Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Udarbejdelse af Segmenteret Mikrotubuli at studere Forslag drevet af demontering mikrotubuli Ends

Published: March 15, 2014 doi: 10.3791/51150
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 2Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow, Russia, 3Physiology Department, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Mikrotubuli er i sagens natur ustabile polymerer og deres skift mellem vækst og afkortning er stokastisk og vanskelig at kontrollere. Her beskriver vi protokoller anvender segmenterede mikrotubuli med photoablatable stabiliserende hætter. Depolymerisering af segmenterede mikrotubuli kan udløses med høj tidslig og rumlig opløsning og dermed bistå analyse af bevægelser med demonteringen mikrotubuli ender.

Abstract

Mikrotubuli depolymerisering kan give kraft til at transportere forskellige protein komplekser og protein-coatede beads in vitro. De underliggende mekanismer menes at spille en afgørende rolle i mikrotubuli-afhængige kromosomfejl bevægelser under celledeling, men de relevante proteiner og deres præcise roller er dårligt defineret. Således er der et stigende behov for at udvikle assays med til at studere en sådan motilitet in vitro under anvendelse af oprensede komponenter og defineret biokemiske miljø. Mikrotubuli, er dog i sagens natur ustabile polymerer deres skift mellem vækst og afkortning er stokastisk og vanskelig at kontrollere. De protokoller, vi beskriver her drage fordel af de segmenterede mikrotubuli, der er lavet med photoablatable stabiliserende caps. Depolymerisering af sådanne segmenterede mikrotubuli kan udløses med høj tidslig og rumlig opløsning og dermed bistå studier af motilitet ved demonteringen mikrotubuli ender. Denne teknik kan bruges til caRRY en kvantitativ analyse af antallet af molekyler i fluorescens-mærket protein-komplekser, som bevæger processively med dynamisk mikrotubulus ender. For at optimere et signal-til-støj-forholdet i dette og andre kvantitative fluorescerende assays bør dækglas behandles for at reducere uspecifik absorption af opløselige fluorescens-mærkede proteiner. Detaljerede protokoller er tilvejebragt for at tage hensyn til ujævnheder i fluorescerende belysning og bestemme intensiteten af ​​en enkelt fluorophor hjælp ækvidistante gaussisk pasform. Endelig beskriver vi anvendelse af segmenterede mikrotubuli at studere mikrotubulus-afhængige bevægelser af protein-coatede mikroperler, der giver indsigt i evnen af ​​forskellige motordrevne og motonske proteiner par mikrotubuli depolymerisation til bearbejdende last bevægelse.

Introduction

Mikrotubuli er højkonserverede cytoskeletstrukturen der er vigtige for cellulær arkitektur, celle motilitet, celledeling, og intracellulær transport 1.. Disse dynamiske polymerer samle fra tubulin i nærvær af GTP, og de ​​skifter spontant mellem vækst og afkortning 2. Mikrotubuli er meget tynde (kun 25 nm i diameter) derfor specielle optiske teknikker til at øge kontrasten skal bruges til at observere mikrotubuli med et lysmikroskop. Tidligere arbejde med disse polymerer undersøgt deres dynamiske adfærd ved hjælp af kontrast differential interferens (DIC) 3. Denne og lignende undersøgelser in vitro viste, at under typiske eksperimentelle betingelser, mikrotubuli gennemgå katastrofe og skift til den depolymerisering kun sjældent, en gang hver 5-15 min (denne frekvens er for 7-15 mM opløselig tubulin koncentration undersøgt på 28-32 ° C ) 4.. Forskellige teknikker er således blevet foreslået at induce mikrotubuli depolymerisering på en kontrolleret måde. Mikrotubulus afkortning kan udløses ved at vaske væk opløseligt tubulin 5,6, opskæring mikrotubuli med en laserstråle 7, eller ved hjælp af segmenterede mikrotubuli 8, som beskrevet her. Tidligere arbejde under anvendelse af segmenterede mikrotubuli samt stokastisk skifter polymerer, har fundet, at små intracellulære laster, såsom kromosomer, vesikler, og protein-coatede perler, kan bevæge sig ved enderne af forkortelsen af mikrotubuli 9-13. Dette fænomen menes at have en direkte virkning på kromosom bevægelser i mitotiske celler, og de ​​underliggende mekanismer er i øjeblikket under aktiv efterforskning 14-16.

For nylig har fluorescerende-baserede teknikker, herunder total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi, er blevet ansat til at studere motilitet med dynamisk mikrotubuli ender 17-24. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at det tillader undersøgelse af interaktionens mellem mikrotubuli og mikrotubuli-bindende proteiner i realtid ved hjælp proteiner mærket med forskellige fluoroforer. Adskillige protein-komplekser blev fundet til at bevæge processively med forlængede og / eller afkorte mikrotubuli ender. De omfatter mikrotubuli-associeret proteiner Dam1 10,12,18, Ska1 19 og XMAP215 20 samt kinesin motorer Kif18A 21,22, MCAK 23 og CENP-E 24. Disse proteiner udviser processive tip-tracking, som er fundamentalt forskellig fra de klassiske tip-tracking proteiner som EB1 25. Selv EB1 molekyler og de ​​associerede partnere synes at forblive stabilt forbundet med dynamisk mikrotubuli ender de enkelte molekyler forbliver bundet til mikrotubuli tip til kun ~ 0,8 sek, hurtigt udveksle med den opløselige pool 26. I modsætning hertil processive tip-trackers, ligesom Dam1, rejse med mikrotubuli ender for mange mikrometer, og deres tilknytning til mikrotubuli tips kan vare meventuelle sekunder. Spidsen forening tid, samt den resulterende sats for tracking, afhænger meget af antallet af molekyler, der danner spids-tracking kompleks 27. Større protein ensembler er normalt meget bedre tip-trackers. For eksempel kan sådanne komplekse enheder som de isolerede gær kinetochores fortsat være koblet til mikrotubuli ender i timevis 28. Nogle mikrotubuli-bindende proteiner, fx Ndc80 kinetochore protein kompleks, har vist sig at være ude af stand til at spore med mikrotubuli slutter ved et enkelt molekyle niveau, men Ndc80 er meget effektiv i at koble bevægelse perle last 19,29-31. Således at forstå mekanismen af ​​tip-sporing af forskellige protein-komplekser, såvel som deres biologiske roller, er det vigtigt at undersøge tip-sporing, som en funktion af antallet af molekyler i spids-tracking kompleks, samt at bestemme evnen af ​​disse komplekser udviser kollektiv motilitet på overfladen af ​​perlen last.

(figur 1a). Først er de kommercielt tilgængelige objektglas modificeret til at fastgøre kort polyethylenrør (Protokol 1). Den genanvendelige mikroskopi flowkammer samles derefter fra sådan et dias og kemisk eller plasma-rengøres og silaniserede dækglas (protokol 2) 32-34. Den resulterende kammer volumen er kun 20-25 pi (eller så lille som 15 ul, se note 3 i protokol nr. 1), herunder mængden af ​​indløbsrøret. Kommercielt tilgængelige strømningskamre kan også anvendes, men deres volumen er normalt større, hvilket fører til det unødvendige spild af proteiner. Hvis et større kammer er ansat, bør mængden af ​​alle løsninger i de protokoller nedenstående skaleres proportionalt. Mikrotubuli frø fremstilles derefter, fx under anvendelse langsomt hydrolyserbare GTP-analog, GMPCPP (guanosin-5'-[(α, β)-methyleno] triphosphat) (protokol 3, se også Hyman <em> et al. 35). Frøene er immobiliseret på en renset dækglas og overfladen efterfølgende blokeret for at forhindre ikke-specifik absorption af andre proteiner 32 (protokol 4 beskriver frø immobilisering ved hjælp digoxigenin). De segmenterede mikrotubuli kan derefter fremstilles ved Protokol 5. Den væsentligste begrundelse for denne fremgangsmåde er, at dynamiske mikrotubuli polymerer, som dannes i nærvær af GTP, kan stabiliseres midlertidigt ved at tilføje korte "caps" af stabile tubulin segmenter, som indeholder GMPCPP. Disse hætter indeholder også Rhodamine-mærket tubulin, så de kan fjernes blot ved at belyse synsfelt med en 530-550 nm laser eller kviksølv buelampe (protokol 6) 36. Kan derefter anvendes fluorescensintensitet tip-sporingssignal at estimere antallet af molekyler, der rejser med demontering mikrotubuli ender, idet der tages hensyn til ujævnheder i mikroskop feltbelysning (Protokol 7). Kan bruges En lignende fremgangsmådeat studere samspillet mellem depolymerisering mikrotubuli og protein-coatede perler, fremstillet som beskrevet i 27 (protokol 8). Visse proteiner vil let binde til væggene af segmenterede mikrotubuli, men laser pincet kan også bruges til at holde perlen nær mikrotubulus væggen og derved fremme dets binding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nødvendigt udstyr: De nedenfor beskrevne eksperimenter kræver et lysmikroskop udstyret til DIC og fluorescens imaging (tabel 1). Lysfelt LED-belysning kan anvendes til at forbedre påvisningen af dækglasset-attached mikrotubulus frø 37, som er vanskelig at observere med en regelmæssig Halogenlampe. Til at styre flydende flow i mikroskopi kamre, skal løsninger udveksles med en peristaltisk pumpe i stand til flow hastigheder 10-100 ul / min. En sprøjtepumpe kan også anvendes, men der skal sørges for at undgå luftbobler, som kan dannes, når strømningshastigheden ændres brat. Til håndtering af protein-coatede beads, til for eksempel at bringe dem tæt til den segmenterede mikrotubulus væg, kan en 1064 nm kontinuert bølge laserstråle introduceres i mikroskopets optiske akse og fokuseret med et højt mål numerisk blænde (1.3 eller højere) for at fremstille en fælde. Til kvantitativ analyse af fluorescerendeintensiteten af ​​enkelte molekyler excitationslyset skal leveres af en laser-base-kilde, da intensiteten af ​​lyskilden er mere stabilt end det, der genereres af en kviksølv lampe. For at minimere mekaniske vibrationer, bør mikroskop være anbragt på en optisk tabel. Mere avancerede udstyr er påkrævet for at studere bevægelsen af perlerne med depolymerisering mikrotubuli ender under en konstant kraft, og for at måle single-shot kraft signaler 11,38,39, vil disse metoder blive beskrevet andetsteds.

1.. Produktion Genanvendelige strømningskamre

Glas dias for genanvendelige strømningskamre kan bestilles fra en lokal glas produktionsfacilitet hjælp diagrammer i figur 1B (se tabel 2 for yderligere oplysninger om vores leverandør). Med ultralyd fræsning ændre regelmæssige objektglas (75 mm x 25 mm, 1,0 mm tykke) at lave to riller 15 ± 1 mm lang, 1,0 ± 0,1 mm brede og 0,8 ± 0,05 mm dybe.Afstanden mellem de nærmeste ender skal være 14 ± 1 mm, denne afstand er optimal for et kammer samlet med 22 mm x 22 mm dækglas. Se tabel 2 for en liste over andre materialer.

  1. Anbring en 100 mm lang polyethylenrør (OD 0,61 mm, tabel 2) i hver rille i glideren, der forlader ~ 5 mm udhæng på de indre ender af rillerne. Lave rørene inde i riller med cyanoacrylat klæbemiddel, indlejring rørene helt inde i rillerne.
  2. Fyld rillerne med epoxy lim, og samtidig undgå at spilde limen inde i rørene. Lad limen tørre i ~ 1 dag.
  3. Med en skarp barberblad skære det størknede lim masse 3-4 mm fra den distale ende af hvert bindingssted, fjerne dele proximalt til centrum af objektglasset. Rørene bør forblive inde i deres riller. Fjernelse af de proksimale dele vil også skære og fjerne de indre udhæng, hvilket skaber en flad overflade med to tube åbninger.
  4. Fyld en sprøjte med vand og testom rørene fungerer korrekt. Hvis væsken flyder frit, sætte en dråbe epoxy lim (~ 5 mm i diameter) ved de ydre ender af lunde, tørre i 1 dag (figur 1D). Dette vil gøre kamre mere holdbare, så de kan anvendes gentagne gange i mange måneder.
    Note 1: For at gøre et kammer til et omvendt mikroskop, skal objektglassene ændres desuden at lave to små huller ved de modstående ender af rillerne (figur 1C). Sæt rørene gennem hullerne i diaset, bøje rørene og passe dem stramt inde i riller (Figur 1E). Følg trin 1,2-1,4, men fjerne epoxy lim fra hele den overflade, som vil blive anvendt til at gøre en strømningskammeret.
    Note 2: For at reducere kammer volumen, brug fræsning at lave to fordybninger 0,050 ± 0,005 mm dyb, forlader den centrale del af slæden 5,0 ± 0,5 mm bred og lidt forhøjet (se "ætset områder" på figur 1B og 1C). Når than flow kammer er samlet (som beskrevet nedenfor), placeres dobbeltklæbende tape inde i disse fordybninger.
    Note 3: For at genbruge disse ændrede dias, efter endt forsøgene fjerne dækglasset og dobbeltklæbende tape ved hjælp af et barberblad. Fjern tætningsmiddel ved at trække det ud, og ved at tørre objektglasset med 70% ethanol. Placer dias i en beholder med 1-2% af en lab opvaskemiddel, vedhæfte slangen til en peristaltisk pumpe og perfuse 50-70 ml, følg med tilsvarende volumen deioniseret vand, tør og opbevar det i et støvfrit rum.

2. Fremstilling af Dækglas

Denne protokol tager 6-8 timer og vil bidrage til at forberede 12 dækglas. Du skal bruge en keramisk dækglas holder og 3 dækglas farveskålene med låg, jar volumen skal være 15 ml, så hver vil holde 4 dækglas stablet sammen. En glasbeholder med et låg (250 ml) anvendes til at inkubere dækglas med silan. Bruge almindelige No.1 dækglas (22 mm x 22 mm eller 22 mm x 30 mm, se tabel 2 og 3 for en liste over materialer). Alle trin skal udføres i et stinkskab, mens iført handsker.

  1. Sæt dækglas ind i dækglas farveskålene og fylde krukker med acetone. Der inkuberes i 1 time, vaskes 10x med demineraliseret vand.
  2. Inkubér dækglas 10 min med ethanol og vaskes igen 10x med demineraliseret vand.
  3. Forbered "Piranha" løsning. Sæt 60 ml hydrogenperoxidopløsning (30% i vand) i en varmebestandig glasbeholder og tilsættes langsomt 100 ml svovlsyre (endelige forhold mellem syre hydrogenperoxidopløsning er 5:03). Løsning vil varme op, det er normalt, men vær forsigtig. Piranha løsning er meget ætsende! Brug tykke kittel, handsker og beskyttelsesbriller!
  4. Fyld dækglasset farveskålene med "Piranha" løsning, luk lågene og placere krukker i et vandbad forvarmet til 90 ° C i 1 time.
  5. Hæld "Piranha" solutipå og kassér som anvist af sikkerhedsreglerne på din arbejdsplads. Vask dækglas 10x med deioniseret vand.
  6. Fyld dækglasset farveskålene med 0,1 M KOH, inkuberes 10 min, og vask 10x med demineraliseret vand. Dette vil neutralisere eventuelle syrerester efterladt på dækglas efter "Piranha" behandling.
  7. Tørre dækglas et ad gangen ved at holde hver dækglas med Teflon belagt flade kanter pincet (for at minimere skader på et glas overflade), og samtidig blæser komprimeret tør nitrogen. Sørg for, at dækglas tørres fuldstændigt, fordi silanopløsning er meget reaktivt med vand.
  8. Stak de tørrede dækglas i keramiske holdere (12 dækglas pr indehaver), som bør være grundigt fortørret med nitrogen. Hold keramiske indehavere dækket for at undgå støv klistrer til dækglasset overflade.
  9. Dæk bunden af ​​250 ml glas (6 cm i diameter) med molekylsigter, Grade 564, for vandoptagelse.
  10. Fyld krukke med 200 mlPlusOne Frastøde silanopløsning og langsomt nedsænke en keramisk holder med dækglas i en krukke, luk låget og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Dette vil skabe hydrofobe belægning på dækglasset overflade.
  11. Langsomt fjerne holderen med dækglas fra krukken og overførsel dækglas en ad gangen ind i dækglas farveskålene fyldt med methanol.
  12. Anbring et metal eller glas piedestal i vandbeholderen af ​​en sonisk bad, således at dækglasset farvning krukken er nedsænket til 2/3 af sin højde. Lydbehandles ved 70 W i 20 minutter, skiftende methanolopløsning hver 5 min, og derefter skylles 10x med deioniseret vand. Hvis silaniseringen fungeret korrekt, vil dækglas vises tør, når fjernet fra vandet.
  13. Grundigt at fjerne eventuelt resterende vand ved anvendelse af nitrogen, som ovenfor.
  14. Interlay dækglas med Kimwipes at undgå overflade-til-overflade kontakt mellem dækglas. Dækglas kan opbevares i en forseglet beholder i flere uger ved stuetemperatur.
    Note 1: Trin 2.1-2.6 kan erstattes ved at rense dækglas med Plasma Cleaner i 15 min ved 30 W, hvilket reducerer den samlede tid til forberedelse. Trykket inde i rensekammeret er sat til 100-200 mTorr. Både atmosfærisk og komprimeret ilt kan anvendes. Stak plasma-renset dækglas i keramiske holdere og fortsæt til trin 2.7.

3. Fremstilling af GMPCPP stabiliserede mikrotubulus Frø

Denne procedure vil tage ~ 1 time, og de resulterende mikrotubuli frø er stabil i 1-2 dage ved stuetemperatur. Se Tabel 4 for en liste af reagenser.

  1. Bland på is:
    • 10 pi umærket tubulin (100 uM, tabel 4) i BRB-80-puffer (80 mM Pipes, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl2, pH 6,9 med KOH; supplere med 1-2 mM DTT ved hjælp af friske portion for hvert forsøg).
    • 2.6 pi digoxigenin-mærket tubulin (tabel 4). Juster lydstyrken afhængigt af, forberedelse,sådan, at det endelige forhold mellem mærket til umærket tubulin er ~ 1:10. Bland godt ved pipettering.
    • 1,4 pi 10 mM GMPCPP (slutkoncentration 1 mM)
  2. Inkuber 15 min ved 35 ° C, vil frøene vokse 2-3 um lang. Juster tid, hvis der ønskes forskellige mikrotubulus længde.
  3. Der tilsættes 35 pi BRB-80 (forvarmet til 35 ° C), blandes ved pipettering, og centrifugeres i 15 minutter ved 25.000 x g for at pelletere frøene ved stuetemperatur.
  4. Kassér supernatanten, vaske pille ved forsigtigt at tilføje og fjerne 50 pi varm BRB-80.
  5. Resuspender pellet godt i 25 pi BRB-80.

4.. Fastgørelse af mikrotubuli Frø til Dækglas

Protokoller 4 og 5 kræver 2-3 timer, så to strømningskamre anvendes per dag.

  1. Saml flowkammer ifølge producentens anvisninger ved hjælp silaniserede dækglas og fortsæt til trin 4.2. Hvis du bruger skræddersyede dækglas (Protokol 1), skal du følge trinene below.
    1. Fastgør to stykker af dobbeltklæbende tape (5 mm x 30 mm) langs den centrale ~ 5 mm bredt område, sætte silaniserede dækglas på toppen af ​​båndet, tryk fast.
    2. Fyld kammeret med BRB-80 gennem et af rørene og sæt begge rør med runde tandstikkere.
    3. Klem en lille dråbe af to-farvet Kwik Cast fugemasse på toppen af ​​en lille plastik petriskål, og bland hurtigt, men grundigt med en tandstikker. Fugemassen bliver grønt, anvendes straks, omhyggeligt forsegle alle kanter af dækglasset. Hvis fugemassen trænger for dybt under dækglasset, åbne en af ​​rørene ved at fjerne tandstikker stik og tryk forsigtigt for at forhindre fugemasse fra utætte inde i rørene.
    4. Lad tørre kammer i 10 min og bekræfte, at strømmen ikke er begrænset, før du går videre.
  2. Placer kammeret på et mikroskopobjektbord forvarmet til 32 ° C og vedhæfte et af rørene til en pumpe, der kan pumpe væske ud. Længden af ​​indløbsrøretbør minimeres for at undgå unødvendige tab af reagenser: Den anbefalede længde er 5-7 cm. Fordyb herpå i en 0,5 ml hætteglas med BRB-80 buffer. Dette og alle løsningerne herunder bør forvarmet til 32-35 ° C.
  3. Påfør et let tryk med en pumpe eller blot løfte enden af ​​udløbsrøret til at presse de luftbobler, som kan danne lejlighedsvis, når indløbsrøret stikket er fjernet.
  4. Indstil pumpehastigheden ved 100 ul / min. Vask med 2 kammer mængder af anti-digoxigenin antistoffer fortyndet 1:30 i BRB-80, inkuberes 15 min for at tillade antistof adsorption.
  5. Vask med 5-10 kammer mængder af varm BRB-80, inkuberes 10 min med 1% Pluronic F-127 i BRB-80 for at blokere den hydrofobe overflade silaniseret dækglas.
  6. Vask med 5-10 kammer volumen motilitet buffer (BRB-80 suppleret med 0,4 mg / ml af kasein).
  7. Reducer pumpehastighed til 10 ul / min og perfuse mikrotubuli frø fortyndet 1:200-1:600 ​​i 30-40 pi motilitet buffer. Inkuber 15 min at fremme binding af frøene til dækglas-adsorberede antistoffer.
  8. Vask kammeret ved 100 ul / min med 400 pi motilitet buffer for at fjerne ubundet materiale.
    Note 1: Den resulterende massefylde frø bør være 10-30 per felt (figur 2A) mikroskop. Du kan foretage fejlfinding, brug fluorescensmærkede tubulin under polymerisation (trin 3.1) lettere påvisning af dækglasset-attached frø.
    Note 2: Axonemes fremstillet ud fra Chlamydomonas 40 eller andre biologiske kilder, samt pellikeler af lyserede og deciliated Tetrahymena celler 41 kan også anvendes som mikrotubulus kimdannelsesmidler. Disse kimdannelsesmidler er nyttige til at skabe små mikrotubuli arrays, og foretrækkes, når mikrotubuli med bestemt antal protofilamenter ønskes (GMPCPP frø nucleates en mikrotubuli, der indeholder ≥ 14 protofilamenter 42). Disse strukturer kan være knyttet til de rensede dækglas ved uspecifik absorption, men Attachment er normalt mindre stabil sammenlignet med antistof-baserede vedhæftet fil, især når du bruger silaniserede dækglas.

5.. Forberedelse af segmenteret Mikrotubuli

All løsning nedenstående mængder er for kammer volumen 15-20 pi, stige proportionalt, hvis der bruges større kammer.

  1. Forvarm umærket tubulin mix (45 pi motilitet puffer suppleret med 1 mM Mg-GTP og 10-15 uM umærket tubulin) i 30 sekunder ved 35 ° C. Perfuse på 30 ul / min.
  2. Overvåg mikrotubuli vækst med DIC optik (figur 2B, Video 1). Under 5-7 min inkubation mikrotubuli vokser sædvanligvis ~ 10 um lang.
  3. Forbered rhodamin-tubulin-blanding (65 pi motilitet puffer suppleret med 0,5 mM GMPCPP og 2-5 pM af rhodamin-mærket tubulin med 0,5-1 molforhold rhodamin tubulin), og opvarme opløsningen ved 35 ° C i 30 sek.
  4. Perfuse umiddelbart ved 30 μl / min. Inkuber i 8-10 minutter for at fremme dannelse af stabile fluorescerende hætter på mikrotubuli tips. Stabile mikrotubuli segmenter vil også nucleate spontant og vil være synlig med DIC optik.
  5. Vask kammeret godt med 100 pi af motilitet buffer ved 20 ul / min for at fjerne tubulins og nukleotider samt opløselige mikrotubuli fragmenter.
  6. Med DIC, bekræfter, at mikrotubuli er synlige (figur 2D), deres antal bør dog falde, fordi mange mikrotubuli demontere under capping (Video 2 viser en typisk felt med segmenterede mikrotubuli).
    Note 1: Segmented mikrotubuli er meget stabile og kan anvendes i mindst 2 timer. Imidlertid er levetiden af ​​disse mikrotubuli falder med stor opløsning udveksling, eller hvis 2-mercaptoethanol anvendes i billeddannelse buffer.

6.. Eksperimentel Observation af protein Tracking med depolymerisering mikrotubuli Ends

  1. IntrodUCE 30-50 pi fluorescerende protein (0,1-20 nM) i kammeret på 10 ul / min. Hvis protein klistrer til dækglasset er tydeligt, supplere motilitet buffer med 4-8 mg / ml BSA. Alexa488-Dam1 tip-sporing kræver desuden 10 mM DTT eller 0,5-1% βME 10.
  2. Begræns belysning felt ved hjælp af et mikroskop feltblændet at undgå unødvendig blegning og demontering af mikrotubuli.
  3. Start video opkøbet med GFP filter terning, derefter skifte til rhodaminfilteret terning uden at afbryde billedoptagelse. De røde segmenter ved de mikrotubuli ender bør klart være synlige, og de ​​vil begynde at falme og hurtigt opløses (Video 3).
  4. Fortsæt med at belyse, indtil caps næsten forsvinder (normalt for 10-20 sek, men denne gang vil være længere tid for caps vokset med en lavere Rhodamin mærkning ratio), og skifte tilbage til den GFP kanal til at optage protein tracking med mikrotubuli demontering.
  5. Analysereresulterende sekvenser ved at konstruere kymographs, dvs to-dimensionelle billeder, der viser fluorescensintensitet langs mikrotubuli akse for forskellige tidspunkter under observation) ved hjælp MetaMorph, frit tilgængelige ImageJ eller anden billedbehandling software (Figur 2E).
    Note 1: Erhvervelse bør justeres afhængigt af timingen af ​​de observerede hændelser. Den anbefalede dosis er 2-3 frames per sekund (fps) til den langsomme bevægelse, ring-størrelse Dam1 komplekser 27, men erhvervelse tid til enkelte molekyler skal være> 20 fps 19.
    Note 2: En meget følsom EMCCD, fx ANDOR iXon3, er nødvendig for hurtig optagelse af tip-tracking events med depolymerisering mikrotubuli. De anbefalede indstillinger for Andor iXon3 kamera er: gain 5x, EM vinde 200, 1 MHz udlæsning hastighed, 16-bit-sensor-tilstand, 80 ms eksponeringstid.
    Note 3: Brug af TIRF mikroskopi vil forbedre signal-støj-forhold, dog bør anvendes kortere mikrotubuli, sådan that de fluorescerende stabiliserende hætter forbliver inden for rækkevidde af flygtige felt.

7.. Kvantitativ analyse af Molekylær størrelse mikrotubuli Tip-tracking-komplekser

Begrundelsen for denne fremgangsmåde er at bestemme antallet af molekyler i et tip-tracking kompleks ved at finde forholdet mellem det samlede fluorescerende intensitet af spidsen-tracking komplekset til intensiteten af ​​en enkelt fluorophor. Denne fremgangsmåde kan anvendes til GFP-protein-fusioner og proteiner mærket med fluorescerende farvestoffer, men det kan undervurdere antallet af molekyler i tip-tracking-komplekser, hvis nogle protein molekyler i forberedelserne er ikke fluorescerende.

  1. Optag fotoblegning kinetik for de fluorescensmærkede proteinmolekyler.
    1. Saml regelmæssig mikroskopi kammer ved hjælp af en nonmodified glasplade, to strimler af dobbeltklæbende tape, og en ren dækglas, som kan fremstilles ved hjælp af hele protokol nr. 2, eller kun få skridt 2.1-2.6 i denneprotokol.
    2. Tilsæt ca 50 nM protein i motilitet buffer, kort vask med motilitet buffer og forsegle kammeret med VALAP (tabel 4). Optimer proteinkoncentration for at få banen med jævnt spredte pletter (figur 3a), der repræsenterer enkelte molekyler og deres små aggregater (trimerer og tetramerer, der kan danne spontant i opløsningen eller kan vises, når flere enkelte molekyler er tæt på hinanden, og ikke kan løses) . Dette trin er meget vigtigt for at opnå en multi-peak fordeling af fotoblegning trin og nøjagtig bestemmelse af en trinstørrelse (se nedenfor).
    3. Minimer belysningen laser intensitet, hvormed de enkelte fluorescerende pletter er stadig synlige, med lavere belysning fotoblegning tiden forlænges, kan fås så længere fotoblegning spor. Også minimere eksponeringen tid til at reducere sandsynligheden for mere end én fluorofor blegning i løbet af en ramme. Den anbefalede indstillingfor Andor iXon3 kamera: gain 5.0x, EM vinde 999, 10 MHz udlæsning hastighed, 50-100 ms eksponeringstid.
    4. Fokus på overfladen af dækglasset, luk belysning lukker, flytter til en frisk felt, skal du åbne belysning lukker og hente billeder, indtil alle komplekser er bleget (herefter benævnt img (x, y)).
  2. Ret erhvervede billeder til ujævnheder i belysning (figur 3B).
    1. Forbered opløsning af nogen fluorofor, fx 1 uM Fluoresceinisothiocyanat (FITC) i BRB-80. En sådan løsning kan være forberedt på forhånd, alikvoteret og opbevares ved -20 ° C.
    2. Saml et kammer som i afsnit 7.1.1, men bruge en almindelig dækglas. Tilføj fluorophor løsning og forsegle kammeret ved hjælp VALAP.
    3. Saml> 50 billeder af hele mikroskop felt: Flyt scenen til et nyt ubleget område, mens belysningen lukkeren er lukket, og erhverve billederne umiddelbart efter åbning af lukkeren.
      4. (figur 3C). Det resulterende billede repræsenterer fordelingen af belysningsintensiteten af feltet (Illum (x, y), hvor x og y svarer til pixel koordinater).
    4. Bestem det maksimale pixel lysstyrke af dette billede (Max (Illum)).
    5. Med den lukkede belysning lukker og bruge samme kameraindstillinger som i afsnit 7.2.3 erhverve et billede, bestemme den gennemsnitlige pixelintensitet af dette billede, denne værdi svarer til KN, kamera støj.
    6. Bruge ovenstående værdier og billede (Illum (x, y)) til at normalisere den eksperimentelle billede (img (x, y)) efter følgende udtryk:

      Brug det resulterende billede img normen (x, y) til kvantitativ analyse af brightness af de stationære fluorescerende komplekser, og også til at normalisere billeder med tip-krydse komplekser (Figur 3D).
  3. Bestem intensiteten af ​​en enkelt fluorophor.
    1. Brug af normaliserede billeder img normen (x, y) og enhver billedbehandling software vælge en fluorescerende plet med et cirkulært område (5-6 pixels i diameter) og bestemme dens integreret intensitet i alle rammer, genererer fotoblegning spor. Undgå meget lyse prikker (> 5 gange lysere end de svagere dem).
    2. Brug den samme cirkulære region værktøj, vælge mindst 3 spot-frie områder, generere de tilsvarende fotoblegning spor, gennemsnitlige og passer med eksponentiel henfald funktion.
    3. Tabulate baggrund intensitet kurve, der passer til de eksperimentelle tidspunkter og trække det fra fotoblegning kurver.
    4. Glat Fotoblegning kurver (gennemsnit med glidende vindue på 3-5 point). Efterse de resulterende kurver ogkassere enhver kurve, der viser en brat stigning i fluorescens eller mangel på indlysende blegning (figur 3E).
    5. For hver af de resterende kurver (sædvanligvis 50-70% af det samlede antal af kurver), visuelt vælge den endelige plateau, hvor det fluorescerende plet er bleget. Forkort dette segment til at forlade kun ~ 100 point og gennemsnittet af disse intensiteter. Fratræk denne værdi fra den forkortede fotoblegning kurven for at minimere små variationer er baggrundsniveauerne og at reducere størrelsen af ​​baggrunden peak (nedenfor).
    6. Plot et histogram af de intensiteter for alle tidspunkter fra 20 eller flere Fotoblegning kurver (> 1.000 tidspunkter). Histogrammet skal udvise mindst 4 forskellige toppe (se note 2).
    7. Monter histogram med ækvidistante Gaussisk fordeling 10,43 MATLAB, Mathematica eller lignende software (Figur 3F):

      wher A i og σ i, d og N er montering parametre. Parametrene a og σ jeg svarer til amplitude og bredde i'te peak d er afstanden mellem toppene, N er heltal, der svarer til det samlede antal af toppe i fordelingen. Hvis midten af de første tre eller flere toppe viser et visuelt godt match til den tilpassede linje, afstanden mellem disse toppe (parameter d) svarer til en fluorescensintensitet af et enkelt fluorophor.
      Note 1: Antal undersøgte prikker (afsnit 7.3.6) skal forøges, hvis mikroskopi-systemet udviser betydelige svingninger, eller der er en anden kilde til støj (fx ustabil laserstråle).
      Note 2: Det er vigtigt at få> 3 toppe for præcis analyse med ækvidistante gaussisk pasform. Hvis der opnås færre toppe, kan den falske (fx dobbelt) skridt størrelse opnåsnår belysning ikke er optimale, er fx når prikkerne blegemiddel for hurtigt og enkelt trin ikke løst godt.
  4. Bestem den molekylære størrelse af spids-tracking kompleks.
    1. Brug billeder, der er indsamlet med protokol 6, og vælg de første 2-4 rammer, som blev erhvervet umiddelbart efter åbning af lukkeren. Hvis feltet blev belyst i nogen tid, før spidsen sporing blev observeret, anslås det oprindelige intensitet fra kinetikken fotoblegning under de samme eksperimentelle betingelser.
    2. Gennemsnittet af markerede rammer og normalisere det resulterende billede som i afsnit 7.2.5-7.2.7.
    3. Måle integreret intensitet af det fluorescerende spids-tracking kompleks anvendelse af den samme region størrelse som i afsnit 7.3.1.
    4. Mål integreret intensitet af 3 Baggrund områder, som ligger i nærheden af ​​spidsen-tracking kompleks og bruger den samme region, gennemsnitlig disse værdier og trække fra intensiteten af ​​tip-tracking kompleks fra afsnit 7.4.3. Beregne antallet af fluoroforen molekyler i komplekset ved at dividere fluorescensintensiteten opnået i afsnit 7.4.4 af intensiteten af ​​det indre fluorofor opnået i afsnit 7.3.5.
      Note 1: Det er ønskeligt, at belysningen og erhvervelse indstillingerne for protokol 7.4 er de samme som i protokol 7.1. Hvis enten eksponeringstiden eller laser intensitet blev justeret i løbet af disse trin, bør de resulterende fluorescerende værdier skaleres i overensstemmelse hermed. Imidlertid bør rigtigheden af en sådan skalering verificeres af imaging den samme prøve (fx fluorescerende tid) under disse forskellige betingelser, og beregne forholdet mellem de resulterende intensiteter.

8.. Mikrotubulus Tip sporing af Protein Coated Beads

  1. Udføre eksperimenter med tip-tracking-perler ved at udløse MT demontering som i protokol 6. Intensitet af DIC lyskilde bør reduceres for at tillade syn rhodaminfluorescens samtidig medDIC billeddannelse.
  2. Forbered perlerne som i Grishchuk et al. 10 og Asbury et al. 11. Indførelse 30-50 pi perlesuspension ind i kammeret på 10 ul / min. Den foreslåede perle koncentration er 10 -16 -10 -17 M.
  3. Hvis du bruger opretstående mikroskop, fjerne kammeret fra mikroskopbordet og vend det i 5-10 minutter for at give perlerne til sediment på dækglasset. Dette fremmer en bedre binding af perlen til mikrotubuli tøjret til dækglasset, men denne fremgangsmåde er ikke lykkes med 0,5 um polystyrenperler, der viser lidt tyngdekraftbaserede sedimentering under en sådan kort tid.
  4. Vælg en vulst, som er fastgjort til dækglas-tøjret mikrotubulus; vulsten skal bevæge sig i en klar bue 44 (figur 4A). Den bundne perle skal placeres 1-3 um væk fra dækglasset overflade, som er klart synligt på grund af lejlighedsvise dækglas grupperne perler, der forbliver motionless.
  5. Skift til rhodaminfilteret terning og begynde at indsamle billeder, mens du bruger DIC belysning.
  6. Åbent lukker at belyse Billedfeltet (begrænset med et felt membran) med en kviksølv lampe eller 530-550 nm laser. Optegnelsen fortsættes, indtil perlen løsner eller bevæger sig med demontering mikrotubuli ende (figur 4D, 4F, og 4G).
    Note 1: Optisk fælde kan bruges til at fremme samspillet mellem mikrotubuli væg og protein-belagt perle. Dette er især nyttigt, når der arbejdes med perler overtrukket med kinesin motorer (figur 4E-G). Følg samme protokoller som ovenfor, men supplere motilitet buffer med 2 mM Mg-ATP. I trin 8.3, fange en frit flydende perle med 1.064 nm laserstråle, flytte scenen for at bringe den fangne ​​perle tættere på segmenterede mikrotubuli væg. Begynd billeddannelse med lav lys DIC og via rhodaminfilteret terning og vente på perlen til at begynde at gå mod den udjævnede mikrotubuli ende. Aftis observeres rettet perle bevægelse, lukkes lukkeren for fældefangst stråle og åbne lukkeren for fluorescerende belysning. Optegnelsen fortsættes, indtil perlen løsner eller musiknumre med demontering mikrotubuli ende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protein sporing med depolymerisering mikrotubuli slutter. Gær kinetochore komponent Dam1 er langt den bedste tip-tracker for depolymerisering mikrotubuli ender 14. Denne 10-underenhed kompleks mærket med GFP let kan udtrykkes og oprenses fra bakterieceller 18,38, så vi anbefaler at bruge det som en positiv kontrol for tip-sporing assay. En fluorescerende protein, der sporer med depolymerisering ende af en mikrotubuli ses som en lys fluorescerende plet støt bevæger sig mod dækglasset-attached frø (Video 3). Det vil også blive vist som en skrå linje på en tilsvarende kymograph (Figur 2E). I modsætning hertil, hvis proteinet ikke tip-sporet, mikrotubulus forkorter uden at vise berigelse i fluorescerende signal på mikrotubulus ende, som ses til human Ndc80-GFP kompleks 19 (figur 2F). Når observeres processive sporing, satsen for mikrotubuli kortkelse kan bestemmes ved at spore den bevægelige prik eller ved måling af hældningen af ​​den skrå linje på tilsvarende kymograph. Dette kan give oplysninger om styrken af protein-mikrotubuli end binding 45. Proteiner, der binder stærkt til mikrotubuli, ligesom Dam1 ring komplekse, bremse hastigheden af ​​mikrotubuli depolymerisering. Denne effekt afhænger imidlertid stærkt af størrelsen af den tip-sporing kompleks, og de ​​små komplekser kan udøve lille eller ingen effekt på forekomsten af mikrotubuli demontering 27.. Således skal ændringen i hastigheden af ​​mikrotubulus afkortning skal fortolkes i forbindelse med størrelsen af ​​spids-tracking kompleks. Under visse betingelser kan sporingen være ledsaget af en stigning i lysstyrken af ​​tip-sporing kompleks, da den depolymerisering ende "indsamler" det protein, der var bundet til mikrotubuli gitter. I dette tilfælde hastigheden for depolymerisering ofte sinker samtidig med den stigende størrelse af spids-tracking kompleks. I andre tilfælde forholdet er mere kompleks. For eksempel har mange underenheder af Dam1 protein-kompleks, hvori GFP blev konjugeret ved N-terminalen af Dam1 underenhed, kan opsamles ved slutningen af afkortning mikrotubulus (figur 2G). Mikrotubulus demontering sidst båse, formentlig fordi kraft mikrotubuli depolymerisering er ikke stærk nok til at flytte komplekser, der er for store. Demonteringen genoptager ofte efter et fald i tip lysstyrken, hvilket indikerer dissociation af nogle af de tip-associeret Dam1 underenheder 10. Omhyggelig undersøgelse af disse relationer er vigtigt, fordi de mikrotubuli-bindende proteiner, der ikke spore processively også kan bremse hastigheden af mikrotubuli demontering 19,31,46.

Bead sporing med depolymerisering mikrotubuli ender. Mange mikrotubuli-bindende proteiner er allerede blevet identificeret som koblinger til microbead bevægelse med dynamisk microtubule slutter 5,11,27,39,47. Slående, kan selv den Ndc80 proteinkompleks opretholde mikrotubuli ende tip-sporing af perlerne 29,30. Normalt binding mellem protein-coatede beads og mikrotubuli er stærk, så når perler sættes til mikroskopi kammeret de binder let til de segmenterede, dækglas-attached mikrotubuli (figur 4A). Det er ikke altid muligt definitivt at se med DIC om perlen blev knyttet til kun én mikrotubuli. Vi har udviklet en række kriterier for at undgå at optage perlerne, der har dannet vedhæftede filer til flere mikrotubuli. For det første skal en perle, der er knyttet til en mikrotubuli vise en bue-lignende bevægelse, som mikrotubuli svinger lidt omkring stedet i sin vækst fra cover-slip vedhæftet frø (figur 4B). Det andet, når det stabiliserende hætten lyser kun en rød segment skal ses distalt fra frøet og vulsten (figur 4C). Hætten kan ofte ses following perlens bue-lignende bevægelse, indtil cap blegemidler (Video 4). For det tredje bør observeres perlen bevægelse (eller dets løsrivelse) kort tid efter, at hætten er bleget og retningen af ​​perle bevægelse bør være i overensstemmelse med mikrotubuli orientering, der blev udledt på grundlag af de ovenstående bemærkninger. For det fjerde mikrotubuli forkorter og perle bevæger sig mod frø bør amplituden af bue-lignende svingninger falde (figur 4D).

Når sporing af perlen er meget processive, som vist i figur 4D, disse kriterier er ofte opfyldt. Men hvis vulsten sporings ikke processiv efter nogle indledende rettet bevægelse perlen løsner og begynder at diffundere tilfældigt. Med større perler, fx 1 um glasperler denne termiske bevægelse er langsom nok til, at det kunne misfortolkes som en bue, der indeholder bevægelse med afkortning mikrotubulus ende. Et formelt kriterium er baseret på størrelsen afperle afvigelse fra den lineære spor kan anvendes til at forskelsbehandle sådanne begivenheder 29. I vores tidligere arbejde vi beregnet gennemsnit perle udflugter på tværs af mikrotubuli akse og vurderet, at hvis denne værdi oversteg 0,4 mM / 1 um mikrotubuli-parallel perle bevægelse, perlen var tilbøjelige til at diffundere tilfældigt med 95% tillid. Ved hjælp af denne foranstaltning, fandt vi, at selv i "kontrol" perle præparater, fx perler overtrukket med ikke-specifik antistof eller streptavidin-coatede perler, der anvendes sammen med biotinylerede mikrotubuli, 5% af perlerne blev bedømt til at bevæge processively. Hvis der ønskes større nøjagtighed at overvåge bevægelser af perler med lav processivitet, anbefaler vi at bruge en laser fælde, hvor de rettede perle bevægelser er nemmere at identificere.

Laser fælde bør også bruges, hvis perlerne undlader at danne varige vedhæftede filer til stabile mikrotubuli. Vi anvendte en laserstråle til at fange perler overtrukket med forskellige protein konstruktioner af PLUs-end-instrueret kinesin CENP-E og til "Start" sådanne perler på segmenterede mikrotubuli vægge (figur 4E) 24. I nærværelse af ATP disse perler bevæge sig hurtigt (20-25 um / min) mod hætten mikrotubulus plus enderne og på en kymograph sådanne bevægelse resulterer i den skrå linie rettet mod hætten (figur 4F og 4G). Når hætten er ødelagt, en perle belagt med den afkortede CENP-E protein løsner fra mikrotubuli (grøn pil på figur 4F). Imidlertid kan den fulde længde CENP-E-proteinet opretholde perle bevægelse i den modsatte retning, dvs mod minus mikrotubulus ende (Video 5). Som et resultat, kymograph for sådanne perler viser et zigzag-mønster, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​både plus-ende og minus-enden instrueret bevægelser af perler overtrukket med fuld længde og ikke afkortet CENP-E. Vi forventer, at andre mikrotubuli-afhængige motorer kan udvise lignende motilitet 5,13

Figur 1
Figur 1.. Flow kammer til in vitro-undersøgelser med segmenterede eller dynamiske mikrotubuli. A. Diagram af en segmenteret mikrotubuli (MT). Stabile MT frø er udarbejdet med digoxigenin (DIG)-mærkede tubulin og GMPCPP, fastgjort til dækglas via anti-DIG-antistoffer. Specifik binding af tubulin og andre proteiner er blokeret med Pluronic F127. Mikrotubuli er udvidet fra frøene ved hjælp af umærket tubulin og GTP, og disse udvidelser er udjævnet med korte segmenter indeholdende rhodaminmærket tubulin og GMPCPP (i rødt). MT Plus ende (mærket med +) kan normalt være distinguished fra en meget kortere minus ende (-). B og C. Detaljerede ordninger af den modificerede flow kammer slides til brug med opretstående og omvendte mikroskoper. Sonic slots er vist med gult. Tal er i millimeter. D og E. Side udsigt over de ændrede dias (ikke at skalere) med vedhæftede rør;. Tykke pile angiver flydende flow gennem rørene efter kamrene er fuldt samlet (ikke vist) Klik her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2.. Udarbejdelse af segmenterede mikrotubuli og typiske protein tip-sporing resultater. A. Dækglas-attached mikrotubuli frø visualized med DIC optik (trin 4.8 i protokollen), pilene peger på nogle af frøene. Billedet er et gennemsnit af 10 frames erhvervet sekventielt (100 eksponering msek hver). B. Samme mikroskop banen efter tubulin og GTP blev inkuberet i 8 min ved 32 ° C, er mikrotubuli set stammer fra frø (trin 5.2 i protokollen). C. En pseudo-farvet billede, der viser en segmenteret mikrotubuli ses i DIC (grøn) og rhodamin-mærkede stabiliserende hætter (pile), ses med epifluorescens (rød). D. Samme billede som på panel C, men med et større synsfelt. Nogle Rhodamin-holdige mikrotubuli fragmenter, som nucleate spontant i opløsningen i trin 5.2 i protokollen, kan også ses (pilespidser). E. Kymograph af Dam1-GFP-protein spore demontering mikrotubulus ende. Farvekodede søjler, til venstre viser en fluorescerende kanal, der bruges til erhvervelse af den tilsvarende del af kymograph. Vertgiske fluorescerende linjer er skabt af Dam1-GFP-komplekser, der binder til mikrotubuli væggen og vise lidt bevægelse, indtil mikrotubuli ende kommer forbi. F. Kymograph som på E, men med GFP mærket Ndc80 kompleks 19. I første omgang er mikrotubuli dekoreret ensartet, selv om øget GFP-fluorescens er observeret ved den udjævnede ende efter Rhodamin excitation. Denne stigning afhænger opløselige pulje af Ndc80-GFP-protein, men den underliggende mekanisme er ikke kendt. Efter hætten opløses, bliver mikrotubuli afkortning indlysende, men der er lidt berigelse af fluorescens ved mikrotubuli spids, hvilket indikerer en mangel på tip-tracking. G. Afstand fra spids-tracking Dam1 stedet til axoneme, som blev anvendt til mikrotubuli kernedannelse i dette eksperiment 10 blev målt ved anvendelse MetaMorph trackpunkt drop-in. Den oprindelige lysstyrke bevægelige komplekset svarer til omkring 15 underenheder: nok til at danne en enkelt Dam1 ring. Lysstyrken af ​​the flytter kompleks blev normaliseret til intensiteten af ​​dækglas-attached, ubevægelige fluorescerende pletter til at korrigere for blegning. Horisontal skala stænger: paneler A, B, D (10 um), paneler C, F, E (3 m). Vertikale skala stænger:. 10 sek Klik her for at se større billede.

Figur 3
Figur 3. Kvantitativ analyse af fluorescerende signaler. A. Eksempel billede af mikroskopet felt med Dam1-Alexa488 komplekser bindes uspecifikt til dækglasset overflade. Bemærk heterogenitet prikker lysstyrke og ujævnheder i belysningen. Målestokken er 2 mM. B. Kvantitativ repræsentation af det samme billede som i panel A. C D. Normaliserede billede fra panel A plottet som intensitet overflade ved hjælp Mathematica 9 (Wolfram Research). Bemærk, at denne overflade er mere fladt end på B og toppene er mindre uensartet i højden. E. Eksempler på fotoblegning kurver opnået med CENP-E-GFP-protein. Den integrerende intensiteten af ​​hver prik blev opsamlet, normaliseret for at tage hensyn ujævnheder af belysning og kurverne var glattet (gennemsnit med glidende vindue af 5 point). Signaler i den øverste række, blev udelukket fra yderligere analyse af årsager, der er beskrevet i afsnit 7.3.4. Kurver som dem vist i nederste række blev yderligere behandlet og bruges til at bygge et histogram på panel F, som beskrevet i afsnit 7.3.4-7.3.5. F ng>. Histogram af integrerede intensiteter indsamlet fra 22 blegning CENP-E-GFP prikker (i alt 1.900 datapunkter). Rød linje er passende med ækvidistante Gaussisk funktion 5 forskellige toppe er set. Den integrerede intensitet af et enkelt GFP fluorophor bestemmes ud fra dette histogram var (64,7 ± 1,1) x 10 4 au G. Typisk fotoblegning kurve for Dam1-Alexa488, behandlet som beskrevet i protokol 7.3.5. H. Histogram af integrerede intensiteter indsamlet fra 48 fotoblegning Dam1-Alexa488 prikker (i alt 1.548 datapunkter), 4 forskellige toppe er set. Den integrerede intensitet af et Alexa488 molekyle under disse betingelser var (17,4 ± 0,8) x 10 3 au Klik her for at se større billede.

es/ftp_upload/51150/51150fig4.jpg "/>
Figur 4.. Illustration af beslutningsforslag af mikrotubuli-associeret perler. A. Skematisk af forsøget med perler overtrukket med mikrotubuli-bindende proteiner. Tykke pile angiver retningen af mikrotubuli demontering. B. Maksimal intensitet fremskrivning af DIC billeder af en GFP-Dam1-belagt perle, som var stabilt fastgjort til en segmenteret mikrotubuli (baseret på 26 billeder). Bead viste bue-lignende bevægelse (pil), hvilket tyder på, at det var knyttet til en mikrotubuli orienteret som vist med en stiplet linie. C. Enkelt billede af den samme perle som i panel B, men taget i trin 8.6 i protokollen umiddelbart efter fluorescerende lukker blev åbnet. Pilen peger på de fluorescerende hætte placeret nær vulsten, men på den modsatte side af mikrotubulus bindings-site. D. En maksimal intensitet fremskrivning viser bane af perlen bevægelse med disassembling mikrotubuli. Billede blev skabt fra 115 frames erhvervet sekventielt fra starten af imaging (bemærk buelignende projektion), og indtil perlens detachement (Video 4). E. Skematisk af forsøget med perler overtrukket med plus-end-instrueret kinesin CENP-E. Perlen bringes i kontakt med mikrotubuli ved hjælp af laser fælde. Fælden bliver derefter slukket og perle begynder at bevæge sig i retning af mikrotubuli plus. Når der er fjerne og mikrotubuli afmonterede mikrotubulusstabiliserende cap, perlen vender retningen af dens bevægelse. F. Kymograph viser et 0,5 um perle overtrukket med trunkeret X. laevis CENP-E kinesin vej mod mikrotubuli plus ende 24. Efter perlen rejste omkring 1 um blev fluorescerende lukker åbnes (rød bjælke) og stabiliserende hætten blev synlig (rød pilespids). Perlen fritliggende pludseligt (grøn pilespids), formentlig når motoren stødt afkortning mikrotubuli ende. G Klik her for at se større billede.

Video 1. Udarbejdelse af segmenterede mikrotubuli. Videoen viser DIC billeder af et mikroskop felt under forberedelsen af segmenterede mikrotubuli. Imaging starter efter de mikrotubuli frø, der allerede har knyttet til dækglasset. Små runde prikker er fra partikler, der findes i vores forberedelse af anti-digoxigenin antistoffer. Efter tilsættes tubulin og GTP, begynder mikrotubuli til aflang fra frø (trin 5.2). Når de når den ønskede længde (8-15 um), er løsningen udveksles hurtigt at indføre Rhodaminated tubulin og GMPCPP. Under udvekslingsopholdet, mikrotubuli polymerer bøjning i direction af flow, men efter at pumpen er stoppet, de antager unstrained orientering. Under den efterfølgende "capping" fase, nogle tubulin begynder at polymerisere spontant og små mikrotubuli fragmenter ses flydende i kammeret. De fjernes under den efterfølgende vask (trin 5.5), som også fjerner alle opløselige tubulin og nukleotider. Under disse stadier nogle mikrotubuli undlader at samle de robuste caps, og når opløselig tubulin er skyllet væk de skilles ad hurtigt. De udjævnede mikrotubuli, er imidlertid stabilt i flere timer, medmindre de bliver belyst, når Rhodamin er ophidset, hætterne bliver fragmenteret, og de ikke-reducerede mikrotubuli segmenter bliver udsat for. Billederne blev optaget hvert sekund, spillede på 30 fps.

Video 2. Hætten tages af segmenterede mikrotubuli. Videoen viser en færdigsamlet segmenteret mikrotubuli via DIC, efterfulgt af fluorescerende billeder af den samme mikrotubuli via rhodaminfilteret terning. A bhøjre røde segment i slutningen af ​​mikrotubuli (pil) bevæger sig i lysbuen og svinder hurtigt på grund af foto-blegning. Billeder erhvervet på 6 fps og spillede ved 10 fps.

Video 3. Protein sporing med depolymerisering mikrotubuli ende. Et segmenteret mikrotubuli (MT) er synlige takket være udsmykningen af GFP-mærkede Dam1, som danner tydelige punkter (grønne billeder). Rhodaminfluorescens derefter spændt og den røde hætte bliver synlig, bevæger sig i en blid bue i slutningen af ​​mikrotubuli (røde billeder), resten af ​​mikrotubuli er ikke synlige, fordi den mærkede tubulin blev inkorporeret kun polymerens ende. De cap blegemidler hurtige, begynder at smuldre og den fluorescerende terning skiftes tilbage til GFP, lige i tide til at se starten på afkortning af mikrotubuli segment, der ikke har Rhodaminated tubulin og GMPCPP. Når depolymerisering ende når frem Dam1 prikker, bliver mikrotubuli ende lysegrønne. Efterfølgende en grøn fluorescerernt spot ses bevæger sig med demontering mikrotubuli, hvilket illustrerer processive tip-tracking. Koncentration af Dam1 var 3 nM, billeder blev erhvervet og spillet på 0,4 fps. Målestok 5 um.

Video 4. Bead sporing med depolymerisering mikrotubuli slutter. Glasperle belagt med Dam1 ses bevæger sig i en bue, der angiver, at det er bundet til dækglasset med en mikrotubuli. Når rhodaminfluorescens er begejstret, er den røde hætte set distalt fra perlen og bevæger sig synkront med perlen bevægelse (billeder i rødt). Snart perlen begynder at bevæge sig retningsbestemt, mens dens bue-lignende bevægelse falder i amplitude (figur 4D). DIC billeder blev erhvervet via rhodaminfilteret terning hver 300 msek og spillet 6 fps, perle er 1 um, skala bar 5 um.

Video 5. Kinesin-belagt perle bevæger tovejs på segmenterede mikrotubuli. Imaging starter efter perlen CoATED med fuld længde CENP-E kinesin blev placeret på mikrotubuli (MT) væg. Pil point til den oprindelige perle position. Perlen ses bevæger sig væk fra pilen, da motoren går mod plus mikrotubuli ende. Snart efter plus endekappe er belyst (pilespids, rød billeder), perlen begynder at bevæge sig i den modsatte retning. Kun fuld længde CENP-E kinesin kan koble bevægelse af perlen til afkortning mikrotubuli ende. Perler belagt med afkortet CENP-E kan bevæge sig mod plus-MT ende, men de løsnes hurtigt efter mikrotubuli depolymerisering udløses (sammenlign figur 4F og 4G). DIC billeder blev erhvervet hver 1 sek og spillede ved 16 fps, perle er 0,5 mM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mange enkelt molekyle assays dag rutinemæssigt bruger specielt behandlede dækglas til drastisk at reducere uspecifik protein stikning. Den procedure, vi beskriver her er en modificering af den oprindelige protokol udviklet i Howard lab 32, og vi finder, at silanizing dækglas er indsatsen værd, selv med DIC-baserede perle assays, der ikke anvender fluorescens. Chambers samlet med disse dækglas viser meget renere overflader, og de opnåede resultater i nærvær af opløseligt mikrotubulus-bindende protein er mere reproducerbar, især hvis der anvendes en meget lav proteinkoncentration.

De mest kritiske skridt for en vellykket forberedelse af segmenterede MTS er:

  1. optimering af tubulin koncentration og inkubationstider (trin 5,1-5,2). De tider og koncentrationer angivet i protokollen er omtrentlige og kan variere på grund af forskelle i tubulin præparater, kammer volumen osv.
  2. specifik og stramfastgørelse af mikrotubulus kimdannelsesmidler til dækglasset, og
  3. evnen til at kontrollere strømningshastigheder præcist. I vores hænder, er de bedste resultater opnås, når eksperimenter udført i de forseglede strømningskamre.

Den største fordel ved denne protokol er, at mikrotubuli depolymerisering kan udløses med høj tidslig og rumlig opløsning og dermed bistå analyse af bevægelserne på demonteringen mikrotubuli ender. Med denne teknik kan buffere kan ændres hurtigt, og mikrotubulus-bindende proteiner og perler kan tilsættes i en række forskellige buffere efter mikrotubuli har dannet. Dette giver mulighed for studiet af virkningerne af et protein på mikrotubuli depolymerisering adskilt fra dens mulige roller i mikrotubulusaggregering. Dette er nyttigt hvis proteinet også kan interagere med opløselig tubulin, hvilket kan maskere dets interaktioner med mikrotubuli. Men da fri, upolymeriseret tubulin er til stede i cellen, der bør udvises forsigtighed whøne tolkning fysiologiske betydning af sådanne resultater.

Den væsentligste begrænsning af segmenterede mikrotubuli tilgang er, at det ikke er egnet til at studere bevægelser under mikrotubulusaggregering eller virkningerne af sporing proteiner på mikrotubulus katastrofe og redning. For disse spørgsmål, assays med dynamiske mikrotubuli dyrket i nærvær af opløselig tubulin er mere passende. En anden begrænsning ved denne metode er, at motilitet buffere bør være fri for oxygen-fjernende enzymer. Sådanne enzymblandinger kan fx baseret på katalase og glucose-oxidase 48, en væsentlig forbedring af levetiden for fluorescerende molekyler. Men hvis disse reagenser anvendes i segmenterede mikrotubuli assay, foto-induktion af demontering er sjælden, fordi mikrotubuli hætter blegemiddel uden disintegration. I kvantitative fluorescensanalyser, altid skal tages hensyn til graden af ​​blegning, som beskrevet ovenfor, eller for eksempel i henvisningen23, især hvis der ikke anvendes anti-blegemidler.

Testes i segmenterede mikrotubuli assay Adskillige mikrotubuli-bindende proteiner udviste præferentiel binding til Rhodamine-mærkede stabiliserende hætter vs umærkede mikrotubuli segmenter. Binding til hætterne kan reducere den brøkdel af processive perler, da cap-associerede perler ofte løsnes fra mikrotubuli når hætten opløses. Endelig bemærker vi, at hvis motor-coatede perler gå mod plus mikrotubuli ende meget hurtigt, de ofte nå de røde huer før mikrotubuli depolymerisering udløses, i hvilket tilfælde de vil også tage afstand fra mikrotubuli og sådan et eksperiment vil ikke være produktiv .

Sammenfattende evne mikrotubulus-bindende proteiner med nogen iboende motorisk aktivitet at følge afkortning enden af ​​en mikrotubuli er en interessant, men dårligt forstået fænomen. De her beskrevne protokoller bør bistå undersøgelser af sådanne PRoteins og deres egenskaber in vitro. Mikrotubuli depolymerisering-afhængige transport spiller en vigtig rolle i kromosomsegregering under mitose. Således håber vi, at de teknikker, der er beskrevet her i sidste ende vil bidrage til at få mere indsigt i de mekanismer for celledeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke FI Ataullakhanov for at hjælpe med at designe og fremstille genanvendelige strømningskamre, N. Dashkevich, N. Gudimchuk og A. Korbalev for at levere billeder til figurer, N. Gudimchuk og P. Zakharov for at udvikle en protokol og levere reagenser til forberede digoxigenin-mærket mikrotubuli frø, A. Potapenkos hjælp til tekstredigering og andre medlemmer af Grishchuk laboratorium for tips og diskussioner. Dette arbejde blev støttet delvist af NIH tilskud GM R01-098.389 og en pilot tilskud fra Pennsylvania Muskel Institute til ELG, der er en Kimmel Scholar ved RFBR giver 12-04-00.111-en 13-04-40.190-H og 13 -04-40188-H, Russian Academy of Sciences Præsidiets Grants (Mekanismer Molekylær Systems Integration og Molekylær og molekylær cellebiologi programmer) til FI Ataullakhanov, NIH tilskud GM R01 GM033787 til JR McIntosh og en Dmitry Zimin dynastiet Foundation postdoc-stipendium til at VAV

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1. Microscopy and other equipment.
Microscope Zeiss
Nikon		 Axio Imager 2
Eclipse Ti		 other microscope models capable of DIC and epifluorescence-imaging can be used
Objective Zeiss
Nikon		 420490-9900-000
CFI Apo 100x Oil 1.49		 100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Objective heater Bioptechs 150803, 150819-19
Fluorescent filter cube Chroma 49004 or 49008
41017 or 49020		 optimized for Rhodamine fluorescence 
optimized for GFP fluorescence
Acquisition software freeware MicroManager
Molecular Devices		 not applicable
MetaMorph 7.5		 http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/
other software can be used to acquire images and for a particle tracking
EMCCD camera Andor iXon3, DU-897E-cs0-#BV Highly sensitive EMCCD camera
Trapping laser IPG Photonics YLR-10-1064-LP 1,064 nm laser, 10 W
Fluorescence excitation lasers Coherent, Inc.
Coherent, Inc.		 Sapphire 488 LP
Sapphire 552 LP		 excitation of green fluorophores
excitation of red fluorophores
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Commercial flow chambers Warner Instruments RC-20 or RC-30
Perfusion pump Cole Palmer
Harvard Apparatus		 Masterflex 77120-52
Pico Plus		 Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia. 
Table 2. Microscopy chamber preparation.
Modified microscope slides for reusable chambers Precision Glassblowing of Colorado Custom order www.precisionglassblowing.com Sonic slots in slides using schematics in Figure 1
Polyethylene tubing Intramedic 427410 I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container
Polyethylene tubing Intramedic 427400 I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber
Regular microscope slides VWR 48312-003 Other similar slides can be used
Coverslips VWR 48393-150, 48366-067 Other similar coverslips can be used
Silicon sealant World Precision Instruments KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE
Epoxy glue Loctite 83082
Cyanoacrylate adhesive Scotch 3M AD114 Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers
Table 3. Coverslips cleaning and coating.
Molecular Sieves, Grade 564 Macron 4490-04
Coverglass Staining Jar Ted Pella, Inc. 21036
Coverslip Ceramic Holder Thomas Scientific 8542e40
PlusOne Repel Silane GE Healthcare Biosciences 17-1332-01
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Anti-digoxigenin AB Roche Applied Science 11093274910
Table 4. Preparation of seeds and segmented microtubules.
Tubulin purified from cow brains
Cytoskeleton, Inc
T238P		 For purification protocols see 49–51
Unlabeled porcine tubulin
Labeled tubulin Cytoskeleton, Inc
Invitrogen
Invitrogen		 TL590M
C1171 (Rhodamine)
A-2952 (Digoxigenin)		 Rhodamine-labeled porcine tubulin
Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.
GMPCPP Jena Biosciences NU-405 Aliquot and store at -70 °C
VALAP Vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass see reference9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13, 83-117 (1997).
  2. Mitchison, T. M., Kirschner, M. W. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
  3. Walker, R. A., Brien, O., et al. Dynamic Instability of Individual Microtubules Analyzed by Video Light Microscopy: Rate Constants and Transition Frequencies. J. Cell Biol. 107, 1437-1448 (1988).
  4. Gardner, M. K., Zanic, M., Gell, C., Bormuth, V., Howard, J. Depolymerizing Kinesins Kip3 and MCAK Shape Cellular Microtubule Architecture by Differential Control of Catastrophe. Cell. 147 (5), 1092-1103 (2011).
  5. Lombillo, V. A., Stewart, R. J., McIntosh, J. R. Minus-end-directed motion of kinesin-coated microspheres driven by microtubule depolymerization. Nature. 373, 161-164 (1995).
  6. Franck, A. D., Powers, A. F., Gestaut, D. R., Gonen, T., Davis, T. N., Asbury, C. L. Tension applied through the Dam1 complex promotes microtubule elongation providing a direct mechanism for length control in mitosis. Nat. Cell Biol. 9 (7), 832-837 (2007).
  7. Tran, P. T., Walker, R. A., Salmon, E. D. A metastable intermediate state of microtubule dynamic instability that differs significantly between plus and minus ends. J. Cell Biol. 138 (1), 105-117 (1997).
  8. Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438, 384-388 Forthcoming.
  9. Coue, M., Lombillo, A., Richard, J. Microtubule Depolymerization Promotes Particle and Chromosome Movement In Vitro. J. Cell Biol. 112 (6), 1165-1175 (1991).
  10. Grishchuk, E. L., Spiridonov, I. S., et al. Different assemblies of the DAM1 complex follow shortening microtubules by distinct mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (19), 6918-6923 (2008).
  11. Asbury, C. L., Gestaut, D. R., Powers, A. F., Franck, A. D., Davis, T. N. The Dam1 kinetochore complex harnesses microtubule dynamics to produce force and movement. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (26), 9873-9878 (2006).
  12. Westermann, S., Wang, H. -W., Avila-Sakar, A., Drubin, D. G., Nogales, E., Barnes, G. The Dam1 kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends. Nature. 440 (7083), 565-569 (2006).
  13. Grissom, P. M., Fiedler, T., Grishchuk, E. L., Nicastro, D., West, R. R., Mcintosh, J. R. Kinesin-8 from Fission Yeast A Heterodimeric , Plus-End – directed Motor that Can Couple Microtubule Depolymerization to Cargo Movement. Mol. Biol. Cell. 20, 963-972 (2009).
  14. McIntosh, J. R., Volkov, V., Ataullakhanov, F. I., Grishchuk, E. L. Tubulin depolymerization may be an ancient biological motor. J. Sci. 123, 3425-3434 (2010).
  15. Grishchuk, E. L., McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Force generation by dynamic microtubule polymers. Compr. Biophys. 4, 93-117 (2012).
  16. Asbury, C. L., Tien, J. F., Davis, T. N. Kinetochores' gripping feat: conformational wave or biased diffusion. Trends Cell Biol. (1), 38-46 (2011).
  17. Tien, J. F., Umbreit, N. T., et al. Cooperation of the Dam1 and Ndc80 kinetochore complexes enhances microtubule coupling and is regulated by aurora B. Cell Biol. 189 (4), 713-723 (2010).
  18. Gestaut, D. R., Graczyk, B., et al. Phosphoregulation and depolymerization-driven movement of the Dam1 complex do not require ring formation. Nat. Biol. 10 (4), 407-414 (2008).
  19. Schmidt, J. C., Arthanari, H., et al. The Kinetochore-Bound Ska1 Complex Tracks Depolymerizing Microtubules and Binds to Curved Protofilaments. Dev. Cell. 23 (5), 968-980 (2012).
  20. Brouhard, G. J., Stear, J. H., et al. XMAP215 is a processive microtubule polymerase. Cell. 132 (1), 79-88 (2008).
  21. Stumpff, J., Du, Y., et al. A Tethering Mechanism Controls the Processivity and Kinetochore-Microtubule Plus-End Enrichment of the Kinesin-8 Kif18A. Mol. Cell. 43 (5), 764-775 (2011).
  22. Su, X., Qui, W., Gupta, M., Pereira-Leal, J., Reck-Peterson, S. L., Pellman, D. Mechanisms underlying the dual-mode regulation of microtubule dynamics by Kip3/kinesin-8. Mol. Cell. 43 (5), 751-763 (2011).
  23. Helenius, J., Brouhard, G., Kalaidzidis, Y., Diez, S., Howard, J. The depolymerizing kinesin MCAK uses lattice diffusion to rapidly target microtubule ends. Nature. 441 (7089), 115-119 (2006).
  24. Gudimchuk, N., Vitre, B., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nat. Cell Biol. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  25. Akhmanova, A., Steinmetz, M. Microtubule +TIPs at a glance. J. Sci. 20 (Pt 20), 3415-3419 (2010).
  26. Dixit, R., Barnett, B., Lazarus, J., Tokito, M., Goldman, Y., Holzbaur, E. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (2), 492-497 (2009).
  27. Grishchuk, E. L., Efremov, A. K., et al. The Dam1 ring binds microtubules strongly enough to be a processive as well as energy-efficient coupler for chromosome motion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (40), 15423-15428 (2008).
  28. Akiyoshi, B., Sarangapani, K. K., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  29. McIntosh, J. R., Grishchuk, E. L., et al. Fibrils Connect Microtubule Tips with Kinetochores A Mechanism to Couple Tubulin Dynamics to Chromosome Motion. Cell. 135 (2), 322-333 (2008).
  30. Powers, A. F., Franck, A. D., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  31. Umbreit, N. T., Gestaut, D. R., et al. The Ndc80 kinetochore complex directly modulates microtubule dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (40), 16113-16118 (2012).
  32. Gell, C., Bormuth, V., et al. Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods Biol. 95, 221-245 (2010).
  33. Dixit, R., Ross, J. L. Studying Plus-End Tracking at Single Molecule Resolution Using TIRF Microscopy. Methods Cell Biol. 95, 543-554 (2010).
  34. Beausang, F. J., Sun, Y., Quinlan, E. M., Forkey, N. J., Goldman, Y. Construction of Flow Chambers for Polarized Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (polTIRFM). Cold Spring Harbour Protoc. 6, 712-715 (2012).
  35. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP Hydrolysis in Microtubule Dynamics: Information from a Slowly Hydrolyzable Analogue, GMPCPP. Mol. Biol. Cell. 3, 1155-1167 (1992).
  36. Grishchuk, E. L., Ataullakhanov, F. I. In Vitro Assays to Study the Tracking of Shortening Microtubule Ends and to Measure Associated Forces. Methods Cell Biol. 95, 657-676 (2010).
  37. Gutiérrez-Medina, B., Block, S. M. Visualizing individual microtubules by bright field microscopy. Am. J. Phys. 78 (11), 1152-1159 (2010).
  38. Volkov, V. A., Zaytsev, A. V., et al. Long tethers provide high-force coupling of the Dam1 ring to shortening microtubules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (19), 7708-7713 (2013).
  39. Laan, L., Pavin, N., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
  40. Myster, S. H., Knott, J. A., O'Toole, E., Porter, M. E. The Chlamydomonas Dhc1 gene encodes a dynein heavy chain subunit required for assembly of the I1 inner arm complex. Mol. Biol. Cell. 8, 607-620 (1997).
  41. Lombillo, V. A., Coue, M., McIntosh, J. R. In vitro motility assays using microtubules tethered to Tetrahymena pellicles. Methods Cell Biol. 39, 149-165 (1993).
  42. Hyman, A., Chrétien, D., Arnal, I., Wade, R. Structural changes accompanying GTP hydrolysis in microtubules: information from a slowly hydrolyzable analogue guanylyl-(alpha,beta)-methylene-diphosphonate. J. Cell Biol. 128 (1-2), 117-125 (1995).
  43. Park, M., Kim, H., Kim, D., Song, N. W. Counting the Number of Fluorophores Labeled in Biomolecules by Observing the Fluorescence-Intensity Transient of a Single Molecule. Bull. Chem. Soc. Jap. 78, 1612-1618 (2005).
  44. Welburn, J. P. I., Grishchuk, E. L., Backer, C. B., Wilson-Kubalek, E. M., Yates, J. R., Cheeseman, I. M. The human kinetochore Ska1 complex facilitates microtubule depolymerization-coupled motility. Dev. Cell. 16 (3), 374-385 (2009).
  45. Efremov, A., Grishchuk, E. L., Mcintosh, J. R., Ataullakhanov, F. I. In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromosome motions. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (48), 19017-19022 (2007).
  46. Itoh, T., Hisanaga, S., Hosoi, T., Kishimoto, T., Hotani, H. Phosphorylation states of microtubule-associated protein 2 (MAP2) determine the regulatory role of MAP2 in microtubule dynamics. Biochemistry. 36 (41), 12574-12582 (1997).
  47. Oguchi, Y., Uchimura, S., Ohki, T., Mikhailenko, S. V., Ishiwata, S. The bidirectional depolymerizer MCAK generates force by disassembling both microtubule ends. Nat. Biol. (6), 1-8 (2011).
  48. Kishino, A., Yanagida, T. Force measurements by micromanipulation of a single actin filament by glass needles. Nature. 334, 74-76 (1988).
  49. Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro. Ann. NY Acad. Sci. 253, 107-132 (1975).
  50. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S., Kirschner, M. W. A Protein Factor Essential for Microtubule Assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  51. Widlund, P. O., Podolski, M., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Mol. Biol. Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  52. Hyman, A., Drechsel, D., et al. Preparation of Modified Tubulins. Methods Enzymol. 196, 478-485 (1991).

Tags

Grundlæggende protokol mikroskopi flow kammer single-molekyle fluorescens laser fælde mikrotubulus-bindende protein mikrotubuli-afhængige motor mikrotubuli tip-sporing
Udarbejdelse af Segmenteret Mikrotubuli at studere Forslag drevet af demontering mikrotubuli Ends
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Volkov, V. A., Zaytsev, A. V.,… More

Volkov, V. A., Zaytsev, A. V., Grishchuk, E. L. Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends. J. Vis. Exp. (85), e51150, doi:10.3791/51150 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter