Summary
Il trapianto di cellule staminali / progenitrici neurali (NPC) detiene grandi promesse in neurologia rigenerativa. La consegna sistematica di NPC è trasformato in efficace protocollo, bassa invasività, e terapeuticamente molto efficace per fornire cellule staminali nel cervello e nel midollo spinale di roditori e primati non umani affetti da danni infiammatoria cronica sperimentale del sistema nervoso centrale.
Abstract
Cellule staminali / precursori neurali (NPC) sono una fonte di cellule staminali promettente per gli approcci di trapianto finalizzate alla riparazione del cervello o il ripristino in neurologia rigenerativa. Questa direttiva è nata dalla vasta evidenza che la riparazione del cervello è ottenuta dopo trapianto NPC focale o sistemica in diversi modelli preclinici di malattie neurologiche.
Questi dati sperimentali hanno identificato il percorso di consegna cellula come uno dei principali ostacoli di terapie con cellule staminali rigeneranti per le malattie cerebrali che richiede una valutazione urgente. Intraparenchimale trapianto di cellule staminali rappresenta un approccio logico per quelle patologie caratterizzate da isolate e accessibili lesioni cerebrali, quali lesioni del midollo spinale e la malattia di Parkinson. Purtroppo, questo principio è poco applicabile a condizioni caratterizzate da una natura multifocale, infiammatoria e diffusi (sia nel tempo e nello spazio), tra cui la sclerosi multipla (SM). Come tale, il cervello targeting systconsegna NPC emic è diventato un protocollo bassa invasività e terapeuticamente efficace per fornire cellule al cervello e il midollo spinale di roditori e primati non umani affetti da danni infiammatoria cronica sperimentale del sistema nervoso centrale (CNS).
Questo metodo alternativo di consegna delle cellule si basa sul pathotropism NPC, in particolare la loro capacità innata di (i) percepire l'ambiente tramite molecole di adesione cellulare funzionali e citochine e chemochine recettori infiammatori; (Ii) attraversare le perdite barriere anatomiche dopo per via endovenosa (IV). O intracerebroventricolare (ICV) di iniezione; (Iii) accumulare a livello del sito multiplo perivascolare (s), del cervello e del midollo spinale danno infiammatorio; e (iv) esercitare notevole trofico tissutale e effetti regolatori immunitari su diverse cellule bersaglio ospitante in vivo.
Qui si descrivono i metodi che abbiamo sviluppato per il iv. e <em> consegna ICV di NPC singeniche in topi con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), come modello di demielinizzazione infiammatoria cronica del sistema nervoso centrale, e prevedono la consegna delle cellule staminali sistemico come una tecnica preziosa per targeting selettiva del cervello infiammato in neurologia rigenerativa.
Introduction
Forte evidenza è sorta da studi in vivo che attestano l'efficacia terapeutica del trapianto di cellule somatiche neurali staminali / precursori (NPC) in modelli animali di disturbi al SNC 1-8. Tuttavia, una serie di questioni relative alla fornitura di cellule staminali nel ospitante richiede un attento esame prima che questi risultati sperimentali possono essere tradotti in applicazioni cliniche. Un ostacolo particolarmente significativo verso lo sviluppo di (ematopoietiche) terapie con cellule staminali rigeneranti per multifocali, malattie infiammatorie cerebrali croniche è l'identificazione del percorso ideale di iniezione NPC. Una solida comprensione della fisiopatologia della malattia mirata (focale o multifocale; degenerativa infiammatoria o primaria primaria), ed un'analisi prudente di questioni di fattibilità e di rischio associati alle tecniche di spedizione sono a individuare il protocollo ottimale per la consegna delle cellule staminali.
Mentre la focale (
Grande promessa emerso dalle osservazioni che NPC colpiscono un tumore intracranico (ad es. Glioma) nei topi quando iniettato per via endovenosa al di fuori del CNS9. Seguendo questa seminaleevidenza in vivo di cellule staminali pathotrophism 10, numerosi dati sono stati accumulati relativi alla fattibilità e l'efficacia terapeutica del trapianto sistemico di NPC in animali da laboratorio con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello di danno infiammatorio del SNC, sia via endovenosa (iv) o intracerebroventricolare (ICV). NPC iniezione 1,2,5,6,8 .. Abbiamo prima dimostrato che questo dipende dalla capacità di NPC trapiantate per indirizzare e inserire il SNC infiammato, e di impegnarsi in seguito intercellulare multipla programmi di comunicazione all'interno di microambienti particolari in vivo 11. Al fine di indirizzare specificamente il CNS, NPC vengono consegnati direttamente nel liquido cerebrospinale (CSF) circolazione mediante iniezione ICV, o nel flusso sanguigno tramite iniezione endovenosa. Una volta immettendo nel flusso sanguigno o CSF, NPC trapiantate interagiscono attivamente conil cervello di sangue (BBB) o di sangue nel liquido cerebrospinale (BCSFB) le barriere e inserire il parenchima del SNC. Questa interazione tra l'innesto NPC e il BBB (o BCSFB) è regolata da specifica serie di molecole di adesione cellulare di superficie NPC (CAM) e facilitato dalla espressione di elevati livelli di CAM contro-ligandi sulla attivati endoteliali / cellule ependimali 12-14. Esempi di queste camme includono il recettore per ialuronato, CD44, e la molecola di adesione intercellulare (ICAM) -1 ligando molto tardi antigene (VLA) -4 5,15,16 (che, nei leucociti, sono responsabili dell'interazione con ependimali attivato e cellule endoteliali), e di un linfocita misura Function-associated Antigen molto più basso (LFA) -1 e P-selectina ligando glicoproteina (PSGL) -1. NPC esprimono anche una vasta gamma di recettori per chemochine, tra cui CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 e CXCR4 (ma non esprimono CCR3 e CCR7), che sono funzionalmente attivi, sia in vitro che in vivo 5,16. Così, systemicaNPC lly iniettati utilizzano queste camme, insieme a G-proteina recettore accoppiato (GPCR), ad accumularsi a livello del SNC infiammato. Al contrario, PNG iniettato per via sistemica in topi sani non entrare SNC via vascolare o cerebrospinale aeree spazio fluido 2. CNS infiammazione, o endoteliale / attivazione delle cellule ependimali seguente citochine sistemica o lypopolisaccharide (LPS) iniezione come modello di encefalite indotta chimicamente, è pertanto necessario per l'accumulo di NPC sistematicamente iniettate nel cervello e nel midollo spinale 2. Così, il targeting successo del SNC con terapie sistemiche NPC dipende dalla identificazione di una finestra specifica malattia di opportunità (woo) in cui il cervello e del midollo spinale ambiente favoriscono l'accumulo e la migrazione transendoteliale di NPC. Tali condizioni generalmente sorgono nel contesto di infiammazione acuta e subacuta 17. Dopo aver inserito il sistema nervoso centrale, trapiantato NPC indifferenziatihanno dimostrato di migliorare le caratteristiche clinico-patologiche di topi e anche più grandi, primati non umani con EAE. Questo è stato descritto a dipendere da minimal sostituzione cella 2 e notevole secrezione di fattori immunitari paracrini regolamentari e neuroprotettivi all'interno perivascolare CNS 2,5,6,18 vs non-SNC zone infiammate 19,20 (ad esempio linfonodi) in risposta alla segnalazione di cellule infiammatorie suscitato infiltrandosi cellule immunitarie 5.
Qui descriviamo gli aspetti chiave metodologici della iniezione sistemica di NPC somatiche in un modello murino di EAE cronica. Più in particolare, si definiscono i protocolli che abbiamo stabilito a (i) Derive, espandere e prepararsi per trapianto NPC somatici dalla zona subventricolare (SVZ) di adulti C57BL / 6 topi; (Ii) indurre EAE cronica in questi topi e (iii) effettuare terapeuticamente efficace sistemica (iv o ICV) trapianto NPC itopi nto EAE.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono gli animali vengono eseguite secondo i principi della cura degli animali da laboratorio approvati dalla UK Home Office sotto gli animali (procedure scientifiche) Act 1986 (PPL n ° 80/2457 di SP).
1. Derivazione di Somatic neurali Cellule staminali / progenitrici (NPC) dalla zona subventricolare (SVZ) del cervello di topi adulti
- Preparazione di strumenti di dissezione e supporti
NB: Queste due soluzioni devono essere preparate 1-2 ore prima di strumenti dissezioni sono pronti e preriscaldato a 37 ° C per almeno 20-30 minuti prima dell'uso (aiuta a diluire papaina e ottimizza l'attività enzimatica).- Autoclave una forbice tagliente dritto, una piccola forbice chirurgica e due piccole pinze dentellate curve.
- Soluzione 'digestione': Preparare due distinte provette da 50 ml con:
Soluzione # 1: 25 ml di soluzione salina bilanciata (EBSS) + 10 mg di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) + 10 mg L-cisteina di Earle;e
Soluzione # 2: 25 ml EBSS + 50 mg papaina. - Preparare 'Media Complete crescita' (CGM): completa il mouse medio basale di proliferazione integratori del mouse, eparina 0,002%, fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF; 10 ng / ml), il fattore di crescita epidermico (EGF; 20 ng / ml), e gli antibiotici (Pen / Strep).
- Cervello dissezione
NB: La rimozione delle ossa temporali possono facilmente danneggiare il tessuto a causa della loro nitidezza. Per evitare questo, fissare saldamente le ossa con le pinze e tirare fuori fino a quando l'intero osso è stato rimosso.- Per ogni preparazione di NPC, cull per dislocazione cervicale n = 5-7, 4-8 settimane di età C57BL / 6 topi.
- Pulire con etanolo al 70% (in acqua) il pelo dei topi abbattuti e dietro alle orecchie con la forbice tagliente dritto per rimuovere la testa;
- Effettuare una incisione mediana con una piccola forbice chirurgica per tagliare la pelle sopra il cranio. Utilizzando le pinze, piegare le due chiazze di pelle per manifestazionivia e il cranio.
- Con la piccola forbice chirurgica eseguire due piccoli tagli alla base del cranio e rimuovere le ossa sotto il ponte / midollo (cranio ventrale). Procedere tirando le ossa temporali. Con la stessa forbice eseguire un taglio lungo tutto il cranio, partendo dalla base alle lampadine, senza danneggiare la superficie del cervello. Inoltre, effettuare un taglio tra le ossa frontali e gli occhi, per facilitare la rimozione delle ossa parietali. Con due pinze iniziare a rimuovere il cranio tirando ciascuna delle ossa parietali verso l'esterno. Mentre si tira, prestare attenzione alle meningi, che può danneggiare il cervello quando le ossa vengono rimossi.
- Una volta che il cranio è stato rimosso, far scorrere la pinza tra il cervello e il cranio di staccare completamente le meningi sinistra. Sollevare delicatamente il cervello dal cranio. Tagliare i nervi ottici per rilasciare il cervello ed infine raccogliere il cervello in un tubo con fosfato freddo salina tamponata (PBS).
- Mantenere il tubo su un ghiacciod ripetere la stessa procedura per tutti i topi.
- Saggi dissezione del SVZ, neurosfere di formazione e di manutenzione
Numero medio di cellule x fattore di diluizione x 10 4
Dove 10 4 rappresenta la conversione del volume totale della camera hematocytometer (volume totale = 0.1 mm 3 -> 10-4 cm 3 -> 10-4 ml). Quando si considera il fattore di diluizione, sia quello fatto con CGM e con il colorante vitale devono essere presi in considerazione. Come esempio, se 160 cellule sono state contate nelle 4 caselle d'angolo, la densità finale (cellule / ml) di sospensione cellulare sarà:
160/4 x 5 (diluizione con CGM) x 2 (diluizione con colorante vitale) x 10 4- Attivare un cappuccio dissezione dotato di un microscopio da dissezione.
- Pulire tutte le superfici con etanolo al 70% (in acqua), e spruzzare con una soluzione anti Mycoplasma per ridurre il rischio di contaminazione.
- Coperturail fondo di un bicchiere con garza sterile (per preservare strumenti affilato) e riempirlo con etanolo al 70% (in acqua). Mettere a bagno nel bicchiere due paia di pinze, un paio di micro forbici e una lama chirurgica.
- Porre l'intero cervello sulla matrice cervello-affettatrice.
- Utilizzando due lamette eseguono una coronale sezionamento 2 mm dal polo anteriore del cervello, escludendo i tratti ottici, e 3 mm posteriormente al taglio precedente; e posizionare il tessuto su una scatola di Petri pulita.
- Sotto il microscopio da dissezione isolare il tessuto SVZ e tagliate a 1 millimetro 3 pezzi con le forbici iridectomia. Ripetere l'operazione per tutti i cervelli.
- Mescolare bene le due soluzioni (sezione 1.1.2) sopra e filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron subito dopo i cervelli vengono sezionati e le SVZs sono pronti per essere digerito.
- Trasferire le sezioni in 30 ml di soluzione di 'digestione', risospendere delicatamente con a10 pipetta ml ed incubare 30 min a 37 ° C in 5% CO 2. Ogni 15 min scuotere delicatamente il tubo 2-3x.
- Centrifugare a 300 xg per 10 min.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 200 ml di CGM pipettando prima con un P1000 e poi con una pipetta P200 (10-20x ciascuno), fino ad ottenere una sospensione di cellule singole.
- Prendete la sospensione fino a 5 ml con CGM e trasferire ad un pallone T25 cm 2.
- Dopo 5-7 giorni in vitro (DIV) neurosfere formeranno. Raccogliere la sospensione in un tubo di 15 ml e centrifugare 10 min a 150 x g.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 200 ml di CGM.
Dissociare le neurosfere meccanicamente passaging il cellule 100-150x con una pipetta P200, fino ad ottenere una sospensione singola cella e portarlo fino a 1 ml con CGM. - Diluire la sospensione cellulare, ad esempio, 10 ml di sospensione cellulare in 40 ml di CGM per ottenere una diluizione 1:5, e mescolare bene. Miscelare 10 ml di dilutsospensione cellulare e con 10 pl di una macchia vitale e mescolare bene.
- Riempire una camera di conteggio emocitometro con 10 microlitri di una sospensione di cellule 01:01: soluzione colorante vitale. Separatamente contare il numero di (bianco) e morti (blu) cellule vive nelle 4 piazze d'angolo. Per determinare il numero di cellule / ml, applicare il seguente calcolo:
- Risospendere 2 x 10 5 cellule in 5 ml di CGM e portarlo in un pallone T25 cm 2;
- Ripetere sezioni 1.3.11-1.3.12 ogni 4-5 DIV. Dal secondo passaggio di espansione in poi, valutare la vitalità cellulare mediante vitale esclusione macchia e iniziare a costruire una curva di crescita continua mediante placcatura NPC a densità clonale (8.000 cellule/cm2), come descritto 21. Tenere i numeri di cellulare e ripetere la procedura ogni 4-5 DIV. Per generare una curva di crescita continua, procedere come segue:
NB: Per avere una buona preparazione di cellule, dopo 4-5 sfere DIV dovrebbero aver raggiunto un diametro di 150-200 micron. Per avere una buona stima di tegli cellula densità, è importante trovare un fattore di diluizione ottimale per avere celle sovrapposte, ben distribuite in tutta la hematocytometer. Idealmente, ci dovrebbe essere tra 50-200 cellule totali. Quando il conteggio, solo le cellule compresi nella piazza senza toccare i bordi devono essere considerati. Inoltre, la vitalità delle cellule è un fattore cruciale per avere una preparazione sano. Importante, dovrebbe essere maggiore di 90%. Una curva di crescita lineare è un altro indicatore di un preparato di cellule sane.- Contare il numero di cellule vive e morte (es 1.3 x 10 6).
- Definire il tasso di crescita dividendo il numero di cellule vive per il numero di cellule piastrate (ad esempio 1,3 x 10 6/2 x 10 5 = 6.5).
- Calcolare il numero totale di cellule moltiplicando il tasso di crescita per il numero totale di cellule presenti nel punto di tempo precedente (all'inizio = 2 x 10 5).
- Riportare la media7; deviazione standard per costruire una linea di tendenza lineare.
- A partire dal passaggio 6, dissociazione meccanica è sostituito dal dissociazione enzimatica. Dopo centrifugazione a 150 xg per 10 min, rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 200 ml di soluzione di dissociazione cellulare aggregato, risospendere 7-8x con P200 e incubare 10 min a 37 ° C, 5% CO 2.
- Risospendere 7-8x con P200 per ottenere una sospensione di cellule singole e aggiungere 800 ml di CGM. Contare le cellule (sia vivi e morti) e stabilire la loro vitalità. Risospendere 2 x 10 5 cellule in 5 ml di CGM e portarlo in un pallone T25 cm 2.
- Trasduzione virale di NPC per il monitoraggio in vivo delle cellule
NB: Per verificare l'efficienza di trasduzione virale, costruire una curva di crescita in parallelo con gli NPC trasdotte e nontransduced. Inoltre, l'efficienza clonale, cioè il numero assoluto di cellule neurosfere formando presente all'interno di un preparato cellularezione o una analisi del ciclo cellulare per contenuto di DNA (con ioduro di propidio, PI), possono essere utilizzati come ulteriori indicazioni dello stato delle cellule. Se la percentuale di cellule infettate non dovrebbe essere buono, il protocollo di trasduzione virale può essere ripetuta una seconda volta con la stessa popolazione di cellule. Una volta che il livello di infezione è soddisfacente e la curva di crescita è simile a quello ottenuto con le cellule di tipo selvatico, NPC trasdotte possono essere espansi e / o trapiantate.- Raccogliere le neurosfere e ottenere una sospensione singola cella. Piastra le cellule ad alta densità (1,5 x 10 6 cellule in un pallone T75 cm 2) in 10 ml CGM.
- Dopo 12 ore aggiungere 3 x 10 6 TU / ml di una terza generazione di vettori lentivirali pRRLsin. PPT-hCMV costruito con la E. coli derivato β-galattosidasi (lacZ) o con la proteina fluorescente verde (GFP).
- 48 ore più tardi, raccogliere le cellule, centrifugare a 300 xg per 10 min e replate le cellule con un rapporto 1:1.
- Dopo3 passaggi in vitro verifica dell'efficienza dell'infezione. La citometria a flusso è comunemente usato per testare l'efficacia infezione, e il livello soddisfacente di infezione è comunemente accettato per essere nell'intervallo di 75-95% di cellule positive. Controllare nuovamente l'efficienza dell'infezione dopo 3 ulteriori passaggi di espansione per verificare il mantenimento dell'espressione marcatore.
- Neurosfere di congelamento
- Raccogliere le neurosfere da un pallone T25 cm 2, centrifugare a 300 xg per 10 min, e scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet con 1 ml di congelamento media (CGM con 10% dimetilsolfossido (DMSO).
- Posizionare i cryovials a -80 ° C in un contenitore di congelamento.
- Dopo almeno 24 h spostare le cellule ad una cryobox e conservare a -80 ° C per mesi, o portare ad azoto liquido (N 2) per una conservazione più lunga.
- Neurosfere scongelamento
NB: Per evitare gli effetti tossici di contatto prolungato of NPC con DMSO, il processo di scongelamento deve essere il più veloce possibile.- Rimuovere il esageratamente dal -80 ° C / N 2 e mantenere in ghiaccio secco.
- Scongelare rapidamente il flacone a bagnomaria, fino a quasi tutta la sospensione cellulare viene scongelato e solo un piccolo pezzo di sospensione ghiacciata rimane.
- Risospendere la sospensione cellulare con 5 ml di preriscaldata fresco CGM.
- Centrifugare a 300 xg per 10 min.
- Rimuovere il surnatante, risospendere delicatamente con 5 ml di fresco CGM e piastra sospensione di cellule in una beuta pulita, greggia T25 cm 2.
- 1.7) Caratterizzazione NPC
NB: L'ultimo lavaggio PBS può essere sostituito con il 0,05% di sodio azide-PBS per prevenire la crescita di funghi o contaminazioni, e coverslides sono conservati a 4 ° C per 2-3 settimane.
NB: Per colorare per i marcatori intracellulari aggiungere un agente permeabile al PBS nella soluzione di blocco. Se l'origine dell'anticorpo primario è capra, siero bovino albumin (BSA) o siero di diverso capra dovrebbero essere utilizzati.
NB: a macchia di marcatori intracellulare utilizzare un agente permeabile nella soluzione di anticorpo primario.- Posizionare un coverslide vetro 13 millimetri sul fondo di una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 150 ml di soluzione di rivestimento sulla parte superiore di ogni coverslide per creare una piccola goccia. Incubare per almeno 30 min a 37 ° C, 5% CO 2.
- Raccogliere le neurosfere e dissociare per ottenere una sospensione singola cella.
- Contare le cellule vive e diluire per ottenere 80.000 cells/35 microlitri. Rimuovere l'eccesso di soluzione di rivestimento dal coverslide aspirando delicatamente, e piastra 35 microlitri di sospensione cellulare.
- Incubare 25 minuti a 37 ° C, 5% CO 2. Controllare rapidamente al microscopio a contrasto di fase, se le cellule hanno iniziato ad aderire.
- Preparare il terreno di differenziamento mescolando medio basale del mouse con i supplementi adeguati (cfr. tabella 1) e antibiotici (Pen / Strep).
- Aggiungere 400 ml di terreno di differenziamento e incubare a 37 ° C, 5% CO 2.
- Dopo 3 DIV, cambiamento metà del mezzo con terreno di differenziamento fresco.
- Dopo 6 DIV, rimuovere il terreno e lavare una volta con PBS. Sotto cappa chimica rimuovere il PBS e aggiungere 300 ml di preriscaldata 4% paraformaldeide (PFA) 4% di saccarosio. Incubare per 5 min a temperatura ambiente (RT). Rimuovere la PFA e lavare 3x con PBS.
- Per procedere con immunocitochimica, rimuovere il PBS e bloccare con PBS 10% di siero normale di capra (NGS) (soluzione blocco), e incubare 1 ora a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione di saturazione e aggiungere l'anticorpo primario desiderato diluito con PBS 1% NGS. Incubare a 4 ° CO / N o, in alternativa, 120 min a RT.
- Dopo l'incubazione, lavare 2x con PBS. Incubare con l'anticorpo secondario appropriato diluito con PBS 1% NGS. Incubare 60 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare 2x con PBS e contro-macchiare i nuclei con 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) diluito 1:20.000 con PBS agente permeabilizzante per 3 min a temperatura ambiente al buio. Lavare due volte con PBS ed una volta con acqua distillata.
- Mettere una goccia di mezzo di montaggio su un vetrino tessuto di vetro e con una pinza montare il coverslide con le cellule di fronte al mezzo di montaggio. Premere delicatamente il coverslide di spremere l'eccesso di mezzo di montaggio. Lasciare il coverslide al buio a temperatura ambiente fino a quando il mezzo di montaggio viene essiccato e conservare a 4 ° C.
Autoimmunità sperimentale 2. Mielina Oligodendrocyte glicoproteina (MOG) indotta in C57Bl / 6 Mice
- Preparazione della emulsione
- In un bicchiere di vetro preparare un'emulsione composta di adiuvante incompleto di Freund contenente 4 mg / ml di Mycobacterium tuberculosis [altrimenti definito come adiuvante di Freund completo (CFA)] e 200 pg di MOG (peptide 35-55), considerando che la quantità totale di emulsione per topo sarà 300 ml.
NB: Stanziate controlli di topi MOG-immunizzati in CFA sono topi immunizzati con solo CFA. La varianza atteso di insorgenza della malattia nei topi MOG-immunizzati è 11,3 (± 1,8) dpi.
NB: Quando si calcola il volume totale di emulsione necessaria, considerare il doppio volume come il numero di topi per immunizzare. Vetro devono essere preferito Plasticware per minimizzare lo spreco di parte dell'emulsione.- Con una siringa di vetro con una miscela 19 ago G per circa 30 minuti, mantenendo sempre l'emulsione su ghiaccio.
- Per verificare se l'emulsione è pronto, cadere una piccola quantità di emulsione acqua. L'emulsione è pronta per essere iniettata solo se la goccia rimane così com'è e non si disperde.
- Immunizzare il gruppo di controllo di topi con solo CFA. Trattare topi sperimentali (MOG immunizzati) con MOG in CFA. La varianza atteso di insorgenza della malattia in topi immunizzati MOG è 11,3 (± 1,8) dpi.
- Trasferire il ago 19 G a un 1 ml di plastica siringa unnd aspirare l'emulsione. Evitare le bolle, cambiare l'ago con un 25 G e lasciare la siringa sul ghiaccio. Siringhe riempite con l'emulsione sono pronti per essere utilizzati e devono essere tenuti in ghiaccio per un paio di ore.
- In un bicchiere di vetro preparare un'emulsione composta di adiuvante incompleto di Freund contenente 4 mg / ml di Mycobacterium tuberculosis [altrimenti definito come adiuvante di Freund completo (CFA)] e 200 pg di MOG (peptide 35-55), considerando che la quantità totale di emulsione per topo sarà 300 ml.
- Immunizzazione
- Posizionare i topi (6-8 settimane di età, di sesso femminile) in una scatola di riscaldamento e attendere circa 10 minuti per consentire la vena della coda a dilatarsi.
- Trasferire un mouse dalla casella di riscaldamento ad un dispositivo di immobilizzazione mouse. Chiudere il dispositivo di immobilizzazione per evitare qualsiasi movimento del mouse.
- Riempire una siringa da insulina da 1 ml con 100 ml di tossina della pertosse (5 mg / ml), evitando fare bolle. Iniettare lentamente la soluzione nella vena caudale. Rimuovere l'ago e premere per alcuni secondi con un pezzo di carta per collegare l'emorragia.
- Posizionare il mouse indietro nella gabbia e ripetere la stessa procedura per tutti i topi.
- Anestetizzare un mouse con inalazione continua isoflurano (1-2%, 2 L / min) e iniettare 100 ml di emulsione per via sottocutanea a livellodei due fianchi e la base della coda (300 microlitri emulsione / topo). Rimuovere lentamente la siringa, evitando la dispersione dell'emulsione.
- Segnare il mouse con un perforatore orecchio, posizionare il mouse nella gabbia e controllare fino al pieno recupero. Ripetere l'operazione per tutti i topi.
- Dopo 48 ore (due giorni dopo la vaccinazione, dpi) la ripetizione della sezione 2.2.3.
- Analisi comportamentale dei topi EAE
- Partendo da 5 dpi, pesare i topi giornaliero e monitorare le loro prestazioni locomotorie utilizzando il sistema di punteggio scala descritto nella Tabella 1.
3. Iniezione di neurali Cellule staminali / progenitrici nella vena della coda (iv)
- Preparazione cellulare
- Neurosfere raccolto per centrifugazione a 300 xg per 10 min.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 200 ml di soluzione di cellule dissociazione aggregato. Incubare 10 minuti a 37 ° C, 5% CO 2.
- Risospendere delicatamente 10-12x (avoiding bolle) con P200 fino ad ottenere una sospensione singola cella e prendono a 800 ml con medio basale senza Ca 2 + e Mg 2 +.
- Contare le cellule utilizzando un colorante vitale per saggiare la vitalità cellulare e diluire la sospensione con terreno base senza Ca 2 + e Mg 2 + per ottenere una densità finale di 10 microlitri cells/150 6. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- NPC iniezione iv
NB: La dissociazione ideale in sospensione di cellule singole e l'assenza di bolle d'aria sono due aspetti chiave da considerare per ridurre il rischio di entrambi i grumi / aggregati contro la formazione di emboli che possono provocare occlusione venosa e conseguente morte.- Al culmine della malattia (16-18 dpi), pesare e segnare i topi. Distribuire i topi base al loro punteggio in modo da avere gruppi omogenei.
- Mettere i topi in una scatola di riscaldamento e attendere circa 10 minuti per consentire la vena della coda a dilatarsi. Trasferire un mouse dalla casella di riscaldamento ad un dispositivo di immobilizzazione mouse. Chiudere il dispositivo di immobilizzazione per evitare qualsiasi movimento del mouse.
- Riempire una siringa da insulina da 1 ml con 150 ml di sospensione cellulare e assicurarsi di rimuovere tutte le bolle. Iniettare lentamente la soluzione nella vena caudale. Rimuovere l'ago e premere per alcuni secondi con un pezzo di carta per collegare il sanguinamento (Figure 6A e 6B).
- Posizionare il mouse nella gabbia e controllare fino al recupero. Ripetere la stessa procedura per tutti i topi.
4. Iniezione di neurali Cellule staminali / progenitrici nel Cisterna Magna (ICV)
- Preparazione cellulare
- NPC raccolto per centrifugazione a 300 xg per 10 min.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 200 ml di soluzione di cellule dissociazione aggregato. Incubare 10 minuti a 37 ° C, 5% CO 2.
- Risospendere delicatamente 10-12x con P200 fino ad ottenere un unico csospensione ell e prendere a 800 ml con medio basale senza Ca 2 + e Mg 2 +.
- Contare le cellule e diluire la sospensione con terreno base senza Ca 2 + e Mg 2 + avere la densità cellulare desiderata. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- 4.2) iniezione NPC ICV
- Al culmine della malattia (16-18 dpi), pesare e segnare i topi. Distribuire i topi base al loro punteggio in modo da avere gruppi omogenei.
- Posizionare il mouse su un apparato stereotassico sotto inalazione continua isoflurano (1-2%, 2 L / min). Fissare la testa del topo con le barre orecchio. Quindi regolare sia la bocca e naselli. Assicurarsi che la testa del topo è piatta e fissa.
- Tamponare la testa del topo con povidone-iodio (PVP-I) ed effettuare una incisione per tagliare la pelle nella parte posteriore della testa per esporre il cranio.
- Utilizzando un micromanipolatore, inserire la punta di un microlsiringa iter nella fessura tra l'occipite e la vertebra atlante attraverso i muscoli intatti e legamenti della linea mediana nella parte posteriore del collo. La parte piegata dell'ago viene mantenuta in stretto contatto con la superficie interna della regione occipitale per tutta la lunghezza, come descritto 22.
- Inserire lentamente l'ago e attendere qualche secondo. L'operatore ha lo scopo di imparare a riconoscere la sensazione dell'ago essere "agganciato" al cranio del mouse, prima di iniziare l'iniezione della preparazione cellulare. Iniettare lentamente il volume delle cellule (in 3-5 min). Lasciare l'ago in posizione per ulteriori pochi secondi dopo l'iniezione e rimuovere lentamente la siringa.
- Ricucire la pelle e posizionare il mouse in una gabbia di recupero fino al pieno recupero.
5. Tissue Processing
- Profondamente anestetizzare il mouse con una miscela di 0,5 ml di ketamina (100 mg / ml), 0,25 ml xilazina (23,32 mg / ml) e 4,25 ml di acqua sterile e transcardically profumato, wincenerimento con soluzione salina-EDTA e fissaggio con il 4% PFA. Rimuovere entrambe le colonne vertebrali e cervelli e postfix nel 4% PFA per 12 ore a 4 ° C. Lavare il tessuto in PBS, rimuovere midollo spinale dalle ossa e lasciare il tessuto almeno 48 ore in saccarosio al 30% (in PBS) a 4 ° C. Incorporare i tessuti in temperatura di taglio ottimale (OCT) composto e far scattare il congelamento con azoto liquido, come descritto 2.
- Utilizzare un microtomo per tagliare i tessuti in 10-12 micron fette spesse.
- In alternativa, incorporare tessuto fresco in agarosio e tagliare il tessuto utilizzando un vibratome 50-80 micron fette spesse.
- In entrambi i casi, incubare O / N a 37 ° C in soluzione di D-galattopiranoside (X-gal) per rilevare l'attività β-galattosidasi nucleare indolil-β-cloro-3-5-bromo-4.
- Ritagliare sezioni contenenti β-gal + cellule in 5 micron fette e doppia macchia con fibrillare antiglial proteina acida (GFAP) per gli astrociti (50 mg / ml), antigene nucleare antineuronali (NeuN) per i neuroni (1 &# 956; g / ml) e antiNestin per le cellule neurali indifferenziate (10 mcg / ml).
- Procedere come descritto nei paragrafi 1.7.11 e 1.7.12. Per più colorazioni assicurarsi di utilizzare anticorpi secondari coniugati con differenti fluorofori.
- Per i tessuti contenenti cellule GFP etichettati procedere come spiegato nei passaggi 5,1-5,3 e procedere con le molteplici colorazioni.
- Aggiungere alcune gocce di soluzione di montaggio per le diapositive e coprire con un vetrino tessuto.
- Per le sezioni colorate con anticorpi coniugati biotina preparare una soluzione di avidina complesso di biotina (soluzione ABC, vedi Tabella 2) e lasciare in agitazione per 45 min.
- Incubare le fette 5 min con 1% H 2 O 2 per bloccare l'attività della perossidasi endogena.
- Lavare due volte con PBS.
- Incubare con la soluzione ABC per 1 ora a RT.
- Lavare due volte con PBS.
- Incubare con la soluzione di 3,3 '-diaminobenzidina e 0,3% H 2 O 2. Monitorare la reazione delle Nazioni Uniteder un microscopio e lavare con PBS appena la fetta iniziare a ricevere marrone (di solito circa 5-10 min).
- Lavare due volte con PBS e procedere come descritto al punto 5.7.
Elenco completo di materiali e reagenti è mostrato nella Tabella 2.
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Representative Results
NPC derivazione e caratterizzazione
Dissezioni SVZ vengono eseguite su piscine (n = 5-7 topi / pool) di 6-8 settimane di età C57BL / 6 topi mediante dissociazione meccanica ed enzimatica (Figura 1A). Dopo alcuni giorni di coltura in CGM, neurosfere free-floating iniziano a formarsi (Figure 1A e 1B). Sfere primarie sono raccolti e meccanicamente diversi passaggi ogni 4-5 DIV. Su passaging, numero di cellule vive e morte di accertate e numero di cellule cumulativi tracciate per generare una curva di crescita (Figura 1C). Questo dà un'indicazione della velocità di propagazione, garantendo quindi un parametro indiretto per valutare la stabilità globale del preparato NPC. Quando proliferare come neurosfere, PNG esprimono marcatori di attività mitotica (fosfo-istone H3, PHH3, 5 mg / ml) e di cellule neurali indifferenziate (es. Nestin) (Figura 2A). NPC indifferenziati che devono essere terapeuticamente efficacious in EAE dopo trapianto deve esprimere molecole di adesione cellulare, che includono CD44 (5 pg / ml), la subunità α4 del VLA-4 (10 pg / ml) (Figura 2F). Quando placcato in appropriate condizioni di differenziazione, NPC esprimono marcatori tipici delle tre linee neurali, (Figura 2B), come la GFAP marcatore astrogliale (Figura 2C), il marcatore neuronale associata ai microtubuli proteina-2 (MAP-2, 5 pg / ml ) (Figura 2D) ed i marcatori oligodendrogliali O4 (5 mg / ml) e di proteine basica della mielina (MBP, 10 mg / ml) (Figura 2E), confermando in tal modo che gli NPC sono multipotenti verso i tre principali linee neurali. Per facilitare l'identificazione delle cellule trapiantate in vivo, gli NPC sono trasdotte con lentivirus ingegnerizzati a geni reporter stabilmente espressa come GFP. NPC trasdotte esprimono GFP sia come proliferanti neurosfere (figure 3A e 3C) così come quando differenziare in vitro su fattore di crescita recesso (Figura 3B). Per verificare l'efficienza di trasduzione, l'espressione di GFP viene analizzata mediante citometria di flusso, a partire già 3 passaggi dopo trasduzione delle cellule (cioè consentire un tempo sufficiente per avere robusta espressione del transgene introdotto a livello proteico). Quando si applica lentivirus terza generazione di NPC in vitro, abbiamo costantemente osserviamo> 90% delle cellule che mostrano alti livelli di GFP su più esperimenti indipendenti (Figura 3C), né con tossicità manifesta né cambiamenti nella proliferazione, quando si confrontano le curve di crescita di tipo selvatico e Lenti-GFP NPC trasdotte (Figura 3D).
Induzione EAE cronica
EAE è uno dei modelli più caratterizzati di MS, poiché riassume la maggior parte degli eventi patologici e clinici della SM. Immunizzazione di C57Bl / 6 topi con MOG35-55 conduce al SVILUPPOt di una forma cronica di EAE. Quando si avvicina l'esordio della malattia (11,3 ± 1,8 dpi) durante la fase di induzione (preclinica), MOG immunizzato topi cominciano a perdere peso (Figura 4A). All'inizio della fase effettrice / invasione (picco clinica; 16.8 ± 3.2 dpi) topi EAE raggiungono il picco della malattia (punteggio 3,5 ± 0,7), e subito dopo il picco mostrano un recupero progressivo e parziale che stabilizza finalmente durante la cronica fase (stabile clinica) dal 30 dpi poi (punteggio 2,8 ± 0,9) (Figura 4B). Numerosi studi, tra cui alcune indagini EAE da una microscopia intravitale 23 o risonanza magnetica 24, in coppia con in vivo patologia dei tessuti, hanno identificato nel picco della fase effettrici / invasione (16-22 dpi), la finestra ideale di opportunità (WoO) in cui eseguire terapie sistemiche sperimentali con cellule staminali intendono inserire nella cronicamente infiammata EAE CNS e proteggerlo da d secondariaAmage.
Iniezione NPC
NPC singeniche iniettati per via sistemica in topi EAE (Figura 6) si trovano quasi esclusivamente nelle aree perivascolari di danno del sistema nervoso centrale, sia nel cervello (Figura 5A) e del midollo spinale (figure 5B-D), fino a 45 giorni dopo il trapianto (dpt), come descritto 5. iv. iniettato PNG preferenzialmente mantengono un immaturo, Nestin + (Figura 5C) fenotipo, mentre alcuni PNG trasferirsi al di fuori della zona perivascolare esprimere NeuN (Figura 5D). Da segnalare, PNG iniettata iv nei controlli sani non riescono a entrare nel sistema nervoso centrale per via vascolare (Figura 5E). Dopo iv NPC iniezione, un numero significativo di NPC iniettati si trovano a livello di organi non SNC quali il fegato, intestino, milza, polmone e rene, ma non il cuore, come già il 10 dpt (Figura 5F). NPC non-CNS accumulazione sono completamente cancellati su thes e organi periferici di 30 diottrie (Figura 5G).
Figura 1. Isolamento di NPC dalla SVZ di topi adulti e generazione di linee NPC stabilmente espandibili. A, Rappresentazione schematica delle principali fasi critiche della generazione di stabilmente espandibile, e la preparazione di NPC iniettabili mouse. B, Neurosfere in vitro. C , NPC coltivate come neurosfere sono diversi passaggi ogni 4-5 giorni. Numero di cellule vive e morte sono raccolti e il numero di cellule cumulativi tracciate per generare una curva di crescita. La barra di scala in B è di 200 micron. I dati in C sono medio numero cumulativo di cellule ± SD (n = 3).
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Figura 2. Caratterizzazione dei NPC. A, proliferanti neurosfere di topo esprimono il nucleo della proteina istone PHH3 (verde), e il tipo VI filamento intermedio di proteine Nestin (rosso). BE, dopo 6 DIV in condizioni di differenziazione, gli NPC sono multipotenti verso astrogliale (GFAP, rosso in C), neuronale (MAP-2, verde in D) e oligodendrogliali (O4, verde in E e MBP, rosso in E) lignaggi. Quantificazione di GFAP-, MAP-2-, e le cellule O4 esprimono al 6 DIV dopo NPC differenziamento in vitro è mostrato in B. Dati in B sono come media ± SD% (n = 3). Le barre di scala in CE sono 50 pm. F, citometria a flusso dell'espressione dei principali molecole di adesione della superficie delle cellule che regolano leukocyte lo stravaso in neurosfere mouse. Figura 2F è riprodotto da Pluchino et al. 2
Figura 3. Trasduzione di NPC con lentivirus che esprimono geni reporter (es. GFP. A e B, le immagini a contrasto di fase di neurosfere (A) e NPC di differenziazione (B) che sono state trasdotte con un 3 ° generazione lenti-GFP vettore. Citometria a flusso degli NPC di A. C, tipo selvatico (non trasdotte) e Lenti-GFP NPC trasdotte coltivate come neurosfere sono diversi passaggi ogni 4-5 giorni. Numero di cellule vive e morte sono raccolti e il numero di cellule cumulativi tracciati per generare una curva di crescita. La barra di scalaA e B è di 200 micron. I dati in C sono medio numero cumulativo di cellule ± SD (n = 3).
Figura 4. Caratterizzazione funzionale di EAE cronica. A, il monitoraggio in MOG e CFA-immunizzati C57Bl / 6 topi per un peso totale giornaliero di follow-up di 40 dpi. B, Quotidiano EAE monitoraggio score in MOG-e CFA-immunizzati topi C57BL / 6 su un totale di follow-up di 40 dpi . I dati sono espressi come numeri medi ± SD (n = 10 topi / gruppo).
Figura 5. Sistemica iniettato NPC migrmangiato nel parenchima di topi EAE. AE, X-gal colorazione di vibratome taglio (70 micron) cervello (A) e del midollo spinale (B) sezioni di tessuto da topi EAE iniettati iv con NPC singenici, mostrando + cellule β-gal trapiantati ( NPC cellule blu) persistenti all'interno delle aree del sistema nervoso centrale perivascolari fino alla fine del follow-up clinico (106 dpi). C, β-gal + iv. iniettati (blu) persistenti all'interno di aree del sistema nervoso centrale perivascolari, mantenere una Nestin + (marrone) fenotipo. D , Pochi NPC migrazione esprimono NeuN + (marrone) purché si muovono fuori della zona perivascolare. E, X-gal colorazione in una sezione rappresentativa del midollo spinale da una farsa trattato EAE mouse. . Barre di scala, 20 micron FG, Analisi di tessuti diversi dal CNS mostra che ic -. O NPC iv. Iniettati (cellule blu) raggiungere virtualmente tutti gli organi (. Es. polmone, fegato, milza, cuore, intestino, rene) arguziahin 10 diottrie (F), ma sono compensati dagli stessi organi da 30 diottrie (G). Figure 5A-E è riprodotta da riferimento 5, mentre le figure 5F-G è riprodotta da Pluchino et al. 2
. Figura 6 Rappresentazione schematica del protocollo per l'iniezione sistemica di NPC in topi con EAE principali fasi critiche della iniezione sistemica di NPC in topi con EAE:. Dalla preparazione del CAM iniettabile esprimere singola cellula dissociata NPC camera di coltura cellulare (A) , per l'iniezione nella vena caudale di topi EAE al picco della fase di malattia effettore / invasione (B), verso il rilevamento in vivo dei NPC iniettati che hanno miratoil CNS (C), agli studi patologici tissutali in vivo permettendo lo studio dei meccanismi di plasticità terapeutica di NPCs iniettate (D). In D, le cellule verdi sono oligodendrociti, cellule blu scuro sono assoni, le celle azzurre vengono trapiantate NPC, le cellule arancioni sono astrociti, e globuli rossi sono cellule endoteliali.
| Punteggio | Locomotore Risposte |
| 0 | Normale mouse. Non evidenti segni di malattia |
| 1 | Coda Limp: completa flaccidità della coda, e l'assenza di arricciatura sulla punta della coda quando un topo viene prelevato |
| 1.5 | Hind debolezza degli arti: il mouse mostra trippings occasionali e brevi quando si cammina su una andatura ondeggiante |
| 2 | Limp coda e debolezza degli arti posteriori: quando sono immessi sulla sua schiena, il mouse non può girare nella sua posizione normale |
| Parziale posteriore paralisi degli arti: il mouse non può più utilizzare gli arti posteriori per mantenere la postura groppa oa piedi, ma può ancora spostare una o entrambe le zampe posteriori in una certa misura, arti anteriori rimangono inalterate | |
| 3 | Paralisi completa degli arti posteriori: perdita totale di movimento nelle arti posteriori. Il mouse si trascina solo sulle sue zampe anteriori, che rimangono inalterate. Topi in questa fase sono riportati cibo sul pavimento della gabbia, tubi sipper lunghi, e l'iniezione sottocutanea giornaliera di soluzioni idratanti per prevenire la disidratazione. Se i topi sviluppano ferite o lesioni cutanee che non guariscono con il trattamento, saranno uccisi umanamente |
| 3.5 | Debolezza degli arti anteriori: quando posto su una griglia verticale, il mouse non è in grado di salire e lentamente cade |
| 4 | Stato moribondo |
| 5 | Mouse trovati morti o abbattuti secondo endpoint non crudeli |
Table 1. Five scala fase dei segni clinici e paralisi ascendente nei topi EAE.
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Discussion
Terapie basate sulle cellule staminali somatiche stanno emergendo come una delle strategie più promettenti per il trattamento di malattie croniche infiammatorie del sistema nervoso centrale come MS2 11. Mentre i meccanismi che sostengono i loro effetti terapeutici devono ancora essere completamente chiarito, l'impatto significativo della NPC trapianto in diversi modelli sperimentali di malattie neurodegenerative ha dato origine alla credenza un po 'provocatorio che le cellule staminali potrebbero presto essere applicate in studi sull'uomo. Tuttavia, prima di prevedere tutte le possibili applicazioni sull'uomo di tali terapie innovative che dobbiamo affrontare alcune questioni chiave e affrontare alcune domande senza risposta, come ad esempio l'identificazione della fonte ideale di cellule staminali per il trapianto (autologo vs allogenico, pluripotenti vs multipotenti) e il percorso migliore di somministrazione.
Malattie neurodegenerative differiscono nelle loro pathophysiologies, alcune delle quali spazialmente confinati (ad es. Midollo spinale ingiuria, ictus) mentre altri essendo caratterizzato da una diffusione temporale spaziale (es. MS). Ne deriva che l'iniezione focale (staminali) cellule può essere un trattamento adatto per i primi, mentre può essere inadeguato o semplicemente irrealizzabile per quest'ultimo, dove la presenza di diversi siti di danno cerebrale rappresenta una ulteriore sfida da superare.
Prova coerente ha dimostrato che la consegna endovenosa può rappresentare un protocollo valido (e bassa invasività) per la somministrazione delle cellule, sostenuta dalla capacità intrinseca di cellule staminali per percepire l'ambiente e specificamente casa verso il sito (s) di danni. Tuttavia, definizione di terapie sistemiche NPC in cliniche è ancora ostacolato da alcune limitazioni, come il possibile accumulo di cellule trapiantate in organi non-SNC periferici (ad esempio i polmoni, milza, linfonodi e reni) che possono o non possono essere siti delle risposte infiammatorie locali in vivo. Mentre questo accum aspecificamento di NPC iniettati fuori bersaglio CNS è rapidamente eliminato nei topi con EAE2 cronica, vi è evidenza di persistenza NPC a lungo termine (o in alcuni casi targeting esclusivo) a livello degli organi linfoidi secondari (ad es. linfonodi e milza) dopo l'iniezione sistemica in topi con sclerosi multipla recidivante EAE5 19,20. Il fatto che un numero significativo di NPC trapiantate ricircolo verso organi non-SNC crea un effetto di diluizione, riducendo inevitabilmente il numero assoluto di NPC nel SNC. È interessante notare che, iniettati per via sistemica NPC sono terapeuticamente efficaci (ad esempio attraverso interventi di regolamentazione del sistema immunitario), anche quando l'accumulo esclusivamente dal SNC 19,20. E gli effetti terapeutici complessivi di NPC iniettate rivolti al CNS solo 5 o linfonodi solo 19 sono comparabili. Questo può in parte a causa di una plasticità intrinseca delle cellule, che rispondono diversamente ai componenti molecolari del surrounding microambiente. In particolare, se da un lato NPC trapiantate possono sentire la presenza di citochine infiammatorie e esercitare il loro effetto terapeutico attraverso meccanismi modulatori immunitari 16, d'altro canto essi possono venire in contatto con microambienti ostili in definitiva portano alla formazione di tumori 25,26. Per queste ragioni, l'opzione preferita è attualmente concentrare NPC iniettati nel SNC. Come tale, la somministrazione intratecale (tramite un lombare o rotta cisternal) è ancora il futuro percorso più accettata di trattamento negli studi clinici. Tuttavia, la multifocalità e l'eterogeneità patologica delle lesioni della SM possono limitare l'efficacia di tale approccio.
Qui si descrive un protocollo efficiente per isolare, mantenere e caratterizzare progenitori neurali del mouse dalla SVZ adulto e successivamente, come sistemica (sia iv e ICV) iniettare NPC di topi affetti da EAE cronica, uno dei più stumorto modelli di MS. Anche se relativamente semplice e diretto, questi protocolli presentano alcuni punti critici che devono essere presi in considerazione. In un primo momento, è obbligatorio avere un preparato cellulare stabilmente espandibile e sano. Come descritto in tutto il protocollo, la stabilità delle cellule può essere indirettamente dedurre guardando il loro tasso di crescita. Idealmente, neurosfere dovrebbe raggiungere un diametro di 150-200 micron ogni 4-5 DIV e la percentuale di morte cellulare dopo passaggi devono essere molto bassa (inferiore al 10%). Inoltre, neurosfere devono presentare una forma rotonda compatta e regolare al microscopio. L'infezione con lentivirus può interferire con la sopravvivenza e la stabilità delle cellule. Avere un'infezione ottimale, è obbligatorio avere una titolazione del virus di interesse sufficiente avere 3 x 10 6 TU / ml. Infatti, mentre da un lato una bassa quantità di virus porterebbe ad una piccola percentuale di cellule infettate, d'altra parte l'utilizzo di una quantità elevata would probabilmente ad un effetto di tossicità (fortemente dipendenti dal gene di essere infettati). NPC possono essere infettati più volte con i virus che integrano, qualora il risultato del primo trasduzione portare a bassa percentuale di cellule vitali positive transgene. E 'sempre una buona pratica per avere intra confronto sperimentale dei parametri di stabilità e vitalità con il tipo selvatico, nontransduced, controlla NPC. Come per l'induzione di EAE cronica, la parte più problematica è rappresentata dalla preparazione dell'emulsione. Come descritto, bicchieri e ghiaccio devono essere utilizzate in qualsiasi momento. La preparazione dell'emulsione prende 30-45 min, e può essere considerato pronto per essere iniettato solo quando non si disperde in caso di caduta sull'acqua. Se l'emulsione disperde in acqua, ciò significa che non è ancora pronto e richiede ulteriori miscelazione.
Buona precisione durante la procedura di iniezione iv al momento della somministrazione delle cellule è critico. In primo luogo, è estremamente importante averesospensione cellulare Ingle, come l'iniezione di cellule aggregati possono ostruire le vene del mouse iniettato e portare alla sua morte immediata. Per assicurare il corretto posizionamento dell'ago nella vena, è buona pratica per aspirare con la siringa pochi microlitri di sangue. In caso di mancata sangue che nella siringa, l'operatore deve lentamente spostare l'ago indietro o in avanti fino a trovare la posizione corretta. Solo a questo punto può la sospensione cellulare viene iniettata lentamente. È importante sottolineare che l'operatore deve in genere non è tenuto ad applicare alcuna pressione sulla siringa in quanto il liquido dovrebbe facilmente scorrere in vena. Un'iniezione improprio porterebbe inevitabilmente a un rigonfiamento sottocutaneo corrispondente al sito di iniezione.
Vale la pena notare che nel prossimo futuro sistemica iniettato NPCs2, 27, geneticamente modificato o non, possono a loro volta rappresentare una opzione terapeutica, oltre a fornire uno strumento importante per fornire m immunitariofarmaci odulatory e / o neuroprotettivi e agenti remyelinating pro direttamente nel sistema nervoso centrale 28. Pertanto, mentre esistono alcune limitazioni relative alla consegna sistematica di NPC, entrambi iv. e ICV. percorsi possono infine rappresentare valido approccio terapeutico alternativo in quelle malattie in cui l'iniezione focale di cellule non può costituire il protocollo gold standard del trattamento.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Jayden Smith per la revisione critica e la modifica prova del manoscritto. Questo lavoro ha ricevuto il sostegno della National Multiple Sclerosis Society (NMSS, borse di studio parziali RG-4001-A1), l'Associazione Italiana Sclerosi Multipla (AISM, concedere 2010/R/31), il Ministero della Salute italiano (GR08-7), Wings for Life, la Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPr), il Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito dell'accordo ERC-2010-StG di Grant no 260.511-SEM_SEM e 7 ° Programma quadro della Comunità europea (CE) (FP7/2007-2013) ai sensi della convenzione di sovvenzione n * deg; 280.772 - Ione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| EBSS | Sigma | E2888 | |
| L-Cystein | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Papain | Worthington | 30H11965 | |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0700/50 | |
| Mouse NeuroCult basal medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult proliferation supplements | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B-1000 | |
| Epidermal growth factor | Peprotech | AF-100-15-1000 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 1514012 | |
| Matrigel (coating solution) | BD Biosciences | 354230 | |
| NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) | Stem Cell Technologies | 05704 | |
| Accumax | eBioscience | 00-4666-56 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg | PAA Laboratories | H15-011 | |
| Myco trace | PAA Laboratories | Q052-020 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Immunofluorescence | |||
| Normal goat serum | PAA Laboratories | B11-035 | |
| Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Mouse anti Nestin | Abcam | ab11306 | |
| Rabbit anti GFAP | DAKO | 203344 | |
| Mouse anti Histone H3 (phospho S10) | Abcam | ab14955 | |
| Rabbit anti MAP-2 | Abcam | ab32454 | |
| Rat anti MBP | AbD SEROTEC | MCA409S | |
| Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 | Millipore | MAB345 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting solution | DAKO | S3023 | |
| EAE | |||
| Freund's Adjuvant Incomplete | Sigma Aldrich | F5506 | |
| Mycobacterium tuberculosis | DIFCO | H37Ra | |
| MOG(35–55) | Espikem | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories | 181 | |
| Tissue processing | |||
| Iris scissor straight | Fine Sciences Tools | 14060-09 | |
| Blunt/bended forceps | Fine Sciences Tools | 11080-02 | |
| Brain slicer | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Surgical blades | Swann-Morton | 324 | |
| P200, P1000 pipettes | |||
| Ketamine (Vetalar) | Boehringer Ingelheim | 01LC0030 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 32371 | |
| Stereotaxic frame | KOPF | Model 900 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7762-04 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 158127 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 |
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