Summary
Этот протокол описывает экспериментальную процедуру быстрого строительства искусственных факторов транскрипции (АССАЛХ) с родственными GFP репортеров и количественного определения способности АССАЛХ стимулировать экспрессию GFP через проточной цитометрии.
Abstract
Синтетическая биология стремится рационально спроектировать и построить синтетические схемы с заданными количественными свойствами, а также предоставляет инструменты для допросить структуру родных цепей управления. В обоих случаях способность программы экспрессии генов в быстром и перестраиваемого образом, без мимо ворот эффектов, может быть полезным. Мы построили штаммов дрожжей, содержащие СИГН.1 промоутер вверх по течению кассеты URA3 последующим лиганд-связывающего домена рецептора человеческого эстрогена и VP16. При преобразовании этого штамма с линейным продукта ПЦР, содержащего ДНК-связывающий домен и выбора в отношении присутствии URA3, конститутивно экспрессируется искусственный фактор транскрипции (ATF) могут быть получены путем гомологичной рекомбинации. АССАЛХ сконструированные таким образом можно активировать уникальный ген мишень в присутствии индуктора, тем самым устраняя как мимо ворот активацию и нефизиологических условий роста, найденные с обычно используемой conditiрных систем экспрессии генов. Простой метод для быстрого строительства GFP репортерных плазмид, которые отвечают конкретно к нативной или искусственного фактора транскрипции интересующего также предоставляется.
Introduction
Разработка генетических переключателей в дрожжах представляет большой интерес в научных и промышленных исследований. В идеальном случае, генетические переключатели могут использоваться для активации конкретного гена (или набор генов) только при желании экспериментатором. Последовательность, кодирующую ген, помещенный ниже по потоку от синтетического промотора не экспрессируется в отсутствие индуцирующего молекулы: при индуктора того ген должен быть быстро выражены. Это лишь недавно было показано, что такое переключение может быть спроектирован в дрожжах, где в отсутствие индуктора, штамм отображает фенотип удаления, но в присутствии индуктора, выражение активированного пропорционально уровню индуктора во всех клетках 1,2. Исторически сложилось так, условные системы экспрессии в дрожжах которые полагались на питательных аспекты последовательностей ДНК, в том числе МЕТ, PHO и GAL промоторов (деятельность которых чувствительны к внеклеточных уровней метионина, фосфата игалактоза, соответственно). В то время как условное выражение может быть достигнуто, это происходит за счет значительных плейотропных эффектов.
Гормональные рецепторы, такие как рецепторы человека эстрогена, оказались эффективными выключатели у эукариот 3,4. При отсутствии гормона, белок, слитый с рецептором гормона могут быть изолированы в цитоплазму, где он взаимодействует с шаперона Hsp90 комплекса. После связывания соответствующий лиганд, рецептор претерпевает конформационные изменения, в результате чего он будет выпущен из шаперонной комплекса Hsp90 и выявление сигнал ядерной локализации. Чтобы наблюдать динамику локализации того или иного рецептора, содержащих белок гормона, мы создали С-концевой слияние Gal4dbd.ER.VP16 (ГэВ, синтетического транскрипционного фактора, содержащего связывающий домен Gal4p ДНК, лиганд-связывающий домен рецептора эстрогена человека , и VP16) с GFP 2. Ядерная локализация наблюдалась в 8 мин после добавлениянасыщая количеств индуктора, ß-эстрадиола, к которому дикого типа дрожжей полностью инертны. К этому времени, большинство клеток имеют четко видимые активные центры транскрипции для GEV генов-мишеней (анализировали с помощью флуоресценции в гибридизация), а также полностью зрелые мРНК 2,5. Гены-мишени GEV увеличилась в экспрессии> 2 раза в течение 2,5 мин 2,6 (измерено с использованием микрочипов), демонстрируя, что он принимает <2,5 мин для химерного активатора к транслокации в ядро, связывать ДНК и активировать транскрипцию.
В то время как несколько других на-переключателей были применены в дрожжах, которые используют различные мелкие молекулы или наркотики (в том числе классических доксициклин основе коммутаторов от кишечной палочки 7,8 и переключатель индиго на основе 9 из арабидопсис), ни один не добились скорости, специфичность, или теснота регулирования выставлены гормона основе коммутаторов. Стоит отметить, тшапка быстрый от-переключателей были также разработаны в дрожжах, и обычно работают путем слияния гена протеазы в убиквитинлигазы или последовательность 2,10,11,12 ориентации. Способность быстро удалить целевой белок из клетки облегчает исследование важных генов, а также гены, которые склонны к генетической подавления при удалении 10.
Методы, описанные в данном протоколе являются для строительства и характеризующие синтетические на-переключателей в дрожжах. Во-первых, мы покажем, как быстро генерировать геномно интегрированные гибридные белки, состоящие из ДНК-связывающего домена интереса, лиганд-связывающий домен рецептора эстрогена человека, и VP16 (DBD-электромобилей). После нашего протокола, слитый белок экспрессируется из ACT1 промотора. Затем мы показываем, как создать узнаваемый репортер плазмиды для ATF и проверить ее функциональность, воспользовавшись проточной цитометрии. Хотя мы предполагаем эти репортер плазмиды используются с новыми АССАЛХ (рис. 1), они могут бе используется в качестве репортеров для родной активатор транскрипции, а также. Наконец, данные проверки эффекта активации АТФ на рост клеток в 96-луночных планшетах и для инженерных индуцируемые геномных аллелей предоставляются.
Protocol
На рисунке 2 представлен схематический вид секции протокольных 1-3.
1. Создание АССАЛХ
- Создание праймеров для ПЦР амплификации ДНК-связывающий домен интересов. Гомологию с ACT1 промотора и гормональных рецепторов (как описано на фиг.3 и 4) добавляется через PCR, чтобы облегчить правильную рекомбинации в штамм yMN15.
- ПЦР-амплификации DBD интереса с использованием полимеразы высокой точностью.
- Transform> 1 мкг очищенного продукта ПЦР в дрожжах с использованием метода ацетат лития 13.
- После трансформации спиновые клетки на максимальной скорости в течение 15 секунд в микроцентрифуге и снимите смесь трансформации.
- Ресуспендируют в ~ 200 мкл стерильной воды и пластины на YPD.
- На следующий день, реплики пластина из YPD на 5-FOA пластин (5-FOA пластины изготовлены, как описано в дрожжевой Руководство Cold Spring Harbor) 13.
- Разрешить рост на 2-4 гн я, и restreak по крайней мере, 5-10 колонии на YPD. Выполнение ПЦР колоний с использованием праймеров в таблице 1 и последовательности, чтобы проверить включение.
2. Создание АТФ плазмиды Reporter
- Определите сайт связывания АТФ (скорее всего приехать из литературы).
- Закажите необходимое связывающую область как олигонуклеотидов (или Ultramers, если это необходимо). Заказать как верхней и нижней нитей с правильными свесами для NotI и XbaI, как показано в таблице 2.
- Развести олигонуклеотидов в эквимолярных концентрациях (100 мкм).
- Фосфорилировать с использованием полинуклеотидкиназы Т4 и затем отжига в амплификатор. Условия реакции приведены в таблице 3.
- Дайджест ~ 1-2 мкг pMN8 с NotI-HF и XbaI в течение 1 часа при 37 ° С (условия реакции в таблице 4).
- Гель очистить магистральную группу.
- Развести очищенную основу до 10 нг / мкл.
- Развести двухцепочечной, фосфорилованные сайт связывания до 5х молярную концентрацию позвоночника за мкл.
- Использование ДНК-лигазы Т4, лигировать в сайты связывания в переваренной позвоночника при комнатной температуре в течение 30 мин (табл. 5).
- Для трансформации, добавить половину реакции лигирования к 50 мкл стандарта, химически компетентных кишечной палочки, такие как XL1-Blue или DH5-альфа.
- Теплового шока клетки в течение 45 секунд в водяной бане при 42 °, а затем поместить на льду в течение 2 мин.
- Добавить 900 мкл SOC среде реакции трансформации.
- Расти при 37 ° С в течение 1 часа на роликовом барабане.
- Распространение 100-200 мкл клеток на LB + AMP (100 мкг / мл) пластины и инкубировать в течение ночи.
- Расти E. палочка в LB + AMP жидкости и урожай ДНК плазмиды. Последовательность проверки новой репортерной плазмидой от лигирования колоний с использованием праймера 5'-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 '.
- Transform новый репортер плазмиды в АТФ-содержащих дрожжей улайн из раздела 1, используя литиевую преобразование ацетат.
3. Количественной оценки влияния АТФ индукцией по экспрессии генов Использование GFP Reporter
Подготовка образцов:
- Сделать 25 мм β-эстрадиола акций (10 мл этанола + 0,0681 г β-эстрадиола). Хранить в холодильнике.
- Расти ATF + Репортер-штамм, содержащий одну ночь в 5 мл SC-УРА.
- Получить девять 250 мл встряхнуть колбы и добавить 25 мл SC-УРА друг.
- Добавить 0 нМ, 0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ, или 10 мкМ β-эстрадиол. Проще всего это делается путем 10-кратного серийные разведения 25 мм β-эстрадиола складе. Для конечной концентрации 10 мкМ β-эстрадиола, добавить 10 мкл 25 мМ β-эстрадиола складе в 25 мл SC-URA.
- Добавить 125 мкл ночных культур в колбах (1:200 разведение).
- Для 2 оставшихся колб, прививку с учредительной GFP производства Straiн и штамм хватает GFP. Они необходимы для калибровки проточного цитометра.
- Взболтать при 200 оборотах в минуту при 30 ° С в течение 12-18 часов.
Примечание: Оптимальное время инкубации определяется путем выявления, когда индукционные GFP больше не меняется следующее добавление β-эстрадиола. - Возьмите 500 мкл каждой культуры и спином вниз в отдельных 1,7 мл микропробирок.
- Аспирируйте SC-УРА.
- Вымойте раз в 1 мл PBS 0,1% Твин-20 и аспирации.
- Добавьте 1 мл PBS 0,1% Твин-20 и ресуспендируют.
- Добавить 1 мл PBS +0,1% Tween-20 в пробирки Фалкон.
- Добавьте ресуспендировали клетки в 5 мл пробирки (конечный объем = 2 мл) (можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких дней).
- Дополнительно: соникатные клетки слегка, чтобы распада любые слипаются клетки.
Проточной цитометрии анализа: Обзор: флуоресценция 10000-100000 клеток, как правило, анализируется на образец. Данные могут быть обработаны либо в FlowJo или с помощью пользовательских сценариев в MATLAB илиР. Убедитесь откалибровать напряжение GFP канала с помощью GFP положительные и отрицательные элементы управления. Как только файлы FCS экспортируется, сценарий, например, на Рисунке 6 вместе с функцией fca_readfcs ( http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader ) может быть использован для обработки данные. - Выполните проточной цитометрии.
- Использование вперед разброс (ФСБ) и боковые разброс (SSC) для идентификации дрожжевых клеток.
- Установите расход до ~ 3000 ячеек / с.
- Измерьте GFP (FITC канал).
- После того, как данные, собранные, экспорт. FCS файлы
- Загрузите MATLAB.
- Перемещение. FCS файлы, fcs_readfcs.m и сценарий, похожий на что из рисунка 6 в ту же папку.
- Изменение настоящего рабочий каталог в папку, содержащую данные и сценарии.
- Запустите сценарий из рисунка 6 (обратите внимание:легенда, вручную внесенный производить то, что показано на рисунке 7).
4. Количественной оценки влияния АТФ индукции на рост клеток
- Из замороженных запасов, серия из как (1) АТФ-содержащий штамм и (2) штамм АТФ-не хватает (например, yMN15) на отдельные YPD пластин.
- После 2 дней роста, привить отдельные культуры пробирки, содержащие 5 мл YPD жидкости с каждого штамма и расти в течение ночи при 30 ° С
- Выполнение 10-кратных серийных разведений 0,25 мМ β-эстрадиола маточного раствора до 10000-кратного (0,025 мкМ β-эстрадиола) в 100% этаноле.
- Добавить 40 мкл ночных культур в 10 мл YPD жидкости (1-250 разбавление).
- Для каждого штамма, добавить 96 мкл разбавленных клеток в 18 лунки 96-луночного планшета с.
- Добавьте 4 мкл β-эстрадиола на клетки. Существенно, чтобы убедиться, что каждый хорошо имеет тот же объем от общего этанола. (В качестве альтернативы мо Re концентрированный запас β-эстрадиола могут быть использованы и в дальнейшем разбавляют до точки, эффект этанола на рост не поддается измерению).
- Выполните в трех экземплярах. Три из скважин для каждого штамма должно быть этанол только для управления.
- Накройте 96-луночный планшет в газовой мембраной.
- Монитор рост (OD 600) в ридере.
- Количественная оценка скорости роста с использованием любого количества стандартных методов, таких как нахождение максимального наклона.
Примечание: Мы имел хороший успех с программного пакета с открытым исходным кодом grofit 14, которая проходит в среде R программирования Стоит отметить, что в то время темпы роста, рассчитанные по 96-а анализах пластины по сравнению с Shake-колбы (25 мл культуры). не обязательно то же самое (в связи как с различиями в физиологии и в приборном), мы наблюдали, что относительные темпы роста похожи (хотя это не всегда может быть и исключения).
- Получить pMN10, в noncentromeric плазмиду с АТФ-отзывчивым промоутер от pMN8 слитого с KanMX (в противоположной ориентации).
- Ограничение переварить вектор костяк и экстракт гель как в разделе 2.
- Отжиг, фосфорилируют и перевязывать олигонуклеотиды, содержащие соответствующие сайты связывания, как описано в разделе 2.
- Последовательность проверки. Эта плазмида теперь будет служить в качестве ДНК-матрицы для создания индуцируемую аллель.
- Получите штамм дрожжей, выражающее соответствующую ATF интересов.
- ПЦР-амплификации кассету KanMX-промотор (~ 2 КБ) с использованием праймеров, из таблицы 6.
- Преобразование ПЦР-продукта в АТФ-экспрессирующих штамма по методу с ацетатом лити.
- Табличка на YPD и реплики пластину на YPD + G418 на следующий день.
- Подтверждение соответствующую вставку промотора с использованием прямого праймера (5'-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 ') и обратного праймера внутренней йе ген, промотор был заменен. Обратный праймер обычно предназначены для между 200-300 п.о. ниже по потоку от первого ATG 15. Конечный ПЦР-продукт составляет ~ 1,2 кб.
Representative Results
На рисунке 5 показано индукцию GFP по Z 3 EV, Z 4 EV, или GEV с течением времени. Обратите внимание на увеличение производства GFP в ответ на АССАЛХ содержащих nonyeast ДНК связывающих доменов. Недавно мы предположили, что это следует из этих факторов достижение одного гена специфичность в геноме дрожжей 1. Один GEV индукция приводит к активации / репрессии сотен генов, тогда как Z 3 EV и Z 4 EV только активировать экспрессию гена-мишени помещают ниже синтетического промотора, содержащего соответствующие сайты связывания (5'-GCGTGGGCG-3 'и 5'- GCGGCGGAGGAG-3 ', соответственно) 1. Рисунок 7 демонстрирует жесткое регулирование системы (не индуктор результатов в отсутствие обнаруживаемой GFP) и что все клетки получают индуцируется в ответ на индуктор Способность Z 3 EV индуцировать GFP по целому ряду β-эстрадиола концентрации показано на фиг.8.
ЛОР "FO: держать-together.within-страницу =" всегда ">
Рисунок 1. Искусственные факторы транскрипции взаимодействовать с Hsp90 в отсутствие β-эстрадиола. Когда β-эстрадиол связывается с АТФ, Hsp90 диссоциирует, позволяя АТФ, чтобы войти в ядро и активировать экспрессию из плазмиды репортера.
Рисунок 2. Схема протокола для инженерных штаммов, содержащих искусственные транскрипционные факторы и строительство / тестирование родственные GFP журналистам.
load/51153/51153fig3highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg "/>
Рисунок 3. ACT1pr-URA3-EV последовательность в штамме yMN15 на LEU2 локуса.
Рисунок 4. Проектирование ПЦР-праймеров для амплификации ДНК-связывающий домен интерес с дополнительным гомологии последовательности, чтобы создать новый слитый белок когда успешно преобразован в yMN15.
Рисунок 5. Индукция GFP с помощью трех различных пар ATF-промотора в ответ на 1 мкМ β-эстрадиола. </ Р>
Рисунок 6. Сценарий MATLAB для потока обработки цитометрии данных. Этот сценарий был адаптирован из http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data .
Рисунок 7. Индукция GFP по Z 3 EV в ответ на 0 μ M β-эстрадиола и 1 мкМ β-эстрадиола следующем 18 часов индукции. Флуоресценции также измеsured от клеток, не GFP, чтобы проиллюстрировать тесную регулирование EV системы Z 3. Эта цифра была создана с использованием код на рисунке 6.
Рисунок 8. Отношения между концентрацией индуктора и выхода выражение оценивается с коэффициентом Хилла, равным ~ 1. (A) Распределение выражения GFP в зависимости от β-эстрадиола концентрации. (B) Среднее флуоресценции распределений из (а). Данные были пригодны к функции G (D) = G мин + (G макс-G мин) D н / (К п + D п), где D является β-эстрадиола доза, G мин и G макс минимальная и максимальные значения GFP, разрешениеpectively, н-коэффициент Хилла, и К-β-эстрадиол доза, которая дает ½ (G + G макс мин).
| Oligonucleotide Последовательность | Название |
| 5'-TTGAAACCA AACTCGCCTCT-3 ' | DBD Проверьте Вперед |
| 5'-tccagagac ttcagggtgct-3 ' | DBD Проверить Обратный |
Таблица 1. Грунтовки для подтверждения правильного слияние DBD интереса к рецептора эстрогена. Прямой праймер гомологичен ACT1 промоутер и обратный праймер гомологичен с рецептором эстрогена. Для типичных DBDS (~ 300 б.п.), продукт ПЦР <1,5 кб.
| Oligonucleotide Последовательность | Название |
| 5'-ggccgc ... DBD кайфа сайт ... т-3 ' | Топ олиго |
| 5'-ctaga ... связывающий ДНК-сайт обратный ... GC-3 ' | Нижняя олиго |
| 5'-GCC gcGTGGGCG Т GCGTGGGCG G G CGTGGGCG Т GCGTGGGCG G GCGTG GGCG Т GCGTGGGCG т-3 ' | Сайты связывания Топ олиго + 6x Zif268 |
| 5'-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC CACGCACGCCCACgc-3 ' | Сайты связывания Нижняя олиго + 6x Zif268 |
Таблица 2. S tructure праймеров для создания двухцепочечной ДНК, содержащий сайты связывания интересов. Для создания Z 3 EV проблематику промотор, олигонуклеотиды Топ олиго + 6x Zif268 сайтов связывания и Нижняя олиго + 6x Zif268 переплета были использованы.Последовательности для создания правильных свесы ДНК находятся в нижнем регистре. Консенсус сайт связывания Zif268, GCGTGGGCG, указывается в верхнем олиго.
| Реагент | Количество |
| T4 полинуклеотидкиназой буфера | 5 мкл |
| T4 полинуклеотидкиназой (@ 10000 единиц / мл) | 1 мкл |
| Лучшие олиго (100 мкМ) | 1,5 мкл |
| Нижняя олиго (100 мкМ) | 1,5 мкл |
| Воды | 41 мкл |
Таблица 3. Фосфорилируют и отжига праймеров в амплификаторе использованием 50 мкл реакции, описанной выше. Существуют два шага амплификаторе. Шаг 1: 37 ° C 30 мин (фосфорилируют), и шаг 2: 95 ° С 30 сек (не уйти в отставку на 1 ° С каждые 30 сек, пока при 4 ° С; отжига).
| Реагент | Количество |
| XbaI | 1 мкл |
| NotI-HF | 1 мкл |
| ДНК плазмиды | 5 мкл (1-2 мкг) |
| 10x Вырезать Смарт буфера | 5 мкл |
| Воды | 38 мкл |
Таблица 4. Ограничение дайджест плазмиды pMN8 с XbaI и NotI.
| Реагент | Количество |
| Т4 лигазы Bufфер | 2 мкл |
| T4 лигазы | 0,2 мкл |
| Магистраль @ 10 нг / мкл | 1 мкл |
| Связывающие последовательности @ 5x молярной концентрации / мкл | 1 мкл |
| Воды | 15.8 мкл |
Таблица 5. Лигируют сайты связывания в ДНК плазмиды.
| Грунтовка | Описание |
| ~ 40 б.п. выше по течению от ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 ' | Прямой праймер для усиления KanMX-промоутер |
| 5'-обратной комплементарной (ГПТ + ~ 37bp) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 ' | Реверс PRIМер для усиления KanMX-промоутер |
| 5'-caatttgtctgctcaagaaaataaa ttaaatacaaataaaCGCAC TTAACTTCGCATCTG-3 ' | Прямой праймер для изготовления GCN4 промоутер своп. |
| 5'-tggatttaaagcaaataaacttgg ctgatattcggacatTATAGTT TTTTCTCCTTGACG-3 ' | Обратный праймер для изготовления GCN4 промоутер своп. |
Таблица 6. ПЦР амплификации KanMX-промоутер для изготовления titratible аллель.
Discussion
Коммутаторы гормонов основе, описанные здесь, имеют бесчисленные приложения, от изучения родного биологию клеток к тестированию на способность ДНК-связывающего домена интереса к целевым последовательность ДНК в естественных условиях. Система не имеет много привлекательных особенностей, включая градуированной ответ на индуктора, быстрых действий и жесткое регулирование (т.е.. Никакого измеримого неплотности, см. рисунок 7). Однако, есть еще возможности для совершенствования и расширения.
Последние работы в синтетической биологии подчеркнул мультиплексирования синтетических систем и расширение репертуара хорошо охарактеризованных, программируемых частей ДНК 16. Независимая, условное выражение различных генов-мишеней требует как несколько индукторов и связывающие домены ДНК, которые не имеют перекрывающиеся специфику. Наличие разработаны и природных рецепторов предоставляет большой набор частей, с которыми по разработке новых факторов искусственного транскрипции. РасширениеРепертуар взаимно ортогональных переключателей был весьма способствуют направленной эволюции подходов 17,18. В настоящее время усилия перепрограммировать лигандсвязывающий специфику наших искусственных факторов транскрипции будут представлены в будущем.
Ранее фенотипические последствия делеции гена / избыточной экспрессии были широко изучены в дрожжах 19,20. Тем не менее, он не был простым для изучения влияния выражения на разных фенотипов по всему диапазону уровней экспрессии. Основной особенностью системы, представленной в настоящем документе, его градуированная природа (рис. 8). В то время как часто предполагается, отношения между экспрессии генов и фенотипов интерес не обязательно может быть монотонной. Искусственные факторы транскрипции, такие как Z 3 EV и Z 4 EV сделает задачу анализируя фенотипические ответов на изменения в экспрессии генов простой.
Наконец, протоколы обсужденияред в этой рукописи для инженерно-характеризующие искусственные транскрипционные факторы, которые отвечают на β-эстрадиола, однако, важной альтернативой химически реагирующих доменов является использование света проблематики доменов (например, PhyB/Pif3, LOV и Bluf), , деятельность которых обратимы без возмущают среду для роста культуры 21-23. Системы на основе света облегчить пространственно-временной контроль экспрессии генов, белок-белковых взаимодействий, ионный транспорт и ферментативную активность, которая уже проверенную мощный 21-26.
В заключение мы представили методы для быстрого строительства индуцибельных, искусственных факторов транскрипции в дрожжах. Этот протокол обеспечивает шаблон для их конструкции в сочетании с родственными GFP репортеров, а также методов анализа данных репортер с помощью проточной цитометрии и анализируя эффект активации АТФ на рост.
Disclosures
McIsaac, Нойес и Ботстайн (с другими) представили часть этой системы в качестве Патентного раскрытия.
Acknowledgments
РСМ признает финансирование от NSF Высшей исследовательский грант. MBN признает финансирование от Льюиса-Sigler стипендий и наделенный даром Питера Льюиса. DB признает финансирование от NIH (GM046406) Национальный институт Генеральной медицинских наук Центра количественного биологии (GM071508). Мы признаем, Кристина DeCoste за помощь в проточной цитометрии экспериментов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Expand High Fidelity PCR System | Roche | 11 732 650 001 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Competent E. coli | Life Technologies | 18258-012 | |
| Estradiol | Tocris Biosciences | 2824 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-23 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| clonNAT | Jena Bioscience | AB-102L | |
| XbaI | NEB | R0145S | |
| NotI-HF | NEB | R3189S | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| Glucose | Fisher Scientific | D15-500 | |
| Bacto-Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 210929 | |
| Agarose | BD Biosciences | 214010 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-031 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| Lithium acetate dihydrate | Sigma-Aldrich | L-6883 | |
| Salmon sperm DNA | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
| Plasmids pMN8 and pMN10; yeast strain yMN15 | Noyes or Botstein labs | ||
| Luria Broth | Sigma-Aldrich | L3397 | |
| EQUIPMENT: | |||
| LSRII Flow Cyometer | BD Biosciences | Various Models | |
| MATLAB or FlowJo | MATLAB or FlowJo | Software for analyzing .FCS files from flow cytometry experiments | |
| R | Open Source | For analyzing growth-rate data from plate reader. | |
| Falcon Tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| 1.7 ml Eppendorf Tubes | GeneMate | C3262-1 | |
| 250 ml Shake Flasks | Corning | 4446-250 | |
| 96-well, flat-bottom plates | Costar | 3635 | |
| Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader) | BioTek | H1MG | |
| Breathe-Easy Membranes | Sigma-Aldrich | Z380059-1PAK | |
| Thermocycler | various companies | Various models | |
| SC-Ura powder | MP Biomedicals | 114410622 | |
| 5-FOA | Zymo Research | F9001-1 |
References
- McIsaac, R. S., et al. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic acids res. 41, e57 (2013).
- McIsaac, R. S., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. cell. 22, 4447-4459 (2011).
- Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast. Gene. 131, 129-134 (1993).
- Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., Evan, G. I. A modified oestrogen receptor ligand-binding domain as an improved switch for the regulation of heterologous proteins. Nucleic acids res. 23, 1686-1690 (1995).
- McIsaac, R. S., et al. Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (76), e50382 (2013).
- McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Mol. Biol. cell. 23, 2993-3007 (2012).
- Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic acids res. 26, 942-947 (1998).
- Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Meth. Enzymol. 327, 401-421 (2000).
- Kodama, S., Okada, K., Akimoto, K., Inui, H., Ohkawa, H. Recombinant aryl hydrocarbon receptors for bioassay of aryl hydrocarbon receptor ligands in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 7, 119-128 (2009).
- Hickman, M. J., et al. Coordinated regulation of sulfur and phospholipid metabolism reflects the importance of methylation in the growth of yeast. Mol. Biol. cell. 22, 4192-4204 (2011).
- Taxis, C., Stier, G., Spadaccini, R., Knop, M. Efficient protein depletion by genetically controlled deprotection of a dormant N-degron. Mol. Syst. Biol. 5, 267 (2009).
- Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nat. methods. 6, 917-922 (2009).
- Burke, D. J., Amberg, D. C., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Kahm, M., Hasenbrink, G., Lichtenberg-Frate, H., Ludwig, J., Kschischo, M. grofit: Fitting Biological Growth Curves with R. J. Stat. Softw. 33, 1-21 (2010).
- Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol. Biol. 132, 365-386 (2000).
- Khalil, A. S., et al. A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions. Cell. 150, 647-658 (2012).
- Chockalingam, K., Chen, Z., Katzenellenbogen, J. A., Zhao, H. Directed evolution of specific receptor-ligand pairs for use in the creation of gene switches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5691-5696 (2005).
- McLachlan, M. J., Chockalingam, K., Lai, K. C., Zhao, H. Directed evolution of orthogonal ligand specificity in a single scaffold. Angewandte Chemie. 48, 7783-7786 (2009).
- Jorgensen, P., Nishikawa, J. L., Breitkreutz, B. J., Tyers, M. Systematic identification of pathways that couple cell growth and division in yeast. Science. 297, 395-400 (2002).
- Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol. cell. 21, 319-330 (2006).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat. biotechnol. 20, 1041-1044 (2002).
- Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J. Am. Chem. Soc. 134, 16480-16483 (2012).
- Losi, A., Gartner, W. Old chromophores, new photoactivation paradigms, trendy applications: flavins in blue light-sensing photoreceptors. Photochem. Photobiol. 87, 491-510 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nat. biotechnol. 29, 1114-1116 (2011).
