Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Beredning av Segmente mikrotubuli att studera Motioner Driven av demonteringen mikrotubuli Ends

Published: March 15, 2014 doi: 10.3791/51150
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 2Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow, Russia, 3Physiology Department, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Mikrotubuli är till sin natur instabila polymerer, och deras växling mellan tillväxt och matfett är stokastisk och svår att kontrollera. Här beskriver vi protokoll som använder segmente mikrotubuli med photoablatable stabiliserande mössor. Depolymerisation av segmente mikrotubuli kan utlösas med hög tids-och rumsupplösning, och därigenom hjälpa analys av rörelser med demonteringen mikrotubuli ändar.

Abstract

Mikrotubuli depolymerisation kan ge kraft för att transportera olika proteinkomplex och proteinbelagda pärlor in vitro. De bakomliggande mekanismerna är tänkt att spela en viktig roll i mikrotubuli beroende kromosom rörelser under celldelning, men de relevanta proteiner och deras exakta roll är dåligt definierad. Således finns det ett växande behov av att utveckla analyser som att studera en sådan rörlighet in vitro med hjälp av renade komponenter och definierade biokemiska miljö. Mikrotubuli, men är i sig instabila polymerer, sin växling mellan tillväxt och matfett är stokastisk och svår att kontrollera. De protokoll som vi beskriver här dra nytta av de segmente mikrotubuli som görs med photoablatable stabiliserande mössor. Depolymerisation av sådana segmente mikrotubuli kan utlösas med hög tids-och rumsupplösning och därmed hjälpa studier av motilitet vid demonteringen mikrotubuli ändar. Denna teknik kan användas för att caRRY en kvantitativ analys av antalet molekyler i de fluorescensmärkta proteinkomplex, som rör sig processively med dynamisk mikrotubulus slutar. För att optimera ett signal-till-brus-förhållande i detta och andra kvantitativa fluorescerande analyser bör täck behandlas för att minska icke-specifik absorption av lösliga fluorescerande-märkta proteiner. Detaljerade protokoll finns för att ta hänsyn till ojämnheter i fluorescerande belysning, och bestämma intensiteten av ett enda fluorofor med användning ekvidistanta Gaussisk passform. Slutligen beskriver vi användandet av segmente mikrotubuli att studera mikrotubuli beroende rörelser hos de proteinbelagda mikrokulor, som ger insikt i förmågan hos olika motor-och nonmotor proteiner till par mikrotubulus depolymerisation till processiv last rörelse.

Introduction

Mikrotubuli är starkt konservativa cytoskelettala strukturer som är viktiga för cellulära arkitektur, cellmotilitet, celldelning, och intracellulär transport 1. Dessa dynamiska polymerer ihop från tubulin i närvaro av GTP, och de byter spontant mellan tillväxt och förkorta 2. Mikrotubuli är mycket tunna (endast 25 nm i diameter) därför speciella optiska tekniker för att öka kontrasten bör användas för att observera mikrotubuli med ett ljusmikroskop. Tidigare arbete med dessa polymerer sökte deras dynamiska beteende med hjälp av differential interferens kontrast (DIC) 3. Denna och liknande studier in vitro visade att under typiska experimentella förhållanden, mikrotubuli genomgår katastrof och byta till depolymeriseringen sällan, en gång varje 5-15 min (denna frekvens är för 7-15 mM löslig tubulin koncentration undersöks vid 28-32 ° C ) 4. Olika tekniker har sålunda föreslagits att induktionse mikrotubul depolymerisation på ett kontrollerat sätt. Mikrotubuli förkortning kan utlösas genom att tvätta bort löslig tubulin 5,6, skära mikrotubuli med en laserstråle 7, eller med hjälp av segmente mikrotubuli 8, som beskrivs här. Tidigare arbete med användning av segmenterade mikrotubuli samt stokastiskt omkopplings polymerer har funnit att små intracellulära laster, såsom kromosomer, vesiklar, och proteinbelagda pärlor, kan röra sig vid ändarna av matfettet mikrotubuli 9-13. Detta fenomen tros ha en direkt implikation för kromosom rörelser i mitotiska celler, och de bakomliggande mekanismerna är föremål för pågående utredning 14-16.

Nyligen har lysrörsbaserade tekniker, bland annat total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi, använts för att studera motilitet med dynamiska mikrotubuli slutar 17-24. Fördelen med denna metod är att den tillåter granskning av interaktions mellan mikrotubuli och mikrotubuli-bindande proteiner i realtid med hjälp av proteiner som är märkta med olika fluoroforer. Flera proteinkomplex befanns röra processively med förlängning och / eller förkorta mikrotubuli ändar. De inkluderar de mikrotubulus-associerade proteiner Dam1 ,10,12,18 Ska1 19 och XMAP215 20 samt kinesin motorer Kif18A 21,22, MCAK 23 och CENP-E 24. Dessa proteiner uppvisar processive tip-tracking, som i grunden skiljer sig från de klassiska tip-tracking proteiner som EB1 25. Även EB1 molekyler och de associerade partner tycks förbli stabilt samband med dynamiska mikrotubuli ändar, de enskilda molekylerna förblir bundet till mikrotubuli spetsen för endast ~ 0,8 sek, snabbt utbyte med den lösliga pool 26. Däremot processive tip-trackers, som Dam1, resa med mikrotubuli slutar för många mikron, och deras samband med mikrotubuli tips kan pågå mnågra sekunder. Spetsen association tid, liksom den resulterande hastighet av spårning, är starkt beroende av antalet molekyler som bildar spetsen följ komplex 27. Större protein ensembler är oftast mycket bättre tip-trackers. Exempelvis kan sådana komplexa sammansättningar som de isolerade jäst kinetochores vara kopplad till mikrotubuli slutar i timmar 28. Vissa mikrotubuli-bindande proteiner, t ex Ndc80 kinetochor proteinkomplex, har visat sig vara oförmögna att spåra med mikrotubulus slutar på en enda molekyl, vilket åter Ndc80 är mycket effektiv i att koppla rörelsen hos vulsten last 19,29-31. Således, för att förstå mekanismen för dricks-spårning av olika proteinkomplex, samt deras biologiska roller, är det viktigt att undersöka spets-spårning som en funktion av antalet molekyler i spetsfölj komplex, samt att bestämma möjligheten för dessa komplex att ställa kollektiva motilitet på ytan av pärla last.

(Figur 1A). Först är de kommersiellt tillgängliga glasskivor modifierats för att fästa kort polyeten slang (protokoll 1). Den återanvändbara mikroskopi flödeskammare sedan samman av en sådan bild och det kemiskt eller plasma-rengjorda och silaniserad täckglas (protokoll 2) 32-34. Den resulterande kammarvolym är endast 20-25 l (eller så små som 15 pl, se not 3 i protokoll nr 1), inklusive volymen av inloppsslangen. Kommersiellt tillgängliga flödeskammare kan också användas, men deras volym är vanligen större, vilket leder till onödigt slöseri med proteiner. Om en större kammare används, bör volymen på alla lösningar i protokollen nedan skalas proportionellt. Mikrotubulus frön framställs därefter, exempelvis med användning långsamt hydrolyserbar GTP-analog, GMPCPP (guanosin-5'-[(α, β)-methyleno] trifosfat) (protokoll 3, se även Hyman <em> et al. 35). Fröna är immobiliserade på en rengjord täckglas och ytan därefter blockeras för att förhindra ospecifik absorption av andra proteiner 32 (protokoll 4 beskriver frön immobilisering med hjälp digoxigenin). De segmente mikrotubuli kan sedan framställas med protokoll 5. Det viktigaste skälet till detta är att dynamiska mikrotubuli polymerer, som bildar i närvaro av GTP, kan stabiliseras tillfälligt genom att lägga till korta "lock" av stabila tubulin segment, som innehåller GMPCPP. Dessa kapslar innehåller också rodaminmärkt tubulin, så att de kan tas bort helt enkelt genom att belysa synfältet med en 530 till 550 nm laser eller kvicksilverbåglampa (Protokoll 6) 36. Fluorescensintensiteten hos spetsen spårningssignal kan sedan användas för att uppskatta antalet av molekyler som reser med demonteringen mikrotubuli ändar, med hänsyn till ojämnheter i mikroskop fältbelysning (Protokoll 7). Kan användas Ett liknande tillvägagångssättatt studera interaktioner mellan depolymerisering mikrotubuli och proteinbelagda pärlor, framställda såsom beskrivits i 27 (protokoll 8). Vissa proteiner kommer lätt binda till väggarna i segmente mikrotubuli, men laserpincett kan också användas för att hålla vulsten nära mikrotubulus vägg och därigenom främja dess bindning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Utrustning som krävs: Experimenten beskrivs nedan kräver ett ljusmikroskop utrustat för DIC och fluorescens avbildning (Tabell 1). Ljusa fält LED-belysning kan användas för att avsevärt förbättra upptäckten av täcklösa mikrotubuli frön 37, som är svåra att observera med en vanlig halogenlampa. För att styra vätskeflödet i mikroskopi kamrarna bör de lösningar som skall utbytas med en peristaltisk pump med förmåga att flödeshastigheter från 10 till 100 | il / min. En injektionspump kan också användas, men försiktighet bör vidtas för att undvika att luftbubblor som kan bildas när flödeshastigheten ändras abrupt. För hantering av proteinbelagda pärlor, till exempel för att föra dem nära den segmente mikrotubuli väggen, kan en 1064 nm kontinuerlig våg laserstråle införas i mikroskopets optiska axel och fokuserad med en hög numerisk objektiv bländare (1.3 eller högre) för att producera en fälla. För kvantitativ analys av det fluorescerandeintensiteten av enstaka molekyler excitationsljuset bör erbjuda en laserbaserad källa eftersom intensiteten av denna ljuskälla är mer stabil än den som genereras av en kvicksilverlampa. För att minimera mekaniska vibrationer bör mikroskopet placeras på ett optiskt bord. Mer sofistikerad utrustning krävs för att studera rörelsen av pärlorna med depolymerizing mikrotubuli slutar under ett konstant kraft, och för att mäta de enda skott kraftsignalerna 11,38,39, kommer dessa metoder beskrivs på annan plats.

1. Tillverkningsåter Flow Chambers

Glasskivor för återströmningskammare kan beställas från en lokal glastillverkningsanläggning med hjälp av scheman i figur 1B (se tabell 2 för information om vår leverantör). Med ultraljud fräsning modifiera vanliga objektglas (75 mm x 25 mm, 1,0 mm tjocka) för att göra två spår 15 ± 1 mm lång, 1,0 ± 0,1 mm breda och 0,8 ± 0,05 mm djupa.Avstånd mellan de närmast ändarna ska vara 14 ± 1 mm, detta avstånd är optimalt för en kammare monteras med 22 mm x 22 mm täckglas. Se tabell 2 för en lista med andra material.

  1. Placera ett 100 mm långt polyetenrör (OD 0,61 mm, Tabell 2) i varje spår i sliden, vilket lämnar ~ 5 mm överhäng vid de inre ändarna av spåren. Fäst rören inuti spåren med cyanoakrylatlim, bädda rören helt inne i spåren.
  2. Fyll spåren med epoxilim, och samtidigt undvika att spilla limmet inuti rören. Låt limmet torka i cirka 1 dag.
  3. Med ett vasst rakblad kapa stelnade limmet massa 3-4 mm från den distala änden av varje fastsättningsställe, avlägsna de delar proximalt till mitten på bilden. Rören ska stanna kvar i sina spår. Ta bort de proximala delarna kommer också att minska och ta bort de inre överhäng, skapa en plan yta med två rörsöppningar.
  4. Fyll en spruta med vatten och provom rören fungerar. Om vätskan flödar fritt, sätta en droppe epoxy lim (~ 5 mm i diameter) vid de yttre ändarna av lundar, torra för 1 dag (figur 1D). Detta kommer att göra kamrar mer hållbara, så att de kan användas flera gånger under flera månader.
    Anmärkning 1: För att göra en kammare för ett inverterat mikroskop, bör objektglasen modifieras ytterligare för att göra två små hål vid de motsatta ändarna av spåren (figur 1C). För in rören genom hålen i bilden, böja rören och montera dem tätt innanför spåren (figur 1E). Följ steg 1,2-1,4, men ta bort epoxy lim från hela ytan, som kommer att användas för att göra en flödeskammare.
    Anmärkning 2: För att minska kammarvolym, använd fräs för att göra två inbuktningar 0.050 ± 0.005 mm djupa, lämnar den centrala delen av bilden 5,0 ± 0,5 mm breda och något förhöjd (se "etsade områden" på figurerna 1B och 1C). När tHan flödeskammare monteras (som beskrivs nedan), placera dubbelhäftande tejp innanför dessa fördjupningar.
    Not 3: För att återanvända dessa ändrade bilder, efter att ha avslutat experimenten ta bort täckglas och dubbelhäftande tejp med hjälp av ett rakblad. Ta bort tätningsmedlet genom avdragning av den och genom att torka av objektglas med 70% etanol. Placera objektglaset i en behållare med 1-2% av ett labb diskmedel, fästa slangen till en peristaltisk pump och BEGJUTA 50-70 ml, följ med lika volym avjoniserat vatten, torka och förvara i en dammfri facket.

2. Beredning av Täck

Detta protokoll tar 6-8 timmar och kommer att bidra till att förbereda 12 täckglas. Du behöver en keramisk täckhållare och 3 täckfärgningskärl med lock, burk volymen bör vara 15 ml, så var och en kommer att hålla 4 täckglas staplade tillsammans. En glasburk med ett lock (250 ml), bör användas för att inkubera täckglas med silan. Använd vanliga No.1 glas täckglas (22 mm x 22 mm eller 22 mm x 30 mm, se tabell 2 och 3 för en lista på material). Alla steg skall genomföras i ett dragskåp med handskar.

  1. Sätt täckglasen i glaset täckglas färgningskärl och fyll burkarna med aceton. Inkubera under 1 timme, tvätta 10x med avjoniserat vatten.
  2. Inkubera täckglasen 10 min med etanol och tvätta igen 10x med avjoniserat vatten.
  3. Förbered "piraya" lösning. Sätt 60 ml väteperoxidlösning (30% i vatten) i en värmebeständig glaskärl och tillsätt långsamt 100 ml svavelsyra (slutligt förhållande av syra till väteperoxidlösningen är 5:03). Lösning kommer att värma upp, det är normalt, men var försiktig. Piranha lösning är starkt frätande! Använd tjocka labbrock, handskar och skyddsglasögon!
  4. Fyll täckfärgningskärl med "Piranha"-lösning, stänga locken och placera burkarna i ett vattenbad som förvärmts till 90 ° C under 1 timme.
  5. Häll av "piraya" solutiom och kassera enligt anvisningar från säkerhetsföreskrifterna på din arbetsplats. Tvätta täck 10x med avjoniserat vatten.
  6. Fyll täckfärgningskärl med 0,1 M KOH, inkubera 10 min, och tvätta 10x med avjoniserat vatten. Detta kommer att neutralisera eventuella syrarester kvar på täck efter "piraya" behandling.
  7. Torra täck en i taget genom att hålla varje täckglas med teflonbelagda platta kanter pincett (för att minimera skador på en glasyta) och samtidigt blåser komprimerad torrt kväve. Se till att täckglasen torkas fullständigt, eftersom silanlösning är mycket reaktiv med vatten.
  8. Stapla torkade täckglas i keramiska hållare (12 täckglas per hållare), vilket bör noggrant förtorkad med kväve. Behåll de keramiska hållare som omfattas för att undvika damm fastnar på täckytan.
  9. Täck botten av 250 ml glasburk (6 cm i diameter) med molekylsiktar, Grade 564, för vattenabsorption.
  10. Fyll burken med 200 ml avPlusOne Repel silanlösningen och långsamt doppa en keramisk hållare med täckglas i en burk, stänga locket och inkubera under 5 min vid rumstemperatur. Detta kommer att skapa hydrofoba beläggningen på täckytan.
  11. Sakta ut hållaren med täck från burken och överföra täckglas i taget in i täckfärgningskärl fyllda med metanol.
  12. Placera en metall eller glas piedestal i vattenbehållaren av en sonisk bad, så att täckglaset färgning burk är nedsänkt för 2/3 av dess höjd. Ultraljudsbehandla vid 70 W under 20 min, förändras metanollösning varje 5 minuter och skölj sedan 10x med avjoniserat vatten. Om silanisering fungerat korrekt, kommer täck visas torra när de avlägsnas från vattnet.
  13. Grundligt avlägsna eventuellt kvarvarande vatten med användning av kväve, såsom ovan.
  14. Mellanlägg täckglasen med Kimwipes att undvika yta mot yta kontakt mellan täckglas. Täckglas kan lagras i en tillsluten behållare under flera veckor vid rumstemperatur.
    NAnm 1: Steg 2,1-2,6 kan ersättas genom att rengöra täckglas med Plasma Cleaner för 15 min vid 30 W, vilket kraftigt minskar den totala förberedelsetid. Trycket inne i städkammaren är satt till 100-200 mTorr. Både atmosfär och komprimerad syrgas kan användas. Stapla plasma rengjorda täckglas i keramikhållare och gå vidare till steg 2.7.

3. Beredning av GMPCPP-stabiliserade mikrotubuli Seeds

Detta förfarande kommer att ta cirka 1 timme och de resulterande mikrotubuli frön är stabila under 1-2 dagar vid rumstemperatur. Se tabell 4 för en lista av reagenser.

  1. Blanda på is:
    • 10 pl omärkt tubulin (100 M, tabell 4) i BRB-80 buffert (80 mM Pipes, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl2, pH 6,9 med KOH, komplettera med 1-2 mM DTT använda ny omgång för varje experiment).
    • 2,6 pl digoxigeninmärkt tubulin (tabell 4). Justera volymen beroende på förberedelser,så att det slutliga förhållandet av märkt och omärkt tubulin är ~ 01:10. Blanda väl genom pipettering.
    • 1,4 l 10 mM GMPCPP (slutlig koncentration 1 mM)
  2. Inkubera 15 minuter vid 35 ° C, kommer fröna växa 2-3 nm lång. Justera tiden om annan mikrotubuli längd önskas.
  3. Addera 35 pl BRB-80 (förvärmd till 35 ° C), blanda genom pipettering, och centrifugera i 15 min vid 25000 x g för pelletering av frön vid rumstemperatur.
  4. Kassera supernatanten, tvätta pelleten genom att försiktigt lägga till och ta bort 50 pl varm BRB-80.
  5. Återsuspendera pelleten väl i 25 | il BRB-80.

4. Utmätning av mikrotubuli Frön till Täck

Protokollen 4 och 5 kommer att kräva 2-3 tim, så två flödeskammare användes per dag.

  1. Montera flödeskammare enligt tillverkarens anvisningar med hjälp av silaniserade täckglas och gå vidare till steg 4.2. Om du använder skräddarsydda täckglas (protokoll 1), följ stegen beläg.
    1. Fäst två bitar av dubbelhäftande tejp (5 mm x 30 mm) längs den centrala ~ 5 mm brett område, sätta silaniserad täckglas ovanpå tejpen, tryck ordentligt.
    2. Fyll kammaren med BRB-80 genom ett av rören och anslut båda rören med runda tandpetare.
    3. Pressa ut en liten droppe tvåfärgad Kwik Medverkande tätningsmedel på toppen av en liten plast petriskål och blanda snabbt men noggrant med en tandpetare. Fogmassan blir grön, gäller omedelbart, försiktigt tätning alla kanter på täckglas. Om tätningsmedlet tränger för djupt under täckglaset, öppna ett av rören genom att ta bort tandpetare pluggen och tryck lätt för att förhindra tätningsmedel läcker inuti rören.
    4. Låt kammaren torka i 10 minuter och bekräfta att flödet inte begränsas innan du går vidare.
  2. Placera kammaren på en mikroskopställningen förvärmd till 32 ° C, och bifoga ett av rören till en pump, som kommer att pumpa ut vätskan. Längden på inloppsröretbör minimeras för att undvika onödig förlust av reagenser: den rekommenderade längd är 5-7 cm. Sänk ned detta i en 0,5 ml injektionsflaska med BRB-80 buffert. Detta och alla lösningar nedan bör uppvärmd till 32-35 ° C.
  3. Applicera ett lätt tryck med en pump eller att lyfta upp änden av utloppsröret för att pressa ut luftbubblor, som kan bilda ibland när inloppsröret pluggen tas bort.
  4. Ställ in pumphastigheten vid 100 | il / min. Tvätta med 2 kammarvolymer av anti-digoxigenin antikroppar utspädda 1:30 i BRB-80, inkubera 15 minuter för att tillåta antikropps adsorption.
  5. Tvätta med 5-10 kammarvolymer av varm BRB-80, inkubera 10 min med 1% Pluronic F-127 i BRB-80 för att blockera den hydrofoba ytan av silaniserat täckglas.
  6. Tvätta med 5-10 kammarvolymer motilitet buffert (BRB-80 kompletterat med 0,4 mg / ml av kasein).
  7. Minska pumphastigheten till 10 l / min och BEGJUTA mikrotubuli frön utspädda 1:200-1:600 ​​i 30-40 pl motilitet buffert. Inkubera 15 miln för att främja bindning av fröna till täck-adsorberade antikroppar.
  8. Tvätta kammaren vid 100 | il / min med 400 | il av motilitet buffert för att avlägsna eventuellt obundet material.
    Anm 1: Den täthet frön bör vara 10-30 per mikroskopfält (Figur 2A). För att felsöka, använder fluorescerande tubulin under polymerisering (steg 3,1) för lättare upptäckt av täcklösa frön.
    Not 2: Axonemes framställda från Chlamydomonas 40 eller andra biologiska källor, såväl som de pellicles av lyserade och deciliated Tetrahymena-celler 41 kan även användas som mikrotubulus nukleatorer. Dessa är kärnbildare användbart för att skapa små mikrotubuli matriser, och är att föredra när mikrotubuli med särskild antalet protofilament önskas (GMPCPP utsäde nucleates en mikrotubuli som innehåller ≥ 14 protofilament 42). Dessa strukturer kan fästas på de rengjorda täckglas av ospecifik absorption, men den Attachment är vanligtvis mindre stabilt jämfört med antikroppsbaserad fastsättning, speciellt vid användning av silaniserade täckglas.

5. Beredning av Segmenterad mikrotubuli

Alla volymer lösning nedan är för kammarvolym 15-20 pl; öka proportionellt om större kammare används.

  1. Förvärm omärkt tubulin-blandning (45 ^ il motilitet buffert kompletterad med 1 mM Mg-GTP och med 10 till 15 | iM omärkt tubulin) under 30 sek vid 35 ° C. BEGJUTA på 30 | il / min.
  2. Övervaka mikrotubuli tillväxt med DIC optik (Figur 2B, Video 1). Under 5-7 min inkubation mikrotubuli brukar växa ~ 10 mikrometer lång.
  3. Förbered Rhodamine-tubulin-blandning (65 ^ il motilitet buffert kompletterad med 0,5 mM GMPCPP och 2-5 pM rhodamin-märkt tubulin med 0,5-1 molärt förhållande av Rhodamine till tubulin) och värma lösningen vid 35 ° C under 30 sek.
  4. BEGJUTA omedelbart vid 30 μl / min. Inkubera under 8-10 min för att främja bildandet av stabila fluorescerande lock vid mikrotubuli tips. Stabila mikrotubuli segment kommer också kärnor spontant och kommer att vara synlig med DIC optik.
  5. Tvätta kammaren väl med 100 | il av motilitet-buffert vid 20 | il / min för att avlägsna tubulins och nukleotider, samt lösliga mikrotubuli fragment.
  6. Med DIC, bekräfta att mikrotubuli är synliga (Figur 2D), deras antal, bör dock minska eftersom många mikrotubuli isär under tak (Video 2 visar en typisk fält med segmente mikrotubuli).
    Not 1: Segmenterad mikrotubuli är mycket stabila och kan användas i minst två timmar. Emellertid livslängden av dessa mikrotubuli minskar med överdriven utbyte lösningen eller om 2-merkaptoetanol används i avbildnings buffert.

6. Experimentell Observation av Protein Tracking med depolymerisering mikrotubulus Ends

  1. IntrodUCE 30-50 pl av fluorescerande protein (0,1-20 nM) i kammaren vid 10 pl / min. Om protein fastnar på täckglas är uppenbar, komplettera motilitet buffert med 4-8 mg / ml BSA. Alexa488-Dam1 tip-tracking dessutom kräver 10 mM DTT eller 0,5-1% PME 10.
  2. Begränsa belysningsområdet med hjälp av ett mikroskop fältbländare för att undvika onödig blekning och demontering av mikrotubuli.
  3. Starta video förvärv använda GFP filter kub, sedan byta till Rodamin filter kuben utan att avbryta bildinspelning. De röda segmenten vid mikrotubuli ändarna bör tydligt vara synliga, de kommer att börja blekna och falla sönder snabbt (Video 3).
  4. Fortsätt att lysa tills locken nästan försvinna (vanligtvis 10-20 sekunder, men den här gången kommer att vara längre för locken odlas med en lägre Rodamin märkningsförhållande), och växla tillbaka till GFP-kanal att spela in protein spårning med mikrotubuli demontering.
  5. Analyseraresulte sekvenser genom att bygga kymographs, dvs två-dimensionella bilder som visar fluorescensintensiteten längs mikrotubuli axel för olika tider under observation) med hjälp av metamorfa, fritt tillgänglig ImageJ eller annat bildbehandlingsprogram (Figur 2E).
    Anmärkning 1: Förvärvsfrekvensen bör anpassas beroende på tidpunkten för de observerade händelserna. Det rekommenderade priset är 2-3 bilder per sekund (fps) för långsamma, ring stora Dam1 komplex 27 men anskaffningstiden för enstaka molekyler bör vara> 20 fps 19.
    2: En mycket känslig EMCCD, t.ex. ANDOR iXon3, krävs för snabb inspelning av tip-tracking händelser med depolymerizing mikrotubuli. De rekommenderade inställningar för Andor iXon3 kamera är: gain 5x, EM vinna 200, 1 MHz avläsningshastighet, 16-bitars sensor-läge, 80 ms exponeringstid.
    Anm 3: Med hjälp av TIRF mikroskopi förbättrar signal-till-brus-förhållande, dock kortare mikrotubuli bör användas, sådan that de fluorescerande stabiliserande locken håller sig inom räckhåll för försvinnande fält.

7. Kvantitativ analys av molekylär storlek mikrotubuli Tip-tracking komplex

Den logiska grunden för detta angreppssätt är att bestämma antalet molekyler i en spets-tracking komplex genom att hitta förhållandet av totala fluorescensintensiteten hos spetsen följ komplex till intensiteten hos en enstaka fluorofor. Denna metod kan tillämpas på GFP-proteinfusioner och proteiner märkta med fluorescerande färger, men det kan underskatta antalet molekyler i tip-tracking komplex om vissa proteinmolekyler i förberedelserna inte är fluorescerande.

  1. Record fotobleknings kinetiken för den fluorescensmärkta proteinmolekyler.
    1. Montera vanlig mikroskopi kammaren med användning av en icke-modifierad glasskiva, två remsor av dubbelsidig tejp, och ett rent täckglas, som kan framställas med användning av hela protokollet 2 eller endast steg från 2,1 till 2,6 i dennaprotokoll.
    2. Tillsätt cirka 50 nM protein i motilitet buffert, tvätta hastigt med motilitet buffert och försegla kammaren med valap (tabell 4). Optimera proteinkoncentration för att få fältet med jämnt spridda fläckar (Figur 3A), som representerar enstaka molekyler och deras små aggregat (trimerer och tetramerer, som kan bilda spontant i lösningen eller kan uppstå när flera enskilda molekyler är nära varandra och kan inte lösas) . Detta steg är mycket viktigt för att få en multi-topp distribution av fotoblekningssteg och noggrann bestämning av ett steg storlek (se nedan).
    3. Minimera belysningslaserintensitet vid vilken de enskilda fluorescerande fläckarna är fortfarande synliga, med lägre belysning av fotoblekning tiden förlängs, kan så längre fotoblekning spår erhållas. Också minimera exponeringstiden för att minska sannolikheten för att fler än en fluorofor blekning under en ram. Den rekommenderade inställningenför Andor iXon3 kamera: gain 5.0x, EM vinna 999, 10 MHz avläsningshastighet, 50-100 ms exponeringstid.
    4. Fokus på ytan av täckglas, stänga belysnings slutare, flytta till ett nytt område, öppna belysnings slutare och få bilder tills alla komplex har blekt (därefter kallat img (x, y)).
  2. Rätta de förvärvade bilderna för ojämnheter i belysning (Figur 3B).
    1. Bered lösningen av någon fluorofor, t.ex. 1 pM fluorescein isotiocyanat (FITC) i BRB-80. En sådan lösning kan framställas i förväg, alikvoterades och lagrades vid -20 ° C.
    2. Montera en kammare som i avsnitt 7.1.1 men använder en vanlig täckglas. Lägg fluoroforen lösning och försegla kammaren med hjälp valap.
    3. Samla> 50 bilder från hela mikroskopfält: flytta scenen till ett nytt oblekt området medan belysningsslutaren är stängd, och få bilderna omedelbart efter att slutaren.
      4. (figur 3C). Den resulterande bilden visas den procentuella fördelningen av belysningsintensiteten för fältet (Illum (x, y), där x och y motsvarar pixelns koordinater).
    4. Bestäm högsta pixel ljusstyrka här bilden (Max (Illum)).
    5. Med den slutna belysning slutare och använder samma kamerainställningar som i avsnitt 7.2.3 förvärva en bild, fastställa den genomsnittliga pixelintensiteten denna bild, vilket värde motsvarar CN, kameraljud.
    6. Använd ovanstående värden och bild (Illum (x, y)) för att normalisera den experimentella bild (img (x, y)) med användning av följande uttryck:

      Använd den resulterande bilden img norm (x, y) för kvantitativ analys av brightness av de stationära fluorescerande komplex, och även för att normalisera de bilder med spets Slående komplex (Figur 3D).
  3. Bestäm intensiteten i en enda fluorofor.
    1. Använda normaliserade bilder img norm (x, y) och eventuella bildbehandlingsprogram välja en fluorescerande fläck med ett cirkulärt område (5-6 pixlar i diameter) och bestämma dess integrerad intensitet för alla ramar, generering av fotoblekning spår. Undvik mycket ljusa punkter (> 5 gånger ljusare än dimmer sådana).
    2. Med samma cirkulär region verktyget och markera minst 3 spot fria områden, genererar motsvarande fotoblekning spår, genomsnittlig och passar med exponentiellt avtagande funktion.
    3. Tabulera den bakgrunden intensitetskurva för att matcha de experimentella tidpunkter och subtrahera den från fotoblekningskurvor.
    4. Jämna fotoblekning kurvorna (medeltal med skjutfönster på 3-5 poäng). Kontrollera visuellt de resulterande kurvorna ochkassera varje kurva som visar en abrupt ökning av fluorescens eller avsaknad av uppenbar blekning (figur 3E).
    5. För var och en av de övriga kurvorna (vanligtvis 50-70% av det totala antalet kurvor), visuellt markera den sista platån, när det fluorescerande fläck har blekts. Korta detta segment för att lämna endast ~ 100 poäng och i genomsnitt dessa intensiteter. Subtrahera detta värde från den förkortade fotoblekning kurvan för att minimera små variationer är bakgrundsnivåerna och för att minska storleken på bakgrunden toppen (nedan).
    6. Rita ett histogram av de stödnivåer för alla tidpunkter från 20 eller fler fotoblekningskurvor (> 1000 tidpunkter). Histogrammet bör uppvisa minst fyra distinkta toppar (se not 2).
    7. Montera histogrammet med lika avstånd normalfördelning 10,43 hjälp av MATLAB, Mathematica eller liknande programvara (Fig. 3F):

      whär Aj och σ i, d och N är passande parametrar. Parametrarna A I och σ jag motsvarar amplitud och bredd i: te topp, d är avståndet mellan topparna, n är heltal, som motsvarar det totala antalet toppar i distributionen. Om centrum för de första 3 eller fler toppar visar en visuellt bra matchning till den anpassade linjen, avståndet mellan dessa toppar (parameter d) motsvarar en fluorescerande intensitet en enda fluorofor.
      Anmärkning 1: Antal undersökta punkter (avsnitt 7.3.6) bör ökas om mikroskopi systemet uppvisar betydande vibrationer eller det finns en annan bullerkälla (t ex instabil laserstråle).
      Anmärkning 2: Det är viktigt att få> 3 toppar för noggrann analys med samma avstånd Gaussisk passform. Om färre toppar erhålls, kan det falska (t.ex. dubbel) steg storlek erhållasnär belysningsförhållandena inte är optimala, är till exempel när prickarna bleker alltför snabba och enkla steg inte löst väl.
  4. Bestämma molekylstorleken hos spetsen följ komplex.
    1. Använd bilder som samlats in med protokoll 6 och markera de första 2-4 ramar, som förvärvades omedelbart efter att slutaren. Om fältet belystes en tid innan spets-tracking observerades, uppskatta den ursprungliga intensiteten från kinetiken för fotoblekning under samma försöksbetingelser.
    2. Medelvärdet de markerade ramarna och normalisera den resulterande bilden som i avsnitten 7.2.5-7.2.7.
    3. Mät integrerad intensitet av det fluorescerande spets-tracking komplex använder samma region storlek som i avsnitt 7.3.1.
    4. Mät integrerad intensitet av 3 bakgrunds områden som ligger nära spetsen-tracking komplex och använder samma region, i genomsnitt dessa värden och subtrahera från intensiteten i spetsen-tracking komplex från avsnitt 7.4.3. Beräkna antalet fluorofor molekyler i komplex genom att dividera den fluorescensintensitet som erhölls i avsnitt 7.4.4 av intensiteten hos den enda fluoroforen erhållits i avsnitt 7.3.5.
      Anmärkning 1: Det är önskvärt att belysning och förvärvsinställningar för protokoll 7.4 är de samma som i protokoll 7.1. Om någon exponeringstiden eller laser intensitet justerades under dessa steg, bör de resulterande fluorescerande värdena anpassas i enlighet därmed. Dock bör kontrolleras riktigheten av sådan skalning genom att avbilda samma prov (t.ex. fluorescerande tid) under dessa olika förhållanden och beräkning av förhållandet mellan de resulterande intensitet.

8. Mikrotubuli Tip-spårning av Protein Coated Pärlor

  1. Utföra experiment med tip-spårning pärlor genom att utlösa MT demontering som i protokoll 6. Intensitet av DIC ljuskälla bör minskas för att möjliggöra visning rodaminfluorescens samtidigt medDIC avbildning.
  2. Förbered pärlorna som i Grishchuk et al. 10 och Asbury et al. 11 Införa 30-50 pl pärlsuspension i kammaren vid 10 | il / min. Den föreslagna pärla koncentrationen är 10 -16 -10 -17 M.
  3. Om du använder upprätt mikroskop, ta bort kammaren från mikroskop scenen och vänd den i 5-10 minuter för att tillåta pärlor att sedimentera på täckglas. Detta främjar en bättre bindning av pärla till mikrotubuli bundna till täckglaset, men detta förfarande inte lyckas med 0,5 um polystyren pärlor, som visar lite gravitation baserade sedimentation under så kort tid.
  4. Välj en vulst som är fäst vid täckglas-tjudrad mikrotubuli; pärlan bör röra sig i en tydlig båge 44 (figur 4A). Den bundna pärlan ska placeras 1-3 ìm bort från täckytan, som är väl synlig på grund av de tillfälliga täck-anslutna pärlor som förblir motionless.
  5. Växla till Rodamin filter kub och börja samla in bilder när du använder DIC belysning.
  6. Öppna slutaren för att belysa bildfältet (bundet med en fältbländare) med en kvicksilverlampa eller 530-550 nm laser. Fortsätt registreringen tills pärla lossnar eller rör sig med demontering mikrotubuli änden (figur 4D, 4F och 4G).
    Not 1: Optisk fälla kan användas för att främja samverkan mellan mikrotubulus vägg och protein-belagda pärlor. Detta är särskilt användbart när man arbetar med pärlor belagda med kinesin motorer (fig. 4E-G). Följ samma protokoll som ovan men komplettera motilitet buffert med 2 mM Mg-ATP. I steg 8.3, fånga en fritt flytande pärla med 1064 nm laserstråle, flytta scenen för att ta med den fångade pärla närmare den segmente mikrotubuli väggen. Börja avbildning med svagt ljus DIC och via rodamin filterkuben och vänta på att pärla för att börja vandra mot utjämnade mikrotubuli slut. AftER de riktade pärla rörelse observeras, stäng slutaren för att fånga strålen och öppna slutaren för lysrörsbelysning. Fortsätt registreringen tills pärla lossnar eller spår med demontering mikrotubuli slut.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protein spårning med depolymerisera mikrotubuli slutar. Jäst kinetochor komponent Dam1 är den absolut bästa tips-tracker för depolymerizing mikrotubuli slutar 14. Denna 10-subenhet komplex märkta med GFP lätt kan uttryckas och renas från bakterieceller 18,38, så vi rekommenderar att du använder det som en positiv kontroll för tipset-tracking-analysen. En fluorescerande protein som spårar med depolymerizing änden av en mikrotubuli ses som ett klart fluorescerande fläck stadigt rör sig mot täckansluten frö (Video 3). Den kommer också att visas som en sned linje på en motsvarande kymograph (Figur 2E). I motsats härtill om proteinet inte tippa spårigt förkortar mikrotubuli utan att visa anrikning i fluorescerande signal vid mikrotubulus ände såsom ses för humant Ndc80-GFP komplex 19 (Figur 2F). När processive spårning observeras, graden av mikrotubuli kortstärkning kan bestämmas genom att spåra det rörliga prick eller genom att mäta lutningen hos den sneda linjen på motsvarande kymograph. Detta kan ge information om styrkan av protein-mikrotubuli end bindande 45. Proteiner som binder starkt till mikrotubuli, liksom Dam1 ring komplex, bromsa takten i mikrotubuli depolymerisation. Denna effekt är dock starkt beroende av storleken på spets-tracking komplex och de små komplex kan utöva liten eller ingen effekt på hastigheten av mikrotubuli demontering 27. Därför bör förändringen i graden av mikrotubuli förkortning tolkas mot bakgrund av storleken på spets-tracking komplex. Under vissa förhållanden, kan spårningen åtföljas av den ökade ljusstyrkan på spets-tracking komplex, eftersom den depolymerizing änden "samlar" det protein som var bundet till mikrotubuli gitter. I detta fall är hastigheten av depolymerisering saktar ofta ned samtidigt med den ökande storleken av spetsen-tracking komplex. I andra fall förhållandet är mer komplex. Till exempel har många subenheter av Dam1 proteinkomplex, i vilka GFP konjugerades vid N-terminalen av Dam1 subenheten, kan samlas in vid slutet av matfettet mikrotubulus (figur 2G). Mikrotubuli demontering bås så småningom, förmodligen på grund av att kraft mikrotubuli depolymerisation är inte stark nog att flytta komplex som är för stora. Demonteringen återupptar ofta efter en minskning i dricks ljusstyrka, vilket indikerar dissociation av en del av spetsassocierade Dam1 subenheter 10. Noggrann granskning av dessa relationer är viktigt eftersom mikrotubuli-bindande proteiner som inte spårar processively även kan bromsa takten i mikrotubuli demontering 19,31,46.

Bead spårning med depolymerisera mikrotubuli ändar Många mikrotubuli-bindande proteiner har redan identifierats som kopplare för microbead rörelse med dynamisk mi.crotubule slutar 5,11,27,39,47. Påfallande, kan även den Ndc80 proteinkomplex upprätthålla mikrotubuli ändspetsen-spårning av kulorna 29,30. Vanligtvis bindning mellan proteinbelagda pärlor och mikrotubuli är stark, så när pärlor sätts till mikroskopi kammaren de binder lätt till de segmenterade, täcklösa mikrotubuli (Figur 4A). Det är inte alltid möjligt att definitivt se med DIC om pärlan blev fäst vid en enda mikrotubuli. Vi har utvecklat ett antal kriterier för att undvika att spela in kulorna som har bildats bilagor till flera mikrotubuli. För det första bör en pärla som är ansluten till en mikrotubuli visar en båge-liknande rörelse, eftersom mikrotubuli svänger lite runt platsen för sin tillväxt från täckglas fäst frö (Figur 4B). För det andra, när det stabiliserande locket är upplyst, endast ett rött segment bör ses distalt från fröet och vulsten (Figur 4C). Locket kan ofta ses following pärlan s båge-liknande rörelse tills cap blekmedel (Video 4). För det tredje bör iakttas pärlan rörelse (eller dess lösgörande) kort efter att locket har blekts och riktning pärla rörelse bör överensstämma med mikrotubuli orientering, som härleddes baserat på ovanstående iakttagelser. För det fjärde, eftersom mikrotubuli förkortas och pärla rör sig mot frö, bör amplituden av bågliknande svängningar minskar (Figur 4D).

När spårnings genom vulsten är mycket processiv, såsom visas i fig 4D, är dessa kriterier ofta är uppfyllda. Om emellertid vulsten spårning är inte processiv, efter viss inledande riktad rörelse vulsten lossnar och börjar diffundera slumpvis. Med större pärlor, t ex 1 ^ m glaspärlor, är detta termiska rörelse långsam nog att det skulle kunna misstolkas som en båge innehållande rörelse med matfettet mikrotubulus ände. Ett formellt kriterium som grundar sig på omfattningen avvulst avvikelse från det linjära spåret kan användas för att särskilja sådana händelser 29. I vårt tidigare arbete som vi beräknade genomsnittliga pärla utflykter över mikrotubuli axeln och beräknat att om detta värde översteg 0,4 ìm / 1 mikrometer i mikrotubuli-parallell pärla rörelse, var sannolikt att sprida slumpmässigt med 95% förtroende pärlan. Med hjälp av denna åtgärd vi funnit att även i "kontroll" bead preparat, t.ex. pärlor belagda med icke-specifik antikropp eller streptavidinbelagda pärlor som används i samband med biotinylerade mikrotubuli, och 5% av pärlorna bedömdes flytta processively. Om större noggrannhet är önskvärt att övervaka rörelser av pärlor med låg processivitet, rekommenderar vi att du använder en laserfälla, där de riktade pärla rörelser är lättare att identifiera.

Laser fälla bör också användas om pärlorna inte bilda varaktiga bilagor till stabila mikrotubuli. Vi använde oss av en laserstråle för att fånga pärlor belagda med olika proteinkonstruktioner av PLUs-end-riktad kinesinen CENP-E och till "launch" sådana pärlor på de segmente mikrotubuli väggar (Figur 4E) 24. I närvaro av ATP dessa pärlor röra sig snabbt (från 20 till 25 | im / min) mot capped mikrotubuli plus ändar; på en kymograph, sådan rörelse resulterar i den sned linje riktad mot locket (fig. 4F och 4G). Efter det att locket förstörs, en vulst belagd med den stympade CENP-E-proteinet lossnar från mikrotubuli (grön pil på figur 4F). Emellertid kan den fulla längden CENP-E-proteinet sustain bead rörelse i den motsatta riktningen, dvs i riktning mot minus mikrotubulus ände (Video 5). Som ett resultat visar den kymograph för sådana pärlor ett sicksackmönster, vilket indikerar närvaron av både plus-änden och minus-ände riktade rörelser av pärlorna belagda med full längd, och inte trunk CENP-E. Vi förväntar oss att andra mikrotubuli beroende motorer kan uppvisa liknande motilitet 5,13

Figur 1
Figur 1. Flödes kammare för in vitro-studier med segmenterade eller dynamiska mikrotubuli. A. Diagram av en segmenterad mikrotubuli (MT). Stabila MT frön är beredda med digoxigenin (DIG)-märkta tubulin och GMPCPP, bifogas täckglas via anti-DIG-antikroppar. Icke-specifik bindning av tubulin och andra proteiner är blockerad med Pluronic F127. Mikrotubuli utökas från fröna med hjälp av omärkt tubulin och GTP, och dessa förlängningar är täckta med korta segment innehållande Rhodamine märkt tubulin och GMPCPP (i rött). MT Plus slut (märkt med +) kan oftast vara disskiljer sig tydligt från en mycket kortare minus ände (-). B och C. Detaljerade system för den modifierade flödeskammaren glider använda med upprätt och omvänt mikroskop. Sonic platser visas i gult. Siffror är i millimeter. D och E. Sido vyer av modifierade diabilder (ej i skala) med tillhörande slangar,. Tjocka pilar indikerar vätskeflödet genom rören efter kamrarna färdigmonterad är (visas ej) Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2
Figur 2. Beredning av segmente mikrotubuli och typiska protein tip-spårningsresultat A.. Coverlösa mikrotubuli frön visuliserade med DIC optik (steg 4.8 i protokollet), pilar pekar på några av fröna. Bilden är i genomsnitt 10 bildrutor förvärvade sekventiellt (100 ms exponering vardera). B. Samma mikroskopfält efter tubulin och GTP inkuberades under 8 minuter vid 32 ° C, är mikrotubuli sett härrör från frön (steg 5.2 i protokollet). C. En pseudo-färgade bilden visar en segmenterad mikrotubuli ses i DIC (grön) och rodaminmärkt stabiliserings lock (pilar), ses med epifluorescence (röd). D. Samma bild som på panel C, men med ett större synfält. Vissa Rhodamine innehåller mikrotubuli fragment, som kärnor spontant i lösningen under steg 5.2 i protokollet, ses också (pilspetsar). E. Kymograph av Dam1-GFP protein spåra demontering mikrotubulus ände. Färgkodade staplarna till vänster visar en fluorescerande kanal som används för förvärv av motsvarande del av kymograph. VertiCal fluorescerande linjer skapas av Dam1-GFP komplex som binder till mikrotubuli väggen och visar lite rörelse tills mikrotubuli slutet kommer med. F. Kymograph som på E men med GFP märkt Ndc80 komplex 19. Inledningsvis är mikrotubuli dekorerad enhetligt, trots ökad GFP fluorescens observeras vid den utjämnade slut efter Rodamin excitation. Denna ökning beror på den lösliga pool av Ndc80-GFP-protein, men den bakomliggande mekanismen är inte känd. När locket sönderfaller, blir mikrotubuli förkortning uppenbar men det finns lite anrikning av fluorescens i mikrotubuli spetsen, vilket tyder på en brist på spets-tracking. G. Avstånd från en spets-tracking Dam1 fläck till axoneme, som användes för mikrotubuli kärnbildning i detta experiment 10, mättes med användning av MetaMorph spårpunkter drop-in. Den initiala ljusstyrkan på den rörliga komplexet motsvarar ungefär 15 subenheter: tillräckligt för att bilda en enda Dam1 ringen. Ljusstyrkan för the flyttar komplexa normaliserades till intensiteten av täck-anslutna, orörliga fluorescerande fläckar för att korrigera för blekning. Horisontell skala pinnarna: paneler A, B, D (10 ^ m), paneler C, F, E (3 ^ m). Vertikala skala barer:. 10 sek Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3
Figur 3. Kvantitativ analys av fluorescenssignaler. A. Exempel bild av mikroskopfält med Dam1-Alexa488 komplexen binds ospecifikt till täckytan. Observera heterogenitet i punkter ljusstyrka och ojämnheter i belysningen. Skala bar är 2 nm. B. Kvantitativ representation av samma bild som i panel A. C D. Normaliserad bild från panel A ritas som intensitets yta med hjälp av Mathematica 9 (Wolfram Research). Notera att denna yta är mer platt än på B och topparna är mindre heterogena i höjd. E. Exempel på fotoblekningskurvor erhållna med CENP-E-GFP protein. Den integrerade intensiteten hos varje prick uppsamlades, normaliseras med hänsyn till ojämnheter i belysning och kurvorna utjämnas (medelvärde med det glidande fönstret i 5-enheter). Signaler i den övre raden uteslöts från vidare analys av skäl som beskrivs i avsnitt 7.3.4. Kurvor som de som visas i den nedre raden var vidareförädlas och används för att bygga ett histogram på panel F, enligt punkterna 7.3.4-7.3.5. F ng>. Histogram av integrerade intensiteter som samlats in från 22 blek CENP-E-GFP punkter (totalt 1900 datapunkter). Röd linje är passande med samma avstånd Gaussfunktion, 5 distinkta toppar ses. Den integrerade intensiteten i en enda GFP fluorofor bestämmas ur den histogram var (64,7 ± 1,1) x 10 4 au G. Typisk fotoblekning kurva för Dam1-Alexa488, behandlas enligt beskrivning i protokoll 7.3.5. H. Histogram av integrerade intensiteter som samlats in från 48 fotoblekning Dam1-Alexa488 punkter (totalt 1548 datapunkter), 4 olika toppar ses. Den integrerade intensiteten i en Alexa488 molekyl under dessa förhållanden var (17,4 ± 0,8) x 10 3 au Klicka här för att visa en större bild.

es/ftp_upload/51150/51150fig4.jpg "/>
Figur 4. Illustration av rörelser mikrotubuli-associerade pärlor. A. Schematisk av experimentet med pärlor belagda med mikrotubuli-bindande proteiner. Tjocka pilar anger riktning mikrotubuli demontering. B. Maximal intensitet projektion av DIC bilder av en GFP-Dam1 belagd pärla, som stabilt fästes till en segmenterad mikrotubuli (baserat på 26 bilder). Bead visade bågen liknande rörelse (pil), vilket tyder på att den var kopplad till en mikrotubuli orienterad som visas med en streckad linje. C. En bild av samma kula som i panel B, men tas under steg 8.6 i protokollet omedelbart efter det fluorescerande slutaren öppnades. Pilen pekar på den fluorescerande lock som är beläget i närheten av vulsten, men på motsatt sida från mikrotubuli fastsättningsställe. D. En maximal intensitet projektion visar banan för vulsten rörelse med disassembling mikrotubuli. Bild skapades från 115 bildrutor förvärvade sekventiellt från början av imaging (observera den båge-liknande projektion) och fram pärla avskildhet (Video 4). E. Schematisk av experimentet med pärlor belagda med plus-end-riktad kinesinen CENP-E. Vulsten bringas i kontakt med mikrotubuli med hjälp av laser-fälla. Fällan är då avstängd och pärla börjar gå mot mikrotubuli plus slutet. Efter det mikrotubulus-stabiliserande locket bort och mikrotubulus isär reverserar vulsten riktningen för dess rörelse. F. Kymograph visar en 0,5 fim pärla belagd med stympad X. laevis CENP-E kinesin går mot mikrotubuli plus slutet 24. Efter vulsten reste ca 1 ^ m, var fluorescerande slutare öppnas (röd stapel) och stabiliserande locket blev synliga (röda pilspets). Pärlan fristående plötsligt (grön pilspets), förmodligen när motorn mötte förkortning mikrotubuli slut. G Klicka här för att visa en större bild.

Video 1. Beredning av segmente mikrotubuli. Video visar DIC bilder av en mikroskopfält under beredningen av segmente mikrotubuli. Imaging startar efter mikrotubuli fröna redan har fäst på täckglas. Små runda prickar är från partiklar som finns i vår beredning av anti-digoxigenin antikroppar. Efter tubulin och GTP sätts, mikrotubuli börjar att förlänga från frön (steg 5,2). När de når önskad längd (8-15 nm), är lösningen utbyts snabbt att införa Rhodaminated tubulin och GMPCPP. Under utbytet mikrotubuli polymerer krök i direction flödes men efter pumpen stoppas de antar unstrained orientering. Under den följande "tak" stadiet, börjar vissa tubulin att polymerisera spontant och små mikrotubuli fragment ses flytande i kammaren. De tas bort under följande tvätt (steg 5,5), vilket också tar bort alla lösliga tubulin och nukleotider. Under dessa stadier några mikrotubuli misslyckas med att montera de robusta lock, och när lösliga tubulin tvättas bort de isär snabbt. De utjämnade mikrotubuli, dock är stabila under flera timmar om de inte är upplyst, då Rodamin är upphetsad, locken blir fragmenterad, och de icke-begränsade mikrotubuli segmenten blivit utsatt. Bilder förvärvades varje sekund, spelade på 30 fps.

Video 2. Avtäckningssegmente mikrotubuli. Video visar en färdigmonterad segmenterad mikrotubuli via DIC, följt av fluorescerande bilder av samma mikrotubuli via Rodamin filterkuben. A bhögra röda segment i slutet av mikrotubuli (pil) rör sig i båge och bleknar snabbt på grund av fotoblekning. Bilder förvärvades 6 fps och spelade på 10 fps.

Video 3. Protein spårning med depolymerisera mikrotubuli slut. En segmenterad mikrotubuli (MT) är synliga tack vare design av GFP-märkta Dam1, som bildar distinkta prickar (gröna bilder). Rodaminfluorescens är då upphetsad och den röda mössan blir synlig, rör sig i en mjuk båge i slutet av mikrotubuli (röda bilder), resten av mikrotubuli inte syns eftersom den märkta tubulin blev införlivas först i polymerens slut. Locket blekmedel snabbt, börjar falla sönder och den fluorescerande kuben kopplas tillbaka till GFP, precis i tid för att se starten av förkortning av mikrotubuli segment som inte har Rhodaminated tubulin och GMPCPP. När depolymerizing slut når Dam1 prickar blir mikrotubuli slutet ljust grönt. Därefter en grön fluorescerarnt plats ses röra sig med demontering mikrotubuli, illustrerar processive spets-tracking. Koncentration av Dam1 var 3 nM, bilder förvärvades och spelade på 0,4 bilder per sekund. Scale bar 5 um.

Video 4. Bead spårning med depolymerisera mikrotubuli slutar. Glas pärla belagd med Dam1 ses röra sig i en båge, vilket indikerar att det är bundna till täckglas med en mikrotubuli. När rodaminfluorescens exciteras, är den röda mössan sett distalt från kulan och rör sig synkront med pärlan rörelse (bilder i rött). Snart börjar pärla flyttar riktnings, medan dess båge-liknande rörelse minskar i amplitud (Figur 4D). DIC bilder förvärvades via Rodamin filter kub var 300 msek och spelade 6 bps, pärla är 1 mikrometer, skala bar 5 um.

Video 5. Kinesin belagd pärla flytta dubbelriktat på den segmente mikrotubuli. Imaging startar efter pärlan coated med full längd CENP-E kinesin placerades på mikrotubuli (MT) vägg. Pil pekar på den ursprungliga pärla läget. Pärlan ses på väg bort från pilen, eftersom motorn går mot plus mikrotubuli slut. Snart efter plus ändkåpan är upplyst (pilspets, röda bilder), börjar vulsten att röra sig i den motsatta riktningen. Endast fulla längd CENP-E kinesin kan par rörelse pärla till förkortning mikrotubuli slut. Pärlor belagda med stympad CENP-E kan röra sig mot plus-MT slutet men de lossnar snart efter mikrotubuli depolymeriseringen utlöses (jämför figur 4F och 4G). DIC bilder förvärvades varje 1 sekund och spelade på 16 fps, pärlan är 0,5 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Många enda molekyl analyser numera rutinmässigt använda specialbehandlade täckglas för att drastiskt minska ospecifika protein fastnar. Det förfarande som vi beskriver här är en modifikation av den ursprungliga protokoll som utvecklats i Howard lab 32, och vi tycker att silanisering täckglasen är väl värt ansträngningen även med DIC-baserade pärla analyser, som inte använder fluorescens. Chambers monterade med sådana täck visar mycket renare ytor, och de resultat som erhållits i närvaro av löslig mikrotubuli-bindande protein är mer reproducerbar, särskilt om en proteinkoncentration mycket låg används.

De mest kritiska stegen för utarbetandet av ett segmente MT är:

  1. optimering av tubulin koncentration och inkubationstider (steg från 5,1 till 5,2). De tider och koncentrationer som anges i protokollet är ungefärliga och kan variera beroende på skillnader i tubulin beredningar, kammarvolym osv.
  2. specifika och snävafastsättning av mikrotubuli nukleatorer till täckglas, och
  3. förmågan att kontrollera flödeshastigheterna exakt. I våra händer, är det bästa resultatet uppnås när experimenten utförs i de förseglade flödeskammare.

Den största fördelen med detta protokoll är att mikrotubuli depolymerisation kan utlösas med hög tids-och rumsupplösning, och därigenom hjälpa analys av motioner vid demonteringen mikrotubuli ändar. Med denna teknik, kan buffertarna bytas snabbt och mikrotubuli-bindande proteiner och pärlorna kan tillsättas i en mängd olika buffertar efter mikrotubuli har bildats. Detta gör det möjligt för studien av effekterna av ett protein på mikrotubuli depolymerisation separat från dess möjliga roller i mikrotubuli montering. Detta är användbart om proteinet kan också interagera med lösligt tubulin, som kan maskera sina interaktioner med mikrotubuli. Eftersom fri, opolymeriserad tubulin är närvarande i cellen, bör försiktighet iakttas whöna tolk fysiologiska betydelsen av dessa resultat.

Den största begränsningen av den segmenterade mikrotubuli tillvägagångssätt är att det inte är lämpligt att studera rörelser under mikrotubuli montering, eller effekterna av att spåra proteiner på mikrotubuli katastrof och räddning. För dessa frågor, analyser med dynamiska mikrotubuli som odlats i närvaro av lösliga tubulin är lämpligare. En annan begränsning med denna metod är att motorik buffertar bör vara fria från syrgasrenande enzymer. Sådana enzymblandningar, kan exempelvis baseras på katalas och glukosoxidas 48, avsevärt förbättra livstiden för fluorescerande molekyler. Men om dessa reagenser används i den segmente mikrotubulus analys är den fotoinduktion med demontering infrequent eftersom mikrotubulus Lock blekmedel utan sönderfall. I kvantitativa fluorescensanalyser, skall den alltid tas graden av blekning med i beräkningen, såsom beskrivits ovan, eller till exempel i referens23, särskilt om anti-blekmedel inte används.

Flera mikrotubuli-bindande proteiner som testades i den segmente mikrotubuli-analysen visade företrädesrätt bindning till rodaminmärkt stabiliserande lock vs de omärkta mikrotubuli segmenten. Bindning till locken kan minska andelen processiv pärlor, eftersom de cap-associerade pärlor lossnar ofta från mikrotubuli när locket faller sönder. Slutligen noterar vi att om motorbelagda pärlor gå mot plus mikrotubuli slut mycket snabbt, de ofta når de röda locken innan mikrotubuli depolymerisation utlöses, i vilket fall de kommer också att ta avstånd från mikrotubuli och ett sådant försök kommer inte att vara produktiv .

Sammanfattningsvis är möjligheten av mikrotubuli-bindande proteiner med någon inneboende motorik att följa förkortning slutet av en mikrotubuli en intressant, men ändå dåligt kända fenomen. De protokoll som beskrivs här bör hjälpa studier av sådan proteins och deras egenskaper in vitro. Mikrotubuli depolymerisation beroende transporter spelar en viktig roll i kromosomsegregation vid mitos. Därför hoppas vi att de metoder som beskrivs här i slutändan kommer att bidra till att få mer insikt i mekanismerna för celldelning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna vill tacka FI Ataullakhanov för att hjälpa till att designa och tillverka återanvändningsbara flödeskammare, N. Dasjkevitj, N. Gudimchuk och A. Korbalev för att ge bilder för siffror, N. Gudimchuk och P. Zakharov för att utveckla ett protokoll och ge reagenser förbereda digoxigeninmärkta mikrotubuli frön, A. Potapenko för hjälp med textredigering och andra medlemmar av Grishchuk labbet för tips och diskussioner. Detta arbete stöddes delvis av NIH bevilja GM R01-098.389 och en pilot bidrag från Pennsylvania Muscle Institute till ELG, som är en Kimmel Scholar, genom RFBR beviljar 12-04-00111-a, 13-04-40.190-H och 13 -04-40188-H, Russian Academy of Sciences Presidium Grants (Mekanismer för Molecular Systems Integration och Molecular and Molecular Cell Biology program) till FI Ataullakhanov, NIH bevilja GM R01 GM033787 till JR McIntosh, och en Dmitry Zimin Dynasty Foundation postdoktorsstipendium till VAV

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1. Microscopy and other equipment.
Microscope Zeiss
Nikon		 Axio Imager 2
Eclipse Ti		 other microscope models capable of DIC and epifluorescence-imaging can be used
Objective Zeiss
Nikon		 420490-9900-000
CFI Apo 100x Oil 1.49		 100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Objective heater Bioptechs 150803, 150819-19
Fluorescent filter cube Chroma 49004 or 49008
41017 or 49020		 optimized for Rhodamine fluorescence 
optimized for GFP fluorescence
Acquisition software freeware MicroManager
Molecular Devices		 not applicable
MetaMorph 7.5		 http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/
other software can be used to acquire images and for a particle tracking
EMCCD camera Andor iXon3, DU-897E-cs0-#BV Highly sensitive EMCCD camera
Trapping laser IPG Photonics YLR-10-1064-LP 1,064 nm laser, 10 W
Fluorescence excitation lasers Coherent, Inc.
Coherent, Inc.		 Sapphire 488 LP
Sapphire 552 LP		 excitation of green fluorophores
excitation of red fluorophores
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Commercial flow chambers Warner Instruments RC-20 or RC-30
Perfusion pump Cole Palmer
Harvard Apparatus		 Masterflex 77120-52
Pico Plus		 Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia. 
Table 2. Microscopy chamber preparation.
Modified microscope slides for reusable chambers Precision Glassblowing of Colorado Custom order www.precisionglassblowing.com Sonic slots in slides using schematics in Figure 1
Polyethylene tubing Intramedic 427410 I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container
Polyethylene tubing Intramedic 427400 I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber
Regular microscope slides VWR 48312-003 Other similar slides can be used
Coverslips VWR 48393-150, 48366-067 Other similar coverslips can be used
Silicon sealant World Precision Instruments KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE
Epoxy glue Loctite 83082
Cyanoacrylate adhesive Scotch 3M AD114 Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers
Table 3. Coverslips cleaning and coating.
Molecular Sieves, Grade 564 Macron 4490-04
Coverglass Staining Jar Ted Pella, Inc. 21036
Coverslip Ceramic Holder Thomas Scientific 8542e40
PlusOne Repel Silane GE Healthcare Biosciences 17-1332-01
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Anti-digoxigenin AB Roche Applied Science 11093274910
Table 4. Preparation of seeds and segmented microtubules.
Tubulin purified from cow brains
Cytoskeleton, Inc
T238P		 For purification protocols see 49–51
Unlabeled porcine tubulin
Labeled tubulin Cytoskeleton, Inc
Invitrogen
Invitrogen		 TL590M
C1171 (Rhodamine)
A-2952 (Digoxigenin)		 Rhodamine-labeled porcine tubulin
Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.
GMPCPP Jena Biosciences NU-405 Aliquot and store at -70 °C
VALAP Vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass see reference9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13, 83-117 (1997).
  2. Mitchison, T. M., Kirschner, M. W. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
  3. Walker, R. A., Brien, O., et al. Dynamic Instability of Individual Microtubules Analyzed by Video Light Microscopy: Rate Constants and Transition Frequencies. J. Cell Biol. 107, 1437-1448 (1988).
  4. Gardner, M. K., Zanic, M., Gell, C., Bormuth, V., Howard, J. Depolymerizing Kinesins Kip3 and MCAK Shape Cellular Microtubule Architecture by Differential Control of Catastrophe. Cell. 147 (5), 1092-1103 (2011).
  5. Lombillo, V. A., Stewart, R. J., McIntosh, J. R. Minus-end-directed motion of kinesin-coated microspheres driven by microtubule depolymerization. Nature. 373, 161-164 (1995).
  6. Franck, A. D., Powers, A. F., Gestaut, D. R., Gonen, T., Davis, T. N., Asbury, C. L. Tension applied through the Dam1 complex promotes microtubule elongation providing a direct mechanism for length control in mitosis. Nat. Cell Biol. 9 (7), 832-837 (2007).
  7. Tran, P. T., Walker, R. A., Salmon, E. D. A metastable intermediate state of microtubule dynamic instability that differs significantly between plus and minus ends. J. Cell Biol. 138 (1), 105-117 (1997).
  8. Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438, 384-388 Forthcoming.
  9. Coue, M., Lombillo, A., Richard, J. Microtubule Depolymerization Promotes Particle and Chromosome Movement In Vitro. J. Cell Biol. 112 (6), 1165-1175 (1991).
  10. Grishchuk, E. L., Spiridonov, I. S., et al. Different assemblies of the DAM1 complex follow shortening microtubules by distinct mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (19), 6918-6923 (2008).
  11. Asbury, C. L., Gestaut, D. R., Powers, A. F., Franck, A. D., Davis, T. N. The Dam1 kinetochore complex harnesses microtubule dynamics to produce force and movement. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (26), 9873-9878 (2006).
  12. Westermann, S., Wang, H. -W., Avila-Sakar, A., Drubin, D. G., Nogales, E., Barnes, G. The Dam1 kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends. Nature. 440 (7083), 565-569 (2006).
  13. Grissom, P. M., Fiedler, T., Grishchuk, E. L., Nicastro, D., West, R. R., Mcintosh, J. R. Kinesin-8 from Fission Yeast A Heterodimeric , Plus-End – directed Motor that Can Couple Microtubule Depolymerization to Cargo Movement. Mol. Biol. Cell. 20, 963-972 (2009).
  14. McIntosh, J. R., Volkov, V., Ataullakhanov, F. I., Grishchuk, E. L. Tubulin depolymerization may be an ancient biological motor. J. Sci. 123, 3425-3434 (2010).
  15. Grishchuk, E. L., McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Force generation by dynamic microtubule polymers. Compr. Biophys. 4, 93-117 (2012).
  16. Asbury, C. L., Tien, J. F., Davis, T. N. Kinetochores' gripping feat: conformational wave or biased diffusion. Trends Cell Biol. (1), 38-46 (2011).
  17. Tien, J. F., Umbreit, N. T., et al. Cooperation of the Dam1 and Ndc80 kinetochore complexes enhances microtubule coupling and is regulated by aurora B. Cell Biol. 189 (4), 713-723 (2010).
  18. Gestaut, D. R., Graczyk, B., et al. Phosphoregulation and depolymerization-driven movement of the Dam1 complex do not require ring formation. Nat. Biol. 10 (4), 407-414 (2008).
  19. Schmidt, J. C., Arthanari, H., et al. The Kinetochore-Bound Ska1 Complex Tracks Depolymerizing Microtubules and Binds to Curved Protofilaments. Dev. Cell. 23 (5), 968-980 (2012).
  20. Brouhard, G. J., Stear, J. H., et al. XMAP215 is a processive microtubule polymerase. Cell. 132 (1), 79-88 (2008).
  21. Stumpff, J., Du, Y., et al. A Tethering Mechanism Controls the Processivity and Kinetochore-Microtubule Plus-End Enrichment of the Kinesin-8 Kif18A. Mol. Cell. 43 (5), 764-775 (2011).
  22. Su, X., Qui, W., Gupta, M., Pereira-Leal, J., Reck-Peterson, S. L., Pellman, D. Mechanisms underlying the dual-mode regulation of microtubule dynamics by Kip3/kinesin-8. Mol. Cell. 43 (5), 751-763 (2011).
  23. Helenius, J., Brouhard, G., Kalaidzidis, Y., Diez, S., Howard, J. The depolymerizing kinesin MCAK uses lattice diffusion to rapidly target microtubule ends. Nature. 441 (7089), 115-119 (2006).
  24. Gudimchuk, N., Vitre, B., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nat. Cell Biol. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  25. Akhmanova, A., Steinmetz, M. Microtubule +TIPs at a glance. J. Sci. 20 (Pt 20), 3415-3419 (2010).
  26. Dixit, R., Barnett, B., Lazarus, J., Tokito, M., Goldman, Y., Holzbaur, E. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (2), 492-497 (2009).
  27. Grishchuk, E. L., Efremov, A. K., et al. The Dam1 ring binds microtubules strongly enough to be a processive as well as energy-efficient coupler for chromosome motion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (40), 15423-15428 (2008).
  28. Akiyoshi, B., Sarangapani, K. K., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  29. McIntosh, J. R., Grishchuk, E. L., et al. Fibrils Connect Microtubule Tips with Kinetochores A Mechanism to Couple Tubulin Dynamics to Chromosome Motion. Cell. 135 (2), 322-333 (2008).
  30. Powers, A. F., Franck, A. D., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  31. Umbreit, N. T., Gestaut, D. R., et al. The Ndc80 kinetochore complex directly modulates microtubule dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (40), 16113-16118 (2012).
  32. Gell, C., Bormuth, V., et al. Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods Biol. 95, 221-245 (2010).
  33. Dixit, R., Ross, J. L. Studying Plus-End Tracking at Single Molecule Resolution Using TIRF Microscopy. Methods Cell Biol. 95, 543-554 (2010).
  34. Beausang, F. J., Sun, Y., Quinlan, E. M., Forkey, N. J., Goldman, Y. Construction of Flow Chambers for Polarized Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (polTIRFM). Cold Spring Harbour Protoc. 6, 712-715 (2012).
  35. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP Hydrolysis in Microtubule Dynamics: Information from a Slowly Hydrolyzable Analogue, GMPCPP. Mol. Biol. Cell. 3, 1155-1167 (1992).
  36. Grishchuk, E. L., Ataullakhanov, F. I. In Vitro Assays to Study the Tracking of Shortening Microtubule Ends and to Measure Associated Forces. Methods Cell Biol. 95, 657-676 (2010).
  37. Gutiérrez-Medina, B., Block, S. M. Visualizing individual microtubules by bright field microscopy. Am. J. Phys. 78 (11), 1152-1159 (2010).
  38. Volkov, V. A., Zaytsev, A. V., et al. Long tethers provide high-force coupling of the Dam1 ring to shortening microtubules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (19), 7708-7713 (2013).
  39. Laan, L., Pavin, N., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
  40. Myster, S. H., Knott, J. A., O'Toole, E., Porter, M. E. The Chlamydomonas Dhc1 gene encodes a dynein heavy chain subunit required for assembly of the I1 inner arm complex. Mol. Biol. Cell. 8, 607-620 (1997).
  41. Lombillo, V. A., Coue, M., McIntosh, J. R. In vitro motility assays using microtubules tethered to Tetrahymena pellicles. Methods Cell Biol. 39, 149-165 (1993).
  42. Hyman, A., Chrétien, D., Arnal, I., Wade, R. Structural changes accompanying GTP hydrolysis in microtubules: information from a slowly hydrolyzable analogue guanylyl-(alpha,beta)-methylene-diphosphonate. J. Cell Biol. 128 (1-2), 117-125 (1995).
  43. Park, M., Kim, H., Kim, D., Song, N. W. Counting the Number of Fluorophores Labeled in Biomolecules by Observing the Fluorescence-Intensity Transient of a Single Molecule. Bull. Chem. Soc. Jap. 78, 1612-1618 (2005).
  44. Welburn, J. P. I., Grishchuk, E. L., Backer, C. B., Wilson-Kubalek, E. M., Yates, J. R., Cheeseman, I. M. The human kinetochore Ska1 complex facilitates microtubule depolymerization-coupled motility. Dev. Cell. 16 (3), 374-385 (2009).
  45. Efremov, A., Grishchuk, E. L., Mcintosh, J. R., Ataullakhanov, F. I. In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromosome motions. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (48), 19017-19022 (2007).
  46. Itoh, T., Hisanaga, S., Hosoi, T., Kishimoto, T., Hotani, H. Phosphorylation states of microtubule-associated protein 2 (MAP2) determine the regulatory role of MAP2 in microtubule dynamics. Biochemistry. 36 (41), 12574-12582 (1997).
  47. Oguchi, Y., Uchimura, S., Ohki, T., Mikhailenko, S. V., Ishiwata, S. The bidirectional depolymerizer MCAK generates force by disassembling both microtubule ends. Nat. Biol. (6), 1-8 (2011).
  48. Kishino, A., Yanagida, T. Force measurements by micromanipulation of a single actin filament by glass needles. Nature. 334, 74-76 (1988).
  49. Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro. Ann. NY Acad. Sci. 253, 107-132 (1975).
  50. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S., Kirschner, M. W. A Protein Factor Essential for Microtubule Assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  51. Widlund, P. O., Podolski, M., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Mol. Biol. Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  52. Hyman, A., Drechsel, D., et al. Preparation of Modified Tubulins. Methods Enzymol. 196, 478-485 (1991).

Tags

Grundläggande protokoll mikroskopi flödeskammare enda molekyl fluorescens laser fälla mikrotubuli-bindande protein mikrotubuli beroende motor mikrotubuli tip-tracking
Beredning av Segmente mikrotubuli att studera Motioner Driven av demonteringen mikrotubuli Ends
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Volkov, V. A., Zaytsev, A. V.,… More

Volkov, V. A., Zaytsev, A. V., Grishchuk, E. L. Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends. J. Vis. Exp. (85), e51150, doi:10.3791/51150 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter