玻片下，打开管1通过去除牙签插塞和应用温和的压力，以防止密封剂泄漏的管道内。
    4. 让该腔室中干燥10分钟，并确认该流不被进一步处理之前受到限制。
  2. 放置在腔室上的显微镜载物台预热至32℃，并附着在管的1至泵，将泵送的液体流出。在入口管的长度应尽量避免试剂的不必要的损失：推荐长度为5-7厘米。在0.5沉浸为此毫升小瓶BRB-80缓冲区。这和下面所有的解决方案应预热至32-35℃。
  3. 施加轻微的压力与泵或简单地抬起出口管的末端挤压出的空气的气泡，从而可以形成偶尔当入口管塞被移除。
  4. 以100μl/分钟设定的泵速率。在BRB-80 1:30稀释的抗地高辛抗体2室容积洗，孵育15分钟，使抗体吸附。
  5. 用温水BRB-80 5-10室容积洗，孵育10分钟，用1％聚醚F-127在BRB-80阻止硅烷化盖玻片的疏水表面。
  6. 随着运动缓冲5-10室容积（BRB-80补充酪蛋白0.4毫克/毫升）洗。
  7. 降低泵的转速，以10微升/分钟和灌注在30-40微升蠕动缓冲液稀释1:200-1:600​​微管的种子。孵育15英里n到促进种子盖玻片吸附抗体的结合。
  8. 以100μl/分钟与400微升的缓冲运动洗涤室以除去任何未结合的物质。
    注1：种子所得到的密度应为10-30每显微镜视野（ 图2A）。要解决问题，更容易检测盖玻片连接的种子使用荧光标记的微管蛋白聚合（步骤3.1）中。
    注2：从衣藻40或其它生物来源，以及溶解的和deciliated四膜虫的细胞41的表膜制备轴突也可以成核用作微管。这些成核剂可用于创建小微管阵列非常有用，并且当首选微管与原丝的具体数目是理想的（GMPCPP种子成核1微管含有≥14原丝42）。这些结构可以被附连到清洗盖玻片由非特异性吸收，但阿塔用基于抗体的附着，使用硅烷化的盖玻片尤其是在比较chment通常是不太稳定的。

5。分段微管的制备

下面所有的溶液体积是室容积15-20微升;比例增加，如果较大的室内使用。

  1. Prewarm未标记的微管蛋白的组合在35℃（45微升缓冲蠕动补充有1毫米的Mg-GTP和10-15μM未标记的微管蛋白），持续30秒灌注于30微升/分钟。
  2. 监控微管生长与DIC的光学（ 图2B，视频1）。在5-7分钟孵育微管通常生长〜10微米长。
  3. 制备罗丹明-微管蛋白混合物（补充有0.5mM的GMPCPP和2-5μM罗丹明的微管蛋白0.5-1摩尔比罗丹明标记的微管蛋白的65微升的蠕动缓冲液）和温热的溶液在35℃下持续30秒。
  4. 在30μ立即灌注升/分钟。孵育8-10分钟，以促进在微管尖端形成稳定的荧光帽。稳定微管段也将自发成核和将与DIC的光学可见。
  5. 用100μl的缓冲液的蠕动，在20微升/分钟洗室以及以除去微管蛋白和核苷酸，以及水溶性微管的片段。
  6. 并发DIC，确认该微管是可见的（ 图2D），它们的数量，但是，应该减少，因为压盖内许多微管拆卸（ 视频2显示了一个典型场分段微管）。
    注1：分段的微管是非常稳定的并且可以用于在至少2个小时。但是，这些微管的寿命与过量溶液交换降低，或者如果2 - 巯基乙醇被用于在成像缓冲器。

6。蛋白质跟踪与微管解聚完的实验观察

  1. Introd以UCE 30-50微升荧光蛋白（0.1〜20纳米）到10微升/分室。如果蛋白质粘附在盖玻片是显而易见的，补充活力缓冲区4-8毫克/毫升BSA的。 ALEXA488-DAM1尖跟踪还需要10毫米DTT或0.5-1％βME10。
  2. 使用显微镜视场光阑，以避免不必要的漂白的微管和拆卸限制照明领域。
  3. 利用绿色荧光蛋白滤块开始视频采集，然后切换到罗丹明滤块，而无需中断图像记录。红色部分在微管两端应清晰可见，他们将开始褪色，迅速 ​​瓦解（ 视频3）。
  4. 继续照亮，直到瓶盖几乎消失（通常为10-20秒，但这个时间会比较长成长为具有较低罗丹明标记比率的上限），并切换到GFP的通道来记录与蛋白质微管解跟踪。
  5. 分析通过构建kymographs产生的序列，即在观察表明微管沿轴线发光强度不同的时间），使用的MetaMorph，可自由查看ImageJ的或其他的图像处理软件（ 图2E）， 即二维图像。
    注1：采集率应取决于所观察到的事件的定时进行调整。建议税率为滞销每秒（fps）的2-3帧，环大小的DAM1复合物27，但采集时间为单分子应> 20帧19。
    注2：高灵敏度EMCCD， 如 ANDOR iXon3，需要您与微管 ​​解聚尖跟踪事件的快速记录。对于安道尔iXon3相机推荐设置为：增益5倍，EM增益200，1 MHz的读出速度，16位感应器模式，80毫秒的曝光时间。
    注3：使用全内反射荧光显微镜将提高信号噪声比，然而，微管短，应使用这样的THA吨荧光稳定上限保持在消逝场的覆盖范围。

7。微管提示跟踪配合物的分子大小的定量分析

这种方法的基本原理是通过寻找尖端跟踪复杂到一个单一的荧光的强度的总荧光强度的比值，以确定在尖端跟踪复杂的分子的数目。这种方法可以应用到GFP-融合蛋白，并用荧光染料标记的蛋白质，但也可能低估分子的数目在尖端跟踪配合物，如果有的蛋白质分子中的制剂是不荧光。

  1. 记录光漂白动力学的荧光标记的蛋白分子。
    1. 组装常规显微镜室使用未经修饰的载玻片，2条双面胶带，和一个清洁的盖玻片，它可以使用整个方案2来制备，或只执行步骤的这个2.1-2.6协议。
    2. 加约50纳米的蛋白质在蠕动缓冲液，用蠕动缓冲简要地清洗和密封腔室与VALAP（ 表4）。优化的蛋白质浓度，以获得场与均匀分散的斑点（ 图3A），即单分子和它们的小聚集体（三聚体和四聚体，其可以自发地形成在溶液中或在几个单分子彼此靠近并不能得到解决可能出现） 。这个步骤是为了获得的漂白步骤，准确地测定一个步长大小的（见下文）的多峰分布非常重要。
    3. 尽量减少光照强度激光在其个人的荧光斑点仍然清晰可见;低照明光漂白时间延长，所以较长的光漂白的痕迹可以得到。也可以减少曝光时间来减少在一帧期间的一个以上的荧光漂白的概率。推荐设置对于安道尔iXon3摄像头：增益5.0倍，EM增益999，10 MHz的读出速度，50-100毫秒的曝光时间。
    4. 专注于盖玻片表面，关闭照明快门，移动到一个新的领域，打开照明快门和采集图像，直到所有的配合物漂白（以下简称IMG（X，Y））。
  2. 校正照明的不均匀性（ 图3B）所获取的图像。
    1. 准备任何荧光的解决方案， 例如 1微米异硫氰酸荧光素（FITC）在BRB-80。这样的解决方案可以预先制备，分装并储存于-20℃。
    2. 组装一室，如第7.1.1，但使用常规的盖玻片。添加荧光团溶液和使用VALAP密封腔室。
    3. 收集> 50图片整个显微镜视野的：移动台到一个新的未漂白的区域，而在照明光闸被关闭，并且打开快门后立即获取的图像。
      4. 图3C）5像素的半径。所得到的图像表示的字段（ 执行光源（X，Y），其中x和y对应的像素的坐标）的照度的分布。
    4. 确定此图像（ 最大（依路姆））的最高像素亮度。
    5. 与封闭的照明快门，并使用相同的相机设置，如第7.2.3获取一幅图像，确定该图像的平均像素强度，这个值对应于CN，相机的噪点。
    6. 使用上述值和图像（ 依路姆（X，Y））使用下面的表达式正常化实验图像（IMG（X，Y））：

      使用所得到的图像IMG 规范 （X，Y）为BRI的定量分析ghtness固定荧光复合物，以及还正常化与尖端缝复合物（ 图3D）图像。
  3. 确定一个单一的荧光强度。
    1. 使用归一化的图像IMG 规范 （X，Y）和任何图像处理软件选择的荧光斑点的圆形区域（直径5-6个像素），并确定其积分强度为所有的帧，生成所述光漂白的痕迹。避免很亮的点（> 5倍比那些暗亮）。
    2. 使用相同的圆形区域的工具，至少选择3点自由区，产生相应的光漂白的痕迹，平均和适合用指数衰减函数。
    3. 制表此背景强度曲线相匹配的实验时间点，并从光漂白曲线中减去它。
    4. 流畅的漂白曲线（平均为3-5个点的滑动窗口）。目视检查所得到的曲线和丢弃显示荧光或缺乏明显的漂白（ 图3E）的突然增加任何曲线。
    5. 对于每个剩余的曲线（曲线的总数通常为50-70％）的，直观地选择最终的高原，当荧光斑点已漂白。缩短这一部分，只留下〜100分，平均这些强度。减去从缩短光漂白曲线，以尽量减少微小的变化是背景水平的此值，并降低背景峰（下图）的大小。
    6. 画出强度的直方图从20个或更多光漂白曲线（> 1,000个时间点）的所有时间点。直方图应该具有至少4个明显的峰值（见注2）。
    7. 适合与等距高斯分布10,43利用MATLAB，Mathematica的或类似的软件（ 图3F）直方图：

      瓦特这里一个i和σI，D和 N为拟合参数。参数A i和 σ 我对应宽度的第i个峰值的幅度和d为峰值之间的距离，N是一整数，对应于峰中分布的总数。如果第一个3或更多个峰的中心示出了在视觉上良好匹配的拟合线，这些峰（参数D）之间的距离对应于一个单一的荧光团的荧光强度。
      注1：如果显微镜系统具有显著振动或有噪音（ 如不稳定的激光束）的另一个来源，应增加检查点（7.3.6）的数量。
      注2：关键是要取得> 3峰进行准确分析与等距高斯拟合。如果少峰获得，可以得到假（ 如双）步长当光照条件不理想， 例如 ，当点漂太快，单步都没有解决好。
  4. 确定尖端跟踪复杂的分子大小。
    1. 使用与协议第6采集到的图像并选择第一个2-4帧，购入打开快门之后。当字段被点亮一段时间后观察到尖端跟踪之前，从相同的实验条件下，光漂白的动力学推定原来的强度。
    2. 平均所选的帧和规范生成的图像作为第7.2.5-7.2.7。
    3. 测量使用相同的区域大小，如第7.3.1荧光尖端跟踪复杂的积分强度。
    4. 测量的靠近尖端跟踪复杂并使用相同的区域3的背景区积分强度，平均这些值和从第7.4.3节的尖端跟踪复杂的强度中减去。 除以在7.3.5节中得到的单荧光团的强度在第7.4.4节中得到的荧光强度计算荧光分子的复合物的数量。
      注1：这是可取的为7.4协议的照明和采集设置的相同的协议7.1。如果其中的曝光时间或激光强度在这些步骤中的调整，所得到的荧光值应该被相应地缩放。然而，这样的比例的精确度应通过这些不同的条件下成象的样品（ 例如荧光的时间），并计算所得到的强度的比率进行验证。

8。微管提示跟踪的蛋白包被的珠子

  1. 开展与尖端跟踪珠实验通过触发MT拆卸作为协议6。 DIC的光源强度应减少到允许同时观看罗丹明荧光带DIC成像。
  2. 准备微珠作为Grishchuk 等 10和阿斯伯里等 11介绍30-50微升珠悬浮液的进入腔室以10μl/分钟。所建议的磁珠浓度为10 -16 -10 -17 M。
  3. 如果使用正置显微镜，从显微镜载物台取下腔和倒转5-10分钟，使珠沉淀在盖玻片。这促进了更好的结合在胎圈到拴在盖玻片的微管，但这种过程是不成功用0.5微米的聚苯乙烯小珠，它在这么短的时间显示很小的基于重力的沉降。
  4. 选择连接到盖玻片-拴系的微管的珠;胎圈应该以明确弧44（ 图4A）移动。系留珠应位于1-3微米远离盖玻片的表面，这是清晰可见的，由于偶尔盖玻片连接的小珠留米otionless。
  5. 切换到罗丹明过滤立方体，并开始使用时DIC的照度采集图像。
  6. 开快门照亮摄像视场（限制了视场光阑）与汞灯或530-550纳米的激光。继续录制，直到珠脱落，移动与拆卸微管端（ 图4D，4F和4G）。
    注1：光阱可以用来促进微管的壁和蛋白包被的珠之间的相互作用。珠涂有马达驱动蛋白（ 图4E-G）时，此功能特别有用。按照与上述相同的协议，但补充动力的缓冲带2毫米的Mg-ATP。在步骤8.3，捕获一个自由浮动的珠与1,064 nm的激光束，移动舞台，使被困珠接近分段微管墙。开始成像弱光DIC和通过罗丹明滤块，等待珠，开始走向了皑皑的微管末端。船尾呃定向珠运动观察时，关闭快门用于捕集光束和打开快门荧光灯照明。继续录制，直到珠脱落，与微管拆卸结束曲目。

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Representative Results

蛋白与微管 ​​解聚跟踪结束。酵母着丝粒成分DAM1是迄今为止最好的提示跟踪器的微管解聚的结束14。这个10-亚基复合GFP标记可以容易地表达并从细菌细胞18,38纯化，因此建议用它作为阳性对照的尖端跟踪检测。与微管 ​​的解聚结束追踪荧光蛋白被看作是一个明亮的荧光斑点稳步迈向盖玻片连接的种子（ 视频3）。它也将出现在相应kymograph（ 图2E）的斜线。与此相反，如果蛋白质不尖轨，微管变短，而不显示富集荧光信号在微管末端，如看到人类NDC80复合-GFP复合物19（ 图2F）。当的processive跟踪观察，微管短率脱臭可以通过跟踪移动的点，或通过测量斜线的斜率上的相应kymograph来确定。这可以提供有关蛋白质微管末端结合45强度的信息。结合强于微管蛋白，像DAM1环络合物，减慢微管解聚的速率。这种效果，但是，在很大程度上依赖于笔尖跟踪复合物的大小和小络合物可能对微管解27的速率很小或没有影响。因此，在微管缩短率的变化应该被解释在尖端跟踪复杂的大小的情况下。在某些情况下，跟踪可能会伴随着增加的尖端跟踪复杂的亮度，作为解聚结束“收集”被结合到微管晶格的蛋白质。在这种情况下解聚率往往会降低随之而来的尖TRA的规模日益扩大他妈的复杂。在其他情况下的关系更为复杂。例如，DAM1蛋白复合物，其中绿色荧光蛋白缀合于DAM1亚基的N-末端的多亚单位，可以在缩短微管（ 图2G）的端部收集。微管解最终档位;大概是因为微管解聚的力量是不是强大到足以移动物是太大了。拆卸减少尖的亮度，这表明一些尖部-相关DAM1亚基10的离解后往往恢复。这些关系的仔细检查是很重要的，因为微管结合蛋白不跟踪processively也可以减缓微管解19,31,46率。

珠跟踪与微管 ​​解聚两端，许多微管结合蛋白已经被确定为耦合器与动态英里微珠运动crotubule结束5,11,27,39,47。引人注目的是，即使是NDC80复合蛋白复合物可通过珠29,30维持微管端头跟踪。通常，蛋白包被的小珠和微管之间的结合是强的，因此，当珠被添加到显微镜室它们结合容易的分段，盖玻片连接的微管（ 图4A）。它并不总是可能的，用DIC明确看到胎圈是否成为附着于只有一个微管。我们已经开发了一些标准，以避免录音已经形成附件的几个微管的珠子。首先，附加到1微管珠应该显示的圆弧状的运动，如微管稍微枢转围绕从盖玻片附种子（ 图4B），其生长的部位。第二，当稳定帽被照亮，只有一个红色的部分应被看作从该种子和珠（ 图4C）的远端。帽上经常可以看到followi纳克珠的圆弧状运动，直到帽漂白剂（ 视频4）。三，珠运动（或其支队）应观察后不久，盖有漂白和珠运动方向应与微管的方向，这是基于上述的观察推断是一致的。第四，由于微管变短，对种子的胎圈移动时，圆弧状的振动的振幅应该减小（ 图4D）。

当跟踪由胎圈是非常的processive， 如图4D所示，这些标准往往是满意的。然而，如果胎圈跟踪不是的processive，一些最初的定向运动后胎圈分离，并开始扩散，随机。对于较大的珠子， 如 1微米玻璃微珠 ​​，这种热运动速度慢，以至于它可能被误解为与缩短微管末端的圆弧包含运动。基于幅度的正式标准磁珠的从直线轨道偏差，可用于鉴别这样的事件29。在我们以前的工作中，我们计算出的平均珠游览整个微管轴和估计，如果该值超过0.4微米/ 1微米的微管平行珠运动，珠很可能有95％的置信随机扩散。采用这一措施，我们发现，即使在“控制”珠制剂，涂有非特异性的抗体，或与生物素化的微管结合使用链霉亲和包被的珠子，例如珠子，珠子的5％被判定为processively移动。如果需要更高的精度有一定要求，监察珠低延伸能力的运动，我们建议您使用激光陷阱，其中的卷边运动是更容易识别。

激光陷阱也应该会珠不能形成持久的附件，以稳定的微管使用。我们使用的激光束来捕获珠子涂布有PLU的不同蛋白构建S端导向的驱动蛋白CENP-E和“启动”，例如珠分段微管墙（ 图4E）24。在ATP的存在下这些珠子快速移动（20-25微米/分钟）对封端的微管加末端;上kymograph，这种运动导致斜布线朝向帽（ 图4F和4G）。后帽被破坏，涂有截短CENP-E蛋白的胎圈分离的微管（ 图4F的绿色箭头）。然而，全长CENP-E蛋白可以在相反的方向维持胎圈运动， 即朝向减去微管末端（ 视频5）。作为一个结果，kymograph这种珠示之字形图案，这表明定向运动由涂有全长的珠子，并且不被截断，CENP-E都正端和负端的存在。我们预计，其他微管依赖性电机可能会出现类似的蠕动5,13

图1
图1。流动腔体外研究，分段或动态微管一个 。图分段的微管（MT）的。稳定MT种子与地高辛（DIG）标记的微管蛋白和GMPCPP制备，附着通过抗DIG抗体的盖玻片。非特异性微管蛋白和其他蛋白质的结合被阻止与的Pluronic F127。微管是由使用未标记的微管蛋白和GTP的种子延长，并且这些扩展的url用含有罗丹明标记的微管蛋白和GMPCPP（红色）短​​段。 MT加端（标有+）通常会被禁止（ - ）B和 C从一个更短的负端tinguished。修改后的流室的详细计划与滑动直立和倒置显微镜的使用。索尼克槽显示为黄色。数字以毫米为单位。D和 E。侧视图修改幻灯片（不按比例）附管;粗箭头指示后腔完全组装（未显示）的液体流过管点此查看大图。

图2
图2。分段和微管蛋白的典型尖跟踪结果的制备A。盖玻片，微管附着种子VISU靠在与DIC的光学（步骤协议的4.8），箭头指向的一些种子。该图像是平均10帧的连续收购（100毫秒曝光每个）：B。同样显微镜字段后的微管蛋白和GTP，于32℃孵育8分钟，微管能够被看见从种子中（步骤的协议5.2）.13 C发出的。伪彩色图象，显示了分段的微管中的DIC（绿色）观察和罗丹明标记的稳定帽（箭头），以落射荧光（红色）。ð观看。相同的图像作为面板C，但与视野较大。一些含有罗丹明-微管片段，它在该协议的步骤5.2自发核在溶液中，也可见（箭头） 的 E。该DAM1-GFP蛋白Kymograph追踪微管拆卸结束。彩色编码条左侧显示用于收购kymograph的相应部分的荧光通道。垂直iCal的荧光线被结合于微管的壁和显示很少运动的DAM1-GFP复合物，直到微管端来了。 女性Created。 Kymograph作为在电子，但用GFP标记NDC80复合复杂19。最初，微管是均匀布置，虽然增加了GFP荧光的罗丹明在激发后的上限结束观察。这种增加取决于NDC80复合-GFP蛋白的可溶性池，但其作用机制尚不清楚。帽解体后，微管缩短变得明显，但有荧光的微管尖端的小富集，说明缺乏尖端跟踪。 阉 。从尖端跟踪DAM1点的轴丝，将其用于微管成核在本实验中10，距离用的MetaMorph轨迹点落于计量。移动复杂的初始亮度对应于约15亚基：足以形成一个单一的DAM1环。次的亮度Ë移动复合物归的盖玻片连接的，一动不动的荧光斑点纠正漂白的强度。水平比例尺：图A，B，D（10微米），面板C，F，E（3微米）。垂直比例尺：10秒点击此处查看大图。

图3
图3。的荧光信号定量分析一个 。与DAM1-ALEXA488复合物在显微镜领域的例子形象势必非特异性盖玻片表面。注意异质性的点的亮度和照度的不均匀。比例尺为2微米。 乙 。相同的图像在面板A的定量表示。ç 。ð。使用Mathematica 9（Wolfram Research公司）从面板的归一化图像绘制为强度表面。请注意，这个表面是比乙更平坦，峰少异构高度的 E。与CENP-E-GFP蛋白所获得的光漂白曲线的例子。每一个点的积分强度，收集，归一化要考虑到照明的帐户不均和曲线平滑（平均为5个点的滑动窗口）。在上排的信号被排除在进一步分析在第7.3.4节中所述的理由。像那些在低行中所示曲线，进一步处理，并用于建立在踏板F的直方图，如在第7.3.4-7.3.5。F中所述 NG>。直方图从22漂白CENP-E-GFP点（共1,900个数据点）收集的积分强度。红线是装修用等距高斯函数; 5个不同的峰被看见。从这个直方图确定一个单一的GFP荧光的积分强度为（64.7±1.1）×10 4澳洲阉 。对于DAM1-ALEXA488典型漂白曲线，如在协议7.3.5中所述进行处理。 小时 。从48漂白DAM1-ALEXA488点（共1,548个数据点）收集的积分强度的直方图; 4个不同的峰被看见。在这些条件下1 ALEXA488分子的积分强度为（17.4±0.8）×10 3太子港点击这里查看大图。

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图4。插图的微管相关珠运动的一个 。示意性的实验与珠涂布有微管结合蛋白。粗箭头表示微管解：B的方向。一个GFP-DAM1涂珠，这是稳定附着在微分段（基于26图像）的DIC图像的最大密度投影。珠呈圆弧状的运动（箭头），这表明它是附加到定向所示的虚线。℃的微管。相同的珠子在B组的单一形象，但在荧光快门打开后立刻协议的步骤8.6取。箭头指向位于胎圈附近的荧光帽，而是从微管的附着位点。D中的相对侧上。最大强度投影显示与disassemblin珠的运动轨迹克微管。图片是从成像开始（注意圆弧状突起），并且直到珠的脱离（ 视频4）的 E依次获得115帧创建。原理实验与珠涂有加，最终导向驱动蛋白CENP-E的。珠被带到在使用激光捕获微管接触。陷阱，然后断开与珠开始朝着微管正端。后的微管稳定帽被移除和微管分解，胎圈反转其运动。F的方向。 Kymograph展示一个0.5微米珠涂有截断的X。蟾 CENP-E的驱动蛋白朝着微管正端24。后胎边行进约1μm，荧光灯快门被打开（红色条）和稳定帽成为可见的（红色箭头）。突然脱落（绿色箭头）珠，想必当电机遇到的缩短微管到底。Ğ 点击此处查看大图。

视频1。分段微管的制备。视频显示准备分割的微管在显微镜领域的DIC图像。成像启动后微管的种子已经附着在盖玻片。小圆点点是离我们准备抗地高辛抗体的发现微粒​​。微管蛋白和GTP被添加后，微管开始从种子中（步骤5.2）伸长。之后它们到达所希望的长度（8-15微米），将溶液迅速交换引入Rhodaminated微管蛋白和GMPCPP。期间，在D的交流，微管聚合物弯流irection但泵停止后，他们假设无应变的方向。在接下来的“封顶”阶段，一些微管蛋白开始自发聚合和小微管片段看到漂浮在室内。他们下洗（步骤5.5），这也将删除所有可溶性微管蛋白和核苷酸中被删除。在这些阶段的一些失败的微管组装的强大帽，当可溶性微管蛋白被冲走了，他们很快分解。在皑皑的微管，然而，稳定了好几个小时，除非它们被点亮，当罗丹明是兴奋，瓶盖变得支离破碎，并且不封顶的微管段成为暴露。图像被收购的每一秒钟，起到以30 fps。

视频2。分割的微管脱帽。视频显示通过DIC一个完全组装的微管分段，随后用相同的微管通过罗丹明滤波器立方体的荧光图像。 A B在微管的末端右侧的红色部分（箭头）移动电弧并迅速变淡由于光漂白。以6 fps，并获得了在10 fps的图像。

视频3。蛋白与微管 ​​解聚跟踪到底。分段的微管（MT）是可见多亏了GFP标记的DAM1，从而形成不同的点（绿色图像）的装饰。罗丹明荧光是那么兴奋，红色的帽子变得可见，在一个温柔的弧形移动的微管（红色图像）的结束;微管的其余部分是不可见的，因为标记微管蛋白成为唯一在聚合物的末端结合。瓶盖漂白速度快，开始崩溃和荧光立方体切换回GFP，只是在时间看到没有Rhodaminated微管蛋白和GMPCPP微管段缩短的开始。解聚时结束到达DAM1点，微管末端变为亮绿色。随后，绿色发出荧光NT斑被认为是与微管拆卸移动，说明的processive尖端跟踪。 DAM1的浓度为3纳米，收购和播放的影像在0.4 fps的。比例尺为5μm。

视频4。珠与微管 ​​解聚结束。玻璃珠涂有DAM1看出以弧形运动，这表明它是栓系到盖玻片通过微管跟踪 。当罗丹明荧光被激发，红色帽被从胎圈向远侧看到和移动同步地与胎圈的运动（在红色图像）。不久，在胎圈开始移动定向，而其圆弧状运动的振幅（ 图4D）而减小。通过罗丹明滤块被收购的DIC图像，每300毫秒，起到6 fps的珠子是1微米，比例尺5微米。

视频5。驱动蛋白包被的磁珠移动双向的分段微管。成像珠COA后开始泰德与全长CENP-E的驱动蛋白被放置在微管（MT）墙。箭头指向的初始卷边的位置。胎圈被看见正在远离的箭号，作为电动机行走朝向加微管末端。不久后，加端盖被照亮（箭头，红色图像），所述胎圈开始在相反的方向上移动。只有全长CENP-E驱动蛋白可以在珠缩短微管末端的情侣运动。小珠涂截断CENP-E可向加MT年底移动，但它们分离后不久，微管解聚被触发（比较图4F和4G）。 DIC图像被收购的每1秒和演奏在16 fps的珠子是0.5微米。

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Discussion

许多单分子检测时下经常使用经过特殊处理的盖玻片，大大减少非特异性蛋白的粘附。我们在这里描述的过程是在霍华德实验室32开发的原始协议的修改，我们发现，硅烷化的盖玻片甚至与DIC的基础珠实验，不使用荧光是非常值得的努力。腔室装配有这样的盖玻片显示更清洁的表面，并在可溶的微管结合蛋白的存在下所获得的结果是更具有可重复性，特别是当一个非常低的蛋白质浓度使用。

成功制备分段多边贸易体制的最关键的步骤是：

  1. 微管蛋白浓度和孵育时间的优化（步骤5.1-5.2）。本次，在协议给出的浓度是近似值，可能会因在微管蛋白制剂，腔室容积等的差异。
  2. 具体和严格的附着微管成核，以盖玻片，并
  3. 精确地控制流速的能力。在我们的手中，最好的结果是，当实验中的密封流腔进行实现。

该协议的主要优点是微管解聚可与高时空分辨率被触发，从而协助运动的分析，在拆卸微管末端。利用这种技术，缓冲器可以被迅速地改变，微管结合蛋白和小珠可以以各种缓冲剂的加入的微管形成之后。这允许对一个蛋白对微管解聚的影响分开，由微管装配其可能的作用的研究。这是有用的，如果该蛋白还可以与微管蛋白的可溶性互动，这可能掩盖与微管相互作用的。然而，由于免费，未聚合的微管蛋白是存在于细胞中，应谨慎使用瓦特母鸡解释这种结果的生理意义。

分段的微管方法的主要限制是，它不适合微管组装过程中学习动作，或对微管灾难救援和跟踪蛋白质的影响。对于这些问题，以测定可溶性微管蛋白的存在下生长的动态微管是比较合适的。这种方法的另一个限制是，蠕动缓冲器应不受氧清除酶。这样的酶的混合物， 例如，基于过氧化氢 ​​酶和葡萄糖氧化酶48，可显著改善荧光分子的寿命。但是，如果这些试剂中的分段微管测定中使用，光感应拆卸是罕见，因为微管帽漂白而不崩解。在定量荧光测定法，漂白速率应始终被考虑在内，在参考以上或例如作为所述23，特别是如果不使用抗漂白剂。

在分段微管法测试了几个微管结合蛋白显示优先结合到罗丹明标记的稳定帽与未标记的微管段。绑定到帽可能降低的processive珠的分数，由于帽相关的珠子往往是从当帽瓦解微管分离。最后，我们注意到，如果电机包被的磁珠走向正微管端非常快，他们经常到达红盖之前微管解聚被触发，在这种情况下，他们也会从微管解离和这样的实验会不会是生产力。

总之，微管结合蛋白的无固有运动活性遵循微管的缩短端的能力是一个有趣的，但知之甚少现象。这里所描述的协议应协助这些公关研究oteins及其属性体外 。微管解聚有关的运输在染色体分离的有丝分裂过程中发挥重要作用。因此，我们希望在这里描述的技术将最终有助于更深入地了解细胞分裂的机制。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

作者要感谢FI Ataullakhanov帮助设计和制造可重复使用的流室，N. Dashkevich，N. Gudimchuk和A. Korbalev提供图像数据，N. Gudimchuk和P.扎哈罗夫开发协议，并提供试剂备地高辛标记微管的种子，A.波塔潘科​​的帮助文本编辑和Grishchuk实验室的其他成员的提示和讨论。这项工作是由部分支持美国国立卫生研究院授予通用汽车R01-098389以及宾夕法尼亚肌肉学院ELG，谁是金梅尔学者试点补助金，由RFBR给予12-04-00111-A，13-04-40190-H和13 -04-40188-H，俄罗斯科学院主席团资助到FI Ataullakhanov（分子系统集成和分子与分子细胞生物学课程的机制），美国国立卫生研究院授予通用汽车R01 GM033787到JR麦金托什和梅德子敏王朝基金会博士后奖学金到VAV

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1. Microscopy and other equipment.
Microscope Zeiss
Nikon		 Axio Imager 2
Eclipse Ti		 other microscope models capable of DIC and epifluorescence-imaging can be used
Objective Zeiss
Nikon		 420490-9900-000
CFI Apo 100x Oil 1.49		 100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Objective heater Bioptechs 150803, 150819-19
Fluorescent filter cube Chroma 49004 or 49008
41017 or 49020		 optimized for Rhodamine fluorescence 
optimized for GFP fluorescence
Acquisition software freeware MicroManager
Molecular Devices		 not applicable
MetaMorph 7.5		 http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/
other software can be used to acquire images and for a particle tracking
EMCCD camera Andor iXon3, DU-897E-cs0-#BV Highly sensitive EMCCD camera
Trapping laser IPG Photonics YLR-10-1064-LP 1,064 nm laser, 10 W
Fluorescence excitation lasers Coherent, Inc.
Coherent, Inc.		 Sapphire 488 LP
Sapphire 552 LP		 excitation of green fluorophores
excitation of red fluorophores
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Commercial flow chambers Warner Instruments RC-20 or RC-30
Perfusion pump Cole Palmer
Harvard Apparatus		 Masterflex 77120-52
Pico Plus		 Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia. 
Table 2. Microscopy chamber preparation.
Modified microscope slides for reusable chambers Precision Glassblowing of Colorado Custom order www.precisionglassblowing.com Sonic slots in slides using schematics in Figure 1
Polyethylene tubing Intramedic 427410 I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container
Polyethylene tubing Intramedic 427400 I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber
Regular microscope slides VWR 48312-003 Other similar slides can be used
Coverslips VWR 48393-150, 48366-067 Other similar coverslips can be used
Silicon sealant World Precision Instruments KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE
Epoxy glue Loctite 83082
Cyanoacrylate adhesive Scotch 3M AD114 Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers
Table 3. Coverslips cleaning and coating.
Molecular Sieves, Grade 564 Macron 4490-04
Coverglass Staining Jar Ted Pella, Inc. 21036
Coverslip Ceramic Holder Thomas Scientific 8542e40
PlusOne Repel Silane GE Healthcare Biosciences 17-1332-01
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Anti-digoxigenin AB Roche Applied Science 11093274910
Table 4. Preparation of seeds and segmented microtubules.
Tubulin purified from cow brains
Cytoskeleton, Inc
T238P		 For purification protocols see 49–51
Unlabeled porcine tubulin
Labeled tubulin Cytoskeleton, Inc
Invitrogen
Invitrogen		 TL590M
C1171 (Rhodamine)
A-2952 (Digoxigenin)		 Rhodamine-labeled porcine tubulin
Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.
GMPCPP Jena Biosciences NU-405 Aliquot and store at -70 °C
VALAP Vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass see reference9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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