Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kronik EAE ile Fare nöral kök / progenitör hücrelerinin sistemik enjeksiyonundan

Published: April 15, 2014 doi: 10.3791/51154
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Clinical Neurosciences, John Van Geest Centre for Brain Repair, University of Cambridge, UK, 2NIHR Biomedical Research Center, University of Cambridge, UK

Summary

Nöral kök / progenitör hücreler (NPC) nakli rejeneratif nöroloji büyük vaatlerde tutar. NPC sistemik teslimi, beyin ve merkezi sinir sistemi hasarı deney kronik enflamatuar etkilenen kemirgen ve insan olmayan primatların omurilikteki kök hücrelerini sunmak için etkili invazif düşük, ve terapötik açıdan etkili, çok protokol dönüşmüştür.

Abstract

Nöral kök / öncül hücreler (NPC) rejeneratif nöroloji, beyin onarım veya restorasyon amaçlayan nakli yaklaşımlar için umut verici bir kök hücre kaynağıdır. Bu yönerge beyin onarım nörolojik hastalıklar, çeşitli klinik öncesi modellerde, fokal ya da sistemik olarak NPC nakli sonrasında elde edilir, geniş kanıtlar doğmuştur.

Bu deneysel veriler acil değerlendirmeyi gerektirir beyin hastalıkları için restoratif kök hücre tedavilerinin önemli engellerden biri olarak hücre teslim rota belirledik. İntraparenkimal kök hücre aşılama gibi omurilik yaralanmaları ve Parkinson hastalığı gibi izole edilmiş ve erişilebilir beyin lezyonları ile karakterize olan patolojiler için mantıklı bir yaklaşımı temsil etmektedir. Ne yazık ki, bu ilke, multipl skleroz (MS) gibi a, multifokal enflamatuar ve (zaman ve mekan hem de) yaygın doğası ile karakterize edilen koşullara kötü uygulanabilir. Gibi, beyin Sist tarafından hedef olarakemik NPC teslim beyin ve merkezi sinir sistemi (CNS) Deneysel kronik inflamatuar zarar etkilenen kemirgen ve insan olmayan primatların omurilik hücreleri sağlamak için düşük bir invaziv ve terapötik açıdan etkili bir protokol haline gelmiştir.

Hücre teslimat Bu alternatif yöntem, NPC pathotropism (i) fonksiyonel hücre yapışma molekülleri ve enflamatuar sitokin ve kemokin reseptörleri üzerinden çevreye anlamda özel olarak doğuştan gelen bir kapasiteye dayanır; (Ii) sızıntı anatomik intravenöz sonra bariyerleri (. Iv) veya intraserebrovantriküler (icv) enjeksiyonu çapraz; (Iii) de iltihabik beyin ve omurilik hasarı çok perivasküler yer (ler) seviyesinde birikir; ve (iv) in vivo olarak farklı konakçı hedef hücrelerin üzerine kayda değer bir doku trofik ve bağışıklık düzenleyici etkilerini uygularlar.

Burada biz iv için geliştirilmiş olan yöntemler açıklanmaktadır. ve <em> icv kronik CNS inflamatuar demiyelinasyon bir model olarak, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) ile farelerde singeneik NPC teslim, ve rejeneratif nörolojide iltihaplı beyin seçici hedeflemesi için değerli bir teknik olarak sistemik kök hücre teslim öngörmektedir.

Introduction

Güçlü kanıtlar CNS bozukluklarının 1-8 hayvan modellerinde, somatik sinir kök / öncü hücreler (NPC) transplantasyonunda terapötik etkinliği doğrulayan vivo çalışmalarda doğmuştur. Bu deneysel sonuçlar, klinik uygulamalara tercüme edilebilir önce Bununla birlikte, konak içine kök hücrelerin teslimi ile ilgili bir takım konularda dikkatli bir değerlendirme gerektirir. Multifokal, kronik inflamatuar beyin hastalıkları için (hematopoetik olmayan) restoratif kök hücre tedavilerinin geliştirilmesine yönelik özellikle önemli bir engel NPC enjeksiyon ideal bir rota tanımlanmasıdır. Hedeflenen hastalığın patofizyolojisi bir firma anlayışı (fokal veya multifokal; primer inflamatuar veya primer dejeneratif), ve dağıtım teknikleri ile ilgili fizibilite ve risk konularında ihtiyatlı analiz kök hücre teslimat için optimum protokolünü belirlemek bulunmaktadır.

Birlikte odak ( (örneğin, Parkinson ve Huntington hastalığı, beyin ve omurilik travmatik yaralanmalar ve inme), aynı yaklaşım olduğu kanıtlanabilir Böyle bir multifokal kronik ve mekansal olarak yaygın sinir sistemi hasarı zamanla biriken MS, gibi durumlarda pratik olarak mümkün olmadığı için. Bu son durumda, bireysel lezyonların fokal hücre enjeksiyonları hedeflemesi de böylece daha az invazif NPC nakli ile hedef MSS alternatif, daha uygun yöntemlerin belirlenmesini isteyen, CNS parankimi içinde uzun mesafelerde göç nakledilen NPC kapasitesi sınırlı tarafından engellendiği .

CNS9 dışında damardan enjekte edildiğinde büyük vaadi farelerde NPC intrakranial tümör (örn.. Glioma) hedef gözlemlerden ortaya çıktı. Bu seminal ardındankök hücre pathotrophism 10 in vivo kanıt, geniş veri, deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) ile laboratuvar hayvanlarında fizibilite ve NPC sistemik nakli terapötik etkinliğine ilişkin birikmiş olan intravenöz ya yoluyla inflamatuvar MSS hasar bir model olarak (iv) veya intraserebrovantriküler (icv.) NPC enjeksiyon 1,2,5,6,8 .. Biz ilk olarak bu hedef ve girmek iltihaplı MSS ve sonradan birden hücrelerarası meşgul nakledilen NPC yeteneği bağlı olduğunu göstermiştir 11, in vivo olarak belirli bir mikro ortamlar içinde iletişim programları. Özel olarak MSS hedef için, NPC beyin omurilik sıvısı (CSF) icv enjeksiyon ile dolaşım, veya iv enjeksiyon yoluyla kan akışına doğrudan verilir. Bir kez kan dolaşımına veya CSF girilerek, nakledilen NPC aktif etkileşimkan beyin (BBB) ​​veya kan beyin omurilik sıvısı (BCSFB) engeller ve CNS parankimi girin. NPC greft ile BBB (veya BCSFB) arasındaki bu etkileşim, NPC yüzey hücre yapışma molekülleri (CAMlar) spesifik grubu ile düzenlenir ve aktive edilmiş endotel / ependimal hücreler 12-14 CAM kontra-ligandları yüksek seviyelerinin ifadesi ile kolaylaştırılır. Bu CAM'lar örnekleri hiyalüronat için reseptörü, CD44, ve hücreler arası yapışma molekülü (ICAM) -1 ligand çok geç antijen (VLA) -4 5,15,16 (yani, lökositler de, aktive edilmiş ependim ile etkileşim sorumludur içerir ve endotel hücreleri), ve daha düşük bir ölçüde Lenfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen (LFA)-1 ve p-selektin glikoprotein ligandı (PSGL) -1. NPC da CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3, CXCR4 ve şunları içeren çeşitli kemokin alıcılarının, geniş bir yelpazede belirtir (ama CCR3'ü ve CCR7 ifade yoktur), in vitro ve in vivo 5,16 hem de işlevsel açıdan aktif olan,. Bu nedenle, systemically enjekte NPC iltihaplı merkezi sinir sisteminin seviyesinde birikir, G-protein kenetli reseptör (GPCR) ile birlikte, bu CAM'lar kullanın. Tersine, NPC vasküler veya beyin omurilik sıvısı alan yolları 2 üzerinden MSS girmeyin sağlıklı farelere içine sistemik enjekte. Kimyasal olarak bağlı ensefalit, bir model olarak ya da sistemik sitokin lypopolisaccharide (LPS) enjeksiyonu takip CNS enflamasyonu, veya endotelyal / ependim hücre aktivasyonu, beyin ve omurilik 2 içine sistemik olarak enjekte NPC birikimi için gereklidir. Bu nedenle, sistemik tedavileri ile NPC CNS başarılı bir şekilde hedefleme, beyin ve omurilik ortam birikimi ve NPC transendoteliyal taşınması için elverişli olduğu bir fırsat (WoO) bir hastalığa özgü pencerenin tanımlanmasına bağlıdır. Bu tür durumlar, genellikle erken ve geç inflamasyon 17 bağlamında ortaya çıkmaktadır. Bir kez farklılaşmamış NPCleri nakledilen, CNS'yi girmiş olanFarelerin klinik-patolojik özelliklerin yanı sıra daha büyük EAE, insan olmayan primatlar iyileştirilmesi için gösterilmiştir. Bu da karşılık olarak hücre yer değiştirmesi üzerinde çok az 2 olan ve olmayan sinir sistemi iltihaplı bölgelerde 19,20 (örneğin, lenf düğümleri) vs perivasküler CNS 2,5,6,18 olan bağışıklık düzenleyici ve nöro-koruyucu parakrin faktörler dikkate değer salgılanması bağımlı olduğu tarif edilmiştir enflamatuar hücre sinyal bağışıklık hücreleri 5 süzülmesiyle ortaya çıkarmıştır.

Bu yazıda kronik EAE bir fare modeli içine somatik NPC sistemik enjeksiyon kilit metodolojik yönlerini açıklar. Daha spesifik olarak, biz genişletmek ve yetişkin C57BL / 6 farelerin subventricular bölgesi (SVZ) den nakli somatik NPC hazırlamak, biz (i) kurduk protokolleri türeterek tanımlamak; (Ii) bu tür farelerde kronik EAE neden ve (iii) terapötik olarak etkili sistemik (iv veya icv) NPC nakli gerçekleştirmek iNto EAE fareler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvanları içeren tüm uygulamalar 1986 (SP PPL No 80/2457) hareket hayvanlar (bilimsel prosedürleri) kapsamında İngiltere İçişleri Bakanlığı tarafından onaylı laboratuvar hayvan bakım esaslarına göre yapılır.

Yetişkin Farelerde Beyin bölge subventricular (SVZ'una) somatik Nöral kök / progenitör hücrelerin (NPC) 1. Türetilmesi

  1. Diseksiyon aletleri ve medya hazırlanması
    NB: diseksiyonlar araçlar kullanılmadan önce (o papain sulandırmak için yardımcı olur ve enzim aktivitesini optimize) hazır ve 37 º C'de en az 20-30 dk önceden ısıtılmış olan önce bu iki çözümler 1-2 saat hazır olmalıdır.
    1. Bir düz keskin makas, bir küçük cerrahi makas ve iki küçük kavisli tırtıllı forseps otoklavlayın.
    2. 'Sindirim' çözüm: iki ayrı 50 ml tüpler hazırlayın:
      Çözelti 1: 25 ml Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) + 10 mg etilendiamintetraasetik asit (EDTA) + 10 mg L-sistein;ve
      Çözüm # 2: 25 ml EBSS + 50 mg papain.
    3. , Epidermal büyüme faktörü (EGF, 20 ng / ml) ve antibiyotikler,% 0.002, bazik fibroblast büyüme faktörü (10 ng / ml bFGF) heparin, fare çoğalma takviyesi ile birlikte fare bazal ortam: 'tam büyüme ortamında' (CGM) hazırlanması (Pen / Strep).
  2. Beyin diseksiyonu
    NB: Temporal kemik kaldırma kolayca nedeniyle netlik dokusuna zarar verebilir. Bunu önlemek için, sıkıca forseps ile kemiklerini güvenli ve tüm kemik kaldırıldı kadar çekin.
    1. Servikal dislokasyon n = 5-7, 4-8 haftalık C57BL / 6 fareler ile NPC, itlaf her hazırlanması için.
    2. % 70 etanol (suda) itlaf farelerin saç ve baş kaldırmak için düz keskin bir makas ile kulakların arkasında kesilmiş ile temizlemek;
    3. Kafatası üzerinde deri kesmek için küçük bir cerrahi makas kullanarak bir orta hat kesi olun. Forseps kullanarak, tanitima deri yamaları iki kat yukarıkafatası e.
    4. Küçük cerrahi makas ile kafatasının dibinde iki küçük kesikler gerçekleştirmek ve pons / medulla (ventral kafatası) altında kemikleri çıkarın. Temporal kemikleri çekerek devam edin. Aynı makas ile beyin yüzeye zarar vermeden, ampuller tabanından başlayarak tüm kafatası boyunca bir kesim yerine. Ayrıca, parietal kemik çıkarılmasını kolaylaştırmak için, frontal kemik ve gözler arasında bir kesim yerine. Iki forseps dışarıya doğru parietal kemiklerin her çekerek kafatasını kaldırarak başlamak ile. Çekerken, kemikleri çıkarılır olan zaman beyin hasarı, hangi meninkslerde dikkat.
    5. Kafatası çıkarıldıktan sonra, tam olarak sol zarları ayırmak için, beyin ve kafatası arasında forseps kaydırın. Yavaşça kafatası beyni yukarı kaldırın. Beyin serbest bırakmak ve son soğuk fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile birlikte bir tüpün içinde beyin toplamak için optik sinirler kesilir.
    6. Ice üzerinde tüp tutunTüm fareler için aynı işlemi tekrarlayın d.
  3. SVZ'unda diseksiyonu, neurosphere oluşumu ve bakım deneyleri
    Hücreler x ortalama sayısı seyreltme faktörü x 10 4

    10 4 hematositometre bölmesi (-> 10-4 cm 3 -> 10-4 ml toplam hacim = 0.1 mm 3) toplam hacminin dönüşümünü temsil etmektedir. Seyreltme faktörü, CGM ile yapılan bir hayati ve leke ile her iki göz önüne alındığında dikkate alınması gerekir. 160 hücreleri, 4 köşe meydanlarda sayılır edilmiş ise, bir örnek olarak, hücre süspansiyonu nihai yoğunluğu (hücre / ml) olacaktır:

    160/4 x 5 (CGM'nin ile seyreltme) x 2 (önemli bir leke ile seyreltme) 10 x 4
    1. Bir mikroskop ile donatılmış bir diseksiyon başlık açın.
    2. % 70 etanol (suda) ile tüm yüzeyleri temizlemek, ve bulaşma riskini azaltmak için anti Mycoplasma solüsyonu ile sprey.
    3. Kapaksteril bir gazlı bez ile bir kaba alt (bilenmiş aletleri sağlamak için) ve% 70 etanol (su içinde) ile doldurun. Beher forseps iki çift, bir mikro makas çifti ve bir cerrahi bıçak batırın.
    4. Beyin-dilimleyici matris üzerinde tüm beyni yerleştirin.
    5. Iki Jilet optik yolları hariç, beynin ön direğe yerden bir koronal kesit 2 mm gerçekleştirmek ve önceki kesim 3 mm posterior kullanma; ve temiz Petri tabağına doku yerleştirin.
    6. Mikroskop altında SVZ'una doku izole ve makas iridektomi kullanılarak 1 mm 3 parçaya kesilir. Tüm beyinleri için tekrarlayın.
      1. De yukarıdaki iki çözüm (bölüm 1.1.2) karıştırın ve beyinleri ve SVZs sindirmek hazır hemen sonra 0.22 mikron filtre ile filtre.
    7. 'Sindirim' çözeltisi 30 ml bölümleri transfer hafifçe a10 ml pipet ile yeniden süspanse edin ve 3 de 30 dakika inkübe% 5 CO2 içinde 7 ° C. Her 15 dakika hafifçe tüp 2-3x sallayın.
    8. 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
    9. Süpernatant kaldırmak ve tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar, bir P200 pipet (10-20x her biri) ile ilk P1000 ile ve daha sonra pipetleme CGM 200 ul pelletini.
    10. CGM, 5 ml süspansiyon sürebilir ve bir T25 cm 2 şişeye aktarın.
    11. In vitro 5-7 gün sonra (DIV) neurospheres oluşturacak. 150 x g de 15 ml santrifüj tüpü ve 10 dakika içine süspansiyon toplayın.
    12. Süpernatantı ve CGM 200 ul içine pelletini.
      Tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar, bir P200 pipet ile hücreler 100-150X pasajlanarak mekanik neurospheres ayırmak ve CGM ile 1 ml kadar sürer.
    13. Bir 1:05 seyreltme elde etmek için CGM 40 ul hücre süspansiyonu, örneğin, hücre süspansiyonu, 10 ul seyreltilmiş ve iyice karıştırın. Zaman dilüe olabilme 10 ul karıştırıne hücre önemli bir leke 10 ul süspansiyon ve iyice karıştırın.
    14. Canlı bir boya çözeltisi: 1:1 'lik bir hücre süspansiyonu, 10 ul bir hemositometre sayım odası doldurun. Ayrı 4 köşe kareler canlı (beyaz) ve ölü (mavi) hücre sayısını. Hücre / ml sayısını belirlemek için, aşağıdaki hesaplama geçerlidir:
    15. 5 CGM üzerine ilave edildi ve bir T25 cm2 şişeye transfer süspanse 2 x 10 5 hücre;
    16. Bölümleri 1.3.11-1.3.12 her 4-5 DIV tekrarlayın. Itibaren genişleme ikinci geçitten, hayati leke dışlama tarafından hücresel canlılığını değerlendirmek ve 21 anlatıldığı gibi, klonal yoğunluğu (8.000 hücre/cm2) de NPCleri kaplama tarafından sürekli bir büyüme eğrisini yukarı oluşturmaya başlayabilirsiniz. Hücre sayıları tutmak ve prosedür her 4-5 DIV tekrarlayın. Aşağıdaki gibi sürekli bir büyüme eğrisi oluşturmak için, devam:
      Not: 4-5 DIV küreleri 150-200 um bir çapa ulaştığı olmalıdır sonra, iyi bir hücre preparatının sahip olmak. T iyi bir tahmin varO hücre yoğunluğu, bu hematositometre boyunca iyi dağıtılmış, örtüşmeyen hücreleri elde etmek için bir optimum seyreltme faktörü bulmak için önemlidir. İdeal olarak, 50-200 total hücreler arasında olmalıdır. Sayarken, sınırları dokunmadan kare içinde oluşan tek hücreler olarak kabul edilmesi gerekir. Aynı zamanda, hücrelerin canlılığı sağlıklı bir hazırlık için çok önemli bir faktördür. Önemli olarak, bu daha fazla% 90 olması gerekir. Doğrusal bir büyüme eğrisi sağlıklı hücre hazırlama başka bir göstergesidir.
      1. Canlı ve ölü hücrelerin sayısını (örneğin 1,3 x 10 6) saymak.
      2. Kaplama hücre sayısı (örneğin, 1.3 x 10 6/2 x 10 5 = 6.5) ile canlı hücre sayısına bölünmesi büyüme oranını tanımlamak için kullanılır.
      3. (= 2 x 10 5 başlangıcındaki) önceki bir zaman noktasında mevcut hücrelerin toplam sayısı için büyüme çarpılarak toplam hücre sayısını hesaplayın.
      4. Ortalama bildir7; Bir doğrusal eğilim hattı inşa standart sapma.
    17. Geçit 6 başlayarak, mekanik ayırma, enzimatik ayrılma ile değiştirilir. 10 dakika boyunca 150 x g'de santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak toplam hücre ayrışma çözeltisi 200 ul pelletini, bir P200 ile 7-8X tekrar süspansiyon ve 37 ° C,% 5 CO2 de 10 dakika inkübe edilir.
    18. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek ve CGM 800 ul eklemek için P200 ile 7-8x süspanse edin. (Canlı ve ölü) hücreleri saymak ve onların canlılığı kurmak. 5 CGM üzerine ilave edildi ve bir T25 cm2 şişeye transfer süspanse 2 x 10 5 hücre.
  4. In vivo hücre takibi için NPC viral transdüksiyon
    Not:, viral transdüksiyon verimliliğini doğrulamak Transdüksiyona ve nontransduced NPC ile paralel bir büyüme eğrisi oluşturmak için. Buna ek olarak, bu neurosphere oluşturan hücrelerin mutlak sayısı, hücre içinde mevcut hazırlama i klonal verimliliktirtion veya (propidyum iyodür, PI) ile DNA içeriği ile, bir hücre döngüsü analizi, hücre durum da diğer endikasyonlar olarak kullanılabilmektedir. Enfekte olmuş hücrelerin yüzdesi iyi olmamalıdır ise, viral transdüksiyon protokol hücre aynı nüfusu ile bir kez daha tekrarlanabilir. Enfeksiyon düzeyi tatmin edici olan ve büyüme eğrisi vahşi tip hücreleri ile elde edilene benzer bir kez, transduse NPC genişletilmiş ve / veya transplante edilebilir.
    1. Neurospheres hasat ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek. 10 ml CGM yüksek yoğunluklu (a T75 cm2 şişe içinde 1.5 x 10 6 hücre) seviyesinde hücreleri Plate.
    2. 12 saatte bir, bir üçüncü nesil lentiviral vektör pRRLsin 3 x 10 6 TU / ml ekledikten sonra. PPT-hCMV E ile tasarlanmış β-galaktosidaz (LacZ) veya yeşil floresan proteini (GFP) ile coli türevi.
    3. 48 saat sonra, 10 dakika boyunca 300 xg'de hücreler, santrifüj hasat ve bir 1:1 oranında hücreleri replate.
    4. SonraIn vitro 3 pasajlar enfeksiyonun etkinliğini doğrulamak. Akış sitometrisi yaygın bir enfeksiyondur etkinliğini test etmek için kullanılır ve enfeksiyonun yeterli düzeyde yaygın pozitif hücre% 75-95 aralığında olduğu kabul edilmektedir. Markör ifade bakım doğrulamak için genişleme 3 daha ileri pasajlar sonra yeniden enfeksiyonun etkinliğini kontrol edin.
  5. Neurosphere dondurma
    1. 10 dakika boyunca 300 xg'de T25 cm 2 şişesi, santrifüj neurospheres hasat ve süpernatant atın.
    2. % 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile ortamı (CGM dondurma 1 ml ile pelet yeniden süspanse edin.
    3. Bir dondurma kap içinde -80 ° C de cryovials yerleştirin.
    4. En az 24 saat sonra ay boyunca -80 ° C 'de bir cryobox ve saklamak için hücreleri hareket veya daha uzun depolama için sıvı azot (N, 2) getirir.
  6. Neurosphere çözdürme
    Not: uzun süreli temas o toksik etkilerini önlemek içinDMSO ile f NPC, çözülme süreci mümkün olduğunca hızlı olmalıdır.
    1. Dan cryovial çıkarın -80 C / N 2 ° ve kuru buz üzerinde tutmak.
    2. Hemen hemen tüm hücre süspansiyonu çözüldü ve buzlu süspansiyonun sadece küçük bir parça olarak kalır kadar hızlı bir şekilde bir su banyosu üzerinde şişeyi eritin.
    3. Prewarmed taze CGM, 5 ml hücre süspansiyonu süspanse edin.
    4. 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
    5. Taze CGM 5 ml hafifçe süpernatan, tekrar süspansiyon çıkarın ve temiz, muamele edilmemiş T25 cm2 şişe içinde hücre süspansiyonu plaka.
  7. 1.7) NPC karakterizasyonu
    Not: Son yıkama PBS mantar büyümesini veya kirletmesini önlemek için% 0.05 sodyum azid, PBS ile ikame edilmiş olabilir, ve coverslides 2-3 hafta boyunca 4 ° C'de saklanır.

    Not: hücre içi işaretleri için leke için, bloklama çözeltisi PBS için bir su-geçirimli madde ekleyin. Birincil antikorun kaynak keçi, inek serumu albumi isen (BSA) ya da keçi dışında serum kullanılmalıdır.

    Not: hücre içi işaretleyiciler birincil antikor çözeltisi içinde bir su-geçirimli madde kullanım için lekelemeye.
    1. , 24 kuyulu plakanın altındaki bir 13 mm cam coverslide yerleştirin. Küçük bir düşüş oluşturmak için her coverslide üstüne kaplama çözeltisi 150 ul ekle. 37 ° C'de en az 30 dakika boyunca inkübe,% 5 CO2.
    2. Neurospheres hasat ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek üzere ayrışır.
    3. Canlı hücrelerin sayısı ve 80.000 cells/35 ul elde sulandırmak. Hafif aspirasyonla coverslide ikinci kaplama solüsyonu fazlalığını kaldırmak ve hücre süspansiyonu 35 ul plaka.
    4. 37 ° C'de 25 dakika inkübe,% 5 CO2. Hücreler yapışmaya başladı eğer hızlı bir kontrast faz mikroskobunda kontrol edin.
    5. Uygun katkı (bkz. Tablo 1) ve antibiyotik (Pe sahip fare bazal ortamı karıştırılması ile farklılaşma ortamı hazırlayınn / Strep).
    6. Farklılaştırma ortamının 400 ul ilave edin ve 37 ° C'de inkübe edilir,% 5 CO2.
    7. 3 SAYI sonra, taze farklılaşma ortam ile orta yarım değiştirin.
    8. 6 DIV sonra, orta kaldırmak ve bir kez PBS ile yıkayın. Kimyasal bir başlık altında PBS kaldırmak ve önceden ısıtılmış% 4 paraformaldehid (PFA)% 4 sukroz 300 ul ekleyin. Oda sıcaklığında (RT), 5 dakika boyunca inkübe edin. PFA çıkarın ve 3 kez PBS ile yıkayın.
    9. Immunositokimya ile devam etmek için, PBS kaldırmak ve PBS,% 10 normal keçi serumu (NGS) (bloke edici çözelti) ile bloke edildi ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir.
    10. Bloke çözeltisini ayırın ve PBS% 1 NGS ile seyreltildi, istenen birincil antikor ekleyin. Alternatif olarak, 120 dakika oda sıcaklığında, 4 ° CO / veya N, inkübe edin.
    11. İnkübasyondan sonra, 2x PBS ile yıkayın. PBS% 1 NGS ile seyreltildi, uygun ikincil antikor ile inkübe edin. Oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.
    12. Yıkama PBS ile 2x ve 4 ile çekirdek karşı leke ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) PBS, karanlıkta, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca geçirimli madde ile 1:20,000 seyreltilmiştir. PBS ile ve bir kez damıtılmış su ile iki kere yıkayın.
    13. Bir cam slayt üzerine monte doku ortamının bir damla koyun ve forseps ile montaj orta bakan hücreleri ile coverslide monte edin. Yavaşça montaj orta aşırı sıkmak için coverslide basın. Montaj ortamı kuruyuncaya kadar, oda sıcaklığında karanlıkta coverslide bırakın ve 4 ° C'de saklayın

C57BL / 6 fareleri 2. Myelin oligodendrosit Glikoprotein (MOG) kaynaklı Experimental Autoimmunity

  1. Emülsiyonun hazırlanması
    1. Bir cam kap üzerinde [aksi Tam Freund katkı maddesi (CFA) gibi tanımlanmıştır] ve MOG (peptid 35-55), 200 ug, dikkate Mycobacterium tuberculosis 4 mg / ml içeren Eksik Freund katkı maddesi oluşan bir emülsiyonun hazırlanması ki emülsiyonun toplam miktarı başına fare 300 ul olacaktır.
      NB: ÖDENEKCFA içinde MOG-bağışıklık kazandırılmış farelerin te kontrol sadece CFA ile bağışıklaştırılan fareler bulunmaktadır. MOG-aşılanmış farelerde hastalık başlangıcı beklenen varyans 11.3 (± 1.8) dpi.

      Not: gerekli emülsiyonun toplam hacmi hesaplanırken, bağışıklık kazandırmak için farelerin sayısı olarak iki kat daha fazla hacim düşünün. Züccaciye emülsiyonun bir parçası olan atık plastik malzeme, en aza indirmek için tercih edilmelidir.
      1. Bir cam şırınga her zaman buz üzerinde emülsiyonu tutarak, yaklaşık 30 dakika için bir 19 G iğne ile bir karışım tutma.
      2. Emülsiyon hazır olup olmadığını doğrulamak su emülsiyonu bir miktar bırakın. Bu ve dağıtmak etmez olarak düşürmek kalır sadece emülsiyon enjekte edilecek hazırdır.
      3. Sadece CFA ile farelerin kontrol grubu bağışıklık kazandırır. Deney fareleri, CFA içinde tedavi MOG ile (MOG immünize). MOG hastalık başlangıç ​​beklenen varyans fareler 11.3 (1.8 ±) dpi bağışıklı.
    2. Bir 1 ml plastik şırınga A 19 G iğne aktarmand emülsiyonu aspire. , Kabarcıkları önlemek 25 G iğne değiştirmek ve buz üzerinde şırınga bırakın. Emülsiyon ile dolu şırıngalar kullanılmak üzere hazır olan ve bir kaç saat için buz üzerinde tutulmalıdır.
  2. Aşılama
    1. Bir ısınma kutuya (dişi 6-8 haftalık) fareler yerleştirin ve yaklaşık 10 dakika kuyruk ven genişletmek için izin için bekleyin.
    2. Bir fare süzgeç için ısınma kutusundan bir fare aktarın. Fare herhangi bir hareketini önlemek için koruyucularını kapatın.
    3. Kabarcıklar hale kaçınarak pertussis toksini (5 ug / ml) 100 ul bir 1 ml şırınga insülin doldurun. Yavaşça kuyruk damarı içinde çözelti enjekte edilir. Kanamayı takmak için bir kağıt parçası ile bir kaç saniye için iğne ve basın çıkarın.
    4. Geri kafeste fare yerleştirin ve tüm fareler için aynı işlemi tekrarlayın.
    5. Sürekli izofluran teneffüs (% 1-2, 2 L / dak) ile bir fare anestezi ve seviyesinde, emülsiyon, deri altından 100 ul enjekteiki kanat ve kuyruk (300 ul emülsiyon / fare) tabanının. Yavaş yavaş emülsiyonun sızıntısını önlemek, şırınga çıkarın.
    6. , Bir kulak zımba ile fareyi işaretleyin kafes fareler yerleştirin ve tam iyileşme kadar kontrol edin. Tüm fareler için tekrarlayın.
    7. 48 saat sonra (2 gün sonrası bağışıklama, dpi) tekrar bölüm 2.2.3.
  3. EAE farelerin davranış analizi
    1. 5 dpi başlayarak her gün fareler tartmak ve Tablo 1 'de açıklanan ölçekli bir skorlama sistemi kullanarak, lokomotor performansları izlemek.

Kuyruk damarına Nöral Kök / Progenitör Hücre 3. Enjeksiyon (iv)

  1. Hücre hazırlama
    1. 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hasat neurospheres.
    2. Süpernatantı ve hücre agrega ayrışma çözeltisi 200 ul ekleyin. 37 ° C'de 10 dakika inkübe,% 5 CO2.
    3. Yavaşça 10-12x (avoidin tekrar süspansiyong tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar P200 ile kabarcıklar) ve Ca 2 + ve Mg 2 + olmadan bazal ortamı ile 800 ul almak.
    4. Hücre canlılığı deneyi ve 10 6 cells/150 ul bir son yoğunluk elde etmek için Ca 2 + ve Mg2 + olmayan bazal ortam maddesi ile süspansiyon sulandırmak için önemli bir leke kullanarak hücreleri sayın. Kullanılana kadar buz üzerinde tutun hücre süspansiyonu.
  2. NPC iv enjeksiyon
    NB: tek hücre süspansiyonu içine ideal bir ayrışma ve hava kabarcıklarının olmaması damar tıkanıklığı ve buna bağlı olarak ölüme neden olabilir emboli oluşumu vs yığınları / agrega ya riskini azaltmak için dikkate alınması gereken iki önemli yönü vardır.
    1. Hastalığı (16-18 dpi) zirvesinde, tartmak ve fareler puan. Homojen gruplar elde etmek için aldıkları puanlara göre fareler dağıtın.
    2. Bir ısınma kutuya fareler yerleştirin ve yaklaşık 10 dakika kuyruk ven genişletmek için izin için bekleyin. Bir fare süzgeç için ısınma kutusundan bir fare aktarın. Fare herhangi bir hareketini önlemek için koruyucularını kapatın.
    3. Hücre süspansiyonu 150 ul ile 1 ml insülin şırınga doldurun ve tüm kabarcıklar kaldırmak için emin olun. Yavaş yavaş kuyruk damarına solüsyonu enjekte edilir. Kanama (Şekil 6A ve 6B) takmak için bir kağıt parçası ile bir kaç saniye için iğne ve basın çıkarın.
    4. Kafeste fare yerleştirin ve kurtarma kadar kontrol edin. Tüm fareler için aynı işlemi tekrarlayın.

4.. Cisterna Magna (ICV) içine Nöral Kök / Progenitör Hücreler Enjeksiyon

  1. Hücre hazırlama
    1. 10 dakika boyunca 300 x g santrifüj ile hasat NPC.
    2. Süpernatantı ve hücre agrega ayrışma çözeltisi 200 ul ekleyin. 37 ° C'de 10 dakika inkübe,% 5 CO2.
    3. Yavaşça bir tek c elde edilinceye kadar bir P200 ile 10-12x tekrar süspansiyonell süspansiyon ve Ca 2 + ve Mg 2 + olmadan bazal ortamı ile 800 ul almak.
    4. Hücre sayımı ve istenen hücre yoğunluğu elde etmek için Ca 2 + ve Mg2 + olmadan bazal ortamı ile süspansiyon seyreltin. Kullanılana kadar buz üzerinde tutun hücre süspansiyonu.
  2. 4.2) NPC Icv enjeksiyon
    1. Hastalığı (16-18 dpi) zirvesinde, tartmak ve fareler puan. Homojen gruplar elde etmek için aldıkları puanlara göre fareler dağıtın.
    2. Sürekli izofluran inhalasyonu (% 1-2, 2 L / dk) altında steryotaksik cihaz üzerinde fare yerleştirin. Kulak çubukları ile fare baş elde edin. Sonra ağız ve burun parçaları hem de ayarlayın. Fare baş düz ve sabit olduğundan emin olun.
    3. Povidon-iyot (PVP-I) ile fare kafasını çubukla ve kafatası açığa çıkarmak için başın arka kısmında cilt kesmek için bir kesi yapmak.
    4. Bir mikromanipülatör kullanarak, bir MICROL ucuna takınboynun arka orta hatta sağlam kaslar ve bağlar aracılığıyla oksiputa ve atlas vertebra arasındaki yarık içine iter şırınga. İğnenin bükülmüş parçası 22 tarif edildiği gibi, tüm uzunluğu için oksiputa iç yüzeyi ile yakın temas içinde tutulur.
    5. Yavaş yavaş iğne yerleştirin ve birkaç saniye bekleyin. Operatör iğne hücre hazırlık enjekte başlatmak için önce fare kafatası, için "çengel" olma duygusunu tanımayı öğrenmek içindir. Yavaş yavaş (3-5 dakika içinde) hücre hacmini enjekte edilir. Enjeksiyondan sonra ek birkaç saniye yerinde iğne bırakın ve yavaş yavaş şırınga çıkarın.
    6. Cilt kadar dikiş ve tam iyileşme kadar bir kurtarma kafesin içine fare yerleştirin.

5.. Doku İşleme

  1. Derin 0.5 ml ketamin ile (100 mg / ml), 0.25 ml ksilazin (23.32 mg / ml) ve 4.25 ml steril suyun bir karışımı ile fareler uyuşturan ve transcardically w, perfüzetuzlu-EDTA ile külleme ve% 4 PFA ile sabitleme. 4 ° C'de 12 saat boyunca% 4 PFA vertebral sütun ve beyinleri ve postfix'i hem Kaldır PBS içinde doku yıkayın, kemiklerden omurilik çıkarın ve 4 ° C 'de (PBS içinde)% 30 sukroz içinde dokuya en az 48 saat bırakın 2 açıklandığı gibi, optimum kesim sıcaklığında (Ekim) bileşim dokuları gömmek ve sıvı azot ile dondurma oturtun.
  2. 10-12 mikron kalınlığında dilimler halinde dokuları kesmek için bir mikrotom kullanın.
  3. Alternatif olarak, agaroz taze doku gömmek ve bir Vibratome 50-80 mikron kalınlığında dilimler kullanılarak doku kesti.
  4. Her iki durumda da, 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β nükleer β-galaktosidaz aktivitesi tespit etmek için D-galaktopiranosid (X-gal) çözeltisi 37 ° C 'de O / N inkübe edin.
  5. Astrositler (50 ug / ml), nöronlar için antinöronal nükleer antijen (neun) için antiglial fibriller asidik protein (GFAP) kullanılarak 5 um dilimleri ve çift leke içine β-gal + hücreleri ihtiva eden bölümleri (1 & Recut956., g / ml) ve farklılaşmamış sinir hücreleri (10 ug / ml) için antiNestin.
  6. Bölümlerde 1.7.11 ve 1.7.12 de açıklandığı gibi devam edin. Birden lekelemeleri için farklı flüoroforlar ile konjuge sekonder antikorlar kullandığınızdan emin olun.
  7. GFP etiketli hücreleri içeren dokular gibi adımlar 5.1-5.3 açıklandığı ilerleyiniz ve çoklu boyamalar ile devam edin.
  8. Slaytlar montaj orta birkaç damla ekleyin ve doku lamel ile kaplayın.
  9. Ile lekelenmiş bölümler için biyotin konjuge edilmiş antikorlar (bakınız Tablo 2, ABC çözelti) avidin biyotin kompleksi içeren bir çözelti hazırlanması ve 45 dakika için çalkalamada bırakın.
  10. Endojen peroksidaz aktivitesini engellemek için,% 1 H 2 O 2 dilim 5 dakika inkübe edin.
  11. Iki kez PBS ile yıkayın.
  12. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca ABC çözeltisi ile inkübe edin.
  13. Iki kez PBS ile yıkayın.
  14. 3,3 '-diaminobenzidin çözeltisi ve% 0.3 2 H O 2 kuluçkalayın. Reaksiyon un MonitörBir mikroskop der ve kısa sürede dilim kahverengi (genellikle yaklaşık 5-10 dk) başlar gibi PBS ile yıkayın.
  15. PBS ile iki kez yıkayın ve adım 5.7 'de açıklandığı gibi devam edin.

Maddeleri ve kapsamlı listesi Tablo 2'de gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NPC türetme ve karakterizasyonu
SVZ diseksiyonlar mekanik ve enzimatik ayrışma (Şekil 1A) vasıtası ile 6-8 haftalık C57BL / 6 farelerinin (n = 5-7 farenin / havuz) havuzları üzerinde gerçekleştirilir. CGM kültürlemenin bir kaç gün sonra, serbest yüzen neurospheres (Şekil 1A ve 1B) oluşturulması başlar. Birincil küreler alınır ve mekanik olarak her 4-5 DIV pasajlanır. Pasajlayarak sonra canlı ve ölü hücre sayıları tespit ve kümülatif hücre sayıları bir büyüme eğrisi (Şekil 1C) oluşturmak için çizilmiştir. Bu, böylece NPC preparatın genel stabilitesini değerlendirmek için dolaylı bir parametre temin yayılma oranının bir göstergesini vermektedir. Ve farklılaşmamış sinir hücrelerinin (örneğin Nestin) (Şekil 2A); neurospheres olarak çoğalan zaman, NPC mitotik aktivite belirteçleri (5 ug / ml, fosfo-histon H3, PHH3) ifade etmektedir. Terapötik e olması olan ayrım NPCEAE de fficacious nakli sonrası CD44 (5 ug / ml), VLA-4 (10 ng / ml) içinde α4 alt birimi (Şekil 2F) gibi hücre yüzeyi yapışma moleküllerini ifade etmelidir. Uygun türev koşullar altında kaplama olduğunda, NPC gibi astroglial işaretleyici GFAP (Şekil 2C) halinde üç sinir soylar, (Şekil 2B), tipik markörlerini ifade nöronal mikrotübül markör protein-2 (MAP-2 bağlantılı; / ml 5 ug ) (Şekil 2B) ve oligodendroglial işaretleri O4 (5 ug / ml) ve miyelin bazik protein (MBP, 10 ug / ml) (Şekil 2E), böylece NPC üç ana sinir soy doğru multipotent olduğunu kanıtlar. In vivo olarak nakledilen hücrelerin belirlenmesini kolaylaştırmak için, NPC GFP gibi kararlı bir şekilde ifade raportör genler için tasarlanmış lentivirüsler ile iletilir. Transdüksiyona NPC (neurospheres çoğalan olarak Şekil 3A ve 3 hem de GFP ifadeC) yanı sıra büyüme faktörü çekilmesi (Şekil 3B) üzerinde in vitro farklılaşan zaman. Transdüksiyon verimliliğini doğrulamak için, GFP ekspresyon (yani yeterince zaman, protein düzeyinde ortaya transjenin ifade sağlam olması için izin veriyor) gibi erken hücre transdüksiyonu sonra 3 geçişleri başlamak üzere, akış sitometrisi ile analiz edilir. In vitro NCPlerle üçüncü nesil lentivirüsler uygularken, sürekli proliferasyonunda belirgin toksisite veya değişiklikler de olan, birden çok bağımsız deneyin (Şekil 3C) üzerinde GFP'nin yüksek seviyede gösteren hücrelerin>% 90 gözlemlemek, vahşi tip büyüme eğrileri ve karşılaştırırken lenti-GFP kalıt NPC (Şekil 3D).

Kronik EAE indüksiyon
MS'in patolojik ve klinik olayların en özetlediği beri EAE, MS iyi karakterize modellerinden biridir. Developmen için MOG35-55 yol ile C57BL / 6 farelerinin bağışıklaştırılmasıEAE kronik bir forma t. Indüksiyon fazında (klinik öncesi) döneminde hastalık başlangıcını (11.3 ± 1.8 dpi) yaklaşırken, MOG fareler ağırlığı (Şekil 4A) kaybetme başlar bağışıklı. Efektör / işgali fazın başlangıcında (pik klinik; 16.8 ± 3.2 dpi) EAE fareler (3,5 ± 0,7 puan) hastalığın zirveye ulaşır ve kısa bir süre zirve yaptıktan sonra nihayet kronik sırasında stabilize ilerleyici ve kısmi iyileşme gösteriyor itibaren yaklaşık 30 dpi dan faz (stabil klinik) (2.8 ± 0.9 puan) (Şekil 4B). In vivo doku patolojisi ile eşleştirilmiş intravital mikroskopi 23 veya manyetik rezonans görüntüleme 24 ya göre bazı soruşturma EAE, dahil olmak üzere çok sayıda çalışmalar, efektör / işgali faz (16-22 dpi) fırsat ideal bir pencere (woo) zirve belirledik kronik iltihaplı EAE CNS girmek ve ikincil d korumak için tasarlanmıştır kök hücreleri ile sistemik deneysel tedavileri gerçekleştirmek için hangiermeden.

NPC enjeksiyon
Singeneik NPC beyin (Şekil 5A) ve omurilik (Şekiller 5B-D) hem de (Şekil 6) merkezi sinir sistemi hasar perivasküler alanlarında hemen hemen sadece bulunan EAE farelerde sistemik olarak enjekte edilmiş, 45 güne kadar, transplantasyonu (DPT) yayınlamak tarif edileceği gibi 5. iv. Birkaç NPC neun (Şekil 5D) ifade perivasküler alanın dışına taşırken NPC tercihen, bir olgunlaşmamış, Nestin + (Şekil 5C) fenotip korumak enjekte. Notun, NPC sağlıklı kontrollerden içine iv enjekte damar rotası (Şekil 5E) yoluyla MSS girmek için başarısız. Iv NPC enjeksiyonundan sonra, enjeksiyon NPC'nin önemli sayıda erken DPT 10 (Şekil 5F) gibi, karaciğer, bağırsak, dalak, akciğer, böbrek, ancak kalp olmayan CNS organlar seviyesinde bulunurlar. MSS dışı biriken NPC tamamen thes üzerinden temizlenir 30 dpt (Şekil 5G) e periferik organlar.

Şekil 1
Şekil 1.. Yetişkin farelerin SVZ'unda gelen NPC İzolasyon ve stabil genişletilebilir NPC hatları nesil. A, şematik stabil genişletilebilir bir nesil ana kritik adımların gösterimi, ve enjekte fare NPC hazırlanması. B, in vitro Neurospheres. C neurospheres her 4-5 gün geçişli olarak, NPC kültürlenmiştir. Canlı ve ölü hücreleri sayıları toplanarak kümülatif hücre sayıları bir büyüme eğrisini oluşturmak için çizilmiştir. B ölçek çubuğu 200 mikron. C ± SD veri hücre ortalama toplam sayısı (n = 3).

Güre 2 "fo: İçerik-width =": / files/ftp_upload/51154/51154fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51154/51154fig2.jpg "/>" src = fo "5in
Şekil 2.. NPC karakterizasyonu. A, farklılaşma koşullarında 6 DIV sonra, NPC astrogliyal (GAFP doğru multipotent vardır, çoğalan fare neurospheres PHH3 çekirdek histon proteini (yeşil) ifade ve tip VI orta lif, protein Nestin (kırmızı). BE C kırmızı), nöronal (MAP-2, D yeşil) ve oligodendroglial (O4, E yeşile) ve MBP, E kırmızı soy. Niceleme GFAP-, MAP-2-ve 6 DIV da O4-ifade eden hücreler, in vitro NPC farklılaşma B'de gösterilmektedir sonra. B veriler ± SD olarak ortalama% (n = 3). CE Ölçek çubukları leukocy düzenleyen temel hücre yüzey adezyon moleküllerinin ekspresyonunun sitometri analizi 50 um. F, Flowte ekstravazasyon fare neurospheres içinde. Şekil 2F Pluchino ark çoğaltılamaz. 2

Şekil 3,
Lentivirüsler muhabir genler (örneğin, GFP. A ve B, bir 3. nesil lenti-GFP vektör ile transdük oylandı neurospheres (A) ve ayırt NPC (B) Faz kontrastlı görüntüler. Flow sitometri analizi ifade ile NPC Şekil 3. İletimi A. C NPC, Yabani tip (transdüksiyonlu değil) ve neurospheres her 4-5 gün pasajlanır gibi lenti-GFP transdük NPC yetiştirilir., canlı ve ölü hücre sayıları toplanır ve kümülatif hücre sayıları bir büyüme eğrisini oluşturmak için çizilen. ölçek çubuğuA ve B 200 mikron. C ± SD veri hücre ortalama toplam sayısı (n = 3).

Şekil 4,
Şekil 4. Kronik EAE fonksiyonel karakterizasyonu. Üzerinden toplam MOG-ve CFA-bağışıklı C57BI / 6 farelerde izleme A, Günlük kilo 40 dpi takip. B, üzerinden toplam MOG-ve CFA-bağışıklı C57BI / 6 farelerde günlük EAE puanı izleme 40 dpi takip . Veri ± SD olarak ortalama sayı (n = 10 fare / grup) ifade edilmiştir.

Şekil 5,
Şekil 5. Sistemik NPC Migr enjekteEAE farelerin parankimi yedi. AE, vibratome-kesim (70 um), beyin (A) ve omurilik (B) X-gal lekeleme EAE farelerden alınan doku kesitleri nakledilen β-gal + hücreleri, gösterilen sinjeneik NPC ile iv enjekte edilmiş ( perivasküler CNS alanlarda kalıcı klinik sonuna kadar perivasküler CNS alanlarında süregelen mavi hücreler) (106 dpi) takip. C, β-gal + iv. enjekte NPC (mavi), bir Nestin + (kahverengi) fenotip korumak. D , Kaç göç NPC sürece perivasküler alanın dışına taşımak gibi neun + (kahverengi) ifade. E, bir plasebo uygulanan EAE fare temsili bir omurilik bölümünde X-gal boyama. .. Ölçek çubukları, 20 um FG, merkezi sinir sistemi dışındaki dokularda analizi ic göstermektedir - iv. Enjekte NPC (mavi hücreleri) hemen hemen tüm organ ulaşmak ya da (. Örneğin, akciğer, karaciğer, dalak, kalp, bağırsak, böbrek) zekâhin 10 DPT (F), ancak 30 dpt (G) ile aynı organlardan silinir. Şekiller 5F-G Pluchino ark çoğaltılamaz ise 5A-E, kaynak 5 çoğaltılamaz Rakamlar. 2

Şekil 6,
.. EAE ile farelerde NPC sistemik enjeksiyonu EAE ana kritik adımlarla farelerde NPC sistemik enjeksiyon için protokol Şekil 6 şematik olarak gösterilmesi: enjekte edilebilir CAM hazırlanması tek bir hücre ifade eden ikinci NPC ayrışmış hücre kültür odası (A) , hedef olan enjekte NPC in vivo tespiti amacıyla efektör / istila hastalığı faz (B) zirvesinde EAE farelerin kuyruk damarı içine enjeksiyonCNS (C), enjekte NPC (D) terapötik plastisite mekanizmalarının çalışmasını sağlayan in vivo doku patolojik çalışmalar. D'de yeşil hücreler oligodendrosit, koyu mavi hücreler aksonlar olan, açık mavi hücreler NPC transplante edilir, turuncu hücrelerin astrosit olduğu, ve kırmızı hücreler endotelyal hücrelerdir.

<td> 2.5
Skor Lokomotor Tepkiler
0 Normal fare. Hastalığın belirtileri herhangi bir açık
1 Gevşek kuyruk: kuyruk tam gevşeklik ve bir fare alınır kuyruk ucunda kıvırma yokluğu
1.5 Arka bacak zayıflığı: Bir waddling yürüyüşünde yürürken fare sıra ve kısa süreli devinimleri gösterir
2 Limp kuyruk ve arka bacak zayıflığı: sırtında yerleştirildiğinde, fare normal konumuna açamıyorum
Kısmi arka bacak felci: fare artık kıç duruş korumak veya yürümek için arka bacaklarda kullanabilirsiniz, ancak yine de bir ölçüde bir veya her iki arka ayakların hareket edebilir, ön ayakları bundan etkilenmez
3 Komple arka bacak paralizi: arka ayaklarında hareket toplam kaybı. Farenizin yalnızca etkilenmeden kalması yönündeki ön ayakları, kendini sürükler. Bu aşamada fareler kafes katında, uzun sipper tüpler ve su kaybını önlemek için nemlendirici çözümlerin günlük deri altı enjeksiyon gıda verilir. Fareler yaralar ya da tedavi ile iyileşeceğine yok deri lezyonları ortaya çıkarsa, onlar telef olacak
3.5 Ön ayakları zayıflığı: dikey ızgara üzerinde yer, fare tırmanmak mümkün değil ve yavaş yavaş düşüyor
4 Can çekişen devlet
5 Fare insancıl uç noktaları göre ölü bulundu veya itlaf

TaTablo 1. klinik belirti ve EAE farelerde artan felç Beş sahne ölçek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Somatik kök hücre bazlı terapiler gibi MS2 11 gibi kronik iltihaplı CNS bozuklukları tedavi etmek için en ümit verici yöntemlerinden biri olarak ortaya çıkmaktadır. Terapötik etkilerini sürdürme mekanizmaları hala tam olarak aydınlatılamamıştır gerekir iken, nörodejeneratif hastalıkların farklı deneysel modellerde NPC naklinin önemli bir etkisi hücreler yakında insan çalışmalar içine uygulanabilir kök biraz kışkırtıcı inanç doğurmuştur. Ancak, bazı önemli sorunları yüz ve bu tür (multipotent vs allojenik, pluripotent vs otolog) transplantasyon için ideal bir kök hücre kaynağı tespiti ve en iyi yol olarak bazı cevaplanmamış sorular, ele almak gerekir gibi yenilikçi tedavilerin herhangi bir potansiyel insan uygulamalarını öngören önce yönetim.

Nörodejeneratif hastalıklar, örneğin bir uzamsal olarak (kapalı olmak üzere, kendi patofizyolojiler farklıdır. In omurilikJüri, inme) diğer bir mekansal zamansal yayılması (örneğin MS) ile karakterize olurken. Bu beyin hasarı birden sitelerinin varlığı aşılması gereken ek bir sorun teşkil etmektedir ikincisi, yetersiz ya da sadece olanaksız olabilirken (kök) hücrelerinin odak enjeksiyon, eski için uygun bir tedavi olabileceğini gelmektedir.

Tutarlı kanıtlar intravenöz dağıtım ortamı duygusu ve özellikle ev hasar yer (ler) doğru kök hücrelerin iç yeteneği ile desteklenen hücre uygulama için geçerli bir (ve düşük invaziv) protokolünü temsil edebilir göstermiştir. Bununla birlikte, klinik olarak NPC sistemik terapiler için sabit ya da siteleri olmayabilir periferal olmayan CNS organlardaki nakledilen hücrelerin olası birikimi (örneğin, akciğer, dalak, lenf düğümleri ve böbrekler) gibi birkaç sınırlamalar ile engellenmektedir in vivo olarak, yerel enflamatuar tepkiler. Iken bu nonspesifik accumHedef MSS dışarı enjekte NPC ulation hızla kronik EAE2 ile farelerde temizlenir, uzun süreli kalıcılık NPC (veya bazı durumlarda özel hedefleme) kanıtı ikincil lenfoid organlara (örneğin. lenf düğümleri ve dalak) düzeyinde var EAE5 19,20 nükseden ile farelerde sistemik enjeksiyonundan sonra. Nakledilen NPC önemli sayıda olmayan CNS organlara doğru sirküle olması kaçınılmaz CNS'de NPC mutlak sayısını azaltarak, bir seyreltme etkisi yaratır. İlginçtir, sistemik CNS 19,20 üzerinden münhasıran biriken bile NPC (bağışıklık düzenleyici eylemler yoluyla örneğin) terapötik etkili enjekte. Ve merkezi sinir sistemini hedef enjekte NPC genel terapötik etkisi sadece 5 veya lenf düğümleri sadece 19 karşılaştırılabilir. Bu, surroundin moleküler bileşenlerine farklı tepki hücrelerin bir iç plastisitesi, kısmen olabilirg mikroçevresinin. Özellikle, bir yandan nakledilmiş NPC enflamatuar sitokinlerin varlığı hissedebilir ve immün modülatör mekanizmaları 16 yoluyla terapötik bir etki gösterirler, diğer yandan, sonuç olarak tümör 25,26 oluşumuna yol açan düşman mikroçevrelerde ile temas halinde olabilir. Bu nedenlerle, tercih edilen seçenek, CNS enjekte NPC konsantre mevcut yer almaktadır. Bu nedenle, (a lumbar veya sisternal yoldan) intratekal halen klinik araştırmalarda uygulama en çok kabul gören muhtemel yoldur. Ancak, multifokalite ve MS lezyonlarının patolojik heterojen böyle bir yaklaşımın etkinliğini sınırlayabilir.

Burada sistemik (iv ve icv her ikisi de), kronik EAE, en stu biri tarafından etkilenmiş farelerde NPC'ler nasıl enjekte arda yetişkin SVZ'unda ve gelen fare sinir atalarıdır, izole korumak ve karakterize etmek için verimli bir protokol açıklarMS modelleri öldü. Nispeten basit ve anlaşılır, bu protokoller dikkate alınması gereken bazı kritik adımlar mevcut olsa. İlk başta, bir stabil genişletilebilir ve sağlıklı hücre hazırlık elde etmek zorunludur. Protokol boyunca tarif edildiği gibi, hücrelerin stabilitesi dolaylı büyüme oranına bakılarak tahmin edilebilir. İdeal olarak, her 4-5 neurospheres DIV ve geçişleri üzerine hücre ölüm oranı (en az% 10), çok düşük olmalıdır 150-200 um bir çapa ulaşmalıdır. Ayrıca, neurospheres mikroskop bir kompakt ve düzenli yuvarlak şeklini sunmak zorundadırlar. Lentivirüsler ile enfeksiyon hücrelerin hayatta kalma ve istikrar ile müdahale edebilir. Optimal bir enfeksiyon elde etmek için, 3 x 10 6 TU / ml elde etmek için yeterli, ilgi konusu virüs bir titrasyonunu elde etmek üzere zorunludur. Bir yandan virüs düşük miktarda enfekte olmuş hücrelerin küçük bir yüzdesi yol olur ise Gerçekten de, diğer taraftan yüksek miktarda kullanılmasıdır would muhtemelen (enfekte edilecek genin sıkı bir şekilde bağlıdır) bir toksisite etkiye yol açar. NPC entegre virüs birden çok kez enfekte olabilir, olmalıdır transgen pozitif canlı hücrelerin düşük yüzdeye ilk transdüksiyon kurşun sonucu. Bu, nontransduced vahşi tip, kararlılık ve canlılık parametreler içi deneysel karşılaştırma olması her zaman iyi bir uygulamadır NPC kontrol eder. Kronik EAE indüksiyonu için olduğu gibi, en sorunlu kısmı emülsiyonun hazırlanması ile temsil edilmektedir. Açıklandığı gibi, cam ve buz her zaman kullanımı olmalıdır. Emülsiyonun hazırlanması 30-45 dakika sürer ve bu su üzerinde ayrıştırılarak bu dağıtmak etmez sadece enjekte edilecek hazır olarak kabul edilebilir. Emülsiyonu su tüketilir ise, bu henüz hazır değil ve daha fazla karıştırma gerektirir demektir.

Hücre tatbikat zamanında iv enjeksiyon işlemi sırasında iyi bir hassasiyeti önemlidir. Birincisi, o kadar olması son derece önemlidirtoplanan hücrelerin enjeksiyonu gibi ingle hücre süspansiyonu, enjekte edilen fare damarları engellemek ve hemen ölüme yol açabilir. Damar içine iğne doğru konumlandırılmasını sağlamak için, kan şırınga birkaç mikrolitre ile aspire iyi bir uygulamadır. Doğru yer bulunana kadar şırıngaya gelen hiç kan durumunda, operatör yavaş ileri ya da geri iğneyi hareket etmelidir. Ancak bu noktada hücre süspansiyonu yavaş yavaş enjekte edilebilir. Önemli olarak, operatörü tipik haliyle, sıvı kolayca damar akış gerektiği için şırınga üzerinde herhangi bir baskı uygulamak için gerekli olmamalıdır. Uygunsuz bir enjeksiyon kaçınılmaz olarak enjeksiyon yerinde tekabül eden bir deri altı şişmesine neden olacaktır.

Bu çok yakın bir gelecekte sistemik NPCs2, 27, genetiği değiştirilmiş ya da değil, kendileri bir tedavi seçeneği yanı sıra, bağışıklık m sunmak için önemli bir araç temin edebilir enjekte fazlalaştıdirekt olarak CNS 28 içine odulatory ve / veya nöro-koruyucu ilaçlar ve ön remyelinating ajanlar. Bu nedenle, NPC sistemik verilmesine ilişkin bazı kısıtlamalar iki iv mevcut iken. ve intraserebroventriküler. yolları sonuçta hücrelerin fokal enjeksiyon tedavisinde altın standart protokolü teşkil olmayabilir hastalıklarda geçerli bir alternatif tedavi yaklaşımı temsil edebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar eleştirel yazının gözden geçirmez ve düzenleme için Jayden Smith teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Multipl Skleroz Derneği (NMSS, kısmi hibe RG-4001-A1) destek aldı, İtalyan Multipl Skleroz Derneği (AISM, 2010/R/31 hibe), İtalyan Sağlık Bakanlığı (GR08-7), Hayat, Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) ERC-2010-StG Hibe sözleşmesi altında herhangi 260511-SEM_SEM ve Avrupa Topluluğu (AT) 7. Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) için Wings Hibe Anlaşması n * C altında; 280772 - Ione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
EBSS Sigma E2888
L-Cystein Sigma Aldrich C7352
Papain Worthington 30H11965
EDTA Fisher Scientific D/0700/50
Mouse NeuroCult basal medium Stem Cell Technologies 05700
NeuroCult proliferation supplements Stem Cell Technologies 05701
Heparin Sigma H3393
Basic fibroblast growth factor Peprotech 100-18B-1000
Epidermal growth factor Peprotech AF-100-15-1000
Pen/Strep Invitrogen 1514012
Matrigel (coating solution) BD Biosciences 354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) Stem Cell Technologies 05704
Accumax eBioscience 00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg PAA Laboratories H15-011
Myco trace PAA Laboratories Q052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Immunofluorescence
Normal goat serum PAA Laboratories B11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether Sigma Aldrich T8787
Mouse anti Nestin Abcam ab11306
Rabbit anti GFAP DAKO 203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10)  Abcam ab14955
Rabbit anti MAP-2 Abcam ab32454
Rat anti MBP AbD SEROTEC MCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 Millipore MAB345
DAPI Invitrogen D1306
Mounting solution DAKO S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incomplete Sigma Aldrich F5506
Mycobacterium tuberculosis DIFCO H37Ra
MOG(35–55)  Espikem
Pertussis toxin List Biological Laboratories 181
Tissue processing
Iris scissor straight Fine Sciences Tools 14060-09
Blunt/bended forceps Fine Sciences Tools 11080-02
Brain slicer Zivic Instruments BSMAS005-1
Surgical blades Swann-Morton 324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar) Boehringer Ingelheim 01LC0030
Xylazine (Rompun) Bayer 32371
Stereotaxic frame KOPF Model 900
Hamilton syringe Hamilton 7762-04
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 158127
VECTASTAIN Elite ABC Kit Vector Laboratories PK-6100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ben-Hur, T., et al. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 41, 73-80 (2003).
  2. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, 688-694 (2003).
  3. Chu, K., Kim, M., Jeong, S. W., Kim, S. U., Yoon, B. W. Human neural stem cells can migrate, differentiate, and integrate after intravenous transplantation in adult rats with transient forebrain ischemia. Neurosci. Lett. 343, 129-133 (2003).
  4. Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14, 634-644 (2008).
  5. Pluchino, S., et al. Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism. Nature. 436, 266-271 (2005).
  6. Einstein, O., et al. Intraventricular transplantation of neural precursor cell spheres attenuates acute experimental allergic encephalomyelitis. Mol. Cell Neurosci. 24, 1074-1082 (2003).
  7. Chu, K., et al. Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus in adult rats. Brain Res. 1023, 213-221 (2004).
  8. Jeong, S. W., et al. Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage. Stroke. 34, 2258-2263 (2003).
  9. Aboody, K. S., et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12846-12851 (2000).
  10. Muller, F. J., Snyder, E. Y., Loring, J. F. Gene therapy: can neural stem cells deliver. Nat. Rev. Neurosci. 7, 75-84 (2006).
  11. Martino, G., Pluchino, S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nat. Rev. Neurosci. 7, 395-406 (2006).
  12. Deckert-Schluter, M., Schluter, D., Hof, H., Wiestler, O. D., Lassmann, H. Differential expression of ICAM-1, VCAM-1 and their ligands LFA-1, Mac-1, CD43, VLA-4, and MHC class II antigens in murine Toxoplasma encephalitis: a light microscopic and ultrastructural immunohistochemical study. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 457-468 (1994).
  13. Hemmer, B., Archelos, J. J., Hartung, H. P. New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis. Nat. Rev. Neurosci. 3, 291-301 (2002).
  14. Butcher, E. C., Picker, L. J. Lymphocyte homing and homeostasis. Science. 272, 60-66 (1996).
  15. Rampon, C., et al. Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44. Stem Cells. 26, 1673-1682 (2008).
  16. Pluchino, S., et al. Human neural stem cells ameliorate autoimmune encephalomyelitis in non-human primates. Ann. Neurol. 66, 343-354 (2009).
  17. Martino, G., Pluchino, S., Bonfanti, L., Schwartz, M. Brain regeneration in physiology and pathology: the immune signature driving therapeutic plasticity of neural stem cells. Physiol. Rev. 91, 1281-1304 (2011).
  18. Aharonowiz, M., et al. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiple sclerosis. PLoS ONE. 3, e3145 (2008).
  19. Pluchino, S., et al. Immune regulatory neural stem/precursor cells protect from central nervous system autoimmunity by restraining dendritic cell function. PLoS One. 4, (2009).
  20. Einstein, O., et al. Neural precursors attenuate autoimmune encephalomyelitis by peripheral immunosuppression. Ann. Neurol. 61, 209-218 (2007).
  21. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J. Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
  22. Furlan, R., Pluchino, S., Marconi, P. C., Martino, G. Cytokine gene delivery into the central nervous system using intrathecally injected nonreplicative viral vectors. Methods Mol. Biol. 215, 279-289 (2003).
  23. Constantin, G. Visualization and analysis of adhesive events in brain microvessels by using intravital microscopy. Methods Mol. Biol. 239, 189-198 (2004).
  24. Politi, L. S., et al. Magnetic-resonance-based tracking and quantification of intravenously injected neural stem cell accumulation in the brains of mice with experimental multiple sclerosis. Stem Cells. 25, 2583-2592 (2007).
  25. Melzi, R., et al. Co-graft of allogeneic immune regulatory neural stem cells (NPC) and pancreatic islets mediates tolerance, while inducing NPC-derived tumors in mice. PLoS One. 5, (2010).
  26. Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, (2009).
  27. Ben-Hur, T., et al. Effects of proinflammatory cytokines on the growth, fate, and motility of multipotential neural precursor cells. Mol. Cell Neurosci. 24, 623-631 (2003).
  28. Giusto, E., Donega, M., Cossetti, C., Pluchino, S. Neuro-immune interactions of neural stem cell transplants: From animal disease models to human trials. Exp. Neurol. , (2013).

Tags

Immunology Sayı 86 Somatic nöral kök / öncü hücreler nörodejeneratif hastalıklar rejeneratif ilaç çoklu skleroz deneysel otoimmün ensefalomiyelit sistemik doğum damar içine intraserebroventriküler
Kronik EAE ile Fare nöral kök / progenitör hücrelerinin sistemik enjeksiyonundan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donegà, M., Giusto, E.,… More

Donegà, M., Giusto, E., Cossetti, C., Schaeffer, J., Pluchino, S. Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE. J. Vis. Exp. (86), e51154, doi:10.3791/51154 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter