Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Systemisk Injeksjon av Neural Stem / stamceller i Mus med kronisk EAE

doi: 10.3791/51154 Published: April 15, 2014

Summary

Transplantasjon av neural stilk / stamceller (NPC) har store løfter i regenerativ nevrologi. Den systemiske leveringen av NPC har slått til effektiv, lav invasiv, og terapeutisk meget effektiv protokoll for å levere stamceller i hjernen og ryggmargen hos gnagere og ikke-humane primater som påvirkes av eksperimentell kronisk inflammatorisk skade i sentralnervesystemet.

Abstract

Nevrale stilk / forløper celler (NPC) er en lovende stamcellekilde for transplantasjon tilnærminger som tar sikte på hjernen reparasjon eller restaurering i regenerativ nevrologi. Dette direktivet har oppstått fra den omfattende bevis for at hjernen reparasjon oppnås etter fokal eller systemisk NPC transplantasjon i flere prekliniske modeller av nevrologiske sykdommer.

Disse eksperimentelle data har identifisert cellen levering rute som en av de viktigste hindringene for restorative stilk cellen terapi for hjernesykdommer som krever øyeblikkelig vurdering. Intraparenchymal stamcelle pode representerer en logisk tilnærming til disse patologier kjennetegnet ved isolerte og tilgjengelige hjerneskader slik som ryggmargsskader og Parkinsons sykdom. Dessverre er dette prinsippet som gjelder dårlig på tilstander som kjennetegnes ved en multifokal, inflammatoriske og disseminert (både i tid og rom) natur, inklusive multippel sklerose (MS). Som sådan, hjerne målretting av systemic NPC arrangementet har blitt en lav invasiv og terapeutisk effektiv protokoll for å levere celler til hjernen og ryggmargen hos gnagere og ikke-humane primater som påvirkes av eksperimentell kronisk inflammatorisk skade i sentralnervesystemet (CNS).

Denne alternative fremgangsmåte for celle levering er avhengig av NPC pathotropism, spesielt deres iboende evne til å (i) avføle miljøet via funksjonelle celle adhesjons-molekyler og inflammatorisk cytokin-og chemokine reseptorer; (Ii) krysse lekker anatomiske (iv.) Barrierer etter intravenøs eller intracerebroventrikulær (ICV) injeksjon; (Iii) samle seg på nivå med multiple perivaskulær område (r) av inflammatoriske hjerne-og ryggmargsskade; og (iv) utøver bemerkelsesverdige vev trofiske og immun regulatoriske effekter på forskjellige verts målceller in vivo.

Her beskriver vi de metodene som vi har utviklet for iv. og <em> ICV levering av syngene NPCer i mus med eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE), som modell for kronisk betennelse i sentralnervesystemet demyelinisering, og ser for oss den systemiske stamcelle levering som en verdifull teknikk for selektiv målretting av den betente hjernen i regenerativ nevrologi.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sterke bevis har oppstått fra in vivo studier som attesterer den terapeutiske effekten av transplantasjon av somatiske nevrale stilk / forløper celler (NPC) i dyremodeller av forstyrrelser i sentralnervesystemet 1-8. Likevel, en rekke spørsmål knyttet til levering av stamceller i verten krever nøye vurdering før disse eksperimentelle resultatene kan omsettes til kliniske applikasjoner. En spesielt betydelig hinder mot utvikling av (nonhematopoietic) Restorative stamcelle terapi for multifokale, kroniske inflammatoriske hjernesykdommer er identifikasjonen av den ideelle rute for NPC injeksjon. En god forståelse av patofysiologien ved den målrettede sykdom (fokal eller multifokal, primær inflammatorisk eller primær degenerativ), og en forsiktig analyse av gjennomførbarhet og risiko problemer forbundet med leveringsteknikker er å identifisere en optimal protokoll for stamcelle levering.

Mens det sentrale ( (for eksempel Parkinsons og Huntingtons sykdom, hjerne og ryggmarg traumatiske skader, og hjerneslag), kan den samme metode påvise å være praktisk talt ikke er gjennomførbar under forhold slik som MS, hvor en multifokal, kronisk, og rommessig disseminert CNS skade akkumuleres over tid. I dette siste tilfellet, er rettet mot brenn celle injeksjoner til individuelle lesjoner også hindret av den begrensede kapasiteten av transplanterte NPCer å migrere over lange avstander innen CNS parenchyma, og dermed spørre identifisering av alternative, mer egnede metoder for CNS målretting med mindre invasive NPC transplantasjoner .

Store løftet kom fra observasjoner som NPCer er rettet mot en intrakranial svulst (f.eks. Glioma) i mus når injiseres intravaskulært utenfor CNS9. Etter dette seminalin vivo bevis for stamcelle pathotrophism 10, har omfattende data blitt samlet knyttet til gjennomførbarhet og terapeutisk effekt av systemisk transplantasjon av NPCer i forsøksdyr med eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE), som en modell av inflammatorisk CNS skade, enten via intravenøs (iv) eller intracerebroventrikulær (ICVen.) NPC injeksjon 1,2,5,6,8 .. Vi har først vist at dette er avhengig av evnen til transplanterte NPCer å målrette og gå inn i betent CNS, og til senere å engasjere flere inter kommunikasjonsprogrammer innenfor bestemte microenvironments i vivo 11. For å spesifikt målrette CNS er NPC leveres direkte inn i cerebrospinalvæsken (CSF) sirkulasjon av ICV injeksjon, eller inn i blodstrømmen via intravenøs injeksjon. Når inn enten i blodbanen eller CSF, transplanterte NPCer samhandle aktivt medblod-hjerne (BBB) ​​eller blod cerebrospinalvæsken (BCSFB) barrierer og gå inn i CNS parenchyma. Dette samspillet mellom NPC pode og BBB (eller BCSFB) er regulert av bestemte sett av NPC overflate celleadhesjonsmolekyler (cams) og tilrettelagt av uttrykket av høye nivåer av CAM counter-ligander på aktiverte endothelial / ependymal celler 12-14. Eksempler på disse omfatter CAM reseptoren for hyaluronate, CD44, og det intercellulære adhesjonsmolekyl (ICAM) -1 ligand svært sent antigen (VLA) -4 5,15,16 (som i leukocytter, er ansvarlig for interaksjon med aktivert ependymal og endotelceller), og til en mye lavere grad lymfocytt-funksjon-assosiert antigen (LFA) -1-og P-selektin glykoprotein ligand (PSGL) -1. NPC også uttrykke et bredt spekter av chemokine reseptorer, inkludert CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3, CXCR4 og (men ikke uttrykker CCR3 og CCR7), som er funksjonelt aktive, både in vitro og in vivo 5,16. Dermed systemically injisert NPC bruke disse CAM, sammen med G-protein koblet reseptor (GPCR), til å hope seg opp på nivået av den betente CNS. Motsatt, NPCer injisert systemisk til sunn mus ikke inn i CNS via vaskulær eller cerebrospinalvæsken plass ruter to. CNS inflammasjon eller endotelisk / ependymal celleaktivering etter systemisk cytokin eller lypopolisaccharide (LPS) injeksjon som en modell av kjemisk indusert encefalitt, er derfor nødvendig for akkumulering av systemisk injiserte NPC inn i hjernen og ryggmargen 2.. Således er vellykket målretting av CNS med systemisk terapi NPC avhengig av identifiseringen av en sykdom bestemt vindu av muligheter (WoO) som hjernen og ryggmargen miljø er bidrar til akkumulering og transendothelial migrering av NPC. Slike tilstander vanligvis oppstår i forbindelse med akutt og subakutt inflammasjon 17.. Når ha kommet inn i CNS, transplantert udifferensierte NPCerhar vist seg å lindre de klinisk-patologiske trekk ved mus så vel som større og ikke-menneskelige primater med EAE. Dette har blitt beskrevet til å være avhengig av minimal celle utskifting 2 og bemerkelsesverdig sekresjon av immunregulerings og neurobeskyttende parakrine faktorer innenfor perivaskulær CNS 2,5,6,18 vs ikke-CNS-betente områder 19,20 (f.eks lymfeknuter) som reaksjon på inflammatorisk celle signal fremkalte ved å infiltrere immunceller fem.

Heri vi beskrive de viktigste metodiske aspekter ved systemisk injeksjon av somatiske NPCer i en musemodell for kronisk EAE. Mer spesifikt, vi definerer protokoller som vi har etablert for å (i) utlede, utvide og forberede for transplantasjon somatiske NPCer fra subventricular sone (SVZ) av voksne C57BL / 6 mus; (Ii) å indusere kronisk EAE hos slike mus, og (iii) utføre terapeutisk effektiv systemisk (intravenøs eller ICV) NPC transplantasjon into EAE mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle prosedyrer som involverer dyr er utført i henhold til prinsippene i forsøksdyr omsorg som er godkjent av det britiske innenriksdepartementet under dyr (vitenskapelige prosedyrer) handle 1986 (PPL nr. 80/2457 til SP).

En. Utledning av Somatic Neural Stem / stamceller (NPC) fra subventricular Zone (SVZ) av hjernen til voksne mus

  1. Utarbeidelse av disseksjon instrumenter og media
    NB: Disse to løsningene må være forberedt på 1-2 timer før disseksjoner instrumenter er klare og forvarmet ved 37 º C i minst 20-30 min før bruk (det hjelper å fortynne papain og optimaliserer enzymaktivitet).
    1. Autoklav en rett skarp saks, en liten kirurgisk saks og to små buede taggete tang.
    2. 'Fordøyelse' løsning: Forbered to separate 50 ml rør med:
      Løsning nr. 1: 25 ml Earles Balanced Salt Solution (EBSS) + 10 mg etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) + 10 mg L-cystein;og
      Løsning # 2: 25 ml EBSS + 50 mg papain.
    3. Forbered Fullstendig Growth Medium "(CGM): komplett musebasalmedium med mus sprednings kosttilskudd, heparin 0,002%, basic fibroblast vekstfaktor (bFGF, 10 ng / ml), epidermal vekstfaktor (EGF, 20 ng / ml), og antibiotika (Pen / Strep).
  2. Brain disseksjon
    NB: fjerning av temporale ben lett kan skade vev på grunn av sin skarphet. For å unngå dette, må du feste bein med pinsett og dra ut til hele benet har blitt fjernet.
    1. For hver utarbeidelse av NPCer, cull ved halshugging n = 5-7, 4-8 uker gamle C57BL / 6 mus.
    2. Rens med 70% etanol (i vann) håret på hentet mus og kuttet bak ørene med den rette skarp saks for å fjerne hodet;
    3. Lag en midtlinjen snitt ved hjelp av en liten kirurgisk saks til å kutte huden over skallen. Ved hjelp av pinsett, brette opp de to flekker av hud til expose skallen.
    4. Med lite kirurgisk saks utføre to små kutt på undersiden av skallen og fjern bein under pons / medulla (ventral skallen). Fortsett ved å trekke ut de timelige bein. Med samme sakse utføre et kutt langs hele hodeskallen, som starter fra basen til pærene, uten å skade overflaten av hjernen. Dessuten utfører et kutt mellom de fremre ben og øynene, for å lette fjerningen av de parietalbena. Med to tang begynne å fjerne skallen ved å trekke hver av de parietalbena mot utsiden. Mens du drar, ta hensyn til hjernehinnene, som kan skade hjernen når bein blir fjernet.
    5. Når skallen har blitt fjernet, skyver pinsett mellom hjernen og hodeskallen til helt løsrive hjernehinnene igjen. Løft forsiktig opp hjernen fra skallen. Kutt de optiske nerver å frigjøre hjernen og til slutt samle hjernen hos et rør med kaldt fosfatbufret saltvann (PBS).
    6. Hold røret på is end Gjenta samme prosedyre for alle musene.
  3. Disseksjon av SVZ, neurosphere dannelse og vedlikehold analyser
    Gjennomsnittlig antall celler x fortynningsfaktor x 10 4

    Der 10 4 representerer omdannelsen av det totale volumet av den hematocytometer kammeret (totalt volum = 0,1 mm 3 -> 10-4 cm 3 -> 10-4 ml). Når du vurderer fortynningsfaktoren, både den ene ferdig med CGM og med den vitale flekken må tas i betraktning. Som et eksempel, dersom 160 celler har blitt talt i de fire hjørne rutene, vil det endelige densitet (celler / ml) av cellesuspensjonen være:

    160/4 x 5 (fortynning med CGM) x 2 (fortynning med vital flekken) x 10 4
    1. Slå på en disseksjon hette utstyrt med en dissekere mikroskop.
    2. Rens alle overflater med 70% etanol (i vann), og spray med en anti Mycoplasma løsning for å redusere risikoen for forurensning.
    3. Coveri bunnen av en begerglass med sterilt gasbind (for å bevare skjerpet instrumenter), og fylle det med 70% etanol (i vann). Sug i begerglasset to par tenger, ett par av mikro saks og et kirurgisk blad.
    4. Plasser hele hjernen på hjernen-slicer matrise.
    5. Ved hjelp av to barberblad utføre en coronal seksjonering 2 mm fra fremre pol av hjernen, med unntak av de optiske traktater, og 3 mm posterior til forrige kutt; og plassere vevet på en ren petriskål.
    6. Under dissekere mikroskop isolere SVZ vev og skjær i 1 mm 3 stykker som bruker iridectomy saks. Gjenta for alle hjerner.
      1. Bland godt de to løsninger (pkt. 1.1.2) over og filtrere gjennom en 0,22 mikrometer filter umiddelbart etter hjernen er dissekert og SVZs er klar til å bli fordøyd.
    7. Overfør seksjonene inn i 30 ml av "Digestion"-løsning, resuspen-deres forsiktig med a10 ml pipette og inkuberes i 30 min ved 37 ° C i 5% CO 2. Hvert 15. min rist forsiktig på røret 2-3x.
    8. Sentrifuger ved 300 xg i 10 min.
    9. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 200 pl CGM ved pipettering først med en P1000 og deretter med et P200 pipette (10-20x hver), til å oppnå en enkel cellesuspensjon.
    10. Ta suspensjonen opp til 5 ml med CGM og overføre til en T25 cm2 kolbe.
    11. Etter 5-7 dager i vitro (div) neurospheres vil danne. Samle opp suspensjonen i et 15 ml rør og sentrifuger i 10 min ved 150 x g.
    12. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 200 pl av CGM.
      Distansere de neurospheres mekanisk ved passering av celler 100-150x med en P200 pipette, inntil skaffe en enkelt celle suspensjon og ta det opp til en ml med CGM.
    13. Fortynn cellesuspensjonen, for eksempel 10 pl cellesuspensjon i 40 mL av CGM å oppnå en 1:05 fortynning, og bland godt. Bland 10 ul av den fortynnete cellesuspensjon til 10 pl av en vital flekken og bland godt.
    14. Fyll et hemocytometer telling kammer med 10 pl av en 1:01 cellesuspensjon: vital flekk løsning. Separat telle antall levende (hvite) og døde (blå) celler i de fire hjørne firkanter. For å bestemme antall celler / ml, gjelder følgende regnestykke:
    15. Suspender 2 x 10 5 celler i 5 ml av CGM og overføring til et T25 cm 2 kolbe;
    16. Gjenta pkt. 1.3.11-1.3.12 hver 4-5 DIV. Fra den andre passering av ekspansjon fremover, vurdere cellular levedyktighet av vital flekken utstøting og begynne å bygge opp en kontinuerlig vekstkurve ved plating NPCs på klonal tetthet (8000 cells/cm2), som beskrevet 21. Hold celle tall og gjenta prosedyren hver 4-5 DIV. For å generere en kontinuerlig vekstkurve, gjør som følger:
      NB: Hvis du vil ha en god celle forberedelse, etter 4-5 DIV kuler bør ha nådd en diameter på 150-200 mikrometer. Å ha et godt estimat på tHan celletetthet, er det viktig å finne en optimal fortynningsfaktor for å få godt fordelt, ikke-overlappende celler i hele hematocytometer. Ideelt sett bør det være mellom 50-200 totale celler. Når telle, bare cellene som omfattes på torget uten å berøre grensene må vurderes. Dessuten er levedyktigheten til cellene en avgjørende faktor for å få en frisk preparat. Viktigere, bør det være større på 90%. En lineær vekst kurve er en annen indikator på en sunn celleforberedelsen.
      1. Tell antall levende og døde celler (f.eks 1,3 x 10 6).
      2. Definer veksten dividere antallet levende celler med antall belagte celler (for eksempel 1,3 x 10 6/2 x 10 5 = 6,5).
      3. Beregn det totale antall celler ved å multiplisere vekstraten for det totale antall celler tilstede på den tidligere tidspunkt (ved begynnelsen = 2 x 10 5).
      4. Rapporter middelverdien7; Standardavviket for å bygge en lineær trendlinje.
    17. Start fra passasjen 6 er mekanisk dissosiasjon erstattet av enzymatisk dissosiasjon. Etter sentrifugering ved 150 xg i 10 minutter, fjern supernatanten, resuspender pelleten i 200 pl av celleaggregat dissosiasjon løsning, resuspender 7-8x med et P200 og inkuber i 10 min ved 37 ° C, 5% CO2.
    18. Susp 7-8x med en P200 for å få en enkelt celle suspensjon og legge 800 mL av CGM. Telle celler (både levende og døde) og etablere sin levedyktighet. Resuspender 2 x 10 5 celler i 5 ml av CGM og overføring til en T25 cm2 kolbe.
  4. Viral transduksjon av NPCer for in vivo celle sporing
    NB: For å kontrollere effektiviteten av viral transduksjon, bygge en parallell vekst kurve med omformet og nontransduced NPCer. I tillegg er den klonale effektivitet, er at det absolutte antall neurosphere dannende celler tilstede i en celle forberesjon eller en cellesyklus-analyse av DNA-innhold (med propidium jodid, PI), kan anvendes som ytterligere indikasjoner på celletilstand. Dersom prosentandelen av infiserte celler ikke bør være god, kan protokollen for viral transduksjon bli gjentatt en andre gang med den samme populasjon av celler. Når nivået av infeksjon er tilfredsstillende og vekstkurve er lik den som oppnås med villtype-celler, kan transduserte NPC utvides og / eller transplantert.
    1. Høste neurospheres og få en enkelt celle suspensjon. Plate cellene med høy tetthet (1,5 x 10 6 celler i en T75 cm2 kolbe) i 10 ml CGM.
    2. Etter 12 timers legger 3 x 10 6 TU / ml av en tredje generasjon lentiviral vektor pRRLsin. PPT-HCMV konstruert med E. coli-avledet β-galaktosidase (lacZ) eller med grønt fluorescerende protein (GFP).
    3. 48 timer senere høste cellene, sentrifuger ved 300 xg i 10 min, og replate cellene i forholdet 1:1.
    4. Etter3 passasjer in vitro bekrefter effektiviteten av infeksjonen. Strømningscytometri er vanlig brukt for å teste effektiviteten infeksjon, og tilfredsstillende nivå av infeksjon er vanlig akseptert til å være i området fra 75 til 95% av positive celler. Kontroller igjen effektiviteten av infeksjonen etter 3 ytterligere passasjer av ekspansjon for å verifisere at vedlikehold av markør uttrykk.
  5. Neurosphere frysing
    1. Høste neurospheres fra en T25 cm 2 kolbe, sentrifuger ved 300 xg i 10 min, og kast supernatanten.
    2. Resuspender pellet med 1 ml iskaldt medium (CGM med 10% dimetylsulfoksid (DMSO).
    3. Plasser cryovials ved -80 ° C i en frysebeholder.
    4. Etter minst 24 timers flytte cellene til en cryobox og oppbevar ved -80 ° C i flere måneder, eller bringe til flytende nitrogen (N 2) for lengre lagring.
  6. Neurosphere tining
    NB: For å unngå de toksiske effektene av langvarig kontakt of NPCer med DMSO, må tineprosessen være så rask som mulig.
    1. Fjern cryovial fra -80 ° C / N 2 og holde det på tørris.
    2. Raskt tine hetteglasset på et vannbad, inntil nesten hele cellesuspensjonen blir tint, og bare en liten del av suspensjonen avkjølt igjen.
    3. Resuspender cellesuspensjon med 5 ml av forvarmet frisk CGM.
    4. Sentrifuger ved 300 xg i 10 min.
    5. Fjern supernatanten, resuspender forsiktig med 5 ml frisk CGM og plate cellesuspensjonen i et rent, ubehandlet T25 cm2 kolbe.
  7. 1.7) NPC karakterisering
    NB: Den siste vask PBS kan erstattes med 0,05% natriumazid-PBS for å hindre soppvekst, eller forurensninger, og coverslides blir lagret ved 4 ° C i 2-3 uker.

    NB: For å flekke for intracellulære markører legge en permeabilizing middel til PBS i blokkering løsningen. Hvis kilden til det primære antistoff er geit, bovint serum albumin (BSA) eller serum av andre deler enn geit bør brukes.

    NB: For å flekke for intracellulære markører bruke en permeabilizing agent i den primære antistoff løsning.
    1. Plasser en 13 mm glass coverslide på bunnen av en 24 brønns plate. Legg 150 mL av belegg løsning på toppen av hver coverslide å skape en liten dråpe. Inkuber i minst 30 minutter ved 37 ° C, 5% CO 2.
    2. Høste neurospheres og dissosierer for å oppnå en enkel cellesuspensjon.
    3. Telle levende celler og fortynne å skaffe 80.000 cells/35 mL. Fjern overskudd av beleggsløsningen fra coverslide ved forsiktig aspirasjon, og plate av 35 ul av cellesuspensjonen.
    4. Inkuber 25 min ved 37 ° C, 5% CO2. Raskt sjekke på kontrasten fase mikroskop hvis cellene har begynt å følge.
    5. Forbered differensiering medium ved å blande basal mus medium med de riktige kosttilskudd (se tabell 1) og antibiotika (PEn / Strep).
    6. Legg 400 mL av differensiering medium og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2.
    7. Etter 3 DIV, endring halvparten av mediet med friskt medium differensiering.
    8. Etter seks DIV, fjerne medium og vaske en gang med PBS. Under en kjemisk hette fjerne PBS og tilsett 300 mL av forvarmet 4% Paraformaldehyde (PFA) 4% sukrose. Inkuber i 5 min ved romtemperatur (RT). Fjern PFA og vaske 3x med PBS.
    9. For å fortsette med immunocytokjemi, fjerner PBS og blokker med PBS 10% normalt geiteserum (NGS) (blokkering løsning), og inkuberes i 1 time ved RT.
    10. Fjern blokkering løsningen og legge til ønsket primære antistoffet fortynnes med PBS 1% NGS. Inkuber ved 4 ° CO / N eller, alternativt, i 120 minutter ved RT.
    11. Etter inkuberingen vaskes 2x med PBS. Inkuber med det passende sekundært antistoff fortynnet med PBS-1% NGS. Inkuber 60 min ved RT.
    12. Vask 2x med PBS og kontra flekken kjerner med 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) fortynnet 1:20,000 med PBS permeabilizing middel i 3 min ved romtemperatur i mørke. Vask to ganger med PBS og en gang med destillert vann.
    13. Ta en dråpe monteringsmedium på en glassfiberduk lysbilde og med tang montere coverslide med cellene som vender mot monteringsmedium. Trykk forsiktig coverslide å presse ut overflødig av monteringsmedium. La coverslide i mørke ved RT til monteringsmediet tørkes og lagres ved 4 ° C.

2. Myelin oligodendrocyte Glycoprotein (MOG)-indusert Experimental autoimmunitet i C57Bl / 6 Mus

  1. Utarbeidelse av emulsjon
    1. På et begerglass fremstille en emulsjon som består av ufullstendig Freunds adjuvant inneholdende 4 mg / ml Mycobacterium tuberculosis [annet er definert som Freunds fullstendige adjuvans (CFA)] og 200 ug av MOG (peptid 35-55), med tanke på at den totale mengde emulsjon per mus vil være 300 mL.
      NB: hensiktste kontroller av MOG-immunisert mus i CFA er mus immunisert med bare CFA. Den forventede variansen av sykdomsutbruddet i MOG-immunisert mus er 11,3 (± 1,8) dpi.

      NB: Ved beregning av det totale volum av emulsjonen er nødvendig, bør dobbelt så mye volumet som antall mus for å immunisere. Glass bør være foretrukket å plasticware for å minimalisere avfall av en del av emulsjonen.
      1. Med en glassprøyte som holder en 19 G nål blanding i omtrent 30 min, alltid holde emulsjonen på is.
      2. For å kontrollere om emulsjonen er klar, slippe en liten mengde emulsjon på vann. Emulsjonen er klar til å bli injisert bare hvis fallet forblir som den er, og ikke forsvinner.
      3. Immuniserings kontrollgruppen av mus med bare CFA. Unn eksperimentell mus (MOG vaksinert) med MOG i CFA. Den forventede variansen av sykdomsutbruddet i MOG vaksinert mus er 11,3 (± 1,8) dpi.
    2. Overfør 19 G nål til en 1 ml plastsprøyte ennd aspirer emulsjon. Unngå bobler, bytt nålen med en 25 G og la sprøyten på is. Sprøyter fylt med emulsjonen, er klar til å bli brukt og bør holdes på is i et par timer.
  2. Immunisering
    1. Plasser-mus (6-8 uker gamle, hunn) inn i en varmeboks, og vente på ca 10 min for å la halevenen til å utvide seg.
    2. Overfør en mus fra oppvarmingen boksen til en mus rainer. Lukk rainer å unngå enhver bevegelse av musen.
    3. Fyll en 1 ml insulinsprøyte med 100 mL av pertussis toksin (5 ug / ml) unngå å lage bobler. Sakte injisere oppløsningen i halevenen. Fjern nålen og trykk i noen sekunder med et stykke papir for å plugge blødningen.
    4. Plasser musen tilbake i buret og gjenta samme prosedyre for alle musene.
    5. Anesthetize en mus med kontinuerlig isofluran inhalasjon (1-2%, 2 l / min) og injisere 100 ul av emulsjonen subkutant på nivåetav de to flankene og bunnen av halen (300 mL emulsjon / mus). Sakte fjerne sprøyten, unngå lekkasje av emulsjonen.
    6. Marker musen med et øre puncher, plasserer musene i buret og sjekke før full gjenoppretting. Gjenta for alle musene.
    7. Etter 48 timer (2 dager etter vaksinering, dpi) gjenta pkt. 2.2.3.
  3. Atferdsanalyse av EAE mus
    1. Starter fra 5 dpi, veie mus daglig, og overvåke deres bevegelses forestillinger ved hjelp av skalaen scoring system er beskrevet i Tabell 1.

Tre. Injeksjon av Neural Stem / stamceller inn i Tail Vein (iv)

  1. Cell forberedelse
    1. Slakte neurospheres ved sentrifugering ved 300 xg i 10 min.
    2. Fjern supernatanten og tilsett 200 ul av celleaggregat dissosiasjon løsning. Inkuber 10 min ved 37 ° C, 5% CO 2.
    3. Forsiktig resuspender 10-12x (avoiding bobler) med en P200 til å skaffe en enkelt celle suspensjon og ta til 800 mL med basal medium uten Ca 2 + og Mg 2 +.
    4. Tell cellene med en vital flekken for å bestemme cellenes levedyktighet og for å fortynne suspensjonen med basalmedium uten Ca 2 + og Mg 2 + for å oppnå en endelig tetthet på 10 6. cells/150 pl. Hold cellesuspensjonen på is inntil bruk.
  2. NPC iv injeksjon
    NB: Det ideelle dissosiasjon inn enkelt celle suspensjon og fravær av luftbobler er to viktige aspekter å vurdere å redusere risikoen for enten klumper / råvarer vs emboli dannelse som kan resultere i veneokklusjon og påfølgende død.
    1. På toppen av sykdommen (16-18 ppt), veie og score musene. Fordel mus i henhold til stillingen for å få homogene grupper.
    2. Plasser musene i en oppvarmingsboks og vente på ca 10 min for å la halevenen til å utvide seg. Overfør en mus fra oppvarmingen boksen til en mus rainer. Lukk rainer å unngå enhver bevegelse av musen.
    3. Fyll en 1 ml insulinsprøyte med 150 mL av cellesuspensjon og sørge for å fjerne alle boblene. Sakte injisere oppløsning inn i halevenen. Fjern nålen og trykk i noen sekunder med et stykke papir for å plugge blødning (Fig. 6A og 6B).
    4. Plasser musen i buret og sjekk til bedring. Gjenta fremgangsmåten for alle mus.

4. Injeksjon av Neural Stem / stamceller inn i Cisterna Magna (ICV)

  1. Cell forberedelse
    1. Slakte NPCer ved sentrifugering ved 300 xg i 10 min.
    2. Fjern supernatanten og tilsett 200 ul av celleaggregat dissosiasjon løsning. Inkuber 10 min ved 37 ° C, 5% CO 2.
    3. Forsiktig resuspender 10-12x med en P200 til å skaffe en enkelt cell suspensjon og ta til 800 mL med basal medium uten Ca 2 + og Mg 2 +.
    4. Tell cellene og for å fortynne suspensjonen med basalmedium uten Ca 2 + og Mg 2 + for å oppnå den ønskede celletetthet. Hold cellesuspensjonen på is inntil bruk.
  2. 4.2) NPC ICV injeksjon
    1. På toppen av sykdommen (16-18 ppt), veie og score musene. Fordel mus i henhold til stillingen for å få homogene grupper.
    2. Plasser musen på en stereotaxic apparat under kontinuerlig isofluran innånding (1-2%, 2 L / min). Fest hodet av musen med øret barer. Deretter justerer både munn og nese stykker. Pass på at hodet av musen er flat og fast.
    3. Vattpinne hodet av musen med povidonjodid (PVP-I) og lage et snitt til å kutte huden i bakre del av hodet for å avsløre skallen.
    4. Ved hjelp av en mikromanipulator, sette spissen på en mikrolITER sprøyte inn i kløften mellom bakhodet og atlas vertebra gjennom intakte muskler og leddbånd i midtlinjen på baksiden av halsen. Den bøyde del av nålen er holdt i nær kontakt med den innvendige overflaten av bakhodet for hele lengde, slik det er beskrevet 22.
    5. Settes nålen og vente noen sek. Operatøren er ment for å lære å gjenkjenne følelsen av nålen blir "hektet" til musen skallen, før start injisere cellen preparatet. Sakte injisere volumet av cellene (innen 3-5 min). La nålen på plass for ytterligere noen få sekunder etter injeksjonen og fjerne langsomt sprøyten.
    6. Stitch opp huden og plassere musen i en recovery kassen til full gjenoppretting.

5. Tissue Processing

  1. Dypt anaesthetize mus med en blanding av 0,5 ml ketamin (100 mg / ml), 0,25 ml xylazin (23,32 mg / ml) og 4,25 ml sterilt vann og transcardically perfuse, wforaskningen med saltvann-EDTA og feste med 4% PFA. Fjern begge de vertebrale kolonner og hjerner og postfiks i 4% PFA i 12 timer ved 4 ° C. Vask vevet i PBS, fjerner ryggmargen fra bein og la vevet i minst 48 timer i 30% sukrose (i PBS) ved 4 ° C. Legge vev i en optimal skjære temperatur (OCT) forbindelse og feste frysing med flytende nitrogen, slik det er beskrevet to.
  2. Bruk en Mikrotomen å kutte vevet i 10-12 mikrometer tykke skiver.
  3. Alternativt legge friskt vev i agarose og skjære vev ved hjelp av en vibratome 50-80 mikrometer tykke skiver.
  4. I begge tilfellene, inkuber O / N ved 37 ° C i 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-gal)-løsning for å detektere kjerne β-galaktosidase-aktivitet.
  5. Recut seksjoner som inneholder β-gal + celler i fem mikrometer skiver og dobbel flekken ved hjelp antiglial fibrillary surt protein (GFAP) for astrocytter (50 mikrogram / ml), antineuronal atom antigen (Neun) for nevroner (1 &# 956, g / ml) og antiNestin for udifferensierte nevrale celler (10 ug / ml).
  6. Fortsett som beskrevet i pkt. 1.7.11 og 1.7.12. For flere stainings sørg for å bruke sekundære antistoffer konjugert med forskjellige fluorophores.
  7. For vev som inneholder GFP merkede celler frem som beskrevet i trinn 05.01 til 05.03 og fortsette med flere stainings.
  8. Legg noen dråper monteringsmedium til lysbildene og dekk med en vev dekkglass.
  9. For seksjonene farget med biotin-konjugerte antistoffer forberede en oppløsning av avidin biotin kompleks (ABC-løsning, se tabell 2) og la i omrøring i 45 min.
  10. Inkuber skiver 5 minutter med 1% H 2 O 2 for å blokkere aktiviteten til endogen peroksidase.
  11. Vask to ganger med PBS.
  12. Inkuber med ABC-løsning i 1 time ved RT.
  13. Vask to ganger med PBS.
  14. Inkuber med 3,3 '-diaminobenzidin-løsning og 0,3% H 2 O 2. Overvåk reaksjonen unDer et mikroskop og vask med PBS så snart skiven begynner å bli brunt (vanligvis rundt 5 til 10 min.)
  15. Vask to ganger med PBS og fortsetter som beskrevet i trinn 5.7.

Omfattende liste av materialer og reagenser er vist i tabell 2..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NPC derivasjon og karakterisering
SVZ disseksjoner er utført på bassenger (n = 5-7 mus / basseng) på 6-8 ukers gamle C57Bl / 6 mus ved hjelp av mekanisk og enzymatisk dissosiasjon (figur 1A). Etter noen dager med dyrking i CGM, frittflytende neurospheres begynne å danne (figur 1A og 1B). Primære sfærer er samlet og mekanisk passaged hver 4-5 DIV. Ved aging, er antall levende og døde celler konstatert og kumulative celle tall plottet å generere en vekstkurve (figur 1C). Dette gir en indikasjon på forplantningshastighet, og dermed gi en indirekte parameter for å vurdere den globale stabiliteten av NPC preparatet. Når voksende som neurospheres, NPCer uttrykke markører av mitotisk aktivitet (fosfor-histone H3, PHH3, 5 mg / ml) og av udifferensierte nevrale celler (f.eks Nestin) (Figur 2A). Udifferensierte NPCer som er å være terapeutisk efficacious i EAE etter transplantasjon må uttrykke celleoverflate-adhesjons-molekyler som omfatter CD44 (5 ug / ml), den α4 subenheten av VLA-4 (10 ug / ml) (fig. 2F). Når belagt under egnede betingelser differensiering, NPC uttrykke markører som er typiske for de tre nevrale slektsnavn, (figur 2B), slik som astroglial markør GFAP (figur 2C), neuronal markør microtubuli assosiert protein-2 (MAP-2, 5 ug / ml ) (fig. 2D) og den oligodendroglial markører O4 (5 ug / ml) og myelin basisk protein (MBP, 10 ug / ml) (figur 2E), noe som bekrefter at NPC er multipotent mot de tre hoved nevrale linjene. For å lette identifiseringen av transplanterte celler in vivo, er NPCer transduced med lentiviruses konstruert til stabilt ekspress reporter gener som GFP. Transduserte NPCer uttrykker GFP både som formerer neurospheres (Tall 3A og 3C), så vel som når det differensierende in vitro ved vekstfaktor uttak (figur 3B). For å verifisere effektiviteten av transduksjon, er ekspresjon av GFP analysert ved flowcytometri, som starter så tidlig som tre passeringer etter celleoverføring (som er å tillate nok tid til å ha sterk ekspresjon av transgenet introdusert på protein-nivå). Ved påføring av tredje generasjons lentiviruses til NPCer in vitro, vi konsekvent observere> 90% av cellene som viser høye nivåer av GFP over flere uavhengige eksperimenter (Figur 3C), med verken åpenbar toksisitet eller endringer i spredning, når man sammenligner de vekstkurver av vill type og lenti-GFP transduserte NPCer (Figur 3D).

Kronisk EAE induksjon
EAE er en av de best karakteriserte modeller av MS, siden det sammenfatter de fleste av de patologiske og kliniske hendelser i MS. Immunisering av C57Bl / 6 mus med MOG35-55 fører til utvikling Totaltt av en kronisk form av EAE. Når du nærmer sykdomsutbruddet (11,3 ± 1,8 dpi) i løpet av induksjonsfasen (preklinisk), MOG vaksineres mus begynner å miste vekt (Figur 4A). I begynnelsen av effektor / invasjon fase (peak klinisk, 16,8 ± 3,2 dpi) EAE mus nå toppen av sykdommen (skår 3,5 ± 0,7), og kort tid etter peaking de viser en progressiv og delvis gjenvinning som endelig stabiliserer løpet av kronisk fase (stabil klinisk) fra rundt 30 dpi og utover (skår 2,8 ± 0,9) (Figur 4B). Tallrike studier, inkludert noen undersøke EAE enten intramikros 23 eller magnetisk resonanstomografi 24, sammen med in vivo vev patologi, har identifisert i toppen av effektor / invasjon fasen (16-22 ppt) den ideelle vindu av muligheter (WoO) der for å utføre systemisk eksperimentell behandling med stamceller ment å gå inn i kronisk betent EAE CNS og beskytte den mot sekundær dAmage.

NPC injeksjon
Syngen NPC injisert systemisk i mus EAE (figur 6) finnes nesten utelukkende i perivaskulær områder i CNS-skade, både i hjernen (figur 5A) og ryggmargen (figurene 5B-D) opp til 45 dager etter transplantasjonen (DPT), som beskrevet 5. iv. injisert NPCer fortrinnsvis beholde en umoden, Nestin + (figur 5C) fenotype, mens noen NPCer flytte ut av perivascular området uttrykke Neun (figur 5D). Av notatet, NPCer injisert intravenøst ​​i friske kontroller ikke klarer å gå inn i CNS via vaskulær ruten (figur 5E). Etter iv NPC injeksjon, blir et betydelig antall injiserte NPC funnet at nivået av ikke-CNS-organer slik som lever, tarm, milt, lunge og nyre, men ikke i hjertet, så tidlig som 10 dpt (figur 5F). Non-CNS samler NPCer er helt ryddet ut av thes e perifere organer ved 30 dpt (Figur 5G).

Figur 1
Figur 1. Isolering av NPCer fra SVZ av voksne mus og generering av stabilt utvid NPC linjer. A, Skjematisk fremstilling av de viktigste kritiske trinnene i generasjon stabilt utvides, og utarbeidelse av injiserbare muse NPCer. B, neurospheres in vitro. C , NPCer dyrket som neurospheres passeres hver 4-5 dager. Antall levende og døde celler blir innsamlet og kumulative celle tall plottet å generere en vekstkurve. Målestokk i B er 200 mikrometer. Dataene i C er gjennomsnittlig kumulativ antall celler ± SD (n = 3).

gure 2 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51154/51154fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51154/51154fig2.jpg "/>
Figur 2. NPCer karakterisering. A, prolifererende muse neurospheres uttrykke PHH3 kjerne histone protein (grønn), og den type VI mellomliggende filament protein Nestin (rød). BE, Etter 6 DIV i differensiering forhold, NPCer er multipotent mot astroglial (GFAP, rødt i C), nevronale (MAP-2, grønn i D) og oligodendroglial (O4, grønne i E; og MBP, røde i E) linjene. Kvantifisering av GFAP-, MAP-2-, og O4-uttrykker cellene på 6 DIV etter NPC differensiering in vitro er vist i B. Dataene i B er som gjennomsnittlig% ± SD (n = 3). Skalaen barer i CE er 50 mikrometer. F, Flowcytometri analyse av uttrykket av de viktigste celleoverflaten adhesjonsmolekyler regulerer leukocyte bloduttredelse i muse neurospheres. Figur 2F tittelen fra Pluchino et al. 2

Figur 3
Figur 3.. Transduksjon av NPCer med lentiviruses uttrykker reporter gener (f.eks GFP. A og B, bilder fase kontrast av neurospheres (A) og differensierende NPCer (B) som har blitt transduserte med en 3. generasjons lenti-GFP vektor. Flowcytometri analyse av NPCer i A. C, Wild type (ikke transduced) og lenti-GFP transduserte NPCer dyrket som neurospheres passeres hver 4-5 dager. antall levende og døde celler blir innsamlet og kumulative celle tall plottet å generere en vekstkurve. Målestokk iA og B er 200 mikrometer. Dataene i C er gjennomsnittlig kumulativ antall celler ± SD (n = 3).

Figur 4
Figur 4 Funksjonell karakterisering av kronisk EAE.. A, Daily vekt overvåking i MOG-og CFA-immunisert C57Bl / 6 mus over en total oppfølging av 40 dpi. B, Daily EAE poengsum overvåking i MOG-og CFA-immunisert C57BL / 6 mus over en total oppfølging av 40 dpi . Dataene er uttrykt som middeltall ± SD (n = 10 mus / gruppe).

Figur 5
Figur 5. Systemisk injisert NPCer migrspiste i parenchyma av EAE mus. AE, X-gal farging av vibratome-snitt (70 mm) hjerne (A) og ryggmargen (B) vevssnitt fra EAE mus injisert IV med iske NPC, som viser transplanterte β-gal +-celler ( blå celler) vedvarende innenfor perivaskulære CNS områder opp til slutten av klinisk oppfølging (106 dpi). C, β-gal + iv. injisert NPCer (blå) vedvarende innenfor perivaskulære CNS områder, beholde en Nestin + (brun) fenotype. D , Et par trekkende NPCer uttrykke Neun + (brun) så lenge de flytte ut av perivascular området. E, X-gal flekker i et representativt ryggmarg delen fra en humbug-behandlet EAE mus. . Scale barer, 20 mikrometer FG, Analyse av andre enn CNS vev viser at ic -. Eller iv. Injisert NPCer (blå celler) nå praktisk talt alle organer (. F.eks lunge, lever, milt, hjerte, tarm, nyre) viddhin 10 dpt (F), men er fjernet fra de samme organer ved 30 dpt (G). Figurene 5A-E er gjengitt fra referanse 5, mens fig 5F-G er gjengitt fra Pluchino et al. 2.

Figur 6
. Figur 6 Skjematisk fremstilling av protokollen for systemisk injeksjon av NPCer i mus med EAE Hoved kritiske trinn i systemisk injeksjon av NPCer i mus med EAE:. Fra utarbeidelse av injiserbare CAM uttrykke enkelt celle dissociated NPCer cellekultur rommet (A) , til injeksjon inn i halevenen på mus EAE ved toppen av effektor / invasjonssykdommer fase (B), mot in vivo deteksjon av de injiserte NPC som har målrettetCNS (C), til de in vivo vev patologiske studier tillater å studere mekanismene for terapeutisk plastisitet for injiserte NPC (D). I D, grønne celler i er oligodendrocytes, mørk blå celler er axoner, er lys blå celler transplantert NPCer, oransje celler er astrocytter, og røde celler er endotelceller.

<td> 2,5
Resultat Responses Lokomotoriske
0 Vanlig mus. Ingen klare tegn på sykdom
1 Limp hale: komplett flaccidity av halen, og fravær av curling på tuppen av halen når en mus er plukket opp
1,5 Hind lem svakhet: musa viser sporadiske og korte trippings når du går på en vaggende ganglag
2 Limp hale og hind lem svakhet: når den plasseres på ryggen, kan du bruke musen ikke slå til sin normale posisjon
Delvis hind lem lammelse: musen kan ikke lenger bruke baklemmene til å opprettholde rumpe holdning eller gå, men kan fortsatt flytte ett eller begge bakbena til en viss grad, forbein forbli upåvirket
3 Komplett hind lem lammelse: totalt tap av bevegelse i bakbena. Musen drar seg bare på sine forbein, som forblir upåvirket. Mus på dette stadiet får mat på buret gulvet, lange sipper rør, og daglig subkutan injeksjon av fuktighetsgivende løsninger for å hindre dehydrering. Dersom musene utvikler sår eller hudlesjoner som ikke gjenopprette med behandling, vil de bli drept humant
3,5 Forbena svakheter når sted på en vertikal rutenett, er musen ikke er i stand til å klatre og sakte faller
4 Døende tilstand
5 Mus funnet døde eller avlivet i henhold til humane endepunkter

TaBLE en. Fem trinns skala fra kliniske tegn og stigende lammelser i EAE mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Somatiske stamceller basert terapi er fremstår som en av de mest lovende strategi for behandling av kroniske inflammatoriske forstyrrelser i sentralnervesystemet slik som 11 MS2. Mens de mekanismene nærende deres terapeutiske effekter fortsatt trenger å bli fullstendig kjent, har den betydelige effekten av NPC transplantasjon i ulike eksperimentelle modeller av nevrodegenerative sykdommer gitt opphav til noe provoserende troen på at stamceller kan snart bli brukt i studier på mennesker. Men før envisaging eventuelle menneskelige anvendelser av slike innovative behandlingsformer vi trenger for å møte noen viktige spørsmål og ta opp noen ubesvarte spørsmål, for eksempel identifikasjon av den ideelle stamcellekilden for transplantasjon (autolog vs allogen, pluripotent vs multipotent) og den beste ruten administrasjonsmåte.

Nevrodegenerative sykdommer varierer i sine pathophysiologies, med noen blir romlig begrenset (f.eks. Ryggmargen iJuryen, hjerneslag), mens andre er preget av en romlig tidsmessig spredning (f.eks MS). Det stammer at det sentrale injeksjon av (stilk) celler, kan være en passende behandling for det første, mens det kan være utilstrekkelig eller bare unfeasible for sistnevnte, hvor tilstedeværelsen av flere områder av hjerneskade representerer en ytterligere utfordring å overvinnes.

Konsistent bevis har vist at intravenøs levering kan representere et gyldig (og lav invasiv) protokoll for mobil administrering, som støttes av den iboende evne av stamceller for å avføle miljøet og spesielt inn mot det område (r) av skade. Imidlertid er omregning av systemiske NPC terapier i klinikker fortsatt hindret av noen begrensninger, for eksempel den mulige akkumulering av transplanterte celler i perifere ikke-CNS-organer (f. eks lunger, milt, lymfeknuter, og nyrer) som kan eller ikke kan være områder av lokale inflammatoriske responser in vivo. Mens dette uspesifikke accumbefolkningens injisert NPCer ut av målet CNS er raskt ryddet i mus med kronisk EAE2, det er tegn på lang sikt NPC utholdenhet (eller i noen tilfeller eksklusive målretting) på nivå med de sekundære lymfoide organer (f.eks. lymfeknuter og milt) etter systemisk injeksjon i mus med relapsing EAE5 19,20. Det faktum at et betydelig antall transplanterte NPC resirkulere mot ikke-CNS-organer gir en fortynningseffekt, uunngåelig reduksjon av det absolutte antall NPC i CNS. Interessant, systemisk injisert NPCer er terapeutisk virksomt (f.eks via immun regulatoriske tiltak) selv når samler utelukkende ut av CNS 19,20. Og den samlede terapeutiske effektene av injisert NPCer rettet mot CNS bare fem eller lymfeknuter bare 19 er sammenlignbare. Dette kan delvis skyldes en iboende plastisitet av cellene, som reagerer forskjellig på de molekylære komponenter i omgivelserg mikromiljøet. Spesielt, hvis det på den ene siden transplanterte NPC kan føle tilstedeværelse av inflammatoriske cytokiner, og utøve sin terapeutiske effekt ved immunmodulator mekanismer 16, på den annen side at de kan komme i kontakt med fiendtlige microenvironments til slutt fører til dannelsen av tumorer 25,26. Av disse grunner, er det foretrukket alternativ til stede for å konsentrere injisert NPC i CNS. Som sådan er den intratekal administrasjon (via en lumbal eller cisternal rute) fortsatt den mest aksepterte prospektive administrasjonsvei i kliniske studier. Imidlertid kan multifokaliteten og patologisk heterogenitet av MS-lesjoner begrenser effektiviteten av en slik metode.

Her beskriver vi en effektiv protokoll for å isolere, vedlikeholde og karaktermuse nevrale stamceller fra voksne SVZ og suksessivt, hvordan systemisk (både iv og ICV) injisere NPCer i mus rammet av kronisk EAE, en av de mest studøde modeller av MS. Selv om relativt enkel og grei, disse protokollene presentere noen viktige skritt som må tas i betraktning. Ved første, er det obligatorisk å få et stabilt utvides og sunn celleforberedelsen. Som beskrevet over hele protokollen, kan stabiliteten av cellene bli indirekte utledes ved å se på deres veksthastighet. Ideelt sett bør neurospheres nå en diameter på 150-200 um hver 4-5 DIV og andelen av celledød ved passasjer må være meget lav (mindre enn 10%). Også neurospheres må presentere et kompakt og vanlig rund form på mikroskopet. Infeksjonen med lentiviruses kan påvirke overlevelse og stabiliteten av cellene. For å oppnå en optimal infeksjon, er det obligatorisk å oppnå en titrering av virus av interesse tilstrekkelig til å oppnå 3 x 10 6 TU / ml. Faktisk, mens på den ene siden en lav mengde virus ville føre til en liten prosentdel av infiserte celler, på den annen side bruk av en stor mengde holed sannsynligvis føre til en toksisitet effekt (sterkt avhengig av genet som skal bli smittet). NPC kan være infisert flere ganger med integrerende viruser, bør resultatet av den første transduksjon fører til lav prosentandel av transgene positive levedyktige celler. Det er alltid lurt å ha intra eksperimentell sammenligning av parametere stabilitet og levedyktighet med villtypen, nontransduced, kontrollerer NPCer. Som for induksjon av kronisk EAE, er de mest problematiske delen representert ved fremstillingen av emulsjonen. Som beskrevet, må glass og is bli bruk til enhver tid. Utarbeidelse av emulsjonen tar 30-45 min, og det kan betraktes klar til å injiseres bare når den ikke spre når den er droppet på vann. Hvis emulsjonen oppløses i vann, dette betyr at det er ennå ikke klar, og krever ytterligere blending.

God nøyaktighet under iv injeksjonsprosedyren ved tidspunktet for celle administrering er kritisk. Først, er det ekstremt viktig å ha somingle cellesuspensjonen, slik at injeksjon av aggregerte celler kan hindre venene i den injiserte mus og føre til umiddelbar død. For å sikre riktig plassering av nålen inn i venen, er det god praksis å aspirere med sprøyten noen mikroliter blod. I tilfelle av blod som kommer inn i sprøyten, bør operatøren langsomt bevege nålen bakover eller fremover inntil den riktige plassering er funnet. På dette tidspunkt kan cellesuspensjonen blir langsomt injisert. Viktigere, bør operatøren vanligvis ikke være nødvendig å bruke noe press på sprøyten siden væsken bør lett flyte i venen. Feilaktig injeksjon ville uunngåelig resultere i en subkutan hevelse svarende til injeksjonsstedet.

Det er verdt å merke seg at i svært nær fremtid systemisk injisert NPCs2, 27, genmodifisert eller ikke, kan i seg selv representere en terapeutisk alternativ, samt gi et viktig verktøy for å levere immun modulatory og / eller nervecellene narkotika og pro remyelinating midler direkte inn i CNS 28. Derfor, mens noen begrensninger knyttet til systemisk levering av NPCer finnes, både iv. og ICV. ruter kan til slutt representerer gyldig alternativ terapeutisk tilnærming i de sykdommer hvor det sentrale injeksjon av cellene ikke kan utgjøre gullstandardprotokoll for behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Jayden Smith for kritisk gjennomgang og bevis redigere manuskriptet. Dette arbeidet har fått støtte fra National Multiple Sclerosis Society (NMSS, delvis tilskudd RG-4001-A1), den italienske multippel sklerose Association (AISM, gi 2010/R/31), den italienske helsedepartementet (GR08-7), Wings for Life, Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), European Research Council (ERC) under ERC-2010-StG Grant avtalenr 260511-SEM_SEM og Det europeiske fellesskap (EF) syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) henhold Grant Agreement n * grader; 280772 - Ione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
EBSS Sigma E2888
L-Cystein Sigma Aldrich C7352
Papain Worthington 30H11965
EDTA Fisher Scientific D/0700/50
Mouse NeuroCult basal medium Stem Cell Technologies 05700
NeuroCult proliferation supplements Stem Cell Technologies 05701
Heparin Sigma H3393
Basic fibroblast growth factor Peprotech 100-18B-1000
Epidermal growth factor Peprotech AF-100-15-1000
Pen/Strep Invitrogen 1514012
Matrigel (coating solution) BD Biosciences 354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) Stem Cell Technologies 05704
Accumax eBioscience 00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg PAA Laboratories H15-011
Myco trace PAA Laboratories Q052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Immunofluorescence
Normal goat serum PAA Laboratories B11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether Sigma Aldrich T8787
Mouse anti Nestin Abcam ab11306
Rabbit anti GFAP DAKO 203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10)  Abcam ab14955
Rabbit anti MAP-2 Abcam ab32454
Rat anti MBP AbD SEROTEC MCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 Millipore MAB345
DAPI Invitrogen D1306
Mounting solution DAKO S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incomplete Sigma Aldrich F5506
Mycobacterium tuberculosis DIFCO H37Ra
MOG(35–55)  Espikem
Pertussis toxin List Biological Laboratories 181
Tissue processing
Iris scissor straight Fine Sciences Tools 14060-09
Blunt/bended forceps Fine Sciences Tools 11080-02
Brain slicer Zivic Instruments BSMAS005-1
Surgical blades Swann-Morton 324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar) Boehringer Ingelheim 01LC0030
Xylazine (Rompun) Bayer 32371
Stereotaxic frame KOPF Model 900
Hamilton syringe Hamilton 7762-04
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 158127
VECTASTAIN Elite ABC Kit Vector Laboratories PK-6100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ben-Hur, T., et al. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 41, 73-80 (2003).
  2. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, 688-694 (2003).
  3. Chu, K., Kim, M., Jeong, S. W., Kim, S. U., Yoon, B. W. Human neural stem cells can migrate, differentiate, and integrate after intravenous transplantation in adult rats with transient forebrain ischemia. Neurosci. Lett. 343, 129-133 (2003).
  4. Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14, 634-644 (2008).
  5. Pluchino, S., et al. Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism. Nature. 436, 266-271 (2005).
  6. Einstein, O., et al. Intraventricular transplantation of neural precursor cell spheres attenuates acute experimental allergic encephalomyelitis. Mol. Cell Neurosci. 24, 1074-1082 (2003).
  7. Chu, K., et al. Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus in adult rats. Brain Res. 1023, 213-221 (2004).
  8. Jeong, S. W., et al. Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage. Stroke. 34, 2258-2263 (2003).
  9. Aboody, K. S., et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12846-12851 (2000).
  10. Muller, F. J., Snyder, E. Y., Loring, J. F. Gene therapy: can neural stem cells deliver. Nat. Rev. Neurosci. 7, 75-84 (2006).
  11. Martino, G., Pluchino, S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nat. Rev. Neurosci. 7, 395-406 (2006).
  12. Deckert-Schluter, M., Schluter, D., Hof, H., Wiestler, O. D., Lassmann, H. Differential expression of ICAM-1, VCAM-1 and their ligands LFA-1, Mac-1, CD43, VLA-4, and MHC class II antigens in murine Toxoplasma encephalitis: a light microscopic and ultrastructural immunohistochemical study. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 457-468 (1994).
  13. Hemmer, B., Archelos, J. J., Hartung, H. P. New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis. Nat. Rev. Neurosci. 3, 291-301 (2002).
  14. Butcher, E. C., Picker, L. J. Lymphocyte homing and homeostasis. Science. 272, 60-66 (1996).
  15. Rampon, C., et al. Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44. Stem Cells. 26, 1673-1682 (2008).
  16. Pluchino, S., et al. Human neural stem cells ameliorate autoimmune encephalomyelitis in non-human primates. Ann. Neurol. 66, 343-354 (2009).
  17. Martino, G., Pluchino, S., Bonfanti, L., Schwartz, M. Brain regeneration in physiology and pathology: the immune signature driving therapeutic plasticity of neural stem cells. Physiol. Rev. 91, 1281-1304 (2011).
  18. Aharonowiz, M., et al. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiple sclerosis. PLoS ONE. 3, e3145 (2008).
  19. Pluchino, S., et al. Immune regulatory neural stem/precursor cells protect from central nervous system autoimmunity by restraining dendritic cell function. PLoS One. 4, (2009).
  20. Einstein, O., et al. Neural precursors attenuate autoimmune encephalomyelitis by peripheral immunosuppression. Ann. Neurol. 61, 209-218 (2007).
  21. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J. Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
  22. Furlan, R., Pluchino, S., Marconi, P. C., Martino, G. Cytokine gene delivery into the central nervous system using intrathecally injected nonreplicative viral vectors. Methods Mol. Biol. 215, 279-289 (2003).
  23. Constantin, G. Visualization and analysis of adhesive events in brain microvessels by using intravital microscopy. Methods Mol. Biol. 239, 189-198 (2004).
  24. Politi, L. S., et al. Magnetic-resonance-based tracking and quantification of intravenously injected neural stem cell accumulation in the brains of mice with experimental multiple sclerosis. Stem Cells. 25, 2583-2592 (2007).
  25. Melzi, R., et al. Co-graft of allogeneic immune regulatory neural stem cells (NPC) and pancreatic islets mediates tolerance, while inducing NPC-derived tumors in mice. PLoS One. 5, (2010).
  26. Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, (2009).
  27. Ben-Hur, T., et al. Effects of proinflammatory cytokines on the growth, fate, and motility of multipotential neural precursor cells. Mol. Cell Neurosci. 24, 623-631 (2003).
  28. Giusto, E., Donega, M., Cossetti, C., Pluchino, S. Neuro-immune interactions of neural stem cell transplants: From animal disease models to human trials. Exp. Neurol. (2013).
Systemisk Injeksjon av Neural Stem / stamceller i Mus med kronisk EAE
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donegà, M., Giusto, E., Cossetti, C., Schaeffer, J., Pluchino, S. Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE. J. Vis. Exp. (86), e51154, doi:10.3791/51154 (2014).More

Donegà, M., Giusto, E., Cossetti, C., Schaeffer, J., Pluchino, S. Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE. J. Vis. Exp. (86), e51154, doi:10.3791/51154 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter