Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Systemisk injektion af neurale stam / stamceller i mus med kronisk EAE

Published: April 15, 2014 doi: 10.3791/51154
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Clinical Neurosciences, John Van Geest Centre for Brain Repair, University of Cambridge, UK, 2NIHR Biomedical Research Center, University of Cambridge, UK

Summary

Transplantation af neurale stamceller / stamceller (NPCs) besidder store løfter i regenerativ neurologi. Den systemiske levering af NPC har udviklet sig til en effektiv, lav invasiv og terapeutisk meget effektiv protokol til at levere stamceller i hjernen og rygmarven hos gnavere og ikke-humane primater, der berøres af eksperimentel kronisk inflammatorisk skade på det centrale nervesystem.

Abstract

Neurale stamceller / precursorceller (NPCs) er en lovende stamcelle kilde til transplantationscentre tilgange sigter mod hjernen reparation eller restaurering i regenerativ neurologi. Dette direktiv er opstået fra den omfattende dokumentation for, at hjernen reparation opnås efter fokal eller systemisk NPC transplantation i flere prækliniske modeller af neurologiske sygdomme.

Disse eksperimentelle data har identificeret den celle levering rute som en af ​​de vigtigste forhindringer for genoprettende stamcelleterapier inden for hjernesygdomme, der kræver akut vurdering. Intraparenchymal stamcelle podning repræsenterer en logisk tilgang til disse patologier karakteriseret ved isolerede og tilgængelige hjernelæsioner såsom rygmarvsskader og Parkinsons sygdom. Desværre er dette princip er dårligt gælder for tilstande karakteriseret ved en multifokal, provokerende og formidles (både i tid og rum) natur, herunder multipel sklerose (MS). Som sådan hjerne målretning af systemic NPC levering er blevet en lav invasiv og terapeutisk effektiv protokol til at levere celler til hjernen og rygmarven gnavere og ikke-humane primater, der berøres af eksperimentel kronisk inflammatorisk skade på det centrale nervesystem (CNS).

Denne alternative metode til celle levering afhængig af NPC pathotropism specifikt deres medfødte evne til at (i) fornemmer i miljøet via funktionelle celleadhæsionsmolekyler og inflammatoriske cytokin og kemokinreceptorer; (Ii) krydse utætte anatomiske barrierer efter intravenøs (IV). Eller intracerebroventrikulær (icv) injektion; (Iii) akkumuleres på niveau med flere perivaskulær site (s) af inflammatorisk hjerne og rygmarv skader; og (iv) udøve bemærkelsesværdig væv trofisk og immune regulerende virkninger på forskellige vært målceller in vivo.

Her beskriver vi de metoder, vi har udviklet til iv. og <em> ICV levering af syngene NPCs i mus med eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE), som model for kronisk CNS inflammatorisk demyelinisation og forestiller den systemiske stamcelle levering som en værdifuld teknik til selektiv målretning af den betændte hjerne i regenerativ neurologi.

Introduction

Er opstået stærke beviser fra in vivo studier, der attesterer den terapeutiske effekt af transplantation af somatiske neurale stamceller / precursorceller (NPCs) i dyremodeller af CNS-sygdomme 1-8. Ikke desto mindre er en række spørgsmål i forbindelse med levering af stamceller i værten kræver omhyggelig overvejelse, før disse eksperimentelle resultater kan omsættes til kliniske anvendelser. En særlig væsentlig hurdle i retning af udvikling af (ikke-hæmatopoietiske) genoprettende stamcellebehandling for multifokale, kroniske inflammatoriske hjernesygdomme er identifikationen af ​​den ideelle rute NPC injektion. En fast forståelse af patofysiologien af ​​de målrettede sygdom (fokal eller multifokal, primær inflammatoriske eller primær degenerativ), og en forsigtig analyse af feasibility-og risikoforhold forbundet med levering teknikker er at identificere den optimale protokol for stamcelle levering.

Mens omdrejningspunktet ( (fx Parkinsons og Huntingtons sygdom, hjerne og rygmarv traumatiske skader, og slagtilfælde), kan meget samme fremgangsmåde bevise at være praktisk ikke lade sig gøre i forhold såsom MS, hvor en multifokal, kronisk, og rumligt formidles CNS skade akkumuleres over tid. I sidstnævnte tilfælde er rettet mod fokale celle injektioner til individuelle læsioner også hæmmet af den begrænsede kapacitet af transplanterede NPC'ere at migrere over lange afstande inden for CNS parenkym, hvorved der opstår identifikation af alternative, mere hensigtsmæssige metoder til CNS målretning med mindre invasive NPC transplantationer .

Store løfte fremgik af bemærkninger, NPC'ere er målrettet en intrakraniel tumor (f.eks. Gliom) i mus, når det injiceres intravaskulært udenfor CNS9. Efter denne skelsættendein vivo evidens for stamcelle pathotrophism 10, har omfattende data blevet akkumuleret vedrørende gennemførlighed og terapeutiske effekt af den systemiske transplantation af NPC'ere i forsøgsdyr med eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE), som en model for inflammatorisk CNS skader, enten via intravenøs (iv) eller intracerebroventrikulær (icv.) NPC injektion 1,2,5,6,8 .. Vi har først vist, at dette er afhængig af evnen til transplanterede NPC'ere at målrette og indtaste den betændte CNS, og efterfølgende at engagere flere intercellulære kommunikationsprogrammer inden for specifikke mikromiljøer in vivo 11. For specifikt at målrette CNS, er NPC'ere leveret direkte i cerebrospinalvæsken (CSF) cirkulation af ICV injektion, eller ind i blodbanen via iv injektion. Når indtastning enten i blodbanen eller CSF, transplanterede NPC'ere aktivt samspil medblod-hjerne (BBB) ​​eller blod cerebrospinalvæske (BCSFB) barrierer og indtast CNS parenkym. Denne interaktion mellem NPC graft og BBB (eller BCSFB) reguleres af specifikt sæt af NPC overflade celleadhæsionsmolekyler (CAMs) og lettes ved ekspression af høje niveauer af CAM counter-ligander på aktiverede endotelceller / ependymal celler 12-14. Eksempler på disse CAM'er omfatter receptoren for hyaluronat, CD44 og intercellulært adhæsionsmolekyle (ICAM) -1 ligand meget sent antigen (VLA) -4 5,15,16 (, at leukocytter, er ansvarlige for interaktionen med aktiveret ependymal og endotelceller), og i langt mindre grad lymfocytfunktion-associeret antigen (LFA) -1 og P-selectin glycoprotein ligand (PSGL) -1. NPC udtrykker også en bred vifte af kemokinreceptorer herunder CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 og CXCR4 (men udtrykker ikke CCR3 og CCR7), som er funktionelt aktive, både in vitro og in vivo 5,16. Således systemically injiceret NPC bruge disse CAM'er, sammen med G-protein-koblet receptor (GPCR), til at akkumulere på niveau med den betændte CNS. Omvendt NPC'ere injiceret systemisk i sund mus ikke kommer ind i CNS via vaskulære eller cerebrospinalvæske plads ruter 2. CNS-inflammation, eller endotel / ependymal celle aktivering efter systemisk cytokin eller lypopolisaccharide (LPS) injektion som en model for kemisk induceret hjernebetændelse, er derfor nødvendig for akkumulering af systemisk injicerede NPC'ere i hjernen og rygmarven 2.. Således vellykket målretning af CNS med systemiske NPC behandlinger er afhængig af identifikationen af ​​en sygdom specifik vindue af muligheder (WoO) hvor hjernen og rygmarven miljø er befordrende for ophobning og transendothelial migration af NPC'ere. Sådanne betingelser generelt opstår i forbindelse med akut og subakut inflammation 17.. Når man først har indtastet CNS, transplanterede udifferentierede NPC'erehar vist sig at lindre Clínico-patologiske træk mus samt større, ikke-humane primater med EAE. Dette er blevet beskrevet til at være afhængig af celle udskiftning minimal 2 og bemærkelsesværdige sekretion af immun regulatoriske og neuroprotektive paracrine faktorer inden perivaskulær CNS 2,5,6,18 vs ikke-CNS betændte områder 19,20 (f.eks lymfeknuder), som svar på den inflammatorisk cellesignalering fremkaldt af infiltrerende immunceller 5.

Heri beskrives de vigtige metodologiske aspekter af systemisk injektion af somatiske NPC i en musemodel af kronisk EAE. Mere specifikt definerer vi de protokoller, som vi har etableret til (i) stamme, udvide og forberede transplantationscentre somatiske NPC'ere fra subventricular zone (SVZ) af voksne C57BL / 6 mus; (Ii) fremkalde kronisk EAE i sådanne mus og (iii) udføre terapeutisk effektiv systemisk (iv eller icv) NPC transplantation into EAE mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der involverer dyr, udføres i henhold til principperne for laboratoriedyr pleje godkendt af det britiske indenrigsministerium under dyrene (videnskabelige procedurer) Act 1986 (PPL nr. 80/2457 til SP).

1.. Afledning af Somatic Neural Stem / stamceller (NPCs) fra subventrikulære zone (SVZ) af hjernen hos voksne mus

  1. Udarbejdelse af Dissektionsinstrumenter og medier
    NB: Disse to opløsninger skal fremstilles 1-2 hr før dissektioner instrumenter er klar og forvarmet ved 37 º C i mindst 20-30 min før brug (det hjælper at fortynde papain og optimerer enzymaktivitet).
    1. Autoklave en lige skarp saks, en lille kirurgisk saks og to små buede savtakkede pincet.
    2. "Fordøjelsen" løsning: Forbered to separate 50 ml rør med:
      Løsning # 1: 25 ml Earles Balanced Salt Solution (EBSS) + 10 mg ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) + 10 mg L-cystein;og
      Løsning # 2: 25 ml EBSS + 50 mg papain.
    3. Forbered »komplet dyrkningsmedium (CGM): komplet muse basalt medium med mus spredning kosttilskud, heparin 0,002%, basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF; 10 ng / ml), epidermal vækstfaktor (EGF; 20 ng / ml) og antibiotika (Pen / Strep).
  2. Brain dissektion
    NB: Fjernelse af den tidsmæssige knogler kan nemt skade vævet på grund af deres skarphed. For at undgå dette, fastgøre knoglerne med pincet og træk indtil hele knogle er blevet fjernet.
    1. For hver tilberedning af NPC, frasortering ved cervikal dislokation n = 5-7, 4-8 uger gamle C57BL / 6 mus.
    2. Rens med 70% ethanol (i vand) håret af de frasorterede mus og skær bag ørerne med lige skarp saks for at fjerne hovedet;
    3. Foretag en midtlinieincision hjælp af en lille kirurgisk saks til at skære huden over kraniet. Ved hjælp af pincet, fold de to pletter på huden til udstillingere kraniet.
    4. Med den lille kirurgisk saks udføre to små snit i bunden af ​​kraniet, og fjern knoglerne under pons / medulla (ventrale kraniet). Fortsæt ved at trække den tidsmæssige knogler. Med den samme saks udføre et snit langs kraniet, startende fra bunden til løgene, uden at beskadige overfladen af ​​hjernen. Også udføre et snit mellem frontale knogler og øjne, for at lette fjernelsen af ​​parietale knogler. Med to pincet begynde at fjerne kraniet ved at trække hver af de parietale knogler mod ydersiden. Mens du trækker, være opmærksom på hjernehinden, som kan skade hjernen, når knoglerne bliver fjernet.
    5. Når kraniet er blevet fjernet, skal du skubbe tangen mellem hjernen og kraniet helt frigøre meninges venstre. Løft forsigtigt op i hjernen fra kraniet. Skær Synsnerverne at frigive hjerne og til sidst opsamling af hjernen i et rør med koldt phosphatbufret saltvand (PBS).
    6. Hold røret på is etd Gentag samme procedure for alle mus.
  3. Dissektion af SVZ, neurosfæren dannelsen og vedligeholdelsen assays
    Gennemsnitligt antal celler x fortyndingsfaktor x 10 4

    Hvor 10 4 repræsenterer omdannelsen af den samlede mængde af hematocytometer kammer (samlet volumen = 0.1 mm 3 -> 10-4 cm 3 -> 10-4 ml). Når man overvejer fortyndingsfaktoren, både den ene færdig med CGM og med den vitale pletten skal tages i betragtning. Som et eksempel, hvis 160-celler er blevet medregnet i de 4 hjørnefelt vil den endelige densitet (celler / ml) af cellesuspensionen være:

    160/4 x 5 (fortynding med CGM) x 2 (fortynding med vital plet) x 10 4
    1. Tænd en dissektion hætte er udstyret med et dissektionsmikroskop.
    2. Rengør alle overflader med 70% ethanol (i vand), og spray med en anti Mycoplasma løsning til at sænke risikoen for forurening.
    3. Coverbunden af ​​et bæger med steril gaze (for at bevare skærpet instrumenter) og fyld den med 70% ethanol (i vand). Soak i bægeret to par tænger, et par af mikro saks og en kirurgisk kniv.
    4. Anbring hele hjernen på hjernen-pålægsmaskine matrix.
    5. Ved hjælp af to barberblade udføre en koronal sektionering 2 mm fra den forreste pol af hjernen, med undtagelse af de optiske skrifter, og 3 mm posteriort for den foregående cut; og placere vævet på en ren petriskål.
    6. Under dissektionsmikroskop isolere SVZ væv og skæres i 1 mm 3 stykker med iridectomy saks. Gentag for alle hjerner.
      1. Bland godt de to løsninger (afsnit 1.1.2) over og filtreres gennem et 0,22 mm filter umiddelbart efter hjerner dissekeret og SVZs er klar til at blive fordøjet.
    7. Overfør afsnittene i 30 ml "Fordøjelsen"-løsning, forsigtigt resuspenderes med a10 ml pipette og inkuber 30 min ved 37 ° C i 5% CO2. Hver 15 min ryst røret 2-3x.
    8. Centrifuger ved 300 xg i 10 min.
    9. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 200 pi af CGM ved pipettering først med en P1000 og derefter med en P200 pipette (10-20x hver), indtil opnåelse af en enkelt cellesuspension.
    10. Tag suspensionen op til 5 ml med CGM og overføre til en T25 cm2 kolbe.
    11. Efter 5-7 dage in vitro (DIV) neurosfærer vil dannes. Opsaml suspensionen i et 15 ml rør og centrifugeres 10 minutter ved 150 x g.
    12. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 200 pi af CGM.
      Adskille neurosfærerne mekanisk ved passage af cellerne 100-150x med en P200 pipette, indtil opnåelse af en enkelt celle suspension og tage det op til 1 ml med CGM.
    13. Cellesuspensionen, fx 10 pi cellesuspension fortyndes i 40 pi af CGM til opnåelse af en 1:5 fortynding, og bland godt. Bland 10 pi af fortynderene cellesuspension med 10 ul af en vital plet og bland godt.
    14. Fyld en hemocytometer tællekammer med 10 pi af 1:1 cellesuspension: vital farveopløsning. Separat tælle antallet af levende (hvid) og døde (blå) celler i 4 hjørne firkanter. At bestemme antallet af celler / ml, anvende følgende beregning:
    15. Resuspender 2 x 10 5 celler i 5 ml CGM og overførsel til en T25 cm 2 kolbe;
    16. Gentag sektioner 1.3.11-1.3.12 hver 4-5 DIV. Fra den anden passage af ekspansion og fremefter, vurdere den cellulære levedygtighed ved vital pletten udstødelse og begynde at opbygge en kontinuerlig vækst kurven ved plettering NPC'ere ved klonal densitet (8.000 celler/cm2), som beskrevet 21. Hold celle numre og gentag proceduren hver 4-5 DIV. For at generere en kontinuerlig vækstkurve, fortsættes som følger:
      NB: For at få en god forberedelse celle, efter 4-5 DIV kugler skal have nået en diameter på 150-200 um. At have en god estimat af than celletæthed, er det vigtigt at finde en optimal fortyndingsfaktor For at få godt fordelt, ikke-overlappende celler i hele hematocytometer. Ideelt set burde der være mellem 50-200 totale celler. Ved at tælle, kun de celler, som indgår i firkanten uden at røre grænserne skal tages i betragtning. Også levedygtigheden af ​​cellerne er en afgørende faktor for at have en sund forberedelse. Vigtigere er det, bør være større på 90%. En lineær vækstkurve er en anden indikator for en sund cellepræparat.
      1. Tæl antallet af levende og døde celler (fx 1,3 x 10 6).
      2. Definer vækstraten dividere antallet af levende celler med antallet af udpladede celler (fx 1,3 x 10 6/2 x 10 5 = 6,5).
      3. Beregn det samlede antal celler ved at multiplicere vækstrate for det samlede antal celler til stede på tidligere tidspunkt (ved begyndelsen = 2 x 10 5).
      4. Angiv gennemsnittet7.; standardafvigelse til at bygge en lineær trend linie.
    17. Fra passagen 6, er mekanisk dissociation erstattet af enzymatisk dissociation. Efter centrifugering ved 150 xg i 10 min, supernatanten fjernes, pellet resuspenderes i 200 pi celleaggregatstørrelse dissociation opløsning resuspenderes 7-8x med P200 og inkuberes 10 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
    18. Resuspender 7-8x med P200 til opnåelse af en enkelt cellesuspension og tilsæt 800 ul CGM. Tæl cellerne (både levende og døde), og etablere deres levedygtighed. Resuspender 2 x 10 5 celler i 5 ml CGM og overførsel til en T25 cm 2 kolbe.
  4. Viral transduktion af NPC'ere for in vivo-sporing
    NB: For at kontrollere effektiviteten af ​​virustransduktion, opbygge en parallel vækstkurve med transducerede og nontransduced NPC'ere. Hertil kommer, at klonal effektivitet, der er det absolutte antal neurosfæreceller dannende celler til stede i en celle forberedelsening eller en analyse af DNA-indhold (med propidiumiodid, PI) cellecyklus, kan anvendes som yderligere indikationer af cellen status. Hvis procentdelen af ​​inficerede celler ikke bør være god, kan protokollen for virustransduktion gentages endnu en gang med den samme population af celler. Når niveauet af infektion er tilfredsstillende, og vækstkurven svarer til den, der opnås med vildtypeceller kan transducerede NPC udvides og / eller transplanteres.
    1. Harvest neurosfærerne og få en enkelt cellesuspension. Plate cellerne ved høj densitet (1,5 x 10 6 celler i en T75 cm2 kolbe) i 10 ml CGM.
    2. Efter 12 timer tilsættes 3 ​​x 10 6 TU / ml af en tredje generation lentivirusvektor pRRLsin. PPT-hCMV manipuleret med E. coli-afledt β-galactosidase (lacZ) eller grønt fluorescerende protein (GFP).
    3. 48 timer senere, høste celler centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter og replate cellerne i forholdet 1:1.
    4. Efter3 passager in vitro kontrollere effektiviteten af infektionen. Flowcytometri er almindeligt anvendt til at teste infektion effektivitet og tilfredsstillende niveau af infektion er almindeligt accepteret at være i størrelsesordenen 75-95% af positive celler. Kontroller igen effektiviteten af ​​infektion efter yderligere 3 passager af ekspansion at kontrollere opretholdelsen af ​​markøren ekspression.
  5. Neurosfære frysning
    1. Høste neurosfærer fra en T25 cm 2 kolbe centrifugeres ved 300 xg i 10 min, og supernatanten.
    2. Pelleten resuspenderes med 1 ml frysemedium (CGM med 10% dimethylsulfoxid (DMSO).
    3. Placer kryoglas ved -80 ° C under en frysning beholder.
    4. Efter mindst 24 timer flytte cellerne til en cryobox og opbevares ved -80 ° C i flere måneder, eller bringe til flydende nitrogen (N 2) for længere opbevaring.
  6. Neurosfære optøning
    NB: For at undgå de giftige virkninger af langvarig kontakt of NPC'ere med DMSO, skal optøningen være så hurtigt som muligt.
    1. Fjern cryovial fra -80 ° C / N 2 og holde det på tøris.
    2. Hurtigt tø hætteglasset på et vandbad, indtil næsten alle cellesuspensionen afrimes, og kun et lille stykke af iced suspensionen forbliver.
    3. Resuspender cellesuspensionen med 5 ml forvarmet frisk CGM.
    4. Centrifuger ved 300 xg i 10 min.
    5. Fjern supernatanten, resuspender forsigtigt med 5 ml frisk CGM og pladen cellesuspensionen i en ren, ubehandlet T25 cm2 kolbe.
  7. 1.7) NPC karakterisering
    NB: sidste vask PBS kan erstattes med 0,05% natriumazid-PBS at forebygge svampevækst eller kontaminering, og coverslides opbevares ved 4 ° C i 2-3 uger.

    NB: For at pletten for intracellulære markører tilføje en permeabiliserende middel til PBS i blokerende opløsning. Hvis kilden af ​​det primære antistof er ged, bovint serum albumin (BSA) eller serum, bortset geder bør anvendes.

    NB: For at pletten for intracellulære markører bruge en permeabiliserende agent i det primære antistof løsningen.
    1. Anbring et glas coverslide 13 mm på bunden af ​​en 24-brønds plade. Tilføj 150 pi coating løsning på toppen af ​​hver coverslide at skabe en lille dråbe. Inkuber i mindst 30 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
    2. Harvest neurosfærerne og dissocierer til opnåelse af en enkelt cellesuspension.
    3. Tæl levende celler og fortyndes for at opnå 80.000 cells/35 gl. Fjern overskud af coatingopløsningen fra coverslide ved forsigtig aspiration, og pladen de 35 pi cellesuspension.
    4. Inkuber 25 min ved 37 ° C, 5% CO2. Tjek hurtigt i kontrast fase mikroskop, hvis cellerne er begyndt at overholde.
    5. Forbered differentiering medium ved at blande basal mus medium med de relevante kosttilskud (se tabel 1) og antibiotika (PEn / Strep).
    6. Tilsæt 400 pi af differentiering medium og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2.
    7. Efter 3 DIV, ændre halvdelen af ​​mediet med frisk differentiering medium.
    8. Efter 6 DIV, skal du fjerne mediet og vaskes en gang med PBS. Under en kemisk hætte fjernes PBS, og der tilsættes 300 pi forvarmet 4% paraformaldehyd (PFA) 4% saccharose. Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Fjern PFA og vask 3 gange med PBS.
    9. For at fortsætte med immuncytokemi fjerne PBS og blokere med PBS 10% normalt gedeserum (NGS) (blokerende opløsning), og der inkuberes 1 time ved stuetemperatur.
    10. Den blokerende opløsning fjernes, og tilføje den ønskede primære antistof fortyndet med PBS, 1% NGS. Inkuber ved 4 ° CO / N eller alternativt 120 min ved stuetemperatur.
    11. Efter inkubation vaskes 2 gange med PBS. Inkuberes med det passende sekundære antistof fortyndet med PBS 1% NGS. Inkuber 60 minutter ved RT.
    12. Vask 2x med PBS og counter-plette kerner med 4 ',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) fortyndet 1:20.000 med PBS permeabiliserende middel i 3 minutter ved stuetemperatur i mørke. Vask to gange med PBS og en gang med destilleret vand.
    13. Put en dråbe montering medium på en glasvæv dias og med en pincet montere coverslide med cellerne overfor montage medium. Tryk forsigtigt coverslide at presse overskuddet af montage medium. Lad coverslide i mørke ved stuetemperatur, indtil montering medium tørres og opbevares ved 4 ° C.

2.. Myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG)-induceret eksperimentel Autoimmunitet i C57BI / 6 mus

  1. Fremstilling af emulsion
    1. På et bægerglas fremstilling af en emulsion bestående af inkomplet Freunds adjuvans indeholdende 4 mg / ml Mycobacterium tuberculosis [ellers defineres som komplet Freunds adjuvans (CFA)] og 200 ug MOG (peptid 35-55), i betragtning af, at den samlede mængde emulsion per mus vil være 300 pi.
      NB: Appropriate kontrol af MOG-immuniserede mus i CFA er mus immuniseret med kun CFA. Den forventede varians af sygdomsdebut i MOG-immuniserede mus er 11,3 (± 1,8) dpi.

      NB: Ved beregningen af ​​den samlede mængde af emulsion nødvendig, mener dobbelt så meget volumen som antallet af mus til immunisering. Glas bør foretrækkes at plastvarer at minimere spild af en del af emulsionen.
      1. Med et glas sprøjte besiddelse af en 19 G kanyle blanding i ca 30 min, altid holde emulsionen på is.
      2. At kontrollere, om emulsionen er klar, droppe en lille mængde emulsion på vand. Emulsionen er klar til at blive injiceret, hvis dråben forbliver som det er, og ikke spredes.
      3. Immunisere kontrolgruppen af ​​mus med kun CFA. Treat forsøgsmus (MOG immuniseret) med MOG i CFA. Den forventede varians af sygdomsdebut i MOG immuniserede mus er 11,3 (± 1,8) dpi.
    2. Overfør 19 G kanyle til en 1 ml plastsprøjte ennd aspirere emulsionen. Undgå bobler, skift nålen med en 25 G og lad sprøjten på is. Sprøjter fyldt med emulsionen er klar til at blive brugt og skal opbevares på is i et par timer.
  2. Vaccination
    1. Placer mus (6-8 uger gamle, hun) ind i en opvarmning kasse og vente i ca 10 minutter for at tillade halevenen til at spile.
    2. Overfør en mus fra opvarmning boksen til en mus fastholdelsesanlæg. Luk restrainer at undgå enhver bevægelse af musen.
    3. Fyld en 1 ml insulinsprøjte med 100 pi af pertussistoksin (5 ug / ml) undgå at bobler. Langsomt injicere opløsningen i halen vene. Fjern kanylen og presse på for et par sekunder med et stykke papir til at sætte blødningen.
    4. Placer musen tilbage i buret og gentage den samme procedure for alle mus.
    5. Bedøver en mus med kontinuerlig isofluran inhalation (1-2%, 2 L / min) og injicere 100 pi af emulsionen subkutant på det niveau,af de to flanker og haleroden (300 pi emulsion / mus). Langsomt fjerne sprøjten, undgå lækage af emulsionen.
    6. Mærk mus med en øre puncher, placere musene i buret og kontrollere indtil fuld helbredelse. Gentag for alle de mus.
    7. Efter 48 timer (2 dage efter immunisering, dpi) Gentag afsnit 2.2.3.
  3. Behavioral analyse af EAE-mus
    1. Fra 5 dpi, vejer mus dagligt og overvåge deres bevægeapparatet forestillinger ved hjælp af skalaen scoringssystem beskrevet i tabel 1.

3.. Injektion af neurale stam / stamceller i halevenen (iv)

  1. Cellepræparation
    1. Harvest neurosfærer ved centrifugering ved 300 xg i 10 min.
    2. Supernatanten fjernes, og der tilsættes 200 pi celleaggregatstørrelse dissociation løsning. Inkuber 10 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
    3. Forsigtigt resuspender 10-12x (avoiding bobler) med P200, indtil opnåelse af en enkelt cellesuspension og tage til 800 pi med basalt medium uden Ca2 + og Mg2 +.
    4. Tæl celler ved hjælp af en vital plet til analyse cellelevedygtighed og fortyndes suspensionen med basal medium uden Ca2 + og Mg2 + for at opnå en endelig densitet på 10 6 cells/150 pi. Hold cellesuspensionen på is indtil brug.
  2. NPC iv injektion
    NB: Den ideelle dissociation i enkelt celle suspension og fraværet af luftbobler er to vigtige aspekter at overveje at reducere risikoen for enten klumper / aggregater vs emboli formation, som kan resultere i veneokklusion og deraf følgende død.
    1. På toppen af ​​sygdommen (16-18 dpi) vejes og score mus. Fordel mus efter deres score for at have homogene grupper.
    2. Placer mus i en opvarmning kasse og vente i ca 10 minutter for at tillade halevenen til at spile. Overfør en mus fra opvarmning boksen til en mus fastholdelsesanlæg. Luk restrainer at undgå enhver bevægelse af musen.
    3. Fyld en 1 ml insulinsprøjte med 150 pi af cellesuspension og sørg for at fjerne alle boblerne. Injicer langsomt opløsningen i halevenen. Fjern kanylen og presse på for et par sekunder med et stykke papir for at sætte blødning (figur 6A og 6B).
    4. Placer musen i buret og kontrollere indtil bedring. Gentag den samme procedure for alle mus.

4.. Injektion af neurale stam / stamceller i Cisterna Magna (icv)

  1. Cellepræparation
    1. Harvest NPC'ere ved centrifugering ved 300 xg i 10 min.
    2. Supernatanten fjernes, og der tilsættes 200 pi celleaggregatstørrelse dissociation løsning. Inkuber 10 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
    3. Forsigtigt resuspender 10-12x med P200 indtil der opnås en enkelt cell suspension og tage til 800 pi med basal medium uden Ca 2 + og Mg 2 +.
    4. Tæl celler og fortyndes suspensionen med basal medium uden Ca2 + og Mg2 + for at opnå den ønskede celletæthed. Hold cellesuspensionen på is indtil brug.
  2. 4.2) NPC icv injektion
    1. På toppen af ​​sygdommen (16-18 dpi) vejes og score mus. Fordel mus efter deres score for at have homogene grupper.
    2. Anbring musen på en stereotaktisk apparat under konstant isofluran inhalation (1-2%, 2 L / min). Fastgør hovedet af musen med øret barer. Derefter justerer både mund og næse stykker. Sørg for, at lederen af ​​musen er flad og fast.
    3. Aftør hovedet af mus med povidon-iod (PVP-I) og lave et snit at skære huden på den bageste del af hovedet for at blotlægge kraniet.
    4. Ved hjælp af en mikromanipulator Indsæt spidsen af ​​en mikroliter sprøjten ind i kløft mellem nakkeknude og atlas ryghvirvel gennem de intakte muskler og ledbånd i midterlinjen på bagsiden af ​​halsen. Den bøjede del af nålen holdes i tæt kontakt med den indre overflade af occiput til hele længden som beskrevet 22.
    5. Pres langsomt kanylen og vent et par sekunder. Operatøren er beregnet til at lære at genkende følelsen af ​​nålen være "tilsluttet" til muse kraniet før start injicere præparatet celle. Injicer langsomt mængden af ​​celler (inden for 3-5 min.) Lad nålen på plads i yderligere nogle få sekunder efter injektionen, og fjern langsomt sprøjten.
    6. Sy huden op og placere musen i et opsving bur indtil fuld helbredelse.

5.. Vævsbehandling

  1. Dybt bedøve musene med en blanding af 0,5 ml ketamin (100 mg / ml), 0,25 ml xylazin (23,32 mg / ml) og 4,25 ml sterilt vand og transcardically perfuse, wforaskning med saltvand-EDTA og fastsættelse med 4% PFA. Fjern begge de rygsøjle og hjerne og postfix i 4% PFA i 12 timer ved 4 ° C. Vask vævet i PBS fjerne rygmarv fra knoglerne og lade vævet ved mindst 48 timer i 30% saccharose (i PBS) ved 4 ° C. Integrer væv i optimal skæring temperatur (OLT) sammensatte og snap fryse med flydende kvælstof, som beskrevet 2.
  2. Brug en mikrotom til at skære væv i 10-12 um tykke skiver.
  3. Alternativt indkapsle frisk væv i agarose og skære væv ved hjælp af et vibratom 50-80 um tykke skiver.
  4. I begge tilfælde inkuberes O / N ved 37 ° C i 5-brom-4-chlor-3-indolyl-β D-galactopyranosid (X-gal) opløsning til at detektere nuklear aktivitet β-galactosidase.
  5. Recut afsnit med β-gal +-celler i 5 um skiver og dobbelt pletten med antiglial fibrillært surt protein (GFAP) for astrocytes (50 ug / ml), antineuronal nuklear antigen (neun) til neuroner (1 &# 956 g / ml) og antiNestin for udifferentierede neurale celler (10 ug / ml).
  6. Fortsæt som beskrevet i afsnit 1.7.11 og 1.7.12. Til flere farvninger sørg for at bruge sekundære antistoffer konjugeret med forskellige fluoroforer.
  7. For væv, som indeholder GFP mærkede celler frem som forklaret i trin 5,1-5,3 og fortsætte med de mange farvninger.
  8. Tilføj nogle dråber montering medium til dias og dække med en serviet dækglas.
  9. For sektioner farvet med biotin konjugerede antistoffer forberede en opløsning af avidin biotin kompleks (ABC løsning, se tabel 2) og lad i agitation i 45 min.
  10. Inkubér skiver 5 minutter med 1% H 2 O 2 til at blokere aktiviteten af endogen peroxidaseaktivitet.
  11. Vaskes to gange med PBS.
  12. Inkuberes med ABC-opløsning i 1 time ved stuetemperatur.
  13. Vaskes to gange med PBS.
  14. Inkuberes med 3,3 '-diaminobenzidin-opløsning og 0,3% H 2 O 2. Overvåg reaktionen unwho et mikroskop og vask med PBS, så snart skive begynde at få brun (normalt omkring 5-10 min.)
  15. Vask to gange med PBS, og fortsæt som beskrevet i trin 5.7.

Omfattende liste af materialer og reagenser, er vist i tabel 2..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NPC afledning og karakterisering
SVZ dissektioner udføres på puljer (n = 5-7 mus / pool) på 6-8 uger gamle C57BL / 6 mus ved hjælp af mekanisk og enzymatisk dissociation (figur 1A). Efter et par dage med dyrkning i CGM, frit svævende neurosfærer begynde at danne (figur 1A og 1B). Primære kugler indsamles og mekanisk passeret hver 4-5 DIV. Efter passage, antallet af levende og døde celler konstateret og kumulative celleantal afbildes til at generere en vækstkurve (figur 1C). Dette giver en indikation af udbredelseshastighed, hvilket giver en indirekte parameter for at evaluere den globale stabilitet NPC præparatet. Når prolifererende som neurosfærer, NPC udtrykke markører af mitotisk aktivitet (phospho-histon H3, PHH3, 5 ug / ml) og af udifferentierede neurale celler (fx Nestin) (figur 2A). Udifferentierede NPC, der skal være terapeutisk efficacious i EAE efter transplantation skal udtrykke celleoverflade-adhæsionsmolekyler, der omfatter CD44 (5 pg / ml), den α4-underenheden af VLA-4 (10 ug / ml) (figur 2F). Når udpladet under passende differentiering betingelser NPC udtrykke markører er typiske for de tre neurale slægter, (Figur 2B), såsom astroglial markør GFAP (Figur 2C), den neuronale markør mikrotubulus-associeret protein-2 (MAP-2, 5 ug / ml ) (figur 2D) og oligodendrogliale markører O4 (5 ug / ml) og myelin basic protein (MBP; 10 ug / ml) (figur 2E), hvilket bekræfter, at NPC er multipotente over for de tre vigtigste neurale cellelinier. For at lette identifikationen af transplanterede celler in vivo, er NPC'ere transduceres med lentivira manipuleret til stabilt udtrykker reportergener såsom GFP. Transducerede NPC'ere udtrykker GFP både som prolifererende neurosfærer (3A og 3C) samt at differentiere in vitro ved vækstfaktor tilbagetrækning (figur 3B). For at verificere effektiviteten af ​​transduktion, er udtryk for GFP analyseret ved flowcytometri, der starter så tidligt som 3 passager efter celle transduktion (som er at tillade tilstrækkelig tid til at have robust udtryk af det indførte transgen på protein niveau). Ved anvendelse af tredje generation lentivira til NPC'ere in vitro, vi konsekvent observere> 90% af cellerne viser høje niveauer af GFP over flere uafhængige forsøg (figur 3C), hvor ingen åbenbar toksicitet eller ændringer i proliferation, når man sammenligner vækstkurver vildtype og Lenti-GFP-transducerede NPC'ere (figur 3D).

Kronisk EAE-induktion
EAE er en af ​​de bedst karakteriserede modeller af MS, da den sammenfatter de fleste af de patologiske og kliniske begivenheder i MS. Immunisering af C57BI / 6 mus med MOG35-55 fører til UDVIKLINGSt en kronisk form af EAE. Når man nærmer sig sygdomsdebut (11,3 ± 1,8 dpi) under induktion fase (præklinisk), MOG immuniserede mus begynde at tabe vægt (figur 4A). Ved begyndelsen af ​​effektor / invasion fase (peak klinisk, 16,8 ± 3,2 dpi) EAE mus nå toppen af ​​sygdommen (score 3,5 ± 0,7), og kort efter at have toppet de viser en progressiv og delvis genopretning, der til sidst stabiliseres i løbet af den kroniske fase (stabil klinisk) fra omkring 30 dpi fremefter (vurdering 2,8 ± 0,9) (figur 4B). Talrige undersøgelser, herunder nogle undersøger EAE ved enten intravital mikroskopi 23 eller magnetisk resonans 24, parret med in vivo væv patologi, har identificeret i toppen af effektor / invasion fase (16-22 dpi) den ideelle vindue af muligheder (WoO) til at udføre systemiske eksperimentelle behandlinger med stamceller som skal indgå i kronisk betændt EAE CNS og beskytte det mod sekundær dAmage.

NPC injektion
Syngene NPC'ere injiceret systemisk i EAE-mus (figur 6) findes næsten udelukkende i perivaskulære områder af CNS-skader, både i hjernen (figur 5A) og rygmarven (figur 5B-D), op til 45 dage efter transplantation (dpt) som beskrevet 5. iv. injicerede NPC'ere fortrinsvis bevarer en umoden, Nestin + (figur 5C) fænotype, mens nogle NPC'ere bevæger sig ud af den perivaskulære område udtrykker Neun (figur 5D). Notatet, NPC'ere injiceret iv ind i raske kontrolpersoner ikke indtaster den CNS via vaskulære vej (figur 5E). Efter iv NPC injektion, er et betydeligt antal injicerede NPC'ere findes på niveauet af ikke-CNS organer såsom lever, tarm, milt, lunge og nyre, men ikke i hjertet, så tidligt som 10 dpt (figur 5F). Ikke-CNS akkumulerende NPC'ere er helt ryddet ud af THES e perifere organer efter 30 DPT (figur 5G).

Figur 1
Fig. 1. Isolering af NPC fra SVZ af voksne mus og generering af stabilt ekspanderbare NPC linjer. A Skematisk gengivelse af de vigtigste kritiske trin i frembringelsen af stabilt udvides, og fremstillingen af injicerbare mus NPC. B, Neurosphærer in vitro. C , NPC dyrket som neurosfærer passeres hver 4-5 dage. Antallet af levende og døde celler opsamles og kumulative celleantal afbildes til at generere en vækstkurve. Skalaen bar i B er 200 um. Data i C er gennemsnitlige kumulative antal celler ± SD (n = 3).

gur 2 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51154/51154fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51154/51154fig2.jpg "/>
Figur 2.. NPC'ere karakterisering. A, prolifererende mus neurosfærer udtrykke PHH3 kerne histon-protein (grøn), og den type VI mellemliggende filamentprotein Nestin (rød). BE, efter 6 DIV i differentiering betingelser, NPC'ere er multipotente mod astroglial (GFAP, rød i C), neuronal (MAP-2, grøn i D) og oligodendroglial (O4, grøn i E, og MBP, rød i E) slægter. Kvantificering af GFAP-, MAP-2-og O4-udtrykkende celler ved 6 DIV efter NPC differentiering in vitro er vist i B. Data i B er som gennemsnit% ± SD (n = 3). Skalaen barer i CE er 50 mM. F, flowcytometri analyse af ekspressionen af de vigtigste celleoverflade adhæsionsmolekyler regulerer leukocyte ekstravasation i mus neurosfærer. Figur 2F er gengivet fra Pluchino et al. 2.

Figur 3
Fig. 3. Transduktion af NPC med lentivirus udtrykker reportergener (fx GFP. A og B, fasekontrast billeder af neurosfærer (A) og differentierende NPC (B), der er blevet transduceret med en 3. generation lenti-GFP-vektoren. Flowcytometrianalyse af NPC i A. C Vildtype (ikke transduceres) og lenti-GFP-transducerede NPC dyrket som neurosfærer passeres hver 4-5 dage. Antallet af levende og døde celler opsamles og kumulative celleantal afbildes til at generere en vækstkurve. Skalaen bar iA og B er 200 um. Data i C er gennemsnitlige kumulative antal celler ± SD (n = 3).

Figur 4
Fig. 4. Funktionel karakterisering af kronisk EAE. A, daglig vægt overvågning i MOG-og CFA-immuniserede C57BI / 6 mus over en samlet opfølgning på 40 dpi. B, daglig EAE score overvågning i MOG-og CFA-immuniserede C57BL / 6 mus over en samlet opfølgning på 40 dpi . Data er udtrykt som middelværdier tal ± SD (n = 10 mus / gruppe).

Figur 5
Figur 5.. Systemisk injicerede NPC'ere migrspiste i parenkym EAE-mus. AE, X-gal-farvning af vibratom-snit (70 um) hjerne (A) og rygmarv (B) vævssnit fra EAE-mus injiceret iv med syngene NPC, der viser transplanterede β-gal +-celler ( blå celler) vedvarende inden for perivaskulære CNS områder indtil udgangen af den kliniske opfølgning (106 dpi). C, β-gal + iv.-injicerede NPC (blå) vedvarende inden for perivaskulære CNS områder, bevarer en Nestin + (brun) fænotype. D , få migrerer NPC'ere udtrykker Neun + (brun), så længe de bevæger sig ud af perivaskulære område. E, X-gal farvning i et repræsentativt rygmarv sektion fra en farce-behandlede EAE mus. . Skalapanelerne, 20 um FG, analyse af andre end CNS væv viser, at IC -. Eller iv.-Injicerede NPC'ere (blå celler) nå stort set alle organer (. F.eks lunge, lever, milt, hjerte, tarm, nyre) within 10 dpt (F), men er fjernet fra de samme organer med 30 dpt (G). Figur 5A-E er gengivet fra henvisning 5, mens Figur 5F-G er gengivet fra Pluchino et al. 2.

Figur 6
. Figur 6 Skematisk fremstilling af protokollen for systemisk injektion af NPC'ere i mus med EAE vigtigste kritiske trin i den systemisk injektion af NPC'ere i mus med EAE:. Fra forberedelsen af injicerbar CAM udtrykke enkelt celle dissocieret NPC'ere cellekultur værelse (A) til injektion i halevenen af EAE-mus på toppen af fase effektor / invasion sygdom (B) mod in vivo-påvisning af de injicerede NPC, der målrettetCNS (C) til in vivo vævspatologiske undersøgelser muliggør studiet af mekanismerne for terapeutisk plasticitet af injicerede NPC (D). I D, grønne celler i er oligodendrocytter, mørkeblå celler er axoner, er lyseblå celler transplanteret NPC'ere, appelsin celler er astrocytter, og røde blodlegemer er endothelceller.

<td> 2.5
Score Locomotor Responses
0 Normal mus. Ingen åbenlyse tegn på sygdom
1 Slap hale: fuldstændig slap tilstand af halen, og fravær af curling på spidsen af ​​halen, når en mus afhentet
1.5 Bagbenssvaghed: musen viser lejlighedsvise og korte trippings, når du går på en Waddling gangart
2 Limp hale og bagben svaghed: når de placeres på ryggen, kan musen ikke henvende sig til sin normale position
Delvis bagbensparalyse: musen kan ikke længere bruge bagbenene at opretholde bagdel kropsholdning eller gå, men kan stadig bevæge en eller begge bagben til en vis grad, forlemmer forblive upåvirket
3 Komplet bagbensparalyse: totalt tab af bevægelse i bagben. Musen slæber sig kun på sine forlemmer, som forbliver upåvirket. Mus i denne fase får mad på buret gulvet, lange sipper rør og daglig subkutan injektion af fugtgivende løsninger for at undgå dehydrering. Hvis mus udvikler sår eller hudlæsioner, der ikke gendanne med behandling, vil de blive aflivet på en human
3.5 Forben svaghed: når sted på en lodret gitter, musen ikke er i stand til at klatre og langsomt falder
4. Døende tilstand
5. Mus er fundet døde eller aflivet i henhold til humane endpoints

Taligt 1.. Fem trin skala af kliniske tegn og stigende lammelse i EAE-mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Somatiske stamceller baserede terapier dukker op som en af de mest lovende strategier til behandling af kroniske inflammatoriske CNS-lidelser, såsom MS2 11. Mens stadig skal være helt klarlagt de mekanismer bevare deres terapeutiske virkninger, har den store betydning af NPC transplantation i forskellige eksperimentelle modeller for neurodegenerative sygdomme givet anledning til den noget provokerende tro på, at stamceller kan snart blive anvendt i humane studier. Men inden man overvejer eventuelle menneskelige anvendelser af sådanne innovative behandlinger, vi har brug for at stå over for nogle centrale spørgsmål og behandle nogle ubesvarede spørgsmål, såsom identifikation af den ideelle stamceller kilde til transplantation (autolog versus allogen, pluripotent vs multipotent), og den bedste rute administration.

Neurodegenerative sygdomme er forskellige i deres patofysiologier, med nogle er rumligt begrænset (f.eks. Rygmarv ijury, slagtilfælde), mens andre er kendetegnet ved en rumlig tidsmæssig spredning (f.eks MS). Det stammer at omdrejningspunktet injektion af (stamceller) celler kan være en passende behandling for det tidligere, mens det kan være utilstrækkelig eller simpelthen umuligt for sidstnævnte, hvor tilstedeværelsen af ​​flere sites på hjerneskade udgør en yderligere udfordring, der skal overvindes.

Konsekvent dokumentation har vist, at intravenøs levering kan repræsentere en gyldig (lav og invasive) protokol for celle administration, der støttes af den iboende evne af stamceller til at fornemme miljøet og specifikt hjem mod site (s) for skader. Imidlertid translation af systemiske NPC behandlinger i klinikker stadig hæmmet af nogle få begrænsninger, såsom en mulig ophobning af transplanterede celler i perifere ikke-CNS-organer (fx lunger, milt, lymfeknuder og nyrer), som måske eller måske ikke være steder lokale inflammatoriske reaktioner in vivo. Mens dette uspecifik accumfolkning af injicerede NPC'ere ud af målet CNS hurtigt ryddet i mus med kronisk EAE2, der er tegn på lang sigt NPC vedholdenhed (eller i nogle tilfælde eksklusiv målretning) på niveau med de sekundære lymfoide organer (f.eks. lymfeknuder og milt) efter systemisk injektion i mus med recidiverende EAE5 19,20. Det faktum, at et betydeligt antal transplanterede NPC'ere recirkulere mod non-CNS organer skaber en udvanding, uundgåeligt reducere det absolutte antal NPC'ere i CNS. Interessant, systemisk injicerede NPC'ere er terapeutisk effektive (fx via immune reguleringsindgreb), selv når akkumulere udelukkende ud af CNS 19,20. Og de overordnede terapeutiske virkninger af injicerede NPC'ere rettet mod CNS kun 5 eller lymfeknuderne kun 19 er sammenlignelige. Dette kan delvis skyldes en indre plasticitet af cellerne, som reagerer forskelligt på de molekylære komponenter i surrounding mikromiljø. Især hvis den på den ene side transplanterede NPC'ere kan føle tilstedeværelsen af inflammatoriske cytokiner og udøve deres terapeutiske effekt gennem immun modulerende mekanismer 16, på den anden side, de kan komme i kontakt med fjendtlige mikromiljøer i sidste ende fører til dannelse af tumorer 25,26. Af disse grunde er den foretrukne løsning er på nuværende tidspunkt at koncentrere injicerede NPC'ere i CNS. Som sådan intratekal administration (via en lumbal eller cisternal rute) er stadig den mest accepterede prospektive administrationsvej i kliniske forsøg. Den multifocality og patologisk heterogenitet MS-læsioner, kan dog begrænse effekten af ​​en sådan fremgangsmåde.

Her beskriver vi en effektiv protokol til at isolere, vedligeholde og karakterisere mus neurale progenitorer fra den voksne SVZ og successivt, hvordan systemisk (både iv og icv) injicere NPC'ere i mus er ramt af kronisk EAE, en af de mest studøde modeller af MS. Selvom relativt enkel og ligetil, disse protokoller præsentere nogle vigtige skridt, der skal tages i betragtning. I første omgang er det obligatorisk at få et stabilt udvides og sund forberedelse celle. Som beskrevet hele protokollen kan stabiliteten af ​​cellerne indirekte udledes ved at se på deres vækstrate. Ideelt set bør neurosfærer nå en diameter på 150-200 um hver 4-5 DIV og den procentdel af celledød ved passager skal være meget lav (mindre end 10%). Desuden skal neurosfærer præsentere en kompakt og regelmæssig rund form i mikroskop. Infektionen med lentivira kan interferere med overlevelse og stabilitet af cellerne. For at opnå en optimal infektion, er det obligatorisk at opnå en titrering af virus af interesse tilstrækkeligt til at opnå 3 x 10 6 TU / ml. Faktisk, mens det på den ene side en lille mængde virus ville føre til en lille procentdel af inficerede celler på den anden side anvendelsen af ​​en stor mængde would sandsynligvis føre til en giftighed effekt (stærkt afhængig af genet for at være inficeret). NPC'ere kan blive smittet flere gange med at integrere vira, bør resultatet af den første transduktion føre til lav procentdel af transgene positive levedygtige celler. Det er altid en god ide at have intra eksperimenterende sammenligning af stabilitet og levedygtighed parametre med vildtype, nontransduced kontrollerer NPC'ere. Med hensyn til induktion af kronisk EAE er den mest problematiske del repræsenteret ved fremstilling af emulsionen. Som beskrevet skal glasvarer og is være brug på alle tidspunkter. Fremstillingen af ​​emulsionen tager 30-45 minutter, og det kan anses for klar til at blive injiceret, når det ikke spredes, når faldt på vand. Hvis emulsionen forsvinder i vand, betyder det, det er endnu ikke klar, og kræver yderligere blanding.

God nøjagtighed under injektion procedure iv ved celle administration er kritisk. Først, er det ekstremt vigtigt at have såIngle celle suspension, som injektion af aggregerede celler kan blokere venerne i den injicerede mus og føre til dens umiddelbare død. For at sikre den korrekte placering af kanylen ind i venen, er det god praksis at aspirere med sprøjte få mikroliter blod. I tilfælde af ingen blod, der kommer ind i sprøjten, skal operatøren langsomt flytte nålen frem eller tilbage, indtil den korrekte placering er fundet. Først på dette tidspunkt kan cellesuspensionen langsomt injiceres. Vigtigere er det, bør operatøren typisk ikke være forpligtet til at anvende nogen form for pres på sprøjten, da væsken nemt skal flyde i venen. En forkert injektion vil uundgåeligt resultere i en subkutan hævelse svarende til injektionsstedet.

Det er værd at bemærke, at i den nærmeste fremtid systemisk injiceret NPCs2, 27, er genetisk modificeret eller ej, kan i sig selv udgøre en terapeutisk mulighed, samt give et vigtigt redskab til at levere immun modulatory og / eller neuroprotektive stoffer og pro remyelinating agenter direkte i CNS 28. Derfor, mens nogle begrænsninger relateret til den systemiske levering af NPC'ere findes, både iv. og ICV. ruter kan i sidste ende repræsentere gyldige alternativ terapeutisk tilgang i de sygdomme, hvor omdrejningspunktet injektion af celler kan ikke udgøre den gyldne standard-protokol for behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Jayden Smith for en kritisk gennemgang og bevis redigere manuskriptet. Dette arbejde har modtaget støtte fra National Scleroseforeningen (NMS'er, delvise tilskud RG-4001-A1), den italienske Multipel Sclerose Association (AISM indrømme 2010/R/31), det italienske sundhedsministerium (GR08-7), Wings for Life, Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under ERC-2010-StG tilskudsaftale nr. 260.511-SEM_SEM og Det Europæiske Fællesskab (EF) 7. rammeprogram (FP7/2007-2013) under tilskudsaftale n * deg; 280.772 - Ione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
EBSS Sigma E2888
L-Cystein Sigma Aldrich C7352
Papain Worthington 30H11965
EDTA Fisher Scientific D/0700/50
Mouse NeuroCult basal medium Stem Cell Technologies 05700
NeuroCult proliferation supplements Stem Cell Technologies 05701
Heparin Sigma H3393
Basic fibroblast growth factor Peprotech 100-18B-1000
Epidermal growth factor Peprotech AF-100-15-1000
Pen/Strep Invitrogen 1514012
Matrigel (coating solution) BD Biosciences 354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) Stem Cell Technologies 05704
Accumax eBioscience 00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg PAA Laboratories H15-011
Myco trace PAA Laboratories Q052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Immunofluorescence
Normal goat serum PAA Laboratories B11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether Sigma Aldrich T8787
Mouse anti Nestin Abcam ab11306
Rabbit anti GFAP DAKO 203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10)  Abcam ab14955
Rabbit anti MAP-2 Abcam ab32454
Rat anti MBP AbD SEROTEC MCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 Millipore MAB345
DAPI Invitrogen D1306
Mounting solution DAKO S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incomplete Sigma Aldrich F5506
Mycobacterium tuberculosis DIFCO H37Ra
MOG(35–55)  Espikem
Pertussis toxin List Biological Laboratories 181
Tissue processing
Iris scissor straight Fine Sciences Tools 14060-09
Blunt/bended forceps Fine Sciences Tools 11080-02
Brain slicer Zivic Instruments BSMAS005-1
Surgical blades Swann-Morton 324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar) Boehringer Ingelheim 01LC0030
Xylazine (Rompun) Bayer 32371
Stereotaxic frame KOPF Model 900
Hamilton syringe Hamilton 7762-04
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 158127
VECTASTAIN Elite ABC Kit Vector Laboratories PK-6100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ben-Hur, T., et al. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 41, 73-80 (2003).
  2. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, 688-694 (2003).
  3. Chu, K., Kim, M., Jeong, S. W., Kim, S. U., Yoon, B. W. Human neural stem cells can migrate, differentiate, and integrate after intravenous transplantation in adult rats with transient forebrain ischemia. Neurosci. Lett. 343, 129-133 (2003).
  4. Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14, 634-644 (2008).
  5. Pluchino, S., et al. Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism. Nature. 436, 266-271 (2005).
  6. Einstein, O., et al. Intraventricular transplantation of neural precursor cell spheres attenuates acute experimental allergic encephalomyelitis. Mol. Cell Neurosci. 24, 1074-1082 (2003).
  7. Chu, K., et al. Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus in adult rats. Brain Res. 1023, 213-221 (2004).
  8. Jeong, S. W., et al. Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage. Stroke. 34, 2258-2263 (2003).
  9. Aboody, K. S., et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12846-12851 (2000).
  10. Muller, F. J., Snyder, E. Y., Loring, J. F. Gene therapy: can neural stem cells deliver. Nat. Rev. Neurosci. 7, 75-84 (2006).
  11. Martino, G., Pluchino, S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nat. Rev. Neurosci. 7, 395-406 (2006).
  12. Deckert-Schluter, M., Schluter, D., Hof, H., Wiestler, O. D., Lassmann, H. Differential expression of ICAM-1, VCAM-1 and their ligands LFA-1, Mac-1, CD43, VLA-4, and MHC class II antigens in murine Toxoplasma encephalitis: a light microscopic and ultrastructural immunohistochemical study. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 457-468 (1994).
  13. Hemmer, B., Archelos, J. J., Hartung, H. P. New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis. Nat. Rev. Neurosci. 3, 291-301 (2002).
  14. Butcher, E. C., Picker, L. J. Lymphocyte homing and homeostasis. Science. 272, 60-66 (1996).
  15. Rampon, C., et al. Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44. Stem Cells. 26, 1673-1682 (2008).
  16. Pluchino, S., et al. Human neural stem cells ameliorate autoimmune encephalomyelitis in non-human primates. Ann. Neurol. 66, 343-354 (2009).
  17. Martino, G., Pluchino, S., Bonfanti, L., Schwartz, M. Brain regeneration in physiology and pathology: the immune signature driving therapeutic plasticity of neural stem cells. Physiol. Rev. 91, 1281-1304 (2011).
  18. Aharonowiz, M., et al. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiple sclerosis. PLoS ONE. 3, e3145 (2008).
  19. Pluchino, S., et al. Immune regulatory neural stem/precursor cells protect from central nervous system autoimmunity by restraining dendritic cell function. PLoS One. 4, (2009).
  20. Einstein, O., et al. Neural precursors attenuate autoimmune encephalomyelitis by peripheral immunosuppression. Ann. Neurol. 61, 209-218 (2007).
  21. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J. Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
  22. Furlan, R., Pluchino, S., Marconi, P. C., Martino, G. Cytokine gene delivery into the central nervous system using intrathecally injected nonreplicative viral vectors. Methods Mol. Biol. 215, 279-289 (2003).
  23. Constantin, G. Visualization and analysis of adhesive events in brain microvessels by using intravital microscopy. Methods Mol. Biol. 239, 189-198 (2004).
  24. Politi, L. S., et al. Magnetic-resonance-based tracking and quantification of intravenously injected neural stem cell accumulation in the brains of mice with experimental multiple sclerosis. Stem Cells. 25, 2583-2592 (2007).
  25. Melzi, R., et al. Co-graft of allogeneic immune regulatory neural stem cells (NPC) and pancreatic islets mediates tolerance, while inducing NPC-derived tumors in mice. PLoS One. 5, (2010).
  26. Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, (2009).
  27. Ben-Hur, T., et al. Effects of proinflammatory cytokines on the growth, fate, and motility of multipotential neural precursor cells. Mol. Cell Neurosci. 24, 623-631 (2003).
  28. Giusto, E., Donega, M., Cossetti, C., Pluchino, S. Neuro-immune interactions of neural stem cell transplants: From animal disease models to human trials. Exp. Neurol. , (2013).

Tags

Immunologi somatiske neurale stamceller / precursorceller neurodegenerative sygdomme regenerativ medicin multipel sklerose eksperimentel autoimmun encephalomyelitis systemisk levering intravenøs intracerebroventrikulær
Systemisk injektion af neurale stam / stamceller i mus med kronisk EAE
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donegà, M., Giusto, E.,… More

Donegà, M., Giusto, E., Cossetti, C., Schaeffer, J., Pluchino, S. Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE. J. Vis. Exp. (86), e51154, doi:10.3791/51154 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter