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Biology

Disassembling Microtubule रुप से प्रेरित प्रस्ताव का अध्ययन करने के खंडों सूक्ष्मनलिकाएं तैयारी

Published: March 15, 2014 doi: 10.3791/51150
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 2Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow, Russia, 3Physiology Department, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

सूक्ष्मनलिकाएं स्वाभाविक रूप से अस्थिर पॉलिमर हैं, और विकास और छोटा करने के बीच उनके स्विचिंग स्टोकेस्टिक और नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है. यहाँ हम photoablatable स्थिर टोपी के साथ खंडों सूक्ष्मनलिकाएं का उपयोग प्रोटोकॉल का वर्णन. खंडों सूक्ष्मनलिकाएं depolymerization जिससे disassembling microtubule के साथ समाप्त होता गतियों का विश्लेषण सहायता, उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ शुरू किया जा सकता है.

Abstract

Microtubule depolymerization विट्रो में विभिन्न प्रोटीन परिसरों और प्रोटीन में लिपटे मोतियों के परिवहन के लिए बल प्रदान कर सकते हैं. अंतर्निहित तंत्र कोशिका विभाजन के दौरान microtubule निर्भर गुणसूत्र गतियों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा लगा रहे हैं, लेकिन प्रासंगिक प्रोटीन और उनके सटीक भूमिकाओं बुरा परिभाषित कर रहे हैं. इस प्रकार, शुद्ध घटकों और परिभाषित जैव रासायनिक वातावरण का उपयोग इन विट्रो में ऐसी गतिशीलता का अध्ययन करने के साथ जो assays विकसित करने के लिए एक बढ़ती आवश्यकता है. सूक्ष्मनलिकाएं, तथापि, स्वाभाविक रूप से अस्थिर पॉलिमर कर रहे हैं, विकास और छोटा करने के बीच उनके स्विचिंग स्टोकेस्टिक और नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है. हम यहाँ वर्णन प्रोटोकॉल photoablatable टोपियां स्थिर साथ बना रहे हैं कि खंडों सूक्ष्मनलिकाएं का लाभ ले. ऐसे खंडों सूक्ष्मनलिकाएं depolymerization जिससे disassembling microtubule सिरों पर गतिशीलता के अध्ययन की सहायता, उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ शुरू किया जा सकता है. इस तकनीक सीए करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैगतिशील microtubule के साथ समाप्त होता processively जो कदम fluorescently लेबल प्रोटीन परिसरों में अणुओं की संख्या का एक मात्रात्मक विश्लेषण बाहर RRY. एक इस में संकेत करने वाली शोर अनुपात और अन्य मात्रात्मक फ्लोरोसेंट assays का अनुकूलन करने के लिए, coverslips घुलनशील fluorescently लेबल प्रोटीन की अविशिष्ट अवशोषण को कम करने के लिए इलाज किया जाना चाहिए. विस्तृत प्रोटोकॉल खाते में फ्लोरोसेंट रोशनी की असमता ले, और समान दूरी गाऊसी फिट का उपयोग कर एक एकल फ्लोरोफोरे की तीव्रता का निर्धारण करने के लिए प्रदान की जाती हैं. अंत में, हम processive कार्गो गति को जोड़े microtubule depolymerization को अलग मोटर और nonmotor प्रोटीन की क्षमता में अंतर्दृष्टि प्रदान करने, प्रोटीन में लिपटे microbeads के microtubule निर्भर गतियों का अध्ययन करने के खंडों सूक्ष्मनलिकाएं के उपयोग का वर्णन.

Introduction

सूक्ष्मनलिकाएं अत्यधिक सेलुलर वास्तुकला, सेल गतिशीलता, कोशिका विभाजन, और intracellular परिवहन 1 के लिए महत्वपूर्ण हैं कि cytoskeletal संरचनाओं संरक्षित कर रहे हैं. ये गतिशील पॉलिमर जीटीपी की उपस्थिति में ट्यूबिलिन से इकट्ठा, और वे सहज विकास और 2 छोटा करने के बीच स्विच. सूक्ष्मनलिकाएं (व्यास में केवल 25 एनएम) के विपरीत एक प्रकाश माइक्रोस्कोप से सूक्ष्मनलिकाएं निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए बढ़ाने के लिए इसलिए विशेष ऑप्टिकल तकनीक बहुत पतले होते हैं. इन पॉलिमर के साथ पिछले काम अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) 3 का उपयोग उनके गतिशील व्यवहार की जांच की. इन विट्रो में यह और इसी तरह के अध्ययन ठेठ प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, सूक्ष्मनलिकाएं, केवल शायद ही कभी depolymerization को तबाही और स्विच गुजरना पता चला है कि एक बार हर 5-15 मिनट (इस आवृत्ति 28-32 डिग्री सेल्सियस पर जांच 7-15 मिमी घुलनशील ट्यूबिलिन एकाग्रता के लिए है ) 4. विभिन्न तकनीकों इस प्रकार induc करने का प्रस्ताव किया गया हैएक नियंत्रित तरीके से ई microtubule depolymerization. Microtubule छोटा रूप में यहाँ वर्णित, दूर घुलनशील ट्यूबिलिन 5,6 धोने एक लेजर बीम 7 के साथ सूक्ष्मनलिकाएं काटने, या खंडों सूक्ष्मनलिकाएं 8 का उपयोग करके चालू किया जा सकता है. खंडों सूक्ष्मनलिकाएं, साथ ही stochastically स्विचन पॉलिमर का उपयोग पिछला काम, ऐसे गुणसूत्रों, पुटिका, और प्रोटीन में लिपटे मोतियों के रूप में छोटे intracellular cargos, छोटा सूक्ष्मनलिकाएं 9-13 के सिरों पर स्थानांतरित कर सकते हैं कि मिल गया है. इस घटना mitotic कोशिकाओं में गुणसूत्र गतियों के लिए एक सीधा प्रभाव है सोचा, और अंतर्निहित तंत्र सक्रिय जांच 14-16 के अंतर्गत वर्तमान में है.

हाल ही में, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी सहित फ्लोरोसेंट आधारित तकनीकों, गतिशील microtubule साथ गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है 17-24 समाप्त होता है. इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि अनुमति देता है बातचीत की परीक्षाविभिन्न fluorophores के साथ लेबल प्रोटीन का उपयोग वास्तविक समय में सूक्ष्मनलिकाएं और microtubule बाध्यकारी प्रोटीन के बीच है. कई प्रोटीन परिसरों microtubule सिरों elongating और / या छोटा करने के साथ processively स्थानांतरित करने के लिए पाए गए. वे microtubule जुड़े प्रोटीन Dam1 10,12,18, Ska1 19, और XMAP215 20, साथ ही kinesin मोटर्स Kif18A 21,22, MCAK 23 और CENP ई 24 में शामिल हैं. ये प्रोटीन EB1 25 की तरह क्लासिक नोक पर नज़र रखने के लिए प्रोटीन के उस से मौलिक अलग है जो processive टिप ट्रैकिंग, दिखा रहे हैं. EB1 अणुओं और जुड़े भागीदारों stably गतिशील microtubule व्यक्तिगत अणुओं तेजी से घुलनशील पूल 26 के साथ आदान प्रदान, केवल ~ 0.8 सेकंड के लिए microtubule टिप करने के लिए बाध्य रहते हैं, छोर से जुड़े रहने के लिए दिखाई देते हैं. Microtubule कई माइक्रोन के लिए समाप्त हो जाती है साथ इसके विपरीत, processive टिप trackers, Dam1 तरह, यात्रा, और microtubule सुझावों के साथ अपने सहयोग मीटर के लिए पिछले कर सकते हैंकिसी भी सेकंड. टिप एसोसिएशन समय है, साथ ही ट्रैकिंग के परिणामस्वरूप दर, टिप ट्रैकिंग जटिल 27 कि फार्म अणुओं की संख्या पर दृढ़ता से निर्भर करता है. बड़ा प्रोटीन ensembles आमतौर पर ज्यादा बेहतर टिप trackers हैं. उदाहरण के लिए, अलग खमीर गुणसूत्रीबिंदुओं के रूप में इस तरह के जटिल विधानसभाओं microtubule के लिए युग्मित रह सकता घंटे 28 के लिए समाप्त हो जाती है. कुछ microtubule बाध्यकारी प्रोटीन, जैसे Ndc80 kinetochore प्रोटीन जटिल, एक अणु के स्तर पर समाप्त होता है microtubule साथ ट्रैक करने में असमर्थ हो पाया है, फिर भी Ndc80 मनका कार्गो 19,29-31 की गति युग्मन में बहुत कुशल है किया गया है. इस प्रकार, विभिन्न प्रोटीन परिसरों, साथ ही उनके जैविक भूमिकाओं से नोक पर नज़र रखने के तंत्र को समझने के लिए, यह टिप ट्रैकिंग परिसर में अणुओं की संख्या के एक समारोह के रूप में की नोक पर नज़र रखने की जांच करने के लिए, साथ ही यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है मनका कार्गो की सतह पर सामूहिक गतिशीलता प्रदर्शन करने के लिए इन परिसरों की क्षमता.

(चित्रा 1 ए) के साथ प्रयोगों को तैयार करने और संचालन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान नीचे. सबसे पहले, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध गिलास स्लाइड कम पॉलीथीन टयूबिंग (1 प्रोटोकॉल) संलग्न करने के लिए संशोधित कर रहे हैं. पुन: प्रयोज्य माइक्रोस्कोपी प्रवाह चैम्बर तो इस तरह के एक स्लाइड से इकट्ठा किया और रासायनिक या प्लाज्मा साफ और silanized coverslip (प्रोटोकॉल 2) 32-34 है. परिणामस्वरूप मात्रा कक्ष इनलेट टयूबिंग की मात्रा सहित केवल 20-25 μl (या 15 μl के रूप में छोटे, प्रोटोकॉल 1 में नोट 3 देखें), है. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रवाह कक्षों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन उनकी मात्रा प्रोटीन की अनावश्यक बर्बादी के लिए अग्रणी, आम तौर पर बड़ा है. एक बड़े कक्ष में कार्यरत है, तो नीचे प्रोटोकॉल में सभी समाधान की मात्रा आनुपातिक बढ़ाया जाना चाहिए. Microtubule बीज फिर धीरे hydrolysable जीटीपी अनुरूप, GMPCPP (ग्वानोसिन-5'-[(α, β) methyleno] triphosphate) (प्रोटोकॉल 3 का उपयोग कर उदाहरण के लिए, तैयार हैं, Hyman <भी देखनाउन्हें> एट अल. 35). बीज एक साफ coverslip पर स्थिर रहे हैं और सतह बाद में अन्य प्रोटीन की अविशिष्ट अवशोषण को रोकने के लिए ब्लॉक किया गया है 32 (प्रोटोकॉल 4 digoxigenin का उपयोग कर बीज स्थिरीकरण का वर्णन). खंडित सूक्ष्मनलिकाएं तो प्रोटोकॉल 5 का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण के लिए मुख्य तर्क यह जीटीपी की उपस्थिति में जो फार्म गतिशील microtubule पॉलिमर, GMPCPP होते हैं जो स्थिर ट्यूबिलिन खंडों की कमी "टोपी" जोड़कर अस्थायी रूप से स्थिर किया जा सकता है. ये टोपियां भी rhodamine-लेबल ट्यूबिलिन होते हैं, तो वे एक 530-550 एनएम लेजर या पारा आर्क दीपक (प्रोटोकॉल 6) 36 के साथ देखने के क्षेत्र को प्रकाशित करके बस हटाया जा सकता है. टिप ट्रैकिंग संकेत के प्रतिदीप्ति तीव्रता तो खाते में माइक्रोस्कोप क्षेत्र रोशनी (प्रोटोकॉल 7) की असमता ले रही है, disassembling microtubule के साथ समाप्त होता है कि यात्रा के अणुओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक समान दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया जा सकता है27 (प्रोटोकॉल 8) के रूप में वर्णित तैयार depolymerizing सूक्ष्मनलिकाएं और प्रोटीन में लिपटे मोतियों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए. कुछ प्रोटीन आसानी खंडों सूक्ष्मनलिकाएं की दीवारों के लिए बाध्य होगा, लेकिन लेजर चिमटी भी इस तरह अपने बंधन को बढ़ावा देने, microtubule दीवार के पास मोती धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

आवश्यक उपकरण: नीचे वर्णित प्रयोगों डीआईसी और प्रतिदीप्ति इमेजिंग (तालिका 1) के लिए सुसज्जित एक प्रकाश माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है. उज्ज्वल क्षेत्र एलईडी रोशनी काफी एक नियमित हलोजन दीपक के साथ पालन करने के लिए मुश्किल हो जाता है जो coverslip संलग्न microtubule बीज 37, का पता लगाने में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. माइक्रोस्कोपी कक्षों में तरल के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए, समाधान 10-100 μl / मिनट से प्रवाह गति में सक्षम एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के साथ विमर्श किया जाना चाहिए. एक सिरिंज पंप का भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन देखभाल के प्रवाह की गति अचानक बदल जाता है जब फार्म का हो सकता है कि हवाई बुलबुले से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. प्रोटीन में लिपटे मोतियों से निपटने के लिए, उदाहरण के लिए खंडों microtubule दीवार के करीब लाने के लिए, एक 1,064 एनएम निरंतर तरंग लेजर बीम खुर्दबीन के ऑप्टिकल अक्ष में पेश किया और निर्माण करने के लिए एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य (1.3 या अधिक) के साथ ध्यान केंद्रित किया जा सकता है एक जाल. फ्लोरोसेंट की मात्रात्मक विश्लेषण के लिएउत्तेजना प्रकाश इस प्रकाश स्रोत की तीव्रता के बाद से एक लेजर आधार स्रोत द्वारा प्रदान की जानी चाहिए एकल अणुओं की तीव्रता एक पारा दीपक द्वारा उत्पन्न है कि अधिक से अधिक स्थिर है. यांत्रिक कंपन को कम करने के लिए, माइक्रोस्कोप एक ऑप्टिकल मेज पर रखा जाना चाहिए. अधिक परिष्कृत उपकरण depolymerizing microtubule एक निरंतर बल के तहत समाप्त होता है के साथ मोती के आंदोलन का अध्ययन करने के लिए, और एकल शॉट बल संकेतों 11,38,39 उपाय करने की आवश्यकता है, इन तरीकों कहीं वर्णित किया जाएगा.

1. विनिर्माण पुन: प्रयोज्य प्रवाह कक्षों

पुन: प्रयोज्य प्रवाह कक्षों के लिए गिलास स्लाइड (हमारे सप्लायर के बारे में जानकारी के लिए 2 टेबल देखें) चित्रा 1 बी में schematics का उपयोग कर एक स्थानीय गिलास विनिर्माण सुविधा से आदेश दिया जा सकता है. अल्ट्रासोनिक मिलिंग के साथ नियमित रूप से खुर्दबीन दो खांचे 15 ± 1 मिमी लंबा बनाने के लिए स्लाइड (75 मिमी x 25 मिमी, मोटी 1.0 मिमी), 1.0 ± 0.1 मिमी चौड़े और गहरे 0.8 ± 0.05 मिमी संशोधित.निकटतम सिरों के बीच की दूरी 14 ± 1 मिमी होना चाहिए, यह दूरी x 22 मिमी coverslip 22 मिमी के साथ इकट्ठे एक कक्ष के लिए इष्टतम है. अन्य सामग्री की सूची के लिए 2 टेबल देखें.

  1. खांचे की भीतरी छोर पर ~ 5 मिमी overhangs छोड़ने, स्लाइड में प्रत्येक नाली में एक 100 मिमी लंबे पॉलीथीन ट्यूब (आयुध डिपो 0.61 मिमी, तालिका 2) रखें. खांचे के अंदर पूरी तरह से ट्यूब embedding, cyanoacrylate चिपकने के साथ खांचे अंदर ट्यूबों को ठीक करें.
  2. ट्यूब के अंदर गोंद spilling से परहेज करते हुए, epoxy गोंद के साथ खांचे भरें. गोंद ~ 1 दिन के लिए सूखी.
  3. एक तेज धार के साथ स्लाइड के केंद्र के समीपस्थ भागों को दूर करने, प्रत्येक अनुलग्नक साइट के बाहर का अंत से जम गोंद जन 3-4 मिमी काटा. ट्यूबों उनके खांचे के अंदर रहना चाहिए. समीपस्थ हिस्सों को हटाने के भी कटौती और दो ट्यूब के उद्घाटन के साथ एक फ्लैट सतह का निर्माण, आंतरिक overhangs निकाल देंगे.
  4. पानी और परीक्षण के साथ एक सिरिंज भरेंट्यूबों ठीक से काम कर रहे हैं या नहीं. स्वतंत्र रूप से तरल प्रवाह, 1 दिन (चित्रा -1) के लिए सूखी के पेड़ों के बाहरी छोर पर epoxy गोंद की एक बूंद (~ व्यास में 5 मिमी) डाल दिया. इस कक्षों अधिक टिकाऊ बनाना होगा, ताकि वे कई महीनों के लिए बार बार इस्तेमाल किया जा सकता है.
    नोट 1: एक औंधा माइक्रोस्कोप के लिए एक कक्ष बनाने के लिए, स्लाइड्स खांचे (चित्रा 1C) के विपरीत छोर पर दो छोटे छेद बनाने के साथ ही संशोधित किया जाना चाहिए. , स्लाइड में छेद के माध्यम से ट्यूब डालें ट्यूब मोड़ और grooves (चित्रा 1E) के अंदर कसकर उन्हें फिट. कदम 1.2-1.4 का पालन करें, लेकिन एक प्रवाह चैम्बर बनाने के लिए उपयोग किया जाएगा जो पूरी सतह से epoxy गोंद हटा दें.
    नोट 2:, चैम्बर मात्रा कम दो indentations 0.050 गहरी ± 0.005 मिमी बनाने के लिए मिलिंग का उपयोग, 5.0 ± 0.5 मिमी चौड़े और थोड़ा ऊपर उठाया स्लाइड के मध्य भाग छोड़ने (आंकड़े 1B और 1C पर "etched क्षेत्रों" देखें). जब टी(नीचे वर्णित) वह प्रवाह चैम्बर इकट्ठा किया है, इन indentations के अंदर दो तरफा टेप जगह है.
    नोट 3: इन संशोधित स्लाइड्स का पुन: उपयोग करने के लिए, प्रयोगों एक रेजर ब्लेड का उपयोग coverslip और दो तरफा टेप हटाने के खत्म होने के बाद. यह बंद छीलने से और 70% इथेनॉल के साथ स्लाइड पोंछते द्वारा सीलेंट निकालें. एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप टयूबिंग देते हैं और 50-70 मिलीलीटर छिड़कना, एक धूल से मुक्त डिब्बे में बराबर विआयनीकृत पानी की मात्रा, सूखा और दुकान के साथ पालन करें, एक प्रयोगशाला dishwashing डिटर्जेंट का 1-2% के साथ एक कंटेनर में स्लाइड रखें.

2. Coverslips की तैयारी

इस प्रोटोकॉल 6-8 घंटे लगते हैं और 12 coverslips तैयार करने में मदद मिलेगी. आप lids के साथ एक चीनी मिट्टी coverslip धारक और 3 coverslip धुंधला जार की आवश्यकता होगी, जार मात्रा 15 मिलीग्राम होना चाहिए, ताकि हर एक साथ खड़ी 4 coverslips का आयोजन करेगा. एक ढक्कन (250 मिलीलीटर) के साथ एक ग्लास जार silane साथ coverslips सेते करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. नियमित रूप से नंबर 1 गिलास coverslips का उपयोग करें (22 मिमी x 22 मिमी या 2X 30 मिमी 2 मिमी,) सामग्री की सूची के लिए टेबल्स 2 और 3 को देखें. दस्ताने पहने हुए सभी कदम, एक धूआं हुड में बाहर किया जाना चाहिए.

  1. कांच coverslip धुंधला जार में coverslips रखो और एसीटोन के साथ जार भरें. 1 घंटे के लिए सेते हैं, विआयनीकृत जल के साथ 10x धो लो.
  2. इथेनॉल के साथ coverslips 10 मिनट सेते हैं और विआयनीकृत पानी के साथ फिर से 10x धो लो.
  3. "पिरान्हा" समाधान तैयार करें. एक गर्मी प्रतिरोधी कांच के बर्तन में हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान (पानी में 30%) का 60 मिलीलीटर रखो और धीरे से सल्फ्यूरिक एसिड की 100 मिलीलीटर जोड़ने (हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान के लिए एसिड के अंतिम अनुपात 05:03 है). समाधान, गर्मी होगा यह सामान्य है लेकिन सावधानी रखें. पिरान्हा समाधान बेहद संक्षारक है! मोटी प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और काले चश्मे का प्रयोग करें!
  4. पलकों को बंद करने और 1 घंटे के लिए 90 डिग्री सेल्सियस के लिए छोड़ देते हैं एक पानी के स्नान में जार जगह, "पिरान्हा" समाधान के साथ coverslip धुंधला जार भरें.
  5. "पिरान्हा" soluti डालोअपने कार्यस्थल पर सुरक्षा नियमों के निर्देशानुसार और पर त्यागें. धो विआयनीकृत पानी के साथ 10x coverslips.
  6. , 0.1 एम KOH के साथ coverslip धुंधला जार भरें 10 मिनट सेते हैं, और विआयनीकृत पानी के साथ 10x धो लो. यह "पिरान्हा" उपचार के बाद coverslips पर छोड़ दिया है किसी भी एसिड के अवशेष बेअसर करेंगे.
  7. सूखी coverslips Teflon लेपित फ्लैट धार चिमटी (एक कांच की सतह को नुकसान को कम करने के लिए) के साथ प्रत्येक coverslip धारण करके एक समय में एक और संकुचित शुष्क नाइट्रोजन उड़ाने जबकि. Silane समाधान पानी के साथ उच्च प्रतिक्रियाशील है, क्योंकि coverslips पूरी तरह से सूख रहे हैं कि सुनिश्चित करें.
  8. अच्छी तरह से नाइट्रोजन के साथ predried किया जाना चाहिए जो चीनी मिट्टी धारकों (धारक प्रति 12 coverslips), में सूखे coverslips हो चुकी है. Coverslip सतह से चिपके से धूल से बचने के लिए कवर चीनी मिट्टी धारकों रखें.
  9. आणविक sieves, ग्रेड 564, जल अवशोषण के लिए साथ 250 मिलीलीटर ग्लास जार (व्यास में 6 सेमी) के नीचे कवर.
  10. के 200 मिलीलीटर के साथ जार भरेंPlusOne पीछे हटाना Silane समाधान और धीरे से ढक्कन बंद और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं, एक जार में coverslips के साथ एक चीनी मिट्टी धारक विसर्जित कर दिया. इस coverslip सतह पर हाइड्रोफोबिक कोटिंग पैदा करेगा.
  11. धीरे धीरे जार से coverslips के साथ धारक को हटाने और स्थानांतरण मेथनॉल से भरा coverslip धुंधला जार में एक समय में एक coverslips.
  12. Coverslip धुंधला जार अपनी ऊंचाई के 2/3 के लिए डूब जाता है कि इस तरह के एक ध्वनि स्नान के पानी जलाशय में एक धातु या कांच कुरसी रखें. 20 मिनट के लिए 70 डब्ल्यू पर Sonicate, मेथनॉल समाधान हर 5 मिनट बदलते, तब विआयनीकृत पानी के साथ 10x कुल्ला. Silanization ठीक से काम किया तो पानी से निकाल दिया, जब coverslips सूखी दिखाई देगा.
  13. अच्छी तरह से ऊपर के रूप में, नाइट्रोजन का उपयोग कर किसी भी अवशिष्ट पानी निकाल दें.
  14. Coverslips के बीच सतह से सतह संपर्क से बचने के लिए Kimwipes साथ coverslips interlay. Coverslips कमरे के तापमान पर कई हफ्तों के लिए एक मोहरबंद कंटेनर में संग्रहित किया जा सकता है.
    एनOTE 1: 2.1-2.6 बहुत कुल तैयारी के समय को कम करने, 30 डब्ल्यू पर 15 मिनट के लिए प्लाज्मा क्लीनर के साथ coverslips सफाई से प्रतिस्थापित किया जा सकते हैं कदम. सफाई कक्ष के अंदर दबाव 100-200 mTorr पर सेट किया जाता है. दोनों वायुमंडलीय और संकुचित ऑक्सीजन का इस्तेमाल किया जा सकता है. चीनी मिट्टी धारकों में प्लाज्मा साफ coverslips हो चुकी है और 2.7 कदम आगे बढ़ना.

3. GMPCPP स्थिर Microtubule बीज की तैयारी

यह प्रक्रिया ~ 1 घंटा लगेगा और जिसके परिणामस्वरूप microtubule बीज कमरे के तापमान पर 1-2 दिनों के लिए स्थिर रहे हैं. अभिकर्मकों की एक सूची के लिए तालिका 4 देखें.

  1. बर्फ पर मिक्स:
    • 10 μl BRB-80 बफर में ट्यूबिलिन (100 माइक्रोन, तालिका 4) unlabeled (80 मिमी पाइप, 1 मिमी EGTA, 4 मिमी 2 MgCl, KOH के साथ पीएच 6.9, पूरक 1-2 मिमी डीटीटी के साथ एक प्रयोग के लिए नए सिरे से विभाज्य का उपयोग).
    • 2.6 μl digoxigenin लेबल ट्यूबिलिन (तालिका 4). तैयारी के आधार पर मात्रा समायोजित,unlabeled ट्यूबिलिन करने के लिए लेबल की अंतिम अनुपात ~ 01:10 है कि इस तरह के. Pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं.
    • 1.4 μl 10 मिमी GMPCPP (अंतिम एकाग्रता 1 मिमी)
  2. 35 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट सेते हैं, बीज लंबे 2-3 माइक्रोन बढ़ेगा. विभिन्न microtubule लंबाई वांछित है अगर समय समायोजित करें.
  3. कमरे के तापमान पर बीज गोली 25,000 XG पर 15 मिनट के लिए 35 μl BRB-80 (35 डिग्री सेल्सियस के लिए prewarmed), pipetting द्वारा मिश्रण, और अपकेंद्रित्र जोड़ें.
  4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें धीरे गर्म BRB-80 के 50 μl जोड़ने और हटाने से गोली धोने.
  5. Resuspend 25 μl BRB-80 में अच्छी तरह से गोली.

4. Coverslips को Microtubule बीज की कुर्की

प्रोटोकॉल 4 और 5 में 2-3 घंटे की आवश्यकता होगी, तो दो प्रवाह कक्षों प्रति दिन किया जाता है.

  1. Silanized coverslips का उपयोग निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रवाह चैम्बर इकट्ठा और 4.2 कदम आगे बढ़ना. कस्टम बनाया coverslips का उपयोग अगर (प्रोटोकॉल 1), कदम बेल का पालन करेंओ.
    1. , केंद्रीय ~ 5 मिमी चौड़े क्षेत्र के साथ दो तरफा टेप के दो टुकड़े (5 मिमी x 30 मिमी) अटैच मजबूती से टेप, प्रेस के ऊपर silanized coverslip डाल दिया.
    2. ट्यूबों में से एक के माध्यम से BRB-80 के साथ चैम्बर भरें और दौर toothpicks के साथ दोनों ट्यूबों प्लग.
    3. एक छोटे से प्लास्टिक पेट्री डिश के शीर्ष पर दो रंग Kwik कास्ट सीलेंट की एक छोटी सी बूंद निचोड़ है, और एक दन्तखुदनी का उपयोग जल्दी लेकिन अच्छी तरह मिक्स. सीलेंट हरे रंग की बारी होगी, तुरंत लागू होते हैं, ध्यान से coverslip के सभी किनारों सील. सीलेंट coverslip के तहत भी गहरा प्रवेश करते हैं, तो दन्तखुदनी प्लग निकाल कर ट्यूबों में से एक को खोलने और ट्यूब के अंदर लीक से सीलेंट को रोकने के लिए कोमल दबाव लागू होते हैं.
    4. 10 मिनट के लिए चैम्बर सूखा और प्रवाह आगे बढ़ने से पहले ही सीमित नहीं है की पुष्टि करें.
  2. 32 डिग्री सेल्सियस के लिए prewarmed एक खुर्दबीन मंच पर चैम्बर रखें और तरल बाहर पंप होगा, जो एक पंप करने के लिए ट्यूब में से एक देते हैं. इनलेट ट्यूब की लंबाईसिफारिश की लंबाई 5-7 सेमी है: अभिकर्मकों की अनावश्यक नुकसान से बचने के लिए कम से कम किया जाना चाहिए. एक 0.5 में यह अंत विसर्जित मिलीलीटर BRB-80 बफर के साथ शीशी. यह और नीचे सभी समाधान 32-35 डिग्री सेल्सियस के prewarmed किया जाना चाहिए
  3. एक पंप के साथ एक सौम्य दबाव लागू करें या बस इनलेट ट्यूब प्लग निकाल दिया जाता है जब कभी कभी हो सकता है फार्म जो हवाई बुलबुले, बाहर निचोड़ की दुकान ट्यूब के अंत उठा.
  4. 100 μl / मिनट पर पंप दर निर्धारित. , BRB-80 में 1:30 पतला विरोधी digoxigenin एंटीबॉडी के 2 चैम्बर संस्करणों के साथ धो एंटीबॉडी सोखना अनुमति देने के लिए 15 मिनट सेते हैं.
  5. , गर्म BRB-80 के 5-10 चैम्बर संस्करणों के साथ धो silanized coverslip के हाइड्रोफोबिक सतह ब्लॉक करने के लिए BRB-80 में 1% Pluronic एफ 127 के साथ 10 मिनट सेते हैं.
  6. गतिशीलता बफर के 5-10 चैम्बर मात्रा (BRB-80 कैसिइन के 0.4 मिलीग्राम / एमएल के साथ पूरक) के साथ धोएं.
  7. 10 μl / मिनट के लिए पंप की गति को कम करने और 30-40 μl गतिशीलता बफर में 1:200-1:600 ​​पतला microtubule बीज छिड़कना. 15 मील सेतेcoverslip-adsorbed एंटीबॉडी के लिए बीज के बंधन को बढ़ावा देने के लिए एन.
  8. किसी भी अपार सामग्री को हटाने के लिए गतिशीलता बफर के 400 μl के साथ 100 μl / मिनट पर चैम्बर धो लें.
    नोट 1: बीज के परिणामस्वरूप घनत्व 10-30 प्रति माइक्रोस्कोप क्षेत्र (2A चित्रा) होना चाहिए. के निवारण के लिए coverslip संलग्न बीज की आसान पता लगाने के लिए polymerization (3.1 कदम) के दौरान fluorescently लेबल ट्यूबिलिन का उपयोग करें.
    नोट 2: Chlamydomonas 40 या अन्य जैविक स्रोतों, साथ ही lysed और deciliated Tetrahymena कोशिकाओं की 41 pellicles से तैयार Axonemes भी nucleators microtubule के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. ये nucleators छोटे microtubule सरणियों बनाने के लिए उपयोगी हैं, और protofilaments की विशिष्ट संख्या के साथ सूक्ष्मनलिकाएं (GMPCPP बीज nucleates ≥ 14 protofilaments 42 होता है कि एक microtubule) वांछित हैं जब पसंद कर रहे हैं. इन संरचनाओं आटा अविशिष्ट अवशोषण द्वारा साफ coverslips से जुड़ा है, लेकिन हो सकता हैchment silanized coverslips का उपयोग विशेष रूप से जब एंटीबॉडी आधारित लगाव, के साथ तुलना में आमतौर पर कम स्थिर है.

5. खंडों सूक्ष्मनलिकाएं तैयारी

नीचे सभी समाधान संस्करणों चैम्बर मात्रा 15-20 μl के लिए कर रहे हैं, बड़ा चैम्बर प्रयोग किया जाता है अगर आनुपातिक वृद्धि हुई है.

  1. Prewarm unlabeled ट्यूबिलिन मिश्रण 35 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए (45 μl गतिशीलता बफर 1 मिमी मिलीग्राम जीटीपी साथ और 10-15 माइक्रोन unlabeled ट्यूबिलिन के साथ पूरक) 30 μl / मिनट पर छिड़कना.
  2. डीआईसी प्रकाशिकी (चित्रा 2B, वीडियो 1) के साथ microtubule विकास की निगरानी. 5-7 मिनट ऊष्मायन के दौरान सूक्ष्मनलिकाएं आमतौर पर ~ 10 माइक्रोन लंबे हो जाना.
  3. Rhodamine-ट्यूबिलिन मिश्रण (0.5 मिमी GMPCPP और ट्यूबिलिन को Rhodamine की 0.5-1 दाढ़ अनुपात के साथ rhodamine-लेबल ट्यूबिलिन की 2-5 माइक्रोन के साथ पूरक 65 μl गतिशीलता बफर) तैयार करें और 30 सेकंड के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर समाधान गर्म है.
  4. 30 μ पर तुरंत छिड़कनाएल / मिनट. Microtubule सुझावों पर स्थिर फ्लोरोसेंट टोपी के गठन को बढ़ावा देने के लिए 8-10 मिनट के लिए सेते हैं. स्थिर microtubule क्षेत्रों में भी अनायास नाभिक जाएगा और डीआईसी प्रकाशिकी के साथ दिखाई जाएगी.
  5. Tubulins और nucleotides, साथ ही घुलनशील microtubule टुकड़े को हटाने के लिए 20 μl / मिनट पर गतिशीलता बफर के 100 μl के साथ अच्छी तरह से चैम्बर धो लें.
  6. जिला उद्योग केंद्र के साथ, सूक्ष्मनलिकाएं (चित्रा 2 डी) दिखाई दे रहे हैं, इसकी पुष्टि, कई सूक्ष्मनलिकाएं कैपिंग के दौरान अलग करना क्योंकि उनकी संख्या, तथापि, (वीडियो 2 खंडों सूक्ष्मनलिकाएं साथ एक ठेठ क्षेत्र से पता चलता है) में कमी करनी चाहिए.
    नोट 1: खंडों सूक्ष्मनलिकाएं बहुत स्थिर रहे हैं और कम से कम 2 घंटे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, इन सूक्ष्मनलिकाएं के जीवनकाल अत्यधिक समाधान मुद्रा के साथ कम हो जाती है, या 2-mercaptoethanol इमेजिंग बफर में प्रयोग किया जाता है.

6. Depolymerizing Microtubule समाप्त होता है के साथ प्रोटीन की ट्रैकिंग की प्रयोगात्मक अवलोकन

  1. IntrodUCE 30-50 10 μl / मिनट पर चेंबर में फ्लोरोसेंट प्रोटीन (0.1-20 एनएम) के μl. Coverslip से चिपके प्रोटीन स्पष्ट है, तो 4-8 मिलीग्राम / एमएल BSA के साथ गतिशीलता बफर के पूरक. Alexa488-Dam1 टिप ट्रैकिंग इसके अतिरिक्त 10 मिमी डीटीटी या 0.5-1% βME 10 की आवश्यकता है.
  2. सूक्ष्मनलिकाएं की अनावश्यक विरंजन और disassembling से बचने के लिए एक खुर्दबीन क्षेत्र डायाफ्राम का उपयोग कर रोशनी क्षेत्र को सीमित करें.
  3. GFP फिल्टर क्यूब का उपयोग वीडियो अधिग्रहण शुरू, तो छवि रिकॉर्डिंग में दखल के बिना Rhodamine फिल्टर घन करने के लिए स्विच. microtubule सिरों पर लाल क्षेत्रों स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए, वे (वीडियो 3) हो पाती है और जल्दी बिखर शुरू हो जाएगा.
  4. टोपियां लगभग (आमतौर पर 10-20 सेकंड के लिए लेकिन इस बार अब एक कम Rhodamine लेबलिंग अनुपात के साथ हो टोपियां के लिए किया जाएगा) गायब हो जब तक रोशन, और microtubule disassembly के साथ ट्रैकिंग प्रोटीन रिकॉर्ड करने के लिए GFP चैनल को वापस स्विच करने के लिए आगे बढ़ें.
  5. विश्लेषणkymographs निर्माण से परिणामस्वरूप दृश्यों, Metamorph, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ImageJ या अन्य इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर (चित्रा 2 ई) का उपयोग करते हुए) अवलोकन के दौरान विभिन्न समय के लिए microtubule अक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता है कि शो यानी दो आयामी चित्र.
    नोट 1: अधिग्रहण की दर मनाया घटनाओं के समय के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए. सिफारिश की दर धीमी गति से चलती के लिए दूसरे (एफपीएस) प्रति 2-3 तख्ते है, अंगूठी के आकार Dam1 27 परिसरों लेकिन एकल अणुओं के लिए अधिग्रहण के समय> 20 एफपीएस 19 होना चाहिए.
    नोट 2: एक बेहद संवेदनशील EMCCD, जैसे ANDOR iXon3, depolymerizing सूक्ष्मनलिकाएं साथ नोक पर नज़र रखने की घटनाओं के तेजी से रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक है. Andor iXon3 कैमरे के लिए सिफारिश की सेटिंग्स हैं: लाभ 5x, EM लाभ 200, 1 मेगाहर्ट्ज readout गति 16 बिट सेंसर मोड, 80 मिसे समय जोखिम.
    3 नोट: TIRF माइक्रोस्कोपी का प्रयोग संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार होगा, हालांकि, कम सूक्ष्मनलिकाएं इस्तेमाल किया जाना चाहिए, इस तरह थाटी फ्लोरोसेंट स्थिर टोपियां क्षणभंगुर क्षेत्र की पहुंच के भीतर रहते हैं.

7. Microtubule टिप ट्रैकिंग परिसर के आणविक आकार के मात्रात्मक विश्लेषण

इस दृष्टिकोण के लिए तर्क एक ही फ्लोरोफोरे की तीव्रता को टिप ट्रैकिंग जटिल की कुल फ्लोरोसेंट तीव्रता के अनुपात खोजने के द्वारा एक टिप ट्रैकिंग परिसर में अणुओं की संख्या निर्धारित करने के लिए है. यह दृष्टिकोण GFP प्रोटीन fusions और फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन तैयारी में कुछ प्रोटीन अणुओं फ्लोरोसेंट नहीं कर रहे हैं, तो यह टिप ट्रैकिंग परिसरों में अणुओं की संख्या को नजरअंदाज कर सकते हैं.

  1. Fluorescently लेबल प्रोटीन अणुओं रिकॉर्ड photobleaching कैनेटीक्स.
    1. पूरे प्रोटोकॉल 2 का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है जो एक nonmodified कांच स्लाइड, डबल पक्षीय टेप के दो स्ट्रिप्स, और एक स्वच्छ coverslip, का उपयोग नियमित माइक्रोस्कोपी चैम्बर इकट्ठा, या केवल इस बात का 2.1-2.6 कदमोंप्रोटोकॉल.
    2. , गतिशीलता बफर में लगभग 50 एनएम प्रोटीन जोड़ने गतिशीलता बफर के साथ संक्षिप्त धोने और VALAP (तालिका 4) के साथ चैम्बर सील. (समाधान में अनायास फार्म कर सकते हैं या कई एकल अणुओं को एक साथ बंद कर रहे हैं और हल नहीं किया जा सकता है जब प्रकट हो सकता है जो trimers और tetramers,) एकल अणुओं का प्रतिनिधित्व समान रूप से छितरी स्पॉट (चित्रा 3), और उनके छोटे समुच्चय के साथ मैदान प्राप्त करने के लिए प्रोटीन एकाग्रता का अनुकूलन . यह कदम photobleaching कदम और एक कदम आकार का सही निर्धारण (नीचे देखें) के एक बहु - चोटी वितरण प्राप्त करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है.
    3. व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट धब्बे अभी भी दिखाई दे रहे हैं, जिस पर रोशनी लेजर तीव्रता को कम से कम, कम रोशनी के साथ photobleaching समय बढ़ा दिया है, इसलिए अब photobleaching निशान प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा एक सीमा के दौरान एक से अधिक फ्लोरोफोरे विरंजन की संभावना को कम करने के लिए समय जोखिम को कम. की सिफारिश की सेटिंगAndor iXon3 कैमरे के लिए: लाभ 5.0x, EM लाभ 999, 10 मेगाहर्ट्ज readout गति 50-100 मिसे समय जोखिम.
    4. , रोशनी शटर बंद एक ताजा क्षेत्र के लिए कदम, रोशनी शटर खुला है और सभी परिसरों (उसके बाद आईएमजी (एक्स, वाई के रूप में)) प्रक्षालित है जब तक छवियों के अधिग्रहण, coverslip की सतह पर ध्यान दें.
  2. रोशनी की असमता (3B चित्रा) के लिए अधिग्रहीत की छवियों को सही.
    1. किसी भी फ्लोरोफोरे का समाधान तैयार, BRB-80 में जैसे 1 माइक्रोन fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC). इस तरह के समाधान, पहले से तैयार aliquoted और -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता
    2. धारा 7.1.1 में के रूप में एक कक्ष इकट्ठा लेकिन एक नियमित coverslip का उपयोग करें. Fluorophore समाधान जोड़ें और VALAP का उपयोग चैम्बर सील.
    3. > पूरे खुर्दबीन क्षेत्र के 50 छवियों को इकट्ठा: रोशनी शटर बंद कर दिया है, जबकि एक नया कड़ा क्षेत्र के लिए मंच ले जाते हैं, और तुरंत शटर खोलने के बाद छवियों को प्राप्त.
      4. (चित्रा -3 सी) का उपयोग कर 5 पिक्सेल त्रिज्या के साथ गाऊसी कलंक के साथ फिल्टर. परिणामस्वरूप छवि क्षेत्र (एक्स और वाई पिक्सेल निर्देशांक के अनुरूप जहां खेला आज (एक्स, वाई),) की रोशनी तीव्रता का वितरण का प्रतिनिधित्व करता है.
    4. इस छवि (अधिकतम (खेला आज)) की अधिकतम पिक्सेल चमक निर्धारित करते हैं.
    5. बंद रोशनी शटर और 7.2.3 के अधिग्रहण की धारा में के रूप में एक छवि एक ही कैमरा सेटिंग्स का उपयोग कर के साथ, इस छवि का औसत पिक्सेल तीव्रता का निर्धारण, इस मूल्य सीएन, कैमरा शोर से मेल खाती है.
    6. निम्नलिखित अभिव्यक्ति का उपयोग करते हुए प्रायोगिक छवि (आईएमजी (एक्स, वाई)) मानक के अनुसार करने के लिए ऊपर मूल्यों और छवि (खेला आज (एक्स, वाई)) का उपयोग करें:

      बीआरआई के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए जिसके परिणामस्वरूप छवि IMG आदर्श (एक्स, वाई) का प्रयोग करेंटिप tacking परिसरों (चित्रा 3 डी) के साथ छवियों को सामान्य करने के लिए भी स्थिर फ्लोरोसेंट परिसरों, और के ghtness.
  3. एक एकल फ्लोरोफोरे की तीव्रता का निर्धारण.
    1. आदर्श (एक्स, वाई) img सामान्यीकृत छवियों का उपयोग और किसी भी इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर एक परिपत्र क्षेत्र (व्यास में 5-6 पिक्सल) के साथ एक फ्लोरोसेंट स्थान का चयन करें और सभी फ्रेम के लिए अपने अभिन्न तीव्रता का निर्धारण, photobleaching निशान पैदा. बहुत उज्ज्वल डॉट्स (> dimmer लोगों की तुलना में उज्जवल 5 गुना) से बचें.
    2. एक ही परिपत्र क्षेत्र उपकरण का उपयोग, कम से कम 3 जगह से मुक्त क्षेत्रों का चयन औसत इसी photobleaching निशान पैदा करते हैं और घातीय क्षय समारोह के साथ फिट.
    3. प्रयोगात्मक समय बिंदुओं मैच और photobleaching घटता से घटाना करने के लिए इस पृष्ठभूमि तीव्रता वक्र समतल.
    4. Photobleaching घटता (3-5 अंक के फिसलने खिड़की के साथ औसत) चिकनी. दिखने में जिसके परिणामस्वरूप घटता है और निरीक्षणप्रतिदीप्ति या स्पष्ट विरंजन (चित्रा 3E) की कमी में अचानक वृद्धि से पता चलता है कि किसी भी वक्र त्यागें.
    5. (घटता की कुल संख्या का आमतौर पर 50-70%) शेष घटता में से प्रत्येक के लिए, नेत्रहीन फ्लोरोसेंट मौके प्रक्षालित गया है जब अंतिम पठार, का चयन करें. केवल ~ 100 अंक छोड़ने के लिए और इन तीव्रता औसत करने के लिए इस क्षेत्र को छोटा करें. छोटे बदलाव को कम करने के लिए छोटा photobleaching वक्र पृष्ठभूमि का स्तर है से इस मूल्य घटाना और पृष्ठभूमि शिखर (नीचे) के आकार को कम करने के लिए.
    6. 20 या अधिक photobleaching घटता (> 1,000 समय अंक) से हर समय अंक के लिए तीव्रता का एक हिस्टोग्राम साजिश है. हिस्टोग्राम कम से कम 4 अलग चोटियों (नोट 2 देखें) का प्रदर्शन करना चाहिए.
    7. MATLAB, Mathematica या इसी तरह के सॉफ्टवेयर (चित्रा 3F) का उपयोग कर समान दूरी गाऊसी वितरण 10,43 साथ हिस्टोग्राम फिट:

      डब्ल्यूएक मैं और σ मैं, डी और एन यहां मानकों फिटिंग कर रहे हैं. मैं आयाम करने के लिए अनुरूप और चौड़ाई मैं वें शिखर की एक मैं और σ मानकों; डी चोटियों के बीच की दूरी है, एन वितरण में चोटियों की कुल संख्या से मेल खाती है जो पूर्णांक संख्या है. पहले 3 या अधिक चोटियों के केन्द्रों से सज्जित लाइन के लिए एक नेत्रहीन अच्छा मैच दिखाने के लिए, इन चोटियों (पैरामीटर डी) के बीच की दूरी एक एकल फ्लोरोफोरे की एक फ्लोरोसेंट तीव्रता से मेल खाती है.
      नोट 1: माइक्रोस्कोपी प्रणाली महत्वपूर्ण कंपन दर्शाती या शोर (जैसे अस्थिर लेजर बीम) का एक अन्य स्रोत नहीं है, तो जांच की डॉट्स (धारा 7.3.6) की संख्या में वृद्धि की जानी चाहिए.
      नोट 2: यह> समदूरस्थ गाऊसी फिट के साथ सटीक विश्लेषण के लिए 3 चोटियों प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. कम चोटियों प्राप्त कर रहे हैं, झूठे (जैसे डबल) कदम आकार प्राप्त किया जा सकता हैरोशनी शर्तों इष्टतम नहीं कर रहे हैं, डॉट्स भी तेजी से और एक कदम ब्लीच जब जैसे अच्छी तरह से हल नहीं कर रहे हैं.
  4. टिप ट्रैकिंग परिसर के आणविक आकार का निर्धारण करते हैं.
    1. प्रोटोकॉल 6 के साथ एकत्र छवियों का उपयोग करें और तुरंत शटर खोलने के बाद हासिल किया गया है, जो पहले 2-4 फ्रेम, का चयन करें. टिप ट्रैकिंग मनाया गया से पहले क्षेत्र में कुछ समय के लिए प्रबुद्ध गया था, तो एक ही प्रयोगात्मक शर्तों के तहत photobleaching के कैनेटीक्स से मूल तीव्रता का अनुमान है.
    2. चयनित फ्रेम औसत और धारा 7.2.5-7.2.7 में के रूप में जिसके परिणामस्वरूप छवि मानक के अनुसार.
    3. धारा 7.3.1 में के रूप में एक ही क्षेत्र आकार का उपयोग फ्लोरोसेंट टिप ट्रैकिंग परिसर का अभिन्न तीव्रता को मापने.
    4. , टिप ट्रैकिंग परिसर के पास स्थित है और एक ही क्षेत्र का उपयोग 3 पृष्ठभूमि क्षेत्रों का अभिन्न तीव्रता को मापने के लिए इन मूल्यों के औसत और धारा 7.4.3 से टिप ट्रैकिंग जटिल की तीव्रता से घटाना. धारा 7.3.5 में प्राप्त एकल फ्लोरोफोरे की तीव्रता से धारा 7.4.4 में प्राप्त फ्लोरोसेंट तीव्रता विभाजित करके परिसर में fluorophore अणुओं की संख्या की गणना.
      1 नोट: यह प्रोटोकॉल 7.4 के लिए रोशनी और अधिग्रहण सेटिंग्स प्रोटोकॉल 7.1 में के रूप में वही कर रहे हैं कि वांछनीय है. जोखिम समय या लेजर तीव्रता या तो इन चरणों के दौरान समायोजित किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट मूल्यों के हिसाब से बढ़ाया जाना चाहिए. हालांकि, इस तरह स्केलिंग की सटीकता इन अलग अलग परिस्थितियों में एक ही नमूना (जैसे फ्लोरोसेंट समय) इमेजिंग और जिसके परिणामस्वरूप तीव्रता के अनुपात की गणना के द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए.

8. प्रोटीन लिपटे मोतियों से Microtubule टिप ट्रैकिंग

  1. प्रोटोकॉल 6 में के रूप में मीट्रिक टन disassembly ट्रिगर द्वारा टिप ट्रैकिंग मोती के साथ प्रयोग करते हैं. डीआईसी प्रकाश स्रोत की तीव्रता के साथ एक साथ Rhodamine प्रतिदीप्ति देखने की अनुमति देने के लिए कम किया जाना चाहिएडीआईसी इमेजिंग.
  2. 10 μl / मिनट पर चेंबर में मनका निलंबन के 30-50 μl परिचय में Grishchuk एट अल. 10 और Asbury एट अल. 11 के रूप में मोती तैयार. सुझाव मनका एकाग्रता 10 -16 -10 -17 एम है
  3. ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं, तो खुर्दबीन मंच से चैम्बर हटाने और मोती coverslip पर तलछट के लिए अनुमति देने के लिए 5-10 मिनट के लिए इसे पलटना. इस coverslip के लिए सीमित सूक्ष्मनलिकाएं को मनका का एक बेहतर बंधन को बढ़ावा देता है, लेकिन इस प्रक्रिया इतने कम समय के दौरान कम गुरुत्व आधारित अवसादन दिखाने जो 0.5 माइक्रोन polystyrene मोती, साथ सफल नहीं है.
  4. Coverslip सीमित microtubule से जुड़ा हुआ है कि एक मनका का चयन करें; मनका एक स्पष्ट चाप 44 (चित्रा -4 ए) में बढ़ना चाहिए. सीमित मनका 1-3 माइक्रोन दूर एम रहते हैं कि कभी कभी coverslip संलग्न मोती के कारण स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है जो coverslip सतह से स्थित होना चाहिएotionless.
  5. Rhodamine फिल्टर क्यूब में स्विच करें और डीआईसी रोशनी का उपयोग करते समय छवियों का संग्रह शुरू करते हैं.
  6. एक पारा दीपक या 530-550 एनएम लेजर के साथ (एक क्षेत्र डायाफ्राम के साथ प्रतिबंधित) इमेजिंग क्षेत्र रोशन करने के लिए खुला शटर. मनका detaches या disassembling microtubule अंत के साथ चलता है (आंकड़े 4D, 4F, और 4 जी) तक रिकॉर्डिंग जारी.
    नोट 1: ऑप्टिकल जाल microtubule दीवार और प्रोटीन में लिपटे मनका के बीच बातचीत को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Kinesin मोटर्स (आंकड़े 4E जी) के साथ लिपटे मोतियों के साथ काम करते हैं तो यह विशेष रूप से उपयोगी है. ऊपर के रूप में एक ही प्रोटोकॉल का पालन लेकिन 2 मिमी मिलीग्राम एटीपी साथ गतिशीलता बफर के पूरक. कदम 8.3 में, 1,064 एनएम लेजर बीम के साथ एक फ्री फ्लोटिंग मनका कब्जा करीब खंडों microtubule दीवार के लिए फंस मनका लाने के लिए मंच चाल है. कम रोशनी डीआईसी के साथ और rhodamine फिल्टर क्यूब के माध्यम से इमेजिंग शुरू और छाया हुआ microtubule अंत की ओर चलने शुरू करने के लिए मनका के लिए प्रतीक्षा करें. पिछाड़ीएर निर्देशित मनका गति मनाया जाता है, बीम को फँसाने के लिए शटर बंद करने और फ्लोरोसेंट रोशनी के लिए शटर खुला. मनका detaches या disassembling microtubule अंत के साथ पटरियों तक रिकॉर्डिंग जारी.

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Representative Results

Microtubule depolymerizing साथ ट्रैकिंग प्रोटीन समाप्त होता है. खमीर kinetochore घटक Dam1 द्वारा अब तक depolymerizing microtubule का सबसे अच्छा टिप को ट्रैकर 14 समाप्त होता है. GFP के साथ लेबल इस 10 सबयूनिट जटिल आसानी से व्यक्त किया है और बैक्टीरियल कोशिकाओं 18,38 से शुद्ध है, तो हम टिप ट्रैकिंग परख के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग की सिफारिश की जा सकती है. एक microtubule के depolymerizing अंत के साथ पटरियों एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन तेजी से coverslip संलग्न बीज (वीडियो 3) की ओर बढ़ रहा एक उज्ज्वल फ्लोरोसेंट स्थल के रूप में देखा जाता है. यह भी एक इसी kymograph (चित्रा 2 ई) पर एक परोक्ष रेखा के रूप में दिखाई देगा. प्रोटीन ट्रैक टिप करने में विफल रहता है, तो इसके विपरीत,, microtubule मानव Ndc80-GFP जटिल 19 (चित्रा 2 एफ) के लिए देखा, जैसे microtubule अंत में फ्लोरोसेंट संकेत में संवर्धन दिखाए बिना shortens. Processive ट्रैकिंग मनाया जाता है, microtubule कम की दरening आगे बढ़ डॉट नज़र रखने के द्वारा या इसी kymograph पर परोक्ष लाइन की ढलान मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. यह 45 से बाध्यकारी प्रोटीन microtubule अंत की ताकत के बारे में जानकारी दे सकते हैं. Microtubule के लिए दृढ़ता से बाँध कि प्रोटीन, Dam1 अंगूठी जटिल की तरह, microtubule depolymerization की दर को धीमा. इस आशय की, हालांकि, टिप ट्रैकिंग परिसर के आकार पर दृढ़ता से निर्भर करता है और छोटे परिसरों microtubule disassembly 27 की दर पर कम या कोई प्रभाव लागू कर सकते हैं. इस प्रकार, microtubule छोटा करने की दर में परिवर्तन की नोक पर नज़र रखने परिसर के आकार के संदर्भ में व्याख्या की जानी चाहिए. Depolymerizing अंत microtubule जाली करने के लिए बाध्य किया गया था कि प्रोटीन "एकत्र करता है" के रूप में कुछ शर्तों के तहत, ट्रैकिंग, टिप ट्रैकिंग जटिल की चमक में वृद्धि के साथ किया जा सकता है. इस मामले में depolymerization की दर अक्सर नोक टीआरए के बढ़ते आकार के साथ समन्वित रूप से नीचे धीमा कर देती हैcking जटिल. अन्य मामलों में रिश्ते को और अधिक जटिल है. उदाहरण के लिए, GFP Dam1 सबयूनिट के एन टर्मिनस पर संयुग्मित किया गया था जिसमें Dam1 प्रोटीन जटिल है, के कई यूनिटों, छोटा microtubule (चित्रा 2 जी) के अंत में एकत्र किया जा सकता है. Microtubule disassembly अंततः स्टालों, microtubule depolymerization के बल बहुत बड़े हैं कि परिसरों को स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं है संभव है, क्योंकि. disassembly अक्सर नोक जुड़े Dam1 सब यूनिटों 10 में से कुछ की हदबंदी को इंगित करता है जो टिप चमक में कमी के बाद शुरू. Processively ट्रैक नहीं है कि microtubule बाध्यकारी प्रोटीन भी microtubule disassembly 19,31,46 की दर को धीमा कर सकते हैं, क्योंकि इन रिश्तों की सावधानी से जांच जरूरी है.

मनका microtubule सिरों depolymerizing साथ ट्रैकिंग. कई microtubule बाध्यकारी प्रोटीन पहले से ही गतिशील मील के साथ microbead गति के लिए कप्लर्स के रूप में पहचान की गई हैcrotubule 5,11,27,39,47 समाप्त होता है. आश्चर्यजनक ढंग से, यहां तक कि Ndc80 प्रोटीन जटिल मोती 29,30 से microtubule अंत टिप ट्रैकिंग बनाए रख सकते हैं. आमतौर पर, प्रोटीन में लिपटे मोतियों और सूक्ष्मनलिकाएं के बीच बंधन मजबूत है, तो मोती माइक्रोस्कोपी कक्ष में जुड़ जाते हैं, जब वे खंडों, coverslip संलग्न सूक्ष्मनलिकाएं (चित्रा -4 ए) के लिए आसानी से बाँध. यह मनका बन केवल एक microtubule से जुड़ी है कि क्या निश्चित डीआईसी के साथ देखने के लिए हमेशा संभव नहीं है. हम कई सूक्ष्मनलिकाएं को अनुलग्नकों का गठन किया है कि मोती रिकॉर्डिंग से बचने के लिए कई मानदंडों का विकास किया है. Microtubule कवर पर्ची संलग्न बीज (चित्रा 4 बी) से इसके विकास के स्थल के चारों ओर थोड़ा pivots के रूप में सबसे पहले, एक microtubule से जुड़ा हुआ है कि एक मनका, एक चाप की तरह गति दिखाना चाहिए. स्थिर टोपी प्रबुद्ध है जब दूसरा, केवल एक लाल खंड बीज और मनका (चित्रा 4C) से बाहर का देखा जाना चाहिए. टोपी अक्सर followi देखा जा सकता हैटोपी विरंजकों तक मनका के चाप की तरह गति एनजी (वीडियो) 4. तीसरा, मनका गति (या अपनी टुकड़ी) टोपी प्रक्षालित गया है और मनका गति की दिशा ऊपर टिप्पणियों पर आधारित है deduced किया गया था जो microtubule अभिविन्यास, के अनुरूप होना चाहिए के बाद शीघ्र ही मनाया जाना चाहिए. चौथा, microtubule shortens और बीज की ओर मनका चाल के रूप में, चाप की तरह दोलनों के आयाम (चित्रा 4D) में कमी करनी चाहिए.

चित्रा 4D के रूप में दिखाया मनका द्वारा ट्रैकिंग, बहुत processive है, जब इन मानदंडों को अक्सर संतुष्ट हैं. मनका ट्रैकिंग processive नहीं है हालांकि, अगर कुछ प्रारंभिक निर्देशित प्रस्ताव के बाद मनका detaches और बेतरतीब ढंग से diffusing शुरू होता है. बड़े मोतियों के साथ, जैसे 1 माइक्रोन कांच के मोती, इस थर्मल प्रस्ताव यह छोटा microtubule अंत के साथ एक चाप युक्त गति के रूप में misinterpreted किया जा सकता है कि काफी धीमी है. की भयावहता पर आधारित एक औपचारिक कसौटीरेखीय ट्रैक से मनका के विचलन इस तरह की घटनाओं में 29 विभेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारे पिछले काम में हम microtubule अक्ष भर में औसत मनका भ्रमण गणना की और इस मूल्य microtubule समानांतर मनका गति से 0.4 माइक्रोन / 1 माइक्रोन से अधिक हो गई है, तो मनका 95% विश्वास के साथ बेतरतीब ढंग से फैलाना संभावना थी कि अनुमान है. इस उपाय का प्रयोग हम भी "नियंत्रण" मनका तैयारी में, अविशिष्ट एंटीबॉडी या biotinylated सूक्ष्मनलिकाएं के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया streptavidin में लिपटे मोतियों के साथ लेपित जैसे मोती, मोती का 5% processively स्थानांतरित करने के लिए फैसला किया गया है कि पाया. अधिक से अधिक सटीकता कम processivity साथ मोतियों की गति की निगरानी के लिए वांछित है, हम निर्देशित मनका गतियों की पहचान करने के लिए आसान कर रहे हैं, जहां एक लेजर जाल, का उपयोग करना चाहिये.

मोती स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं को स्थायी संलग्नक फार्म विफल लेजर जाल भी इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हम plu के विभिन्न प्रोटीन निर्माणों के साथ लिपटे मोतियों पर कब्जा करने के लिए एक लेजर बीम का इस्तेमाल कियाkinesin CENP ई एस अंत निर्देशित और खंडों microtubule दीवारों (चित्रा 4E) पर "प्रक्षेपण" इस तरह के मोतियों के लिए 24. एटीपी की उपस्थिति में इन मोतियों छाया हुआ microtubule प्लस छोर की ओर (20-25 माइक्रोन / मिनट) तेजी से कदम, एक kymograph पर, तिरछा रेखा में इस तरह के प्रस्ताव के परिणाम की टोपी (आंकड़े 4F और 4 जी) की ओर निर्देशित. टोपी को नष्ट कर दिया है, के बाद छोटा CENP ई प्रोटीन के साथ लेपित एक मनका microtubule (चित्रा 4F पर हरी तीर) से अलग हो जाता है. हालांकि, पूरी लंबाई CENP ई प्रोटीन यानी शून्य से microtubule अंत की ओर, विपरीत दिशा में मनका गति बनाए रख सकते हैं (वीडियो) 5. नतीजतन, इस तरह के मोतियों के लिए kymograph पूरी लंबाई के साथ लिपटे मोतियों से गतियों का निर्देशन किया, और CENP ई नहीं छोटा प्लस के अंत और शून्य से अंत दोनों की उपस्थिति का संकेत है, एक वक्र पैटर्न से पता चलता है. हम अन्य microtubule निर्भर मोटर्स भी इसी गतिशीलता 5,13 प्रदर्शन कर सकते हैं कि उम्मीद

चित्रा 1
चित्रा 1. खंडों या गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं. एक साथ इन विट्रो अध्ययन के लिए चैम्बर प्रवाह. एक खंडों microtubule (मीट्रिक टन) का आरेख. स्थिर मीट्रिक टन बीज, digoxigenin (डीआईजी) लेबल ट्यूबिलिन और GMPCPP साथ तैयार विरोधी डीआईजी एंटीबॉडी के माध्यम से coverslip से जुड़े होते हैं. ट्यूबिलिन और अन्य प्रोटीन के बंधन nonspecific Pluronic F127 के साथ बंद है. सूक्ष्मनलिकाएं unlabeled ट्यूबिलिन और जीटीपी का उपयोग कर बीज से बढ़ा रहे हैं, और इन एक्सटेंशन (लाल रंग में) Rhodamine लेबल ट्यूबिलिन और GMPCPP युक्त छोटे क्षेत्रों के साथ छाया हुआ है. (+ के साथ लेबल) मीट्रिक टन प्लस अंत आमतौर पर जिले हो सकते हैं(-). बी और सी के एक बहुत छोटे कद घटा अंत से tinguished. संशोधित प्रवाह चैम्बर की विस्तृत योजनाओं ईमानदार और उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ उपयोग करने के लिए स्लाइड. ध्वनि स्लॉट्स पीले रंग में दिखाया गया है. नंबर डी. मिलीमीटर में हैं और ई. संलग्न ट्यूबों के साथ संशोधित स्लाइड्स (पैमाने पर नहीं) की ओर देखा;. मोटी तीर कक्षों पूरी तरह से () नहीं दिखाया इकट्ठा कर रहे हैं के बाद ट्यूब के माध्यम से तरल के प्रवाह का संकेत बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. खंडों सूक्ष्मनलिकाएं और विशिष्ट प्रोटीन टिप ट्रैकिंग के परिणाम की तैयारी. ए. Coverslip संलग्न microtubule बीज विसूडीआईसी प्रकाशिकी (कदम प्रोटोकॉल का 4.8) के साथ alized, तीर बीज में से कुछ को इंगित करते हैं. छवि 10 तख्ते के एक औसत प्राप्त कर लिया क्रमिक रूप से (100 मिसे जोखिम प्रत्येक). बी है. ट्यूबिलिन और जीटीपी 32 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए incubated रहे थे वही खुर्दबीन क्षेत्र के बाद, सूक्ष्मनलिकाएं बीज (कदम प्रोटोकॉल का 5.2). सी से चलाई देखा जाता है. Epifluorescence (लाल). विकास के साथ देखा डीआईसी (हरा) में देखी हिस्सों में बंटा हुआ microtubule दिखाते हुए एक छद्म रंग छवि और rhodamine लेबल स्थिर कैप्स (तीर),. पैनल सी पर लेकिन देखने का एक बड़ा क्षेत्र के साथ के रूप में एक ही छवि. प्रोटोकॉल के कदम 5.2 दौरान समाधान में अनायास नाभिक जो कुछ rhodamine-युक्त microtubule टुकड़े, भी (तीर). ई देखा जाता है. Dam1-GFP प्रोटीन की kymograph disassembling microtubule अंत ट्रैकिंग. छोड़ा शो kymograph के इसी हिस्से के अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल एक फ्लोरोसेंट चैनल पर रंग कोडित सलाखों. हरा रंगmicrotubule अंत. एफ से आता है, जब तक राजनैतिक फ्लोरोसेंट लाइनों microtubule दीवार करने के लिए बाध्य है और थोड़ा गति बताते हैं कि Dam1-GFP परिसरों द्वारा बनाई गई हैं. ई पर लेकिन GFP के साथ के रूप में kymograph Ndc80 जटिल 19 लेबल. वृद्धि की GFP प्रतिदीप्ति Rhodamine उत्तेजना के बाद छाया हुआ अंत में मनाया जाता है हालांकि शुरू में, microtubule, समान रूप से सजाया गया है. यह वृद्धि Ndc80-GFP प्रोटीन की घुलनशील पूल पर निर्भर करता है, लेकिन अंतर्निहित तंत्र ज्ञात नहीं है. टोपी विखंडित करने के बाद, microtubule छोटा स्पष्ट हो जाता है लेकिन microtubule नोक पर प्रतिदीप्ति की छोटी संवर्धन की नोक पर नज़र रखने की एक कमी है. जी, यह दर्शाता है. इस प्रयोग 10 में microtubule न्यूक्लिएशन के लिए इस्तेमाल किया गया था जो गुणसूत्र का अक्षीय धागा, टिप ट्रैकिंग Dam1 मौके से दूरी MetaMorph ट्रैक ड्रॉप अंक का उपयोग कर मापा गया था. एक एकल Dam1 अंगूठी बनाने के लिए पर्याप्त: चलती परिसर के प्रारंभिक चमक के बारे में 15 सब यूनिटों से मेल खाती है. वीं की चमकई आगे बढ़ जटिल विरंजन के लिए सही करने के लिए coverslip संलग्न, अविचल फ्लोरोसेंट स्पॉट की तीव्रता को सामान्यीकृत था. क्षैतिज स्केल सलाखों: पैनल ए, बी, डी (10 माइक्रोन), पैनलों सी, एफ, ई (3 माइक्रोन). कार्यक्षेत्र स्केल सलाखों:. 10 सेकंड बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. फ्लोरोसेंट संकेतों के मात्रात्मक विश्लेषण. ए. Dam1-Alexa488 परिसरों के साथ माइक्रोस्कोप क्षेत्र का उदाहरण छवि coverslip सतह को nonspecifically बाध्य. डॉट्स चमक और रोशनी की असमता में विविधता नोट. स्केल बार 2 माइक्रोन. बी है. पैनल में के रूप में एक ही छवि के मात्रात्मक प्रतिनिधित्व. सी डी है. पैनल एक से सामान्यीकृत छवि मेथेमेटिका 9 (Wolfram रिसर्च) का उपयोग तीव्रता सतह के रूप में साजिश रची. इस सतह बी पर अधिक से अधिक फ्लैट है और चोटियों की ऊंचाई में कम विषम हैं. ई ध्यान दें. CENP-E-GFP प्रोटीन के साथ प्राप्त photobleaching घटता के उदाहरण हैं. प्रत्येक डॉट का अभिन्न तीव्रता, एकत्र रोशनी के कारण असमता में लेने के लिए सामान्यीकृत और घटता (5 अंक की रपट खिड़की के साथ औसत) smoothed गया था. ऊपरी पंक्ति में सिग्नल धारा 7.3.4 में वर्णित कारणों के लिए आगे के विश्लेषण से बाहर रखा गया. धारा 7.3.4-7.3.5. एफ में वर्णित के रूप में कम पंक्ति में दिखाया गया है उन लोगों की तरह घटता आगे, संसाधित और पैनल एफ पर एक हिस्टोग्राम का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया गया एनजी>. 22 विरंजन CENP-E-GFP डॉट्स (कुल 1,900 डेटा अंक) से एकत्र अभिन्न तीव्रता के हिस्टोग्राम. रेड लाइन समान दूरी गाऊसी समारोह के साथ संयोग ही है, 5 अलग चोटियों में देखा जाता है. इस हिस्टोग्राम से निर्धारित एक एकल GFP की fluorophore अभिन्न तीव्रता 10 4 Au जी एक्स (64.7 ± 1.1) था. प्रोटोकॉल 7.3.5 में वर्णित के रूप में प्रसंस्कृत Dam1-Alexa488 के लिए विशिष्ट photobleaching वक्र,. एच. 48 photobleaching Dam1-Alexa488 डॉट्स (कुल 1,548 डेटा अंक) से एकत्र अभिन्न तीव्रता के हिस्टोग्राम, 4 अलग चोटियों में देखा जाता है. इन परिस्थितियों में एक Alexa488 अणु का अभिन्न तीव्रता 10 3 Au एक्स (17.4 ± 0.8) था बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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चित्रा 4. Microtubule-जुड़े मोतियों की गतियों का चित्रण. ए. Microtubule बाध्यकारी प्रोटीन के साथ लिपटे मोतियों के साथ प्रयोग के योजनाबद्ध. मोटी तीर microtubule disassembly. बी की दिशा संकेत मिलता है. Stably (26 छवियों के आधार पर) एक खंडों microtubule से जुड़ा था जो एक GFP-Dam1 में लिपटे मनका, की डीआईसी छवियों की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण. मनका यह एक टूटी हुई लाइन. सी के साथ के रूप में दिखाया उन्मुख एक microtubule से जुड़ा था, सुझाव है कि चाप की तरह गति (तीर) से पता चला है. एकल पैनल बी के रूप में ही मनका की छवि, लेकिन फ्लोरोसेंट शटर खोला गया था तुरंत बाद प्रोटोकॉल के कदम 8.6 के दौरान लिया. मनका के पास स्थित फ्लोरोसेंट टोपी को अंक तीर, लेकिन microtubule लगाव साइट. डी से विपरीत दिशा में. अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण disassemblin साथ मनका की गति की गति से पता चलता हैजी microtubule. छवि इमेजिंग की शुरुआत (एआरसी की तरह प्रक्षेपण नोट) से और मनका की टुकड़ी (वीडियो) 4. ई तक क्रमिक रूप से प्राप्त कर लिया 115 फ्रेम से बनाया गया था. प्लस अंत निर्देशित kinesin CENP ई के साथ लिपटे मोतियों के साथ प्रयोग के योजनाबद्ध. मनका लेजर जाल का उपयोग microtubule के साथ संपर्क में लाया जाता है. जाल तो बंद है और मनका शुरू होता है microtubule प्लस अंत की ओर बढ़ रहा है. Microtubule-स्थिर टोपी को हटा दें और microtubule disassembled के बाद, मनका इसकी गति. एफ की दिशा उलट जाती है. Kymograph छोटा X के साथ लेपित एक 0.5 माइक्रोन मनका से पता चलता है laevis CENP ई kinesin microtubule प्लस अंत 24 की ओर बढ़ रहा है. मनका के बारे में 1 माइक्रोन से कूच करने के बाद, फ्लोरोसेंट शटर (लाल पट्टी) खोला गया था, और स्थिर कैप (लाल arrowhead) दृश्य बन गया. मोटर छोटा microtubule अंत का सामना करना पड़ा संभवतः जब (हरा Arrowhead) अचानक अलग मनका,. जी बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

वीडियो 1. खंडों सूक्ष्मनलिकाएं की तैयारी. वीडियो खंडों सूक्ष्मनलिकाएं की तैयारी के दौरान एक खुर्दबीन क्षेत्र के डीआईसी छवियों को दिखाता है. Microtubule बीज पहले से ही coverslip से जुड़ी होने के बाद इमेजिंग शुरू होता है. छोटे गोल डॉट्स विरोधी digoxigenin एंटीबॉडी की हमारी तैयारी में पाया particulates से कर रहे हैं. ट्यूबिलिन और जीटीपी जोड़े जाने के बाद, सूक्ष्मनलिकाएं बीज (कदम 5.2) से बढ़ाना शुरू करते हैं. वे वांछित लम्बाई (8-15 माइक्रोन) तक पहुँचने के बाद, समाधान Rhodaminated ट्यूबिलिन और GMPCPP शुरू करने की जल्दी बदल जाता है. डी में एक्सचेंज, microtubule पॉलिमर मोड़ के दौरानपंप बंद कर दिया है के बाद प्रवाह की irection लेकिन वे शांत अभिविन्यास मान. निम्नलिखित "कैपिंग" चरण के दौरान, कुछ ट्यूबिलिन अनायास और छोटे microtubule टुकड़े कक्ष में चल देखा जाता भाजन शुरू होता है. उन्होंने यह भी सभी घुलनशील ट्यूबिलिन और nucleotides को हटा जो निम्नलिखित धोने (कदम 5.5), के दौरान हटा रहे हैं. इन चरणों के दौरान कुछ सूक्ष्मनलिकाएं मजबूत टोपी को इकट्ठा करने में विफल रहते हैं और घुलनशील ट्यूबिलिन दूर धोया जाता है जब वे जल्दी से अलग करना. वे प्रकाशित कर रहे हैं जब तक छाया हुआ सूक्ष्मनलिकाएं, हालांकि, कई घंटे के लिए स्थिर रहे हैं; Rhodamine उत्साहित है जब, टोपियां खंडित हो, और uncapped microtubule क्षेत्रों उजागर हो गई. छवियाँ, हर पल का अधिग्रहण 30 एफपीएस पर खेला गया.

वीडियो 2. खंडों सूक्ष्मनलिकाएं Uncapping. वीडियो Rhodamine फिल्टर क्यूब के माध्यम से एक ही microtubule के फ्लोरोसेंट छवियों द्वारा पीछा डीआईसी के माध्यम से एक पूरी तरह से इकट्ठे खंडों microtubule को दिखाती है. एक बीmicrotubule के अंत में सही लाल खंड (तीर) चाप में चलता रहता है और कारण तस्वीर विरंजन के लिए जल्दी fades. छवियाँ 6 एफपीएस पर हासिल कर लिया और 10 एफपीएस पर खेला.

वीडियो 3. Microtubule अंत depolymerizing साथ ट्रैकिंग प्रोटीन. एक खंडों microtubule (एमटी) अलग डॉट्स (हरा चित्र) जो रूपों GFP लेबल Dam1, द्वारा सजावट को दिखाई धन्यवाद है. Rhodamine प्रतिदीप्ति तो उत्साहित है और लाल टोपी microtubule (लाल छवियों) के अंत में एक सज्जन चाप में बढ़ रहा है, दृश्य बन जाता है; लेबल ट्यूबिलिन केवल बहुलक के अंत में शामिल हो गया है, क्योंकि microtubule के बाकी दिखाई नहीं देता है. तेजी से टोपी विरंजकों, टुकड़े टुकड़े करना शुरू होता है और फ्लोरोसेंट घन Rhodaminated ट्यूबिलिन और GMPCPP नहीं है कि microtubule खंड का छोटा की शुरुआत देखने के लिए समय बस में वापस GFP के लिए बंद है. अंत depolymerizing Dam1 डॉट्स पहुँचता है, microtubule अंत चमकीले हरे हो जाता है. इसके बाद, एक हरी प्रतिदीप्तिNT मौके processive टिप ट्रैकिंग illustrating, disassembling microtubule साथ आगे बढ़ देखा जाता है. Dam1 की एकाग्रता 3 एनएम, छवियों 0.4 एफपीएस पर हासिल कर लिया और खेला गया था. स्केल बार 5 माइक्रोन.

वीडियो 4. Microtubule यह एक microtubule द्वारा coverslip के लिए सीमित है, यह दर्शाता है. Dam1 साथ लेपित ग्लास मनका एक चाप में आगे बढ़ देखा जाता है समाप्त होता है depolymerizing साथ ट्रैकिंग मनका. Rhodamine प्रतिदीप्ति उत्साहित किया जाता है, लाल टोपी मनका से distally देखा और मनका की गति (लाल रंग में तस्वीरें) के साथ synchrony में बढ़ रहा है. इसके चाप की तरह गति आयाम (चित्रा 4D) में कम हो जाती है, जबकि जल्द ही, मनका, directionally बढ़ शुरू होता है. डीआईसी छवियों Rhodamine फिल्टर क्यूब के माध्यम से हर 300 मिसे हासिल कर लिया और 6 एफपीएस खेले थे, मनका, पैमाने बार 5 माइक्रोन 1 माइक्रोन है.

वीडियो 5. Kinesin में लिपटे मनका खंडों microtubule पर द्वि directionally घूम रहा है. इमेजिंग मनका सीओए के बाद शुरू होता हैपूरी लंबाई CENP ई kinesin साथ टेड microtubule (एमटी) दीवार पर रखा गया था. प्रारंभिक मनका स्थिति को अंक तीर. मोटर प्लस microtubule अंत की ओर चलता है के रूप में मोती, दूर तीर से आगे बढ़ देखा जाता है. प्लस अंत टोपी (Arrowhead, लाल छवियों) प्रबुद्ध तुरंत बाद, मनका विपरीत दिशा में ले जाने के लिए शुरू होता है. केवल पूर्ण लंबाई CENP ई kinesin कर सकते हैं छोटा microtubule अंत करने के लिए मनका की जोड़ी प्रस्ताव. छोटा CENP ई के साथ लिपटे मोतियों से अधिक मीट्रिक टन अंत की ओर ले जा सकते हैं लेकिन microtubule depolymerization (आंकड़े 4F और 4 जी की तुलना) शुरू हो रहा है के बाद वे जल्द ही अलग. डीआईसी छवियों हर 1 सेकंड का अधिग्रहण किया और 16 एफपीएस पर खेला गया, मनका 0.5 माइक्रोन है.

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Discussion

कई एकल अणु assays आजकल नियमित काफी अविशिष्ट प्रोटीन चिपके कम करने के लिए विशेष इलाज coverslips का उपयोग करें. हम यहाँ वर्णन प्रक्रिया हावर्ड प्रयोगशाला 32 में विकसित मूल प्रोटोकॉल के एक संशोधन है, और हम coverslips silanizing भी प्रतिदीप्ति का उपयोग नहीं करते जो डीआईसी आधारित मनका assays, साथ प्रयास के लायक भी है कि लगता है. ऐसे coverslips के साथ इकट्ठे मंडलों बहुत क्लीनर सतहों दिखाने के लिए, और घुलनशील microtubule बाध्यकारी प्रोटीन की उपस्थिति में प्राप्त परिणामों के एक बहुत कम प्रोटीन एकाग्रता प्रयोग किया जाता है, खासकर अगर अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं.

खंडों लाख टन की सफल तैयारी के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं:

  1. ट्यूबिलिन एकाग्रता और ऊष्मायन बार का अनुकूलन (5.1-5.2 कदम). बार और प्रोटोकॉल में दिए गए सांद्रता अनुमानित हैं और कारण आदि ट्यूबिलिन तैयारी, चैम्बर मात्रा में अंतर करने के लिए भिन्न हो सकते हैं.
  2. विशिष्ट और तंगnucleators coverslip करने के लिए microtubule की कुर्की, और
  3. सही प्रवाह की गति को नियंत्रित करने की क्षमता. प्रयोगों सील प्रवाह कक्षों में आयोजित की जाती हैं जब हमारे हाथ में, सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं.

इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ microtubule depolymerization जिससे disassembling microtubule सिरों पर गतियों का विश्लेषण सहायता, उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ शुरू किया जा सकता है. इस तकनीक के साथ, बफ़र्स तेजी से बदला जा सकता है और microtubule बाध्यकारी प्रोटीन और मोती सूक्ष्मनलिकाएं का गठन करने के बाद बफ़र्स की एक किस्म में जोड़ा जा सकता है. इस microtubule विधानसभा में अपनी संभव भूमिकाओं से अलग microtubule depolymerization पर एक प्रोटीन के प्रभाव के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. प्रोटीन भी सूक्ष्मनलिकाएं के साथ अपनी बातचीत मुखौटा हो सकता है, जो घुलनशील ट्यूबिलिन के साथ बातचीत कर सकते हैं, तो यह उपयोगी है. नि: शुल्क, unpolymerized ट्यूबिलिन सेल में मौजूद है लेकिन, जब से सावधानी डब्ल्यू इस्तेमाल किया जाना चाहिएइस तरह के परिणाम की शारीरिक महत्व की व्याख्या मुर्गी.

खंडित microtubule दृष्टिकोण की मुख्य सीमा यह microtubule विधानसभा के दौरान गतियों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं है, या microtubule तबाही और बचाव पर प्रोटीन ट्रैकिंग का प्रभाव. इन सवालों के लिए, घुलनशील ट्यूबिलिन की उपस्थिति में हो गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं साथ assays अधिक उपयुक्त हैं. इस पद्धति का एक और बाधा गतिशीलता बफ़र्स ऑक्सीजन सफाई एंजाइमों से मुक्त होना चाहिए. इस तरह के एंजाइम मिश्रण, Catalase और ग्लूकोज oxidase 48 के आधार पर जैसे, काफी फ्लोरोसेंट अणु के जीवनकाल में सुधार कर सकते हैं. इन अभिकर्मकों खंडों microtubule परख में उपयोग किया जाता है, तो microtubule विघटन के बिना ब्लीच टोपी हालांकि, क्योंकि, disassembly की तस्वीर प्रेरण निराला है. संदर्भ में ऊपर या उदाहरण के लिए वर्णित के रूप में मात्रात्मक प्रतिदीप्ति assays में, विरंजन की दर हमेशा ध्यान में रखा जाना चाहिए23, विरोधी विरंजन एजेंट नहीं किया जाता है, खासकर अगर.

खंडित microtubule परख में परीक्षण कई microtubule बाध्यकारी प्रोटीन unlabeled microtubule क्षेत्रों बनाम rhodamine-लेबल स्थिर टोपी को तरजीही बंधन दिखाया. टोपी जुड़े मोती अक्सर टोपी विखंडित जब microtubule से अलग कर के बाद से टोपियां के लिए बाइंडिंग, processive मोतियों का अंश कम हो सकता है. अंत में, हम मोटर लिपटे मोतियों बहुत तेजी से खत्म प्लस microtubule की ओर चलना अगर microtubule depolymerization वे भी microtubule से अलग कर देना होगा और इस तरह के एक प्रयोग उत्पादक नहीं होगा, जो मामले में शुरू हो रहा है, इससे पहले कि वे अक्सर लाल टोपी तक पहुँचने ध्यान दें कि .

संक्षेप में, एक microtubule का छोटा अंत का पालन करने के लिए कोई निहित मोटर गतिविधि के साथ microtubule बाध्यकारी प्रोटीन की क्षमता एक दिलचस्प, अभी तक खराब समझ घटना है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल ऐसे पीआर की पढ़ाई की सहायता करनी चाहिएइन विट्रो में oteins और उनके गुणों. Microtubule depolymerization निर्भर परिवहन पिंजरे का बँटवारा दौरान गुणसूत्र अलगाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इस प्रकार, हम यहाँ वर्णित तकनीक अंततः कोशिका विभाजन के तंत्र में और अधिक जानकारी हासिल करने के लिए मदद मिलेगी.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों एक प्रोटोकॉल विकसित करने और अभिकर्मकों प्रदान करने के लिए आंकड़े, एन Gudimchuk और पी. ज़ाराखोव के लिए छवियों को प्रदान करने के लिए, एन Dashkevich, एन Gudimchuk और ए Korbalev पुन: प्रयोज्य प्रवाह कक्षों डिजाइन और निर्माण के लिए मदद करने के लिए वित्तीय संस्था Ataullakhanov शुक्रिया अदा करना चाहूँगा पाठ संपादन और सुझाव और विचार विमर्श के लिए Grishchuk प्रयोगशाला के अन्य सदस्यों के साथ मदद के लिए digoxigenin लेबल microtubule बीज, ए Potapenko तैयार करते हैं. इस काम के हिस्से में समर्थन किया गया था NIH अनुदान जीएम R01-098389 और एक किमेल विद्वान है जो ELG पेंसिल्वेनिया स्नायु संस्थान से एक पायलट अनुदान, RFBR 12-04-00111-A, 13-04-40190-एच अनुदान और 13 से -04-40188-एच, विज्ञान प्रेसिडियम अनुदान के रूसी अकादमी FI Ataullakhanov लिए (आण्विक सिस्टम एकीकरण और आण्विक और आण्विक सेल बायोलॉजी कार्यक्रमों के तंत्र), एनआईएच जेआर McIntosh लिए जीएम R01 GM033787 अनुदान, और एक दिमित्री Zimin राजवंश फाउंडेशन postdoctoral फैलोशिप के लिए VAV

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1. Microscopy and other equipment.
Microscope Zeiss
Nikon		 Axio Imager 2
Eclipse Ti		 other microscope models capable of DIC and epifluorescence-imaging can be used
Objective Zeiss
Nikon		 420490-9900-000
CFI Apo 100x Oil 1.49		 100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Objective heater Bioptechs 150803, 150819-19
Fluorescent filter cube Chroma 49004 or 49008
41017 or 49020		 optimized for Rhodamine fluorescence 
optimized for GFP fluorescence
Acquisition software freeware MicroManager
Molecular Devices		 not applicable
MetaMorph 7.5		 http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/
other software can be used to acquire images and for a particle tracking
EMCCD camera Andor iXon3, DU-897E-cs0-#BV Highly sensitive EMCCD camera
Trapping laser IPG Photonics YLR-10-1064-LP 1,064 nm laser, 10 W
Fluorescence excitation lasers Coherent, Inc.
Coherent, Inc.		 Sapphire 488 LP
Sapphire 552 LP		 excitation of green fluorophores
excitation of red fluorophores
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Commercial flow chambers Warner Instruments RC-20 or RC-30
Perfusion pump Cole Palmer
Harvard Apparatus		 Masterflex 77120-52
Pico Plus		 Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia. 
Table 2. Microscopy chamber preparation.
Modified microscope slides for reusable chambers Precision Glassblowing of Colorado Custom order www.precisionglassblowing.com Sonic slots in slides using schematics in Figure 1
Polyethylene tubing Intramedic 427410 I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container
Polyethylene tubing Intramedic 427400 I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber
Regular microscope slides VWR 48312-003 Other similar slides can be used
Coverslips VWR 48393-150, 48366-067 Other similar coverslips can be used
Silicon sealant World Precision Instruments KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE
Epoxy glue Loctite 83082
Cyanoacrylate adhesive Scotch 3M AD114 Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers
Table 3. Coverslips cleaning and coating.
Molecular Sieves, Grade 564 Macron 4490-04
Coverglass Staining Jar Ted Pella, Inc. 21036
Coverslip Ceramic Holder Thomas Scientific 8542e40
PlusOne Repel Silane GE Healthcare Biosciences 17-1332-01
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Anti-digoxigenin AB Roche Applied Science 11093274910
Table 4. Preparation of seeds and segmented microtubules.
Tubulin purified from cow brains
Cytoskeleton, Inc
T238P		 For purification protocols see 49–51
Unlabeled porcine tubulin
Labeled tubulin Cytoskeleton, Inc
Invitrogen
Invitrogen		 TL590M
C1171 (Rhodamine)
A-2952 (Digoxigenin)		 Rhodamine-labeled porcine tubulin
Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.
GMPCPP Jena Biosciences NU-405 Aliquot and store at -70 °C
VALAP Vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass see reference9

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References

  1. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13, 83-117 (1997).
  2. Mitchison, T. M., Kirschner, M. W. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
  3. Walker, R. A., Brien, O., et al. Dynamic Instability of Individual Microtubules Analyzed by Video Light Microscopy: Rate Constants and Transition Frequencies. J. Cell Biol. 107, 1437-1448 (1988).
  4. Gardner, M. K., Zanic, M., Gell, C., Bormuth, V., Howard, J. Depolymerizing Kinesins Kip3 and MCAK Shape Cellular Microtubule Architecture by Differential Control of Catastrophe. Cell. 147 (5), 1092-1103 (2011).
  5. Lombillo, V. A., Stewart, R. J., McIntosh, J. R. Minus-end-directed motion of kinesin-coated microspheres driven by microtubule depolymerization. Nature. 373, 161-164 (1995).
  6. Franck, A. D., Powers, A. F., Gestaut, D. R., Gonen, T., Davis, T. N., Asbury, C. L. Tension applied through the Dam1 complex promotes microtubule elongation providing a direct mechanism for length control in mitosis. Nat. Cell Biol. 9 (7), 832-837 (2007).
  7. Tran, P. T., Walker, R. A., Salmon, E. D. A metastable intermediate state of microtubule dynamic instability that differs significantly between plus and minus ends. J. Cell Biol. 138 (1), 105-117 (1997).
  8. Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438, 384-388 Forthcoming.
  9. Coue, M., Lombillo, A., Richard, J. Microtubule Depolymerization Promotes Particle and Chromosome Movement In Vitro. J. Cell Biol. 112 (6), 1165-1175 (1991).
  10. Grishchuk, E. L., Spiridonov, I. S., et al. Different assemblies of the DAM1 complex follow shortening microtubules by distinct mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (19), 6918-6923 (2008).
  11. Asbury, C. L., Gestaut, D. R., Powers, A. F., Franck, A. D., Davis, T. N. The Dam1 kinetochore complex harnesses microtubule dynamics to produce force and movement. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (26), 9873-9878 (2006).
  12. Westermann, S., Wang, H. -W., Avila-Sakar, A., Drubin, D. G., Nogales, E., Barnes, G. The Dam1 kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends. Nature. 440 (7083), 565-569 (2006).
  13. Grissom, P. M., Fiedler, T., Grishchuk, E. L., Nicastro, D., West, R. R., Mcintosh, J. R. Kinesin-8 from Fission Yeast A Heterodimeric , Plus-End – directed Motor that Can Couple Microtubule Depolymerization to Cargo Movement. Mol. Biol. Cell. 20, 963-972 (2009).
  14. McIntosh, J. R., Volkov, V., Ataullakhanov, F. I., Grishchuk, E. L. Tubulin depolymerization may be an ancient biological motor. J. Sci. 123, 3425-3434 (2010).
  15. Grishchuk, E. L., McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Force generation by dynamic microtubule polymers. Compr. Biophys. 4, 93-117 (2012).
  16. Asbury, C. L., Tien, J. F., Davis, T. N. Kinetochores' gripping feat: conformational wave or biased diffusion. Trends Cell Biol. (1), 38-46 (2011).
  17. Tien, J. F., Umbreit, N. T., et al. Cooperation of the Dam1 and Ndc80 kinetochore complexes enhances microtubule coupling and is regulated by aurora B. Cell Biol. 189 (4), 713-723 (2010).
  18. Gestaut, D. R., Graczyk, B., et al. Phosphoregulation and depolymerization-driven movement of the Dam1 complex do not require ring formation. Nat. Biol. 10 (4), 407-414 (2008).
  19. Schmidt, J. C., Arthanari, H., et al. The Kinetochore-Bound Ska1 Complex Tracks Depolymerizing Microtubules and Binds to Curved Protofilaments. Dev. Cell. 23 (5), 968-980 (2012).
  20. Brouhard, G. J., Stear, J. H., et al. XMAP215 is a processive microtubule polymerase. Cell. 132 (1), 79-88 (2008).
  21. Stumpff, J., Du, Y., et al. A Tethering Mechanism Controls the Processivity and Kinetochore-Microtubule Plus-End Enrichment of the Kinesin-8 Kif18A. Mol. Cell. 43 (5), 764-775 (2011).
  22. Su, X., Qui, W., Gupta, M., Pereira-Leal, J., Reck-Peterson, S. L., Pellman, D. Mechanisms underlying the dual-mode regulation of microtubule dynamics by Kip3/kinesin-8. Mol. Cell. 43 (5), 751-763 (2011).
  23. Helenius, J., Brouhard, G., Kalaidzidis, Y., Diez, S., Howard, J. The depolymerizing kinesin MCAK uses lattice diffusion to rapidly target microtubule ends. Nature. 441 (7089), 115-119 (2006).
  24. Gudimchuk, N., Vitre, B., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nat. Cell Biol. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  25. Akhmanova, A., Steinmetz, M. Microtubule +TIPs at a glance. J. Sci. 20 (Pt 20), 3415-3419 (2010).
  26. Dixit, R., Barnett, B., Lazarus, J., Tokito, M., Goldman, Y., Holzbaur, E. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (2), 492-497 (2009).
  27. Grishchuk, E. L., Efremov, A. K., et al. The Dam1 ring binds microtubules strongly enough to be a processive as well as energy-efficient coupler for chromosome motion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (40), 15423-15428 (2008).
  28. Akiyoshi, B., Sarangapani, K. K., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  29. McIntosh, J. R., Grishchuk, E. L., et al. Fibrils Connect Microtubule Tips with Kinetochores A Mechanism to Couple Tubulin Dynamics to Chromosome Motion. Cell. 135 (2), 322-333 (2008).
  30. Powers, A. F., Franck, A. D., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  31. Umbreit, N. T., Gestaut, D. R., et al. The Ndc80 kinetochore complex directly modulates microtubule dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (40), 16113-16118 (2012).
  32. Gell, C., Bormuth, V., et al. Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods Biol. 95, 221-245 (2010).
  33. Dixit, R., Ross, J. L. Studying Plus-End Tracking at Single Molecule Resolution Using TIRF Microscopy. Methods Cell Biol. 95, 543-554 (2010).
  34. Beausang, F. J., Sun, Y., Quinlan, E. M., Forkey, N. J., Goldman, Y. Construction of Flow Chambers for Polarized Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (polTIRFM). Cold Spring Harbour Protoc. 6, 712-715 (2012).
  35. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP Hydrolysis in Microtubule Dynamics: Information from a Slowly Hydrolyzable Analogue, GMPCPP. Mol. Biol. Cell. 3, 1155-1167 (1992).
  36. Grishchuk, E. L., Ataullakhanov, F. I. In Vitro Assays to Study the Tracking of Shortening Microtubule Ends and to Measure Associated Forces. Methods Cell Biol. 95, 657-676 (2010).
  37. Gutiérrez-Medina, B., Block, S. M. Visualizing individual microtubules by bright field microscopy. Am. J. Phys. 78 (11), 1152-1159 (2010).
  38. Volkov, V. A., Zaytsev, A. V., et al. Long tethers provide high-force coupling of the Dam1 ring to shortening microtubules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (19), 7708-7713 (2013).
  39. Laan, L., Pavin, N., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
  40. Myster, S. H., Knott, J. A., O'Toole, E., Porter, M. E. The Chlamydomonas Dhc1 gene encodes a dynein heavy chain subunit required for assembly of the I1 inner arm complex. Mol. Biol. Cell. 8, 607-620 (1997).
  41. Lombillo, V. A., Coue, M., McIntosh, J. R. In vitro motility assays using microtubules tethered to Tetrahymena pellicles. Methods Cell Biol. 39, 149-165 (1993).
  42. Hyman, A., Chrétien, D., Arnal, I., Wade, R. Structural changes accompanying GTP hydrolysis in microtubules: information from a slowly hydrolyzable analogue guanylyl-(alpha,beta)-methylene-diphosphonate. J. Cell Biol. 128 (1-2), 117-125 (1995).
  43. Park, M., Kim, H., Kim, D., Song, N. W. Counting the Number of Fluorophores Labeled in Biomolecules by Observing the Fluorescence-Intensity Transient of a Single Molecule. Bull. Chem. Soc. Jap. 78, 1612-1618 (2005).
  44. Welburn, J. P. I., Grishchuk, E. L., Backer, C. B., Wilson-Kubalek, E. M., Yates, J. R., Cheeseman, I. M. The human kinetochore Ska1 complex facilitates microtubule depolymerization-coupled motility. Dev. Cell. 16 (3), 374-385 (2009).
  45. Efremov, A., Grishchuk, E. L., Mcintosh, J. R., Ataullakhanov, F. I. In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromosome motions. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (48), 19017-19022 (2007).
  46. Itoh, T., Hisanaga, S., Hosoi, T., Kishimoto, T., Hotani, H. Phosphorylation states of microtubule-associated protein 2 (MAP2) determine the regulatory role of MAP2 in microtubule dynamics. Biochemistry. 36 (41), 12574-12582 (1997).
  47. Oguchi, Y., Uchimura, S., Ohki, T., Mikhailenko, S. V., Ishiwata, S. The bidirectional depolymerizer MCAK generates force by disassembling both microtubule ends. Nat. Biol. (6), 1-8 (2011).
  48. Kishino, A., Yanagida, T. Force measurements by micromanipulation of a single actin filament by glass needles. Nature. 334, 74-76 (1988).
  49. Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro. Ann. NY Acad. Sci. 253, 107-132 (1975).
  50. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S., Kirschner, M. W. A Protein Factor Essential for Microtubule Assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  51. Widlund, P. O., Podolski, M., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Mol. Biol. Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  52. Hyman, A., Drechsel, D., et al. Preparation of Modified Tubulins. Methods Enzymol. 196, 478-485 (1991).

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बुनियादी प्रोटोकॉल अंक 85 माइक्रोस्कोपी प्रवाह चैम्बर एकल अणु प्रतिदीप्ति लेजर जाल microtubule बाध्यकारी प्रोटीन microtubule निर्भर मोटर microtubule टिप ट्रैकिंग
Disassembling Microtubule रुप से प्रेरित प्रस्ताव का अध्ययन करने के खंडों सूक्ष्मनलिकाएं तैयारी
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Volkov, V. A., Zaytsev, A. V., Grishchuk, E. L. Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends. J. Vis. Exp. (85), e51150, doi:10.3791/51150 (2014).

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