Summary
زرع الخلايا الجذعية / السلف العصبية (الشخصيات) يحمل وعودا كبيرة في الأعصاب التجدد. تحولت تسليم النظامية من الشخصيات في انخفاض الغازية، وعلاجية فعالة جدا بروتوكول فعالة، لتقديم الخلايا الجذعية في الدماغ والحبل الشوكي من القوارض والرئيسيات غير البشرية تتأثر التجريبية الضرر التهابات مزمنة في الجهاز العصبي المركزي.
Abstract
الخلايا الجذعية / العصبية السلائف (الشخصيات) هي مصدر الخلايا الجذعية واعدة للمناهج تهدف إلى زرع إصلاح الدماغ أو ترميم الأعصاب في التجدد. وقد نشأ هذا التوجيه من الأدلة الوفيرة على أن يتحقق إصلاح الدماغ بعد تنسيق أو النظامية زرع مجلس الشعب في العديد من النماذج قبل السريرية للأمراض العصبية.
وقد حددت هذه البيانات التجريبية الطريق تسليم خلية واحدة من العقبات الرئيسية لالتصالحية العلاج بالخلايا الجذعية لأمراض الدماغ التي تتطلب تقييم عاجلة. يمثل Intraparenchymal ترقيع الخلايا الجذعية نهج منطقي لتلك الأمراض التي تتميز آفات الدماغ معزولة ويمكن الوصول إليها مثل إصابات الحبل الشوكي ومرض باركنسون. للأسف، وهذا المبدأ ينطبق بشكل سيئ لظروف تتميز الطبيعة متعددة البؤر، التهابات ونشرها (سواء في الزمان والمكان)، بما في ذلك مرض التصلب المتعدد (MS). على هذا النحو، الدماغ استهداف SYSTأصبح EMIC تسليم مجلس الشعب منخفض بروتوكول الغازية وفعالة علاجيا لتقديم الخلايا إلى الدماغ والحبل الشوكي من القوارض والرئيسيات غير البشرية تتأثر التجريبية الضرر التهابات مزمنة في الجهاز العصبي المركزي (CNS).
هذه الطريقة بديل من تسليم خلية يعتمد على توجه للنسيج المريض مجلس الشعب، وتحديدا القدرة الفطرية ل(ط) بمعنى البيئة وظيفية عبر جزيئات التصاق الخلية وخلوى وchemokine مستقبلات التهابات؛ (ب) عبور الحواجز التشريحية تسرب بعد الوريد (رابعا) أو intracerebroventricular (ICV) الحقن؛ (ج) تتراكم على مستوى الموقع حول الوعاء متعددة (ق) من التهابات الدماغ والنخاع الشوكي الضرر؛ و (iv) ممارسة التغذية الأنسجة ملحوظا والآثار التنظيمية المناعة على الخلايا المستهدفة المضيف مختلفة في الجسم الحي.
نحن هنا وصف الطرق التي قمنا بتطويرها لد. و<م> تسليم ICV من الشخصيات مسانج في الفئران مع التهاب الدماغ التجريبية المناعة الذاتية (EAE)، ونموذج من الجهاز العصبي المركزي إزالة الميالين المزمن التهابات، وتتوخى تسليم خلية جذعية النظامية كأسلوب قيمة لاستهداف انتقائي من الدماغ ملتهبة في علم الأعصاب التجدد.
Introduction
نشأت أدلة قوية مستمدة من الدراسات المجراة مما يدل على الكفاءة العلاجية من زرع الخلايا الجذعية العصبية الجسدية / السلائف (الشخصيات) في النماذج الحيوانية من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي 1-8. ومع ذلك، هناك عدد من القضايا المتعلقة إيصال الخلايا الجذعية إلى المضيف تتطلب دراسة متأنية قبل أن تترجم هذه النتائج التجريبية في التطبيقات السريرية. وهناك عقبة كبيرة لا سيما من أجل وضع (nonhematopoietic) التصالحية العلاج بالخلايا الجذعية لمتعددة البؤر، أمراض الدماغ المزمنة التهابات هو تحديد الطريق الأمثل لحقن مجلس الشعب. فهم شركة الفيزيولوجيا المرضية للمرض المستهدفة (تنسيق أو متعددة البؤر؛ الأولية التنكسية التهابات أو الأساسي)، وتحليل حذرا من القضايا الجدوى والمخاطر المرتبطة التقنيات تسليم في تحديد البروتوكول الأمثل للتسليم الخلايا الجذعية.
في حين أن التنسيق (
ظهرت عدا كبيرا من الملاحظات التي الشخصيات استهداف الورم داخل القحف (على سبيل المثال. دبقي) في الفئران عندما تم حقنها intravascularly خارج CNS9. تتبع هذا المنويةفي الجسم الحي من الأدلة pathotrophism الخلايا الجذعية 10، وقد تراكمت البيانات واسعة النطاق تتعلق الجدوى والنجاعة العلاجية للزرع النظامية من الشخصيات في الحيوانات المختبرية مع التهاب الدماغ التجريبية المناعة الذاتية (EAE)، كنموذج للالتهابات الضرر العصبي المركزي، إما عن طريق الوريد (د) أو intracerebroventricular (ICV). مجلس الشعب حقن 1،2،5،6،8 .. لقد عرض لأول مرة أن هذا يعتمد على القدرة على زرع لاستهداف الشخصيات وأدخل CNS ملتهبة، والدخول في وقت لاحق بين الخلايا متعددة برامج الاتصالات داخل microenvironments محددة في الجسم الحي 11. من أجل خصيصا لاستهداف الجهاز العصبي المركزي، ويتم تسليمها الشخصيات مباشرة في السائل النخاعي (CSF) الدورة الدموية عن طريق الحقن ICV، أو في مجرى الدم عن طريق الحقن د. مرة واحدة إما دخول مجرى الدم أو السائل النخاعي، الشخصيات زرع تتفاعل بنشاط معوالدم في الدماغ (BBB) أو الدم السائل النخاعي (BCSFB) الحواجز وأدخل حمة الجهاز العصبي المركزي. وينظم هذا التفاعل بين مجلس الشعب والكسب غير المشروع BBB (أو BCSFB) من خلال مجموعة محددة من سطح مجلس الشعب جزيئات التصاق الخلية (الحدب) ويسر عن طريق التعبير عن مستويات عالية من CAM مكافحة بروابط على تنشيط البطانية / خلايا البطانة العصبية 12-14. أمثلة من هذه الحدب تشمل مستقبلات للهيالورونات، CD44، وجزيء التصاق بين الخلايا (ICAM) -1 يجند في وقت متأخر جدا المستضد (VLA) -4 5،15،16 (أنه في الكريات البيض، هي المسؤولة عن التفاعل مع البطانة العصبية تفعيلها والخلايا البطانية)، وإلى حد أقل بكثير اللمفاويات وظيفة المرتبطة مستضد (LFA) -1 و ف selectin بروتين سكري يجند (PSGL) -1. الشخصيات أيضا أن أعرب عن مجموعة واسعة من المستقبلات chemokine، بما في ذلك CCR1، CCR2، CCR5، CXCR3، وCXCR4 (ولكن لا تعبر عن CCR3 وCCR7)، والتي هي وظيفيا نشطة، سواء في المختبر والمجراة 5،16. وبالتالي، systemicaالشخصيات حقن LLY استخدام هذه الحدب، جنبا إلى جنب مع G-مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs)، لتتراكم على مستوى الجهاز العصبي المركزي ملتهبة. على العكس، حقن الشخصيات بشكل منتظم في الفئران صحية لا تدخل الجهاز العصبي المركزي عن طريق الأوعية الدموية أو المسارات الفضاء السائل النخاعي 2. CNS التهاب، أو البطانية / تنشيط الخلايا البطانة العصبية التالية خلوى النظامية أو lypopolisaccharide (LPS) حقن كنموذج للالتهاب الدماغ الناجم عن كيميائيا، لذا فمن الضروري لتراكم الشخصيات حقن منتظم في الدماغ والحبل الشوكي 2. وبالتالي، والاستهداف الناجح لCNS مع العلاجات مجلس الشعب النظامية تعتمد على تحديد نافذة معينة المرض الفرص (وو) التي الدماغ والحبل الشوكي بيئة تفضي إلى تراكم والهجرة transendothelial من الشخصيات. تنشأ مثل هذه الظروف عادة في سياق الحاد وتحت الحاد التهاب 17. مرة واحدة بعد أن دخلت الجهاز العصبي المركزي، زرع الشخصيات غير متمايزةوقد تبين لتحسين ميزات الممارسة الطبية السريرية المرضية من الفئران وكذلك أكبر، الرئيسيات غير البشرية مع EAE. وقد وصفت هذه أن تعتمد الحد الأدنى من استبدال الخلايا وإفراز 2 ملحوظا من عوامل المناعة نظير الصماوي التنظيمية واعصاب داخل الجهاز العصبي المركزي حول الوعاء 2،5،6،18 مقابل غير CNS المناطق الملتهبة 19،20 (مثل العقد الليمفاوية) في استجابة لل إشارة الخلية التهابات التي تسببها تسلل الخلايا المناعية 5.
هنا نحن تصف الجوانب المنهجية الأساسية لحقن النظامية من الشخصيات الجسدية في نموذج الفأر من EAE المزمن. وبشكل أكثر تحديدا، يمكننا تعريف البروتوكولات التي وضعناها ل(ط) اشتقاق، وتوسيع والاستعداد لزرع الشخصيات الجسدية من منطقة subventricular (SVZ) من الكبار C57BL / 6 الفئران؛ (ب) لحث على EAE المزمنة في مثل الفئران و (iii) أداء فعالة علاجيا النظامية (في الوريد أو ICV) ط زرع مجلس الشعبn لالفئران EAE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا للمبادئ رعاية الحيوانات المختبرية التي وافقت عليها وزارة الداخلية في المملكة المتحدة تحت الحيوانات (الإجراءات العلمية) العمل 1986 (PPL رقم 80/2457 ليرة سورية).
1. اشتقاق الجسدية الخلايا الجذعية العصبية / السلف (الشخصيات) من المنطقة Subventricular (SVZ) من الدماغ من الفئران الكبار
- إعداد أدوات تشريح وسائل الإعلام
ملحوظة: يجب أن يكون مستعدا هذه الحلول اثنين من 1-2 ساعة قبل تشريح أدوات جاهزة وprewarmed في 37 º C 20-30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام (أنه يساعد على تخفيف غراء ويحسن نشاط انزيم).- الأوتوكلاف مقص حاد مستقيم واحد، واحد مقص جراحي صغير واثنين من ملقط مسنن منحني صغيرة.
- "الهضم" الحل: إعداد منفصلين 50 مل أنابيب مع:
الحل رقم 1: 25 مل محلول الملح المتوازن (EBSS) + 10 ملغ حامض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) + 10 ملغ L-السيستين ايرل؛و
الحل رقم 2: 25 مل EBSS + 50 ملغ غراء. - إعداد 'متوسطة كاملة النمو "(CGM): كاملة الماوس المتوسطة القاعدية مع ملاحق انتشار الماوس، الهيبارين 0.002٪، وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF و 10 نانوغرام / مل)، وعامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي، و 20 نانوغرام / مل)، والمضادات الحيوية (القلم / بكتيريا).
- تشريح الدماغ
NB: إزالة العظام الزمنية يمكن أن تتلف بسهولة الأنسجة بسبب الحدة بهم. لتجنب هذا، وتأمين بحزم العظام مع ملقط وسحب حتى تمت إزالة العظام بأكمله.- لكل إعداد الشخصيات، اعدام من قبل خلع عنق الرحم ن = 5-7 و 4-8 الاسبوع القديمة C57BL / 6 الفئران.
- تطهير مع الايثانول 70٪ (في الماء) شعر الفئران اعدام وقطع خلف الأذنين مع مقص حاد مباشرة إلى إزالة الرأس؛
- جعل شق خط الوسط باستخدام مقص جراحي صغير لقطع الجلد فوق الجمجمة. باستخدام ملقط، طيها اثنين من بقع من الجلد إلى المعارضالبريد الجمجمة.
- مع مقص الجراحية الصغيرة أداء اثنين من التخفيضات قليلا في قاعدة الجمجمة وإزالة العظام تحت الجسر / النخاع (الجمجمة بطني). المضي قدما من خلال الانسحاب العظام الزمنية. مع نفس مقص إجراء خفض على طول الجمجمة، بدءا من القاعدة إلى المصابيح، دون الإضرار سطح الدماغ. أيضا، إجراء خفض بين العظام الأمامية والعيون، لتسهيل إزالة العظام الجداري. مع اثنين من ملقط بدء إزالة الجمجمة عن طريق سحب كل من العظام الجداري نحو الخارج. في حين سحب، وإيلاء الاهتمام لالسحايا، التي يمكن أن تتلف الدماغ عندما يتم إزالة العظام.
- مرة واحدة تمت إزالة الجمجمة، مرر ملقط بين الدماغ والجمجمة لفصل تماما غادر السحايا. رفع بلطف صعودا الدماغ من الجمجمة. قطع الأعصاب البصرية للافراج عن الدماغ، وأخيرا جمع الدماغ في أنبوب مع الفوسفات مخزنة المالحة الباردة (PBS).
- الحفاظ على أنبوب على الجليدد تكرار نفس الإجراء بالنسبة لجميع الفئران.
- تشريح SVZ، neurosphere تشكيل وصيانة المقايسات
متوسط عدد الخلايا س عامل تخفيف × 10 4
حيث يمثل 10 4 التحويل من الحجم الكلي للغرفة عدادة الكريات (مجموع حجم = 0.1 ملم 3 -> 10-4 سم 3 -> 10-4 مل). عند النظر في عامل التخفيف، فإن كلا من واحد القيام به مع CGM ومع وصمة عار الحيوية يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار. على سبيل المثال، إذا تم فرز 160 خلايا في الساحات الزاوية 4، فإن الكثافة النهائية (خلية / مل) من التعليق الخلية يكون:
160/4 × 5 (التخفيف مع CGM) × 2 (مع تخفيف وصمة عار الحيوية) 4 × 10- بدوره على غطاء محرك السيارة تشريح مجهزة مجهر تشريح.
- تنظيف جميع الأسطح مع الايثانول 70٪ (في الماء)، ورذاذ مع حل مكافحة الميكوبلازما لخفض مخاطر التلوث.
- غطاءالجزء السفلي من كوب مع شاش معقم (للحفاظ على أدوات شحذ) وملء مع الايثانول 70٪ (في الماء). نقع في الدورق اثنين من أزواج من ملقط، زوج واحد من المقص الصغير وشفرة جراحية.
- وضع الدماغ كله على مصفوفة المخ تقطيع اللحم.
- باستخدام اثنين من شفرات الحلاقة إجراء باجتزاء الاكليلية 2 ملم من القطب الأمامي من الدماغ، باستثناء مساحات البصرية، و 3 ملم الخلفي إلى خفض السابقة؛ ووضع النسيج على طبق بتري نظيفة.
- تحت المجهر تشريح عزل الأنسجة SVZ ومقطعة إلى 1 ملم 3 قطع باستخدام مقص قطع القزحية. أكرر لجميع العقول.
- تخلط جيدا الحلين (القسم 1.1.2) أعلاه وتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون على الفور بعد أن يتم تشريح أدمغة وSVZs مستعدون ليتم هضمها.
- نقل المقاطع إلى 30 مل من "هضم" الحل، في resuspend بلطف مع A10 ماصة مل واحتضان 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. كل 15 دقيقة يهز بلطف أنبوب 2-3X.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
- إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر من CGM بواسطة pipetting الأولى مع P1000 ثم مع ماصة P200 (10-20x ولكل منهما)، حتى الحصول على تعليق خلية واحدة.
- تتخذ تعليق حتى 5 مل مع CGM ونقل إلى T25 قارورة سم 2.
- بعد 5-7 أيام في المختبر (DIV) neurospheres ستشكل. جمع تعليق في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي 10 دقيقة في 150 × ز.
- إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر من CGM.
فصل في neurospheres ميكانيكيا بواسطة الركض الخلايا 100-150X مع ماصة P200، حتى الحصول على تعليق خلية واحدة وأعتبر ما يصل إلى 1 مل مع CGM. - تمييع تعليق الخلية، على سبيل المثال 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في 40 ميكرولتر من CGM للحصول على 1:05 التخفيف، وتخلط جيدا. خلط 10 ميكرولتر من مخففتعليق خلية ه مع 10 ميكرولتر من وصمة الحيوية وتخلط جيدا.
- ملء غرفة عدادة الكريات العد مع 10 ميكرولتر من تعليق خلية 01:01: حل وصمة عار الحيوية. الاعتماد بشكل منفصل عدد حية (أبيض) والقتلى (الأزرق) الخلايا في الساحات الزاوية 4. لتحديد عدد الخلايا / مل، وتطبيق الحساب التالي:
- في resuspend 2 × 10 5 خلايا في 5 مل من CGM ونقل إلى T25 سم 2 قارورة؛
- تكرار المقاطع 1.3.11-1.3.12 كل 4-5 DIV. من الفقرة الثانية من التوسع فصاعدا، وتقييم الجدوى الخليوي عن الإقصاء وصمة عار الحيوية والبدء في بناء منحنى النمو المستمر من خلال الطلاء الشخصيات في كثافة نسيلي (8،000 cells/cm2)، كما هو موضح 21. الحفاظ على أرقام الهواتف المحمولة وكرر الإجراء كل 4-5 DIV. لإنشاء منحنى النمو المستمر، والمضي قدما على النحو التالي:
ملاحظة: للحصول على إعداد خلية جيدة، وبعد 4-5 مجالات DIV ينبغي قد وصلت إلى قطر 150-200 ميكرون. أن يكون تقدير جيد من رانه الخلية الكثافة، فمن المهم للعثور على عامل التخفيف الأمثل من أجل أن يكون توزيعا جيدا، وخلايا غير المتداخلة في جميع أنحاء عدادة الكريات. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون هناك بين 50-200 مجموع الخلايا. عندما عد، إلا أن الخلايا تتكون في الساحة دون لمس الحدود يتعين النظر. أيضا، بقاء الخلايا هو عامل حاسم لديك إعداد صحية. الأهم من ذلك، ينبغي أن تكون أكبر من 90٪. منحنى النمو الخطي هو مؤشر آخر على إعداد الخلايا السليمة.- حساب عدد الخلايا الحية والميتة (على سبيل المثال 1.3 × 10 6).
- تحديد معدل النمو قسمة عدد الخلايا الحية من قبل عدد من الخلايا مطلي (مثل 1.3 × 10 2/6 × 10 = 6.5 5).
- حساب العدد الكلي للخلايا عن طريق ضرب معدل النمو في إجمالي عدد الخلايا الموجودة في نقطة زمنية سابقة (في بداية = 2 × 10 5).
- تقرير المتوسط7؛ الانحراف المعياري لبناء خط الاتجاه الخطي.
- بدءا من مرور 6، يتم استبدال تفارق الميكانيكية بواسطة تفارق الأنزيمية. بعد الطرد المركزي في 150 x ج لمدة 10 دقيقة، وإزالة طاف، resuspend وبيليه في 200 ميكرولتر من الخلايا حل التفكك الكلي، في resuspend 7-8X مع P200 واحتضان 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
- في resuspend 7-8X مع P200 للحصول على تعليق خلية واحدة وإضافة 800 ميكرولتر من CGM. عد الخلايا (على حد سواء الحية والميتة) وإنشاء جدواها. في resuspend 2 × 10 5 خلايا في 5 مل من CGM ونقل إلى T25 قارورة سم 2.
- تنبيغ الفيروسية من الشخصيات في الجسم الحي تتبع الخلايا
ملاحظة: للتحقق من كفاءة تنبيغ الفيروسية، وبناء منحنى النمو بالتوازي مع الشخصيات transduced وnontransduced. بالإضافة إلى ذلك، كفاءة النسيلي، وهذا هو العدد المطلق للخلايا neurosphere تشكيل الحاضر ضمن خلية إعداد الأنشوئها أو تحليل دورة الخلية من خلال محتوى الحمض النووي (مع يوديد propidium، PI)، يمكن استخدام المزيد من المؤشرات عن حالة الخلية. إذا كانت نسبة الخلايا المصابة لا ينبغي أن تكون جيدة، وبروتوكول تنبيغ الفيروسية يمكن أن تتكرر مرة ثانية مع نفس السكان من الخلايا. مرة واحدة على مستوى عدوى مرضية ومنحنى النمو مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها مع خلايا النوع البري، الشخصيات transduced يمكن توسيعها و / أو المزروعة.- حصاد neurospheres والحصول على تعليق خلية واحدة. لوحة الخلايا في كثافة عالية (1.5 × 10 6 خلايا في قارورة T75 سم 2) في 10 مل CGM.
- بعد 12 ساعة إضافة 3 × 10 6 TU / مل من الجيل الثالث ناقلات lentiviral pRRLsin. PPT-HCMV هندسيا مع E. القولونية المستمدة β-غالاكتوزيداز (lacZ) أو مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP).
- بعد 48 ساعة، حصاد الخلايا، أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة وreplate الخلايا في نسبة 1:1.
- بعد3 ممرات في المختبر تحقق من كفاءة عدوى. التدفق الخلوي يستخدم عادة لاختبار فعالية العدوى، والمقبولة عموما على مستوى مرض من عدوى أن تكون في حدود 75-95٪ من الخلايا إيجابية. التحقق مرة أخرى كفاءة العدوى بعد 3 مقاطع مزيد من التوسع للتحقق من الحفاظ على التعبير علامة.
- Neurosphere تجميد
- حصاد neurospheres من قارورة T25 سم 2، الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة، وتجاهل طاف.
- resuspend الكرية مع 1 مل من تجميد المتوسطة (CGM مع 10٪ ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
- وضع cryovials في -80 درجة مئوية داخل حاوية التجميد.
- بعد 24 ساعة على الأقل تحريك الخلايا إلى cryobox وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة أشهر، أو تقديمهم إلى النيتروجين السائل (N 2) لتخزين لفترة أطول.
- Neurosphere الذوبان
NB: لتجنب الآثار السامة للاتصال المطول سو الشخصيات مع DMSO، يجب أن تكون عملية الذوبان في أسرع وقت ممكن.- إزالة cryovial من -80 ° C / N 2 وابقائه على الثلج الجاف.
- ذوبان الجليد بسرعة القارورة في حمام مائي، حتى يتم إذابة تقريبا كل تعليق خلية وفقط قطعة صغيرة من التعليق المثلج لا يزال قائما.
- resuspend وتعليق خلية مع 5 مل من prewarmed CGM الطازجة.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
- إزالة طاف، في resuspend بلطف مع 5 مل من CGM الطازجة وطبق تعليق خلية في بيئة نظيفة، غير المعالجة T25 قارورة سم 2.
- 1.7) توصيف مجلس الشعب
ملحوظة: غسل الماضي PBS يمكن استبدالها مع 0.05٪ من الصوديوم أزيد-PBS لمنع نمو الفطريات أو التلوث، ويتم تخزين coverslides عند 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أسابيع.
NB: لوصمة عار للعلامات داخل الخلايا إضافة كيل permeabilizing لبرنامج تلفزيوني في عرقلة الحل. إذا كان مصدر الأجسام المضادة الأولية هي الماعز، albumi مصل بقرين (BSA) أو مصل أخرى من الماعز ينبغي استخدامها.
NB: لوصمة عار للعلامات داخل الخلايا استخدام وكيل permeabilizing في حل الأجسام المضادة الأولية.- وضع الزجاج 13 ملم coverslide على الجزء السفلي من 24 لوحة جيدا. إضافة 150 ميكرولتر من محلول طلاء على رأس كل coverslide لإنشاء قطرة صغيرة. احتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
- حصاد neurospheres وفصل للحصول على تعليق خلية واحدة.
- عد الخلايا الحية وتمييع للحصول على 80،000 cells/35 ميكرولتر. إزالة الزائدة من محلول طلاء من coverslide بواسطة طموح لطيف، وطبق في 35 ميكرولتر من التعليق الخلية.
- احتضان 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. تحقق بسرعة في المجهر النقيض من المرحلة إذا بدأت خلايا الالتزام.
- إعداد متوسطة التمايز عن طريق خلط القاعدية المتوسطة الفأر مع المكملات المناسبة (انظر الجدول 1) والمضادات الحيوية (بين / بكتيريا).
- إضافة 400 ميكرولتر من التمايز المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
- بعد 3 DIV، وتغير نصف المتوسط مع المتوسطة التمايز الطازجة.
- بعد 6 DIV، وإزالة المتوسطة ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. تحت غطاء الكيميائية إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 300 ميكرولتر من prewarmed بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) 4٪ سكروز. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). إزالة PFA وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني.
- المضي قدما في كيمياء سيتولوجية مناعية، وإزالة برنامج تلفزيوني ومنع مع برنامج تلفزيوني 10٪ مصل الماعز العادي (خ ع) (حل حجب)، واحتضان 1 ساعة على RT.
- إزالة عرقلة الحل وإضافة الأجسام المضادة الأولية مخففة المطلوب مع PBS 1٪ NGS. احتضان عند 4 ° CO / N أو، بدلا من ذلك، 120 دقيقة في RT.
- بعد الحضانة، وغسل 2X مع برنامج تلفزيوني. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المخفف مع PBS 1٪ NGS. احتضان 60 دقيقة في RT.
- غسل 2X مع برنامج تلفزيوني ومكافحة وصمة عار على النوى مع 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي) المخفف 1:20،000 مع برنامج تلفزيوني permeabilizing الوكيل لمدة 3 دقائق على RT في الظلام. يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني ومرة واحدة مع الماء المقطر.
- وضع قطرة من تصاعد المتوسطة على شريحة زجاجية والأنسجة مع ملقط تحميل coverslide مع الخلايا التي تواجه المتوسطة المتزايدة. اضغط بلطف coverslide للضغط على الفائض من تصاعد المتوسطة. مغادرة coverslide في الظلام في RT حتى جفت المتوسطة المتزايدة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
المناعة الذاتية التجريبية 2. المايلين دبقية قليلة التغصن جلايكوبروتين (موج) التي يسببها في C57BL / 6 الفئران
- إعداد مستحلب
- على دورق زجاجي تحضير مستحلب يتكون من مساعد فرويند غير كاملة تحتوي على 4 ملغ / مل من السل المتفطرة [تعريف باسم مساند فرويند الكامل (CFA)] و 200 ميكروغرام من MOG (الببتيد 35-55)، معتبرا أن المبلغ الإجمالي للمستحلب وسوف يكون في الماوس 300 ميكرولتر.
NB: Appropriaضوابط الشركة المصرية للاتصالات من الفئران MOG تحصين في CFA هي تحصين الفئران مع CFA فقط. التباين المتوقع من ظهور المرض في الفئران MOG تحصين هو 11.3 (± 1.8) نقطة في البوصة.
ملحوظة: عند حساب إجمالي حجم مستحلب حاجة، والنظر ضعفي حجم وعدد من الفئران لتحصين. الأواني الزجاجية ينبغي تفضيل لبلستيكور لتقليل النفايات جزء من المستحلب.- مع حقنة الزجاج عقد مزيج G 19 إبرة لمدة 30 دقيقة، وحفظ دائما المستحلب على الجليد.
- للتحقق مما إذا مستحلب جاهز، وانخفاض كمية صغيرة من المستحلب على المياه. مستحلب جاهز ليتم حقنه فقط إذا استمر الانخفاض كما هو ولا تفريق.
- تحصين المجموعة الضابطة من الفئران مع CFA فقط. علاج فئران التجارب (MOG تحصين) مع MOG في CFA. التباين المتوقع من ظهور المرض في MOG تحصين الفئران هو 11.3 (± 1.8) نقطة في البوصة.
- نقل إبرة 19 G إلى 1 مل حقنة بلاستيكية لالثانية نضح مستحلب. تجنب الفقاعات، تغيير إبرة مع 25 G وترك حقنة على الجليد. محاقن مملوءة المستحلب على استعداد لاستخدامها ويجب أن تبقى على الجليد لبضع ساعة.
- على دورق زجاجي تحضير مستحلب يتكون من مساعد فرويند غير كاملة تحتوي على 4 ملغ / مل من السل المتفطرة [تعريف باسم مساند فرويند الكامل (CFA)] و 200 ميكروغرام من MOG (الببتيد 35-55)، معتبرا أن المبلغ الإجمالي للمستحلب وسوف يكون في الماوس 300 ميكرولتر.
- تحصين
- وضع الفئران (6-8 أسابيع من العمر، أنثى) في مربع الاحترار والانتظار لمدة 10 دقيقة للسماح الوريد الذيل لتمدد.
- نقل الماوس واحد من مربع الاحترار إلى كابح الماوس. إغلاق كابح لتجنب أي حركة الماوس.
- ملء حقنة 1 مل الأنسولين مع 100 ميكرولتر من السم السعال الديكي (5 ميكروغرام / مل) تجنب صنع الفقاعات. حقن ببطء الحل في الوريد الذيل. إزالة الإبرة والصحافة لبضع ثوان مع قطعة من الورق لسد النزيف.
- ضع الماوس مرة أخرى في قفص وكرر نفس الإجراء بالنسبة لجميع الفئران.
- تخدير ماوس مع استمرار استنشاق isoflurane و(1-2٪، 2 لتر / دقيقة) وحقن 100 ميكرولتر من مستحلب تحت الجلد على مستوىاثنين من الأجنحة وقاعدة الذيل (300 ميكرولتر مستحلب / الماوس). إزالة ببطء الحقنة، وتجنب تسرب المستحلب.
- بمناسبة الماوس مع الناخس الأذن، وضع الفئران في قفص وتحقق حتى الشفاء التام. أكرر لجميع الفئران.
- بعد 48 ساعة (2 أيام التحصين آخر، نقطة في البوصة) تكرار القسم 2.2.3.
- التحليل السلوكي من الفئران EAE
- بدءا من 5 نقطة في البوصة، وزن الفئران يوميا، ورصد الأداء الحركي من خلال استخدام نظام التسجيل على نطاق وصفها في الجدول 1.
3. حقن الخلايا الجذعية العصبية / السلف في الذيل الوريد (رابعا)
- إعداد الخلية
- neurospheres الحصاد بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
- إزالة طاف وإضافة 200 ميكرولتر من الخلايا حل التفكك الكلي. احتضان 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
- في resuspend بلطف 10-12X (avoidinز فقاعات) مع P200 حتى الحصول على تعليق خلية واحدة واتخاذ إلى 800 ميكرولتر مع متوسطة القاعدية دون كا 2 + 2 + والمغنيسيوم.
- عد الخلايا باستخدام وصمة عار الحيوية لفحص بقاء الخلية وتمييع تعليق مع متوسطة القاعدية دون كا 2 + والمغنيسيوم 2 + للحصول على كثافة النهائي من 10 ميكرولتر cells/150 6. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد حتى الاستخدام.
- مجلس الشعب حقن الرابع
ملحوظة: تفارق مثالية في تعليق خلية واحدة وعدم وجود فقاعات الهواء جانبان رئيسيان للنظر للحد من خطر إما كتل / المجاميع مقابل تشكيل الصمات التي قد تؤدي إلى انسداد الوريد ويترتب على ذلك الموت.- في ذروة المرض (16-18 نقطة في البوصة)، وتزن يسجل الفئران. توزيع الفئران وفقا لدرجاتهم من أجل الحصول على مجموعات متجانسة.
- وضع الفئران في مربع الاحترار والانتظار لمدة 10 دقيقة للسماح الوريد الذيل لتمدد. نقل الماوس واحد من مربع الاحترار إلى كابح الماوس. إغلاق كابح لتجنب أي حركة الماوس.
- ملء الأنسولين حقنة 1 مل مع 150 ميكرولتر من تعليق خلية والتأكد من إزالة كافة الفقاعات. حقن ببطء الحل في الوريد الذيل. إزالة الإبرة والصحافة لبضع ثوان مع قطعة من الورق من أجل سد نزيف (أرقام 6A و6B).
- ضع الماوس في قفص وتحقق حتى الشفاء. كرر نفس الإجراء بالنسبة لجميع الفئران.
4. حقن الخلايا الجذعية العصبية / السلف في صهريج ماجنا (ICV)
- إعداد الخلية
- الشخصيات الحصاد بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
- إزالة طاف وإضافة 200 ميكرولتر من الخلايا حل التفكك الكلي. احتضان 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
- في resuspend بلطف 10-12X مع P200 حتى الحصول على واحد جتعليق الذراع واتخاذ إلى 800 ميكرولتر مع متوسطة القاعدية دون كا 2 + 2 + والمغنيسيوم.
- عد الخلايا وتمييع تعليق مع متوسطة القاعدية دون كا 2 + والمغنيسيوم 2 + للحصول على كثافة الخلية المطلوبة. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد حتى الاستخدام.
- 4.2) حقن ICV مجلس الشعب
- في ذروة المرض (16-18 نقطة في البوصة)، وتزن يسجل الفئران. توزيع الفئران وفقا لدرجاتهم من أجل الحصول على مجموعات متجانسة.
- ضع الماوس على جهاز التجسيمي تحت المستمر استنشاق isoflurane و(1-2٪، 2 لتر / دقيقة). تأمين رأس الفأر مع القضبان الأذن. ثم ضبط كل من الفم والأنف قطعة. تأكد من أن رأس الفأر هو مسطح وثابت.
- المسحة رأس الفأر مع بوفيدون اليود (PVP-I) وإجراء شق لقطع الجلد في الجزء الخلفي من الرأس لفضح الجمجمة.
- باستخدام مياداة مجهرية، إدراج غيض من microlحقنة معبر في الشق بين قفا وفقرة الأطلس من خلال العضلات والأربطة سليمة في خط الوسط في الجزء الخلفي من الرقبة. يتم الاحتفاظ الجزء عازمة الإبرة على اتصال وثيق مع السطح الداخلي للقفا لطول بأكملها، كما هو موضح 22.
- إدراج ببطء الإبرة وانتظر بضع ثوانى. والمقصود المشغل لنتعلم كيف نتعرف على الشعور الإبرة بأنها "مدمن مخدرات" في الجمجمة الماوس، وذلك قبل بدء ضخ إعداد الخلية. حقن ببطء حجم الخلايا (خلال 3-5 دقيقة). ترك الإبرة في مكانها لبضع ثوان إضافية بعد الحقن وإزالة ببطء المحقنة.
- غرزة البشرة ووضع الماوس في قفص الانتعاش حتى الشفاء التام.
5. تجهيز الأنسجة
- بعمق تخدير الفئران مع خليط من 0.5 مل الكيتامين (100 ملغ / مل)، 0.25 مل زيلازين (23.32 ملغ / مل) و 4.25 مل من الماء المعقم ويروي transcardically، ثashing مع المالحة EDTA وتحديد مع PFA 4٪. إزالة كل الأعمدة والعقول الفقري وPOSTFIX في PFA 4٪ لمدة 12 ساعة في 4 درجات مئوية. غسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني، وإزالة النخاع الشوكي من عظام وترك الأنسجة لا يقل عن 48 ساعة في 30٪ سكروز (في برنامج تلفزيوني) في 4 درجات مئوية. تضمين الأنسجة في درجة الحرارة المثلى القطع (أكتوبر) مجمع والمفاجئة تجميد مع النيتروجين السائل، كما هو موضح 2.
- استخدام مبضع للفحص المجهري لقطع الأنسجة في 10-12 ميكرون شرائح سميكة.
- بدلا من ذلك، تضمين أنسجة جديدة في الاغاروز وقطع الأنسجة باستخدام vibratome 50-80 ميكرون شرائح سميكة.
- في كلتا الحالتين، واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية في D-galactopyranoside (X-غال) حل للكشف عن النشاط النووي β-غالاكتوزيداز-كلورو-3-indolyl-β-5 برومو 4.
- Recut المقاطع التي تحتوي على β-غال + الخلايا إلى 5 ميكرون شرائح وصمة عار مزدوجة باستخدام ييفي antiglial الحمضية البروتين (GFAP) عن الخلايا النجمية (50 ميكروغرام / مل)، مستضد النووية antineuronal (NeuN) عن الخلايا العصبية (1 &# 956؛ ز / مل) وللخلايا العصبية antiNestin غير متمايزة (10 ميكروغرام / مل).
- المضي قدما كما هو موضح في أقسام 1.7.11 1.7.12 و. لstainings متعددة تأكد من استخدام الأجسام المضادة الثانوية مترافق مع fluorophores مختلفة.
- لأنسجة تحتوي على خلايا GFP المسمى المضي قدما كما هو موضح في الخطوات 5،1-5،3 والمضي قدما في stainings متعددة.
- إضافة بعض قطرات من تصاعد المتوسطة والشرائح، وتغطي مع ساترة الأنسجة.
- لأقسام ملطخة الأجسام المضادة مترافق البيوتين إعداد حل أفيدين معقدة البيوتين (حل ABC، انظر الجدول 2) وترك في الانفعالات لمدة 45 دقيقة.
- احتضان شرائح 5 دقائق مع 1٪ H 2 O 2 لمنع نشاط البيروكسيديز الذاتية.
- يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان مع الحل ABC ل1HR في RT.
- يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان مع الحل 3،3 '-diaminobenzidine و 0.3٪ H 2 O 2. رصد رد فعل الامم المتحدةدير المجهر ويغسل مع برنامج تلفزيوني في أقرب وقت شريحة البدء في الحصول على البني (عادة حوالي 5-10 دقائق).
- يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني والمضي قدما كما هو موضح في الخطوة 5.7.
يتم عرض قائمة شاملة من المواد والكواشف في الجدول 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مجلس الشعب الاشتقاق وتوصيف
يتم إجراء تشريح SVZ على برك (ن = 5-7 الفئران / حمام السباحة) من 6-8 الاسبوع القديمة C57BL / 6 الفئران عن طريق التفكك الميكانيكية والأنزيمية (الشكل 1A). بعد أيام قليلة من زراعة في CGM، neurospheres التعويم الحر يبدأ تشكيل (أرقام 1A و 1B). يتم جمع الأجواء الأولية وpassaged كل 4-5 DIV ميكانيكيا. على الركض، والتأكد من أعداد الخلايا الحية والميتة وتآمر أرقام الخلية التراكمي لتوليد منحنى النمو (الشكل 1C). هذا يعطي مؤشرا لمعدل الانتشار، وبالتالي توفير معلمة غير المباشرة لتقييم الاستقرار العالمي من إعداد مجلس الشعب. عندما تتكاثر كما neurospheres، الشخصيات التعبير عن علامات النشاط التفتلي (الفوسفات هيستون H3، PHH3؛ 5 ميكروغرام / مل) والخلايا العصبية غير متمايزة (مثل Nestin) (الشكل 2A). الشخصيات غير متمايزة التي هي أن يكون البريد علاجياfficacious في EAE بعد زرع يجب التعبير عن سطح الخلية جزيئات الالتصاق التي تشمل CD44 (5 ميكروغرام / مل)، الوحيدات α4 من VLA-4 (10 ميكروغرام / مل) (الشكل 2F). عندما مطلي في ظل ظروف التمايز المناسبة، الشخصيات التعبير عن علامات نموذجية من ثلاثة الأنساب العصبية، (الشكل 2B)، مثل GFAP علامة astroglial (الشكل 2C)، علامة أنيبيب العصبية المرتبطة بروتين 2 (MAP-2، 5 ميكروغرام / مل ) (الشكل 2D) وعلامات oligodendroglial O4 (5 ميكروغرام / مل) والبروتين الأساسي المايلين (MBP، و 10 ميكروغرام / مل) (الشكل 2E)، مما يؤكد أن الشخصيات هي متعددة القدرات نحو الأنساب العصبية الرئيسية الثلاثة. لتسهيل التعرف على الخلايا التي تم زرعها في الجسم الحي، وtransduced الشخصيات مع lentiviruses هندستها لجينات مراسل صريح ثابت مثل GFP. الشخصيات Transduced التعبير عن GFP على حد سواء كما تنتشر neurospheres (أرقام 3A و 3C) وكذلك عند التفريق في المختبر على عامل النمو الانسحاب (الشكل 3B). للتحقق من كفاءة تنبيغ، ويتم تحليل التعبير عن GFP بواسطة التدفق الخلوي، بدءا في وقت مبكر من 3 مقاطع بعد تنبيغ الخلية (الذي يتيح وقتا كافيا ليكون التعبير قوية من التحوير أدخلت على مستوى البروتين). عند تطبيق lentiviruses الجيل الثالث لالشخصيات في المختبر، نلاحظ باستمرار> 90٪ من الخلايا التي تبين مستويات عالية من GFP خلال تجارب مستقلة متعددة (الشكل 3C)، مع عدم سمية العلني ولا تغييرات في الانتشار، عند المقارنة بين منحنيات النمو من النوع البري و lenti-GFP الشخصيات transduced (الشكل 3D).
تحريض EAE المزمنة
EAE هي واحدة من أفضل نماذج تتميز من مرض التصلب العصبي المتعدد، لأنه يلخص معظم الأحداث المرضية والسريرية لمرض التصلب العصبي المتعدد. تحصين C57BL / 6 الفئران مع MOG35-55 يؤدي إلى التنر من شكل مزمن من EAE. عندما تقترب من بداية ظهور أعراض المرض (11.3 ± 1.8 نقطة في البوصة) خلال مرحلة الحث (قبل السريرية)، تحصين الفئران MOG بدء فقدان الوزن (الشكل 4A). في بداية المرحلة المستجيب / الغزو (الذروة السريرية؛ 16.8 ± 3.2 نقطة في البوصة) الفئران EAE تصل إلى ذروة المرض (يسجل 3.5 ± 0.7)، وبعد فترة وجيزة تبلغ ذروتها أنها تظهر انتعاش التدريجي والجزئي أن تستقر أخيرا خلال المزمنة المرحلة (مستقر السريرية) من نحو 30 نقطة في البوصة فصاعدا (2.8 ± 0.9 نقاط) (الشكل 4B). وقد حددت العديد من الدراسات، بما في ذلك بعض التحقيق EAE إما intravital المجهري 23 أو التصوير بالرنين المغناطيسي 24، يقترن في الجسم الحي الأنسجة علم الأمراض، في ذروة مرحلة المستجيب / الغزو (16-22 نقطة في البوصة) نافذة مثالية من فرصة (وو) التي لأداء العلاجات التجريبية النظامية مع الخلايا الجذعية تهدف إلى دخول الملتهبة بشكل مزمن EAE الجهاز العصبي المركزي وحمايته من د الثانويamage.
حقن مجلس الشعب
حقن الشخصيات مسانج النظامية في الفئران EAE تم العثور على (الشكل 6) بشكل حصري تقريبا في المناطق المحيطة بالأوعية من الضرر العصبي المركزي، سواء في الدماغ (الشكل 5A) والحبل الشوكي (أرقام 5B-D)، وتصل إلى 45 يوما بعد زرع (DPT)، كما هو موضح 5 الرابع. حقن الشخصيات الاحتفاظ تفضيلي وغير ناضجة، Nestin + (الشكل 5C) النمط الظاهري، بينما عدد قليل من الشخصيات تتحرك من المنطقة المحيطة بالأوعية التعبير عن NeuN (الشكل 5D). من المذكرة، حقن الشخصيات في الرابع من الاصحاء تفشل لدخول الجهاز العصبي المركزي من طريق الأوعية الدموية (الشكل 5E). بعد الرابع حقن مجلس الشعب، تم العثور على أعداد كبيرة من الشخصيات حقن على مستوى الأجهزة غير الجهاز العصبي المركزي، مثل الكبد والأمعاء والطحال والرئة والكلى، ولكن ليس في القلب، في وقت مبكر من 10 DPT (الشكل 5F). يتم مسح الشخصيات غير CNS تراكم تماما من تسا ه الأجهزة الطرفية بنسبة 30 DPT (الشكل 5G).
الشكل 1. عزل الشخصيات من SVZ من الفئران الكبار وجيل من خطوط مجلس الشعب توسيع ثابت. A، تمثيل تخطيطي من الخطوات الحاسمة الرئيسية لتوليد توسيع ثابت، وإعداد الشخصيات الماوس عن طريق الحقن. B، Neurospheres في المختبر. C ، مثقف الشخصيات كما و passaged neurospheres كل 4-5 أيام. يتم جمع أعداد الخلايا الحية والميتة وتآمر أرقام الخلية التراكمي لتوليد منحنى النمو. شريط النطاق في B هو 200 ميكرون. البيانات في C هي العدد التراكمي يعني من الخلايا ± SD (ن = 3).
جوري 2 "FO: محتوى العرض =" 5IN "FO: SRC =" / files/ftp_upload/51154/51154fig2highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51154/51154fig2.jpg "/>
الشكل 2. توصيف الشخصيات. A، المتكاثرة neurospheres الماوس تعبر عن PHH3 الأساسية البروتين هيستون (الأخضر)، ونوع البروتين السادس خيوط الوسيطة Nestin (الحمراء). BE، بعد 6 DIV في ظروف التمايز، الشخصيات هي متعددة القدرات نحو astroglial (GFAP، الأحمر في C)، الخلايا العصبية (MAP-2 والأخضر في D) وoligodendroglial (O4 والأخضر في E، وMBP والأحمر في E) الأنساب. الكمي للGFAP، MAP-2، وO4، معربا عن الخلايا في 6 DIV بعد أظهرت مجلس الشعب التمايز في المختبر في (ب). البيانات في B هي متوسط كنسبة مئوية ± SD (ن = 3). أشرطة النطاق في اوربا هي 50 ميكرومتر. F، تحليل التدفق الخلوي للتعبير عن سطح الخلية الرئيسية جزيئات الالتصاق تنظيم leukocyالشركة المصرية للاتصالات التسرب في neurospheres الماوس. يرد الشكل 2F من Pluchino وآخرون. 2
الرقم 3. تنبيغ من الشخصيات مع lentiviruses التعبير عن الجينات مراسل (GFP على سبيل المثال. ألف وباء والصور المرحلة النقيض من neurospheres (A) والشخصيات التفريق (B) التي تم transduced مع الجيل الثالث 3 lenti-GFP النواقل. تحليل التدفق الخلوي من الشخصيات في A. C، نوع وايلد (لا transduced) ومثقف lenti-GFP الشخصيات transduced كما و passaged neurospheres كل 4-5 أيام. يتم جمع أرقام من الخلايا الحية والميتة وتآمر أرقام الخلية التراكمي لتوليد منحنى النمو. شريط النطاق فيA و B هو 200 ميكرون. البيانات في C هي العدد التراكمي يعني من الخلايا ± SD (ن = 3).
الشكل 4. توصيف وظيفي من EAE المزمن. A، الوزن يوميا الرصد في MOG وتحصين CFA-C57BL / 6 الفئران على ما مجموعه 40 متابعة نقطة في البوصة. B، يوميا EAE رصد الدرجات في MOG وتحصين CFA-C57BL / 6 الفئران على ما مجموعه 40 متابعة نقطة في البوصة . يتم التعبير عن بيانات الأرقام كما يعني ± SD (ن = 10 الفئران / المجموعة).
الرقم 5. حقن النظام المصرفي الشخصيات migrيأكلون في لحمة من الفئران EAE. AE، X-غال تلطيخ vibratome قطع (70 ميكرون) الدماغ (A) والحبل الشوكي (B) أقسام الأنسجة من الفئران EAE حقن الرابع مع الشخصيات syngenic، والتي تبين زرع β-غال + الخلايا ( الشخصيات خلايا الأزرق) استمرار داخل مناطق الجهاز العصبي المركزي حول الوعاء حتى نهاية السريرية متابعة (106 نقطة في البوصة). C، β-غال + د. حقن (الازرق) استمرار داخل مناطق الجهاز العصبي المركزي حول الوعاء، تحتفظ Nestin + (البني) النمط الظاهري. D ، عدد قليل من الشخصيات المهاجرة التعبير عن NeuN + (البني) طالما أنها تتحرك من المنطقة المحيطة بالأوعية. E، وتلطيخ X-غال في قسم الحبل الشوكي ممثل من المعالجة الصورية EAE الماوس. . أشرطة النطاق، 20 ميكرومتر FG، تحليل الأنسجة الأخرى من الجهاز العصبي المركزي تظهر أن جيم - أو الشخصيات د. حقن (خلايا الأزرق) الوصول إلى جميع الأجهزة تقريبا (. مثل الرئة والكبد والطحال والقلب والأمعاء والكلى) خفة دمهين 10 DPT (F)، ولكن يتم مسح من نفس الأجهزة بنسبة 30 DPT (G). أرقام يرد 5A-E من المرجع 5، في حين يرد أرقام 5F-G من Pluchino وآخرون. 2
. الرقم 6 تمثيل تخطيطي للبروتوكول للحقن النظامية من الشخصيات في الفئران مع EAE الخطوات الحاسمة الرئيسية للحقن النظامية من الشخصيات في الفئران مع EAE: من إعداد CAM حقن معربا عن خلية واحدة فصلها الشخصيات غرفة زراعة الخلايا (A) ، إلى حقن في الوريد ذيل الفئران EAE في ذروة مرحلة المرض المستجيب / الغزو (B)، نحو كشف في الجسم الحي من الشخصيات التي استهدفت حقنالجهاز العصبي المركزي (C)، إلى الأنسجة في الجسم الحي الدراسات المرضية السماح دراسة آليات اللدونة العلاجية من الشخصيات حقن (D). في D، والخلايا قليلة التغصن الخضراء في هم، وخلايا زرقاء داكنة هي محاور عصبية، يتم زرع خلايا الضوء الأزرق الشخصيات، والخلايا النجمية هي البرتقال، وخلايا الدم الحمراء هي الخلايا البطانية.
| نتيجة | الردود الحركي |
| 0 | الفأر العادي. أي علامات العلني من المرض |
| 1 | الذيل يعرج: ترهل كاملة من الذيل، وعدم وجود الشباك في طرف الذيل عندما يتم اختيار الماوس لأعلى |
| 1.5 | هند أطرافهم الضعف: يظهر الماوس trippings الحين وجيزة عند المشي على مشية متهادية |
| 2 | يعرج الذيل وهند أطرافهم الضعف: عند وضعها على ظهرها، والفأر لا يمكن أن تتحول إلى وضعها الطبيعي |
| جزئية هند أطرافهم شللا: الماوس لم تعد قادرة على استخدام أطرافه الخلفية للحفاظ على الموقف الردف أو المشي ولكن يمكن أن لا تزال تتحرك واحد أو كلا hindlimbs إلى حد ما، لا تزال تتأثر الأمامية | |
| 3 | هند أطرافهم الشلل الكامل: فقدان تام للحركة في hindlimbs. الماوس تستمر فقط على نفسها الأمامية، والتي لا تزال تتأثر. يتم إعطاء الفئران في هذه المرحلة الطعام في الطابق القفص، وأنابيب sipper طويلة، وحقن تحت الجلد يوميا من الحلول ترطيب لمنع الجفاف. إذا الفئران تطوير القروح أو آفات الجلد التي لا تسترد مع العلاج، وأنهم سيقتلون إنسانية |
| 3.5 | ضعف Forelimb: عندما وضع على شبكة الرأسي، والماوس ليست قادرة على تسلق وببطء يسقط |
| 4 | الدولة المحتضرة |
| 5 | العثور على فأر ميت أو أعدمت وفقا لنقاط النهاية إنسانية |
تابلي 1. خمسة نطاق المرحلة من العلامات السريرية والشلل تصاعدي في الفئران EAE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
العلاج بالخلايا الجذعية الجسدية ومقرها الناشئة باعتبارها واحدة من أهم الاستراتيجيات الواعدة لعلاج الاضطرابات الالتهابية المزمنة CNS مثل MS2 11. في حين أن آليات الحفاظ على آثارها العلاجية لا تزال بحاجة إلى توضيح تماما، ونظرا لتأثير كبير من زرع مجلس الشعب في نماذج تجريبية مختلفة من الأمراض العصبية تؤدي إلى الاعتقاد الاستفزازية التي تنبع إلى حد ما قد يكون قريبا تطبيق الخلايا في الدراسات البشرية. ولكن، قبل تتوخى أية تطبيقات البشرية المحتملة لمثل هذه العلاجات المبتكرة نحن بحاجة إلى مواجهة بعض القضايا الرئيسية ومعالجة بعض المسائل التي لم يرد عليها، مثل تحديد مصدر مثالية الجذعية الخلايا للزرع (ذاتي مقابل خيفي، مقابل المحفزة متعددة القدرات) وأفضل طريق الإدارة.
الأمراض العصبية تختلف في pathophysiologies بهم، مع بعض التقوقع مكانيا (على سبيل المثال. النخاع الشوكي فيهيئة المحلفين، والسكتة الدماغية)، في حين الأخرى التي تتميز نشر الزمانية المكانية (مثل MS). انها تستمد أن حقن المحورية (الجذعية) الخلايا قد يكون مناسبا لمعالجة السابق، في حين أنها قد تكون غير كافية أو غير مجدية ببساطة لهذا الأخير، حيث وجود مواقع متعددة من تلف في الدماغ يمثل تحديا إضافيا ليتم التغلب عليها.
وقد أظهرت أدلة ثابتة أن التسليم في الوريد قد يمثل بروتوكول (الغازية وانخفاض) صالحة لإدارة الخلية، بدعم من القدرة الذاتية للخلايا الجذعية لاستشعار البيئة وعلى وجه التحديد المنزل نحو موقع (ق) من الضرر. ومع ذلك، والترجمة من العلاجات مجلس الشعب النظامية في العيادات لا تزال تعوقها بعض القيود، مثل تراكم ممكن من الخلايا التي تم زرعها في الأجهزة الطرفية غير CNS (مثل الرئتين والطحال والغدد الليمفاوية، والكلى) قد تكون أو لا تكون المواقع من الاستجابات الالتهابية المحلية في الجسم الحي. في حين أن هذا ACCUM غير محدديتم مسح ulation من الشخصيات حقن من الهدف CNS بسرعة في الفئران مع EAE2 المزمنة، وهناك أدلة من استمرار مجلس الشعب على المدى الطويل (أو في بعض الحالات استهداف حصرية) على مستوى الأجهزة اللمفاوية الثانوية (على سبيل المثال. الغدد الليمفاوية والطحال) بعد الحقن النظامية في الفئران برجوع EAE5 19،20. حقيقة أن عددا كبيرا من الشخصيات المزروعة نحو إعادة توزيع أجهزة غير الجهاز العصبي المركزي، يخلق تأثير التخفيف، والحد حتما العدد المطلق للالشخصيات في الجهاز العصبي المركزي. ومن المثير للاهتمام، وحقن منتظم الشخصيات هي فعالة علاجيا (على سبيل المثال عن طريق الإجراءات التنظيمية المناعي) حتى عندما تتراكم حصرا من الجهاز العصبي المركزي 19،20. والآثار العلاجية الشاملة من الشخصيات حقن استهداف الجهاز العصبي المركزي فقط 5 أو الغدد الليمفاوية 19 فقط قابلة للمقارنة. هذا قد يرجع ذلك جزئيا إلى اللدونة لا يتجزأ من الخلايا التي تستجيب لمختلف المكونات الجزيئية للsurroundinز المكروية. ولا سيما، إذا من ناحية قد يشعر الشخصيات المزروعة وجود السيتوكينات الالتهابية وممارسة تأثيرها العلاجي من خلال آليات المناعة تغييري 16، من ناحية أخرى قد تأتي في اتصال مع microenvironments معادية مما يؤدي في النهاية إلى تشكيل أورام 25،26. لهذه الأسباب، فإن الخيار المفضل هو في الوقت الحاضر على التركيز الشخصيات حقن في الجهاز العصبي المركزي. على هذا النحو، فإن الإدارة داخل القراب (عن طريق قطني أو المسار الصهريج) لا يزال الطريق المحتملين الأكثر قبولا من الإدارة في التجارب السريرية. ومع ذلك، فإن عدم التجانس وmultifocality المرضية الآفات MS قد تحد من فعالية هذا النهج.
نحن هنا وصف بروتوكول كفاءة لعزل وصيانة وتميز الماوس الأسلاف العصبية من SVZ الكبار وتباعا، وكيفية منتظم (كل من الرابع وICV) حقن الشخصيات في الفئران تتأثر EAE المزمنة، واحدة من أكثر ستوتوفي نماذج من مرض التصلب العصبي المتعدد. على الرغم من بسيطة نسبيا ومباشرة، وهذه البروتوكولات تقديم بعض الخطوات الهامة التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار. في البداية، وهو إلزامي للحصول على إعداد خلية قابلة للتوسيع مستقر وصحي. كما هو موضح في جميع أنحاء البروتوكول، واستقرار الخلايا يمكن الاستدلال بشكل غير مباشر من خلال النظر في معدل نموها. من الناحية المثالية، ينبغي أن neurospheres التوصل إلى قطر 150-200 ميكرون يجب أن تكون كل 4-5 DIV ونسبة موت الخلايا على الممرات منخفضة جدا (أقل من 10٪). أيضا، يجب neurospheres تقديم شكل دائري صغير الحجم ومنتظمة في المجهر. العدوى مع lentiviruses قد تتداخل مع بقاء والاستقرار في الخلايا. للحصول على العدوى الأمثل، وهو إلزامي للحصول على المعايرة للفيروس من اهتمام كاف للحصول على 3 × 10 6 TU / مل. في الواقع، في حين من جهة أن كمية قليلة من الفيروس يؤدي إلى نسبة صغيرة من الخلايا المصابة، من ناحية أخرى استخدام كمية عالية عواد المرجح أن يؤدي إلى تأثير سمية (تعتمد بشدة على الجينات للإصابة). الشخصيات يمكن أن يصاب عدة مرات مع الفيروسات دمج، ينبغي للنتائج أول الرصاص تنبيغ إلى انخفاض نسبة التحوير خلايا قابلة للحياة إيجابية. هو دائما ممارسة جيدة لمقارنة تجريبية داخل الاستقرار وبقاء المعلمات مع نوع البرية، nontransduced، تسيطر الشخصيات. أما بالنسبة للتحريض EAE المزمن، ويمثل الجزء الأكثر إشكالية من إعداد مستحلب. كما وصفها، ويجب أن تكون الأواني الزجاجية واستخدام الجليد في جميع الأوقات. إعداد مستحلب يأخذ 30-45 دقيقة، وعليه يمكن اعتبار جاهزة للحقن فقط عندما لا تفريق عندما أسقطت على المياه. إذا تبدد مستحلب في الماء، وهذا يعني أنها ليست جاهزة بعد ويحتاج إلى مزيد من المزج.
دقة جيدة خلال إجراء الحقن الرابع في الوقت الإدارة خلية أمر بالغ الأهمية. أولا، من المهم للغاية أن يكون كماتعليق خلية إنجل، حيث أن حقن الخلايا مجمعة قد تعيق عروق الماوس حقن ويؤدي إلى الوفاة على الفور. لضمان تحديد المواقع الصحيحة من الإبرة في الوريد، ومن الممارسات الجيدة لنضح مع قليل من حقنة ميكرولتر من الدم. في حالة عدم وجود الدم يسيل في حقنة، يجب على المشغل تتحرك ببطء الإبرة إلى الخلف أو إلى الأمام حتى يتم العثور على الموقع الصحيح. فقط عند هذه النقطة يمكن حقن تعليق خلية ببطء. الأهم من ذلك، ينبغي أن لا تكون مطلوبة عادة المشغل لتطبيق أي ضغط على حقنة منذ السائل ينبغي أن تتدفق بسهولة في الوريد. سوف حقنة غير لائق يؤدي حتما إلى تورم تحت الجلد المقابلة لموقع الحقن.
تجدر الإشارة إلى أنه في المستقبل القريب جدا حقن منتظم NPCs2، 27، المعدلة وراثيا أم لا، قد تمثل خيارا أنفسهم العلاجية، فضلا عن توفير أداة مهمة لإيصال م المناعةodulatory المخدرات و / أو اعصاب وكلاء remyelinating الموالية مباشرة في الجهاز العصبي المركزي 28. لذلك، في حين أن بعض القيود المتعلقة بإيصال النظامية من الشخصيات موجودة، سواء الرابع. وICV. طرق قد تمثل في نهاية المطاف النهج العلاجية البديلة صالحة في تلك الأمراض التي قد لا تشكل حقن تنسيق الخلايا بروتوكول معيار الذهب من العلاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
المؤلفين أشكر جايدن سميث لاستعراض نقدي وإثبات تحرير المخطوطة. وقد تلقى هذا العمل دعما من الجمعية الوطنية التصلب المتعدد (NMSS والمنح الجزئية RG-4001-A1)، والإيطالية جمعية التصلب المتعدد (AISM، منح 2010/R/31)، وزارة الصحة الإيطالية (GR08-7)، أجنحة من أجل الحياة، بنكا بوبولاري اجريكولا دي راغوزا (BAPR)، ومجلس البحوث الأوروبي (ERC) بموجب اتفاق ERC-2010-جنيها استرلينيا أي برنامج المنح الإطار 7 الجماعة الأوروبية (EC) 260511-SEM_SEM و(FP7/2007-2013) تحت اتفاقية المنحة ن * درجة؛ 280772 - حصرى.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| EBSS | Sigma | E2888 | |
| L-Cystein | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Papain | Worthington | 30H11965 | |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0700/50 | |
| Mouse NeuroCult basal medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult proliferation supplements | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B-1000 | |
| Epidermal growth factor | Peprotech | AF-100-15-1000 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 1514012 | |
| Matrigel (coating solution) | BD Biosciences | 354230 | |
| NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) | Stem Cell Technologies | 05704 | |
| Accumax | eBioscience | 00-4666-56 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg | PAA Laboratories | H15-011 | |
| Myco trace | PAA Laboratories | Q052-020 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Immunofluorescence | |||
| Normal goat serum | PAA Laboratories | B11-035 | |
| Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Mouse anti Nestin | Abcam | ab11306 | |
| Rabbit anti GFAP | DAKO | 203344 | |
| Mouse anti Histone H3 (phospho S10) | Abcam | ab14955 | |
| Rabbit anti MAP-2 | Abcam | ab32454 | |
| Rat anti MBP | AbD SEROTEC | MCA409S | |
| Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 | Millipore | MAB345 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting solution | DAKO | S3023 | |
| EAE | |||
| Freund's Adjuvant Incomplete | Sigma Aldrich | F5506 | |
| Mycobacterium tuberculosis | DIFCO | H37Ra | |
| MOG(35–55) | Espikem | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories | 181 | |
| Tissue processing | |||
| Iris scissor straight | Fine Sciences Tools | 14060-09 | |
| Blunt/bended forceps | Fine Sciences Tools | 11080-02 | |
| Brain slicer | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Surgical blades | Swann-Morton | 324 | |
| P200, P1000 pipettes | |||
| Ketamine (Vetalar) | Boehringer Ingelheim | 01LC0030 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 32371 | |
| Stereotaxic frame | KOPF | Model 900 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7762-04 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 158127 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 |
References
- Ben-Hur, T., et al. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 41, 73-80 (2003).
- Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, 688-694 (2003).
- Chu, K., Kim, M., Jeong, S. W., Kim, S. U., Yoon, B. W. Human neural stem cells can migrate, differentiate, and integrate after intravenous transplantation in adult rats with transient forebrain ischemia. Neurosci. Lett. 343, 129-133 (2003).
- Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14, 634-644 (2008).
- Pluchino, S., et al. Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism. Nature. 436, 266-271 (2005).
- Einstein, O., et al. Intraventricular transplantation of neural precursor cell spheres attenuates acute experimental allergic encephalomyelitis. Mol. Cell Neurosci. 24, 1074-1082 (2003).
- Chu, K., et al. Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus in adult rats. Brain Res. 1023, 213-221 (2004).
- Jeong, S. W., et al. Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage. Stroke. 34, 2258-2263 (2003).
- Aboody, K. S., et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12846-12851 (2000).
- Muller, F. J., Snyder, E. Y., Loring, J. F. Gene therapy: can neural stem cells deliver. Nat. Rev. Neurosci. 7, 75-84 (2006).
- Martino, G., Pluchino, S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nat. Rev. Neurosci. 7, 395-406 (2006).
- Deckert-Schluter, M., Schluter, D., Hof, H., Wiestler, O. D., Lassmann, H. Differential expression of ICAM-1, VCAM-1 and their ligands LFA-1, Mac-1, CD43, VLA-4, and MHC class II antigens in murine Toxoplasma encephalitis: a light microscopic and ultrastructural immunohistochemical study. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 457-468 (1994).
- Hemmer, B., Archelos, J. J., Hartung, H. P. New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis. Nat. Rev. Neurosci. 3, 291-301 (2002).
- Butcher, E. C., Picker, L. J. Lymphocyte homing and homeostasis. Science. 272, 60-66 (1996).
- Rampon, C., et al. Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44. Stem Cells. 26, 1673-1682 (2008).
- Pluchino, S., et al. Human neural stem cells ameliorate autoimmune encephalomyelitis in non-human primates. Ann. Neurol. 66, 343-354 (2009).
- Martino, G., Pluchino, S., Bonfanti, L., Schwartz, M. Brain regeneration in physiology and pathology: the immune signature driving therapeutic plasticity of neural stem cells. Physiol. Rev. 91, 1281-1304 (2011).
- Aharonowiz, M., et al. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiple sclerosis. PLoS ONE. 3, e3145 (2008).
- Pluchino, S., et al. Immune regulatory neural stem/precursor cells protect from central nervous system autoimmunity by restraining dendritic cell function. PLoS One. 4, (2009).
- Einstein, O., et al. Neural precursors attenuate autoimmune encephalomyelitis by peripheral immunosuppression. Ann. Neurol. 61, 209-218 (2007).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J. Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Furlan, R., Pluchino, S., Marconi, P. C., Martino, G. Cytokine gene delivery into the central nervous system using intrathecally injected nonreplicative viral vectors. Methods Mol. Biol. 215, 279-289 (2003).
- Constantin, G. Visualization and analysis of adhesive events in brain microvessels by using intravital microscopy. Methods Mol. Biol. 239, 189-198 (2004).
- Politi, L. S., et al. Magnetic-resonance-based tracking and quantification of intravenously injected neural stem cell accumulation in the brains of mice with experimental multiple sclerosis. Stem Cells. 25, 2583-2592 (2007).
- Melzi, R., et al. Co-graft of allogeneic immune regulatory neural stem cells (NPC) and pancreatic islets mediates tolerance, while inducing NPC-derived tumors in mice. PLoS One. 5, (2010).
- Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, (2009).
- Ben-Hur, T., et al. Effects of proinflammatory cytokines on the growth, fate, and motility of multipotential neural precursor cells. Mol. Cell Neurosci. 24, 623-631 (2003).
- Giusto, E., Donega, M., Cossetti, C., Pluchino, S. Neuro-immune interactions of neural stem cell transplants: From animal disease models to human trials. Exp. Neurol. , (2013).
