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Immunology and Infection

क्रोनिक EAE के साथ चूहों में तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के प्रणालीगत इंजेक्शन

Published: April 15, 2014 doi: 10.3791/51154
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Clinical Neurosciences, John Van Geest Centre for Brain Repair, University of Cambridge, UK, 2NIHR Biomedical Research Center, University of Cambridge, UK

Summary

तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (NPCs) के प्रत्यारोपण पुनर्योजी न्यूरोलॉजी में महान वादे रखती है. NPCs की प्रणालीगत प्रसव के दिमाग और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की प्रयोगात्मक जीर्ण सूजन क्षति से प्रभावित rodents और nonhuman primates की रीढ़ की हड्डी में स्टेम कोशिकाओं को वितरित करने के लिए प्रभावी, आक्रामक कम, और therapeutically बहुत प्रभावशाली प्रोटोकॉल में बदल गया है.

Abstract

तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं (NPCs) पुनर्योजी न्यूरोलॉजी में मस्तिष्क की मरम्मत या बहाली पर निशाना प्रत्यारोपण के तरीकों के लिए एक आशाजनक स्टेम सेल के स्रोत हैं. इस निर्देश के मस्तिष्क की मरम्मत मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के कई preclinical मॉडल में फोकल या प्रणालीगत एनपीसी प्रत्यारोपण के बाद हासिल की है कि व्यापक सबूत से उत्पन्न हो गई है.

इन प्रयोगात्मक डेटा तत्काल मूल्यांकन की आवश्यकता है कि मस्तिष्क की बीमारियों के लिए दृढ स्टेम सेल उपचार की मुख्य बाधाओं में से एक के रूप में सेल वितरण मार्ग की पहचान की है. Intraparenchymal स्टेम सेल ग्राफ्टिंग ऐसे रीढ़ की हड्डी की चोट और पार्किंसंस रोग के रूप में अलग और सुलभ मस्तिष्क घावों की विशेषता उन विकृतियों को एक तार्किक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है. दुर्भाग्य से, इस सिद्धांत मल्टिपल स्क्लेरोसिस (एमएस) सहित एक, Multifocal भड़काऊ और (समय में और अंतरिक्ष दोनों) फैलाया प्रकृति की विशेषता शर्तों को खराब लागू है. इस तरह, मस्तिष्क syst द्वारा लक्षित कर के रूप मेंEMIC एनपीसी वितरण दिमाग और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की प्रयोगात्मक जीर्ण सूजन क्षति से प्रभावित rodents और nonhuman primates की रीढ़ की हड्डी के लिए कोशिकाओं को वितरित करने के लिए एक कम आक्रामक और therapeutically प्रभावोत्पादक प्रोटोकॉल बन गया है.

सेल वितरण के इस वैकल्पिक विधि, एनपीसी pathotropism पर (मैं) कार्यात्मक सेल आसंजन अणुओं और भड़काऊ cytokine और केमोकाइन रिसेप्टर्स के माध्यम से पर्यावरण भावना को विशेष रूप से उनके जन्मजात क्षमता निर्भर करता है; (द्वितीय) में रिसाव संरचनात्मक नसों के बाद बाधाओं (. चतुर्थ) या intracerebroventricular (आईसीवी) इंजेक्शन पार; (Iii) भड़काऊ मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को नुकसान के कई परिवाहकीय साइट (ओं) के स्तर पर जमा; और (iv) विवो में अलग मेजबान लक्ष्य कोशिकाओं पर उल्लेखनीय ऊतक पौष्टिकता और प्रतिरक्षा विनियामक प्रभाव डालती है.

यहाँ हम हम चतुर्थ के लिए विकसित किया है कि विधियों का वर्णन. और <उन्हें> आईसीवी पुरानी सीएनएस भड़काऊ demyelination के मॉडल के रूप में प्रयोगात्मक autoimmune इंसेफैलोमाईलिटिस (EAE) के साथ चूहों में syngeneic NPCs के वितरण, और पुनर्योजी न्यूरोलॉजी में सूजन मस्तिष्क के चुनिंदा लक्ष्यीकरण के लिए एक मूल्यवान तकनीक के रूप में प्रणालीगत स्टेम सेल प्रसव की परिकल्पना की गई.

Introduction

पुख्ता सबूत सीएनएस विकारों 1-8 के पशु मॉडल में दैहिक तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं (NPCs) के प्रत्यारोपण के चिकित्सीय प्रभावकारिता के लिए attesting vivo अध्ययन में से उत्पन्न हो गई है. इन प्रयोगात्मक परिणामों नैदानिक ​​अनुप्रयोगों में अनुवाद किया जा सकता से पहले फिर भी, मेजबान में स्टेम कोशिकाओं के वितरण से संबंधित मुद्दों का एक नंबर सावधानी से विचार करने की आवश्यकता है. Multifocal, जीर्ण सूजन मस्तिष्क रोगों के लिए (nonhematopoietic) दृढ स्टेम सेल के उपचारों के विकास की दिशा में एक विशेष रूप से पर्याप्त बाधा एनपीसी इंजेक्शन का आदर्श मार्ग की पहचान है. लक्षित बीमारी के pathophysiology की एक फर्म को समझने (फोकल या Multifocal, प्राथमिक भड़काऊ या प्राथमिक अपक्षयी), और वितरण तकनीकों के साथ जुड़े व्यवहार्यता और जोखिम मुद्दों के एक सतर्क विश्लेषण स्टेम सेल प्रसव के लिए इष्टतम प्रोटोकॉल की पहचान करने में कर रहे हैं.

जबकि केन्द्र ( (जैसे पार्किन्सन और हंटिंगटन रोग, मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी की दर्दनाक चोटों, और स्ट्रोक), बहुत ही दृष्टिकोण साबित हो सकता है इस तरह के एक, Multifocal पुरानी, ​​और स्थानिक फैलाया सीएनएस क्षति समय के साथ जम जाता है जहां एमएस, जैसी स्थितियों में व्यावहारिक रूप से संभव नहीं हो. इस उत्तरार्द्ध मामले में, व्यक्तिगत घावों को फोकल सेल इंजेक्शन लक्षित कर भी इस तरह कम आक्रामक एनपीसी प्रत्यारोपण के साथ लक्षित सीएनएस के विकल्प, अधिक उपयुक्त तरीकों की पहचान उत्साह, सीएनएस पैरेन्काइमा भीतर लंबी दूरी पर विस्थापित करने के लिए प्रतिरोपित NPCs की सीमित क्षमता द्वारा बाधा है .

CNS9 बाहर intravascularly जब इंजेक्शन महान वादा चूहों में NPCs एक intracranial ट्यूमर (जैसे. Glioma) लक्ष्य है कि टिप्पणियों से उभरा. इस मौलिक के बादस्टेम सेल pathotrophism 10 की विवो साक्ष्य के रूप में, व्यापक डाटा, प्रयोगात्मक autoimmune इंसेफैलोमाईलिटिस (EAE) के साथ प्रयोगशाला पशुओं में व्यवहार्यता और NPCs के प्रणालीगत प्रत्यारोपण के चिकित्सीय प्रभावकारिता से संबंधित जमा किया गया है नसों में या तो के माध्यम से भड़काऊ सीएनएस नुकसान की एक मॉडल के रूप में (चतुर्थ) या intracerebroventricular (आईसीवी.) एनपीसी इंजेक्शन 1,2,5,6,8 .. हम पहली बार इस लक्ष्य और दर्ज सूजन सीएनएस, और बाद में कई कहनेवाला संलग्न करने के लिए प्रतिरोपित NPCs की क्षमता पर निर्भर है पता चला है कि विवो 11 में विशिष्ट microenvironments भीतर संचार कार्यक्रम. विशेष रूप से सीएनएस को लक्षित करने के लिए, NPCs मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) ICV इंजेक्शन द्वारा परिसंचरण, या चतुर्थ इंजेक्शन के माध्यम से खून में सीधे वितरित कर रहे हैं. एक बार जब खून या सीएसएफ या तो प्रवेश, प्रत्यारोपित NPCs सक्रिय रूप से बातचीतरक्त मस्तिष्क (BBB) ​​या रक्त मस्तिष्कमेरु द्रव (BCSFB) बाधाओं और सीएनएस पैरेन्काइमा दर्ज करें. एनपीसी भ्रष्टाचार और बीबीबी (या BCSFB) के बीच यह बातचीत एनपीसी सतह सेल आसंजन अणुओं (CAMs) के विशिष्ट सेट द्वारा विनियमित और सक्रिय endothelial / ependymal कोशिकाओं 12-14 पर सीएएम जवाबी ligands के उच्च स्तर की अभिव्यक्ति से मदद की है. इन cams के उदाहरण Hyaluronate के लिए रिसेप्टर, CD44, और कहनेवाला आसंजन अणु (ICAM) -1 ligand बहुत देर प्रतिजन (VLA) -4 5,15,16 (कि, leukocytes में, सक्रिय ependymal के साथ बातचीत के जिम्मेदार हैं शामिल और endothelial कोशिकाओं), और एक बहुत कम हद लिम्फोसाइट समारोह जुड़े प्रतिजन (LFA) -1 और पी selectin ग्लाइकोप्रोटीन ligand (PSGL) -1 के लिए. NPCs भी CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3, और CXCR4 सहित केमोकाइन रिसेप्टर्स की एक विस्तृत श्रृंखला, एक्सप्रेस (लेकिन CCR3 और CCR7 व्यक्त नहीं है) इन विट्रो और इन विवो 5,16, दोनों में कार्यात्मक रूप से सक्रिय हैं, जो. इस प्रकार, systemically इंजेक्शन NPCs सूजन सीएनएस के स्तर पर जमा करने के लिए, जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCRs) के साथ साथ, इन cams का उपयोग करें. इसके विपरीत, NPCs नाड़ी या मस्तिष्कमेरु द्रव अंतरिक्ष मार्गों 2 के माध्यम से सीएनएस में प्रवेश नहीं करते स्वस्थ चूहों में प्रणालीबद्ध इंजेक्शन. रासायनिक प्रेरित इन्सेफेलाइटिस की एक मॉडल के रूप में प्रणालीगत साइटोकाइन या lypopolisaccharide (LPS) इंजेक्शन के बाद सीएनएस सूजन, या endothelial / ependymal सेल सक्रियण, मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी 2 में प्रणालीबद्ध इंजेक्शन NPCs के संचय के लिए आवश्यक है. इस प्रकार, प्रणालीगत एनपीसी चिकित्सा के साथ सीएनएस के सफल लक्ष्यीकरण मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में पर्यावरण के संचय और NPCs के transendothelial प्रवास के लिए अनुकूल हैं, जिनमें अवसर (वू) की एक बीमारी विशिष्ट खिड़की की पहचान पर निर्भर है. ऐसी स्थिति में आम तौर पर तीव्र और subacute सूजन 17 के संदर्भ में उत्पन्न होती हैं. एक बार अविभाजित NPCs प्रतिरोपित, सीएनएस में प्रवेश करने केचूहों के Clinico रोग सुविधाओं के साथ ही EAE साथ बड़ा, nonhuman primates उन्नति दिखाया गया है. इस के जवाब में न्यूनतम सेल प्रतिस्थापन 2 और गैर सीएनएस सूजन क्षेत्रों 19,20 (जैसे लिम्फ नोड्स) बनाम परिवाहकीय सीएनएस 2,5,6,18 भीतर प्रतिरक्षा विनियामक और न्यूरोप्रोटेक्टिव पैराक्राइन कारकों की उल्लेखनीय स्राव से निर्भर होना बताया गया है भड़काऊ संकेतन सेल प्रतिरक्षा कोशिकाओं 5 घुसपैठ से हासिल.

इस के साथ साथ हम पुरानी EAE के एक माउस मॉडल में दैहिक NPCs के प्रणालीगत इंजेक्शन के प्रमुख methodological पहलुओं का वर्णन. अधिक विशेष रूप से, हम विस्तार और वयस्क C57BL 6 / चूहों की subventricular क्षेत्र (SVZ) से प्रत्यारोपण दैहिक NPCs के लिए तैयार है, हम (मैं) की स्थापना की है कि प्रोटोकॉल प्राप्त परिभाषित; (Ii) ऐसे चूहों में पुरानी EAE प्रेरित और (iii) therapeutically प्रभावोत्पादक प्रणालीगत (चतुर्थ या आईसीवी) एनपीसी प्रत्यारोपण प्रदर्शन मैंNto EAE चूहों.

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Protocol

जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं 1986 (सपा को पीपीएल सं 80/2457) में कार्य जानवर (वैज्ञानिक प्रक्रियाओं) के तहत ब्रिटेन के गृह मंत्रालय द्वारा अनुमोदित प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल के सिद्धांतों के अनुसार प्रदर्शन कर रहे हैं.

वयस्क चूहों के मस्तिष्क के subventricular क्षेत्र (SVZ) से दैहिक तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (NPCs) की 1. व्युत्पत्ति

  1. विच्छेदन उपकरणों और मीडिया की तैयारी
    नायब: dissections के उपकरणों का उपयोग करने से पहले (यह papain को कमजोर करने में मदद करता है और एंजाइम की गतिविधि का अनुकूलन) तैयार है और 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 20-30 मिनट पर prewarmed हैं पहले इन दो समाधान 1-2 घंटे तैयार रहना चाहिए.
    1. एक सीधे तेज कैंची, एक छोटी सी शल्य कैंची और दो छोटे घुमावदार दाँतेदार संदंश आटोक्लेव.
    2. 'पाचन' समाधान: के साथ दो अलग 50 मिलीलीटर ट्यूबों तैयार:
      समाधान # 1: 25 मिलीलीटर अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान (EBSS) + 10 मिलीग्राम ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) + 10 मिलीग्राम एल सिस्टीन;और
      समाधान # 2: 25 मिलीलीटर EBSS + 50 मिलीग्राम papain.
    3. , Epidermal वृद्धि कारक (EGF, 20 एनजी / एमएल), और एंटीबायोटिक दवाओं, 0.002%, बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (10 एनजी / एमएल bFGF) हेपरिन, माउस प्रसार की खुराक के साथ पूरा माउस बेसल मध्यम: 'पूर्ण मध्यम विकास' (सीजीएम) तैयार करें (पेन / Strep).
  2. ब्रेन विच्छेदन
    नायब: लौकिक हड्डियों को हटाने आसानी क्योंकि उनकी कुशाग्रता के ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकता है. इससे बचने के लिए, मजबूती संदंश के साथ हड्डियों को सुरक्षित और पूरी हड्डी निकाल दिया गया है जब तक बाहर खींच.
    1. ग्रीवा अव्यवस्था एन = 5-7, 4-8 सप्ताह पुराने C57BL 6 / चूहों द्वारा NPCs, चुनना की हर तैयारी के लिए.
    2. 70% इथेनॉल (पानी में) मारी गईं चूहों के बाल और सिर को दूर करने के लिए सीधे तेज कैंची के साथ कान के पीछे काट साथ शुद्ध;
    3. खोपड़ी पर त्वचा में कटौती करने के लिए एक छोटी सी शल्य कैंची का उपयोग कर एक midline चीरा बनाओ. संदंश का प्रयोग, expos के लिए त्वचा की दो पैच गुनाखोपड़ी ई.
    4. छोटे शल्य कैंची के साथ खोपड़ी के आधार पर दो छोटे कटौती प्रदर्शन और पोंस / मज्जा (उदर खोपड़ी) के तहत हड्डियों को हटा दें. लौकिक हड्डियों बाहर खींच कर आगे बढ़ें. एक ही कैंची के साथ मस्तिष्क की सतह को नुकसान पहुँचाए बिना, बल्ब आधार से शुरू, सभी खोपड़ी के साथ एक कट प्रदर्शन. इसके अलावा, पार्श्विका हड्डियों को हटाने की सुविधा के लिए, ललाट हड्डियों और आंखों के बीच एक कट प्रदर्शन. दो संदंश के बाहर की ओर पार्श्विका हड्डियों में से प्रत्येक खींच द्वारा खोपड़ी को हटाने के शुरुआत के साथ. खींच जबकि, हड्डियों को हटाया जा रहा है जब मस्तिष्क को नुकसान पहुंचा सकता है, जो तानिका के लिए ध्यान देना.
    5. खोपड़ी निकाल दिया गया है एक बार, पूरी तरह से तानिका छोड़ा अलग करने के लिए मस्तिष्क और खोपड़ी के बीच संदंश स्लाइड. धीरे खोपड़ी से मस्तिष्क उठा. मस्तिष्क जारी है और अंत में ठंड फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) के साथ एक ट्यूब में मस्तिष्क को इकट्ठा करने के लिए ऑप्टिक नसों काटें.
    6. बर्फ एक पर ट्यूब रखेंसभी चूहों के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराने चाहते हैं.
  3. SVZ के विच्छेदन, neurosphere गठन और रखरखाव assays
    कोशिकाओं एक्स की औसत संख्या कमजोर पड़ने कारक 10 x 4

    10 4 hematocytometer कक्ष (-> 10-4 3 सेमी -> 10-4 मिलीलीटर कुल मात्रा = 0.1 मिमी 3) की कुल मात्रा का रूपांतरण का प्रतिनिधित्व करता है. कमजोर पड़ने कारक, मुख्य महाप्रबंधक के साथ किया एक और महत्वपूर्ण दाग के साथ दोनों पर विचार करते समय ध्यान में रखा जाना है. 160 कोशिकाओं 4 कोने वर्गों में गिना गया है अगर एक उदाहरण के रूप में, सेल निलंबन के अंतिम घनत्व (कोशिकाओं / एमएल) हो जाएगा:

    160/4 एक्स 5 (सीजीएम के साथ कमजोर पड़ने) 2 (x महत्वपूर्ण दाग के साथ कमजोर पड़ने) 10 x 4
    1. एक विदारक माइक्रोस्कोप से लैस एक विच्छेदन हुड पर मुड़ें.
    2. 70% इथेनॉल (पानी में) के साथ सभी सतहों को साफ, और संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए एक विरोधी Mycoplasma समाधान के साथ स्प्रे.
    3. आवरणबाँझ धुंध के साथ एक बीकर के नीचे (तीव्रता उपकरणों की रक्षा करने के लिए) और 70% इथेनॉल (पानी में) के साथ भरें. बीकर में संदंश के दो जोड़े, एक सूक्ष्म कैंची की जोड़ी और एक सर्जिकल ब्लेड भिगोएँ.
    4. मस्तिष्क स्लाइसर मैट्रिक्स पर पूरे दिमाग रखें.
    5. दो रेज़र ब्लेड ऑप्टिक इलाकों को छोड़कर, मस्तिष्क के पूर्वकाल ध्रुव से एक राज्याभिषेक सेक्शनिंग 2 मिमी प्रदर्शन, और पिछले कटौती करने के लिए 3 मिमी पीछे का उपयोग करना; और एक साफ पेट्री डिश पर ऊतक जगह है.
    6. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत SVZ ऊतक अलग करने और कैंची iridectomy का उपयोग 1 मिमी 3 टुकड़ों में काट लें. सभी के दिमाग के लिए दोहराएँ.
      1. अच्छी तरह से ऊपर दो समाधान (धारा 1.1.2) मिलाएं और दिमाग विच्छेदित और SVZs पच होने के लिए तैयार कर रहे हैं के तुरंत बाद एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर.
    7. 'पाचन' समाधान के 30 मिलीलीटर में वर्गों स्थानांतरण, धीरे A10 एमएल पिपेट साथ resuspend और 3 पर 30 मिनट सेते5% सीओ 2 में 7 डिग्री सेल्सियस. हर 15 मिनट धीरे ट्यूब 2-3X हिला.
    8. 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र.
    9. सतह पर तैरनेवाला निकालें और एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने तक, एक P200 विंदुक (10-20x प्रत्येक) के साथ पहले एक P1000 के साथ और फिर pipetting द्वारा मुख्य महाप्रबंधक के 200 μl में गोली resuspend.
    10. मुख्य महाप्रबंधक के साथ 5 मिलीलीटर निलंबन लो और एक T25 सेमी 2 फ्लास्क को हस्तांतरण.
    11. इन विट्रो में 5-7 दिनों के बाद (DIV) neurospheres बनेगी. 150 x जी पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र 10 मिनट में निलंबन लीजिए.
    12. सतह पर तैरनेवाला निकालें और मुख्य महाप्रबंधक के 200 μl में गोली resuspend.
      एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने तक, एक P200 विंदुक के साथ कोशिकाओं 100-150x passaging द्वारा यंत्रवत् neurospheres अलग कर देना और मुख्य महाप्रबंधक के साथ 1 मिलीलीटर के लिए इसे ले.
    13. एक 1:05 कमजोर पड़ने प्राप्त करने के लिए मुख्य महाप्रबंधक के 40 μl में सेल निलंबन, जैसे सेल निलंबन के 10 μl पतला, और अच्छी तरह मिला लें. Dilut के 10 μl मिक्सई सेल एक महत्वपूर्ण दाग की 10 μl के साथ निलंबन और अच्छी तरह मिला लें.
    14. महत्वपूर्ण दाग समाधान: एक 1:1 सेल निलंबन के 10 μl के साथ एक hemocytometer गिनती चैम्बर भरें. उधर 4 कोने वर्गों में रहते हैं (सफेद) और मृत (नीला) कोशिकाओं की संख्या गिनती. कोशिकाओं / एमएल की संख्या निर्धारित करने के लिए निम्न गणना लागू होते हैं:
    15. 5 सीजीएम की मिलीलीटर और एक T25 सेमी 2 फ्लास्क को हस्तांतरण में Resuspend 2 x 10 5 कोशिकाओं;
    16. वर्गों 1.3.11-1.3.12 हर 4-5 DIV दोहराएँ. बाद विस्तार के दूसरे मार्ग से, महत्वपूर्ण दाग अपवर्जन द्वारा सेलुलर व्यवहार्यता का आकलन और 21 के रूप में वर्णित, प्रतिरूप घनत्व (8000 cells/cm2) में NPCs चढ़ाना द्वारा एक सतत विकास की अवस्था का निर्माण शुरू. सेल नंबर रखने और प्रक्रिया हर 4-5 DIV दोहराएँ. इस प्रकार के रूप में एक सतत विकास की अवस्था उत्पन्न करने के लिए, आगे बढ़ने के लिए:
      नायब: 4-5 DIV क्षेत्रों 150-200 माइक्रोन की एक व्यास पहुँच गए हैं चाहिए के बाद, एक अच्छा सेल तैयार कर सकें. टी का एक अच्छा अनुमान हैवह घनत्व सेल, यह hematocytometer भर में अच्छी तरह से वितरित, nonoverlapping कोशिकाओं के क्रम में एक इष्टतम कमजोर पड़ने कारक खोजने के लिए महत्वपूर्ण है. आदर्श रूप में, 50-200 कुल कोशिकाओं के बीच होना चाहिए. गिनती करते हैं, सीमाओं को छूने के बिना वर्ग में शामिल केवल कोशिकाओं विचार किया जाना है. इसके अलावा, कोशिकाओं की व्यवहार्यता एक स्वस्थ तैयारी के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है. महत्वपूर्ण बात है, यह अधिक से अधिक 90% होना चाहिए. एक रैखिक वृद्धि वक्र एक स्वस्थ कोशिका तैयार करने का एक और संकेत है.
      1. रहते हैं और मृत कोशिकाओं की संख्या (जैसे 1.3 x 10 6) गणना.
      2. मढ़वाया कोशिकाओं की संख्या (जैसे 1.3 x 10 6/2 x 10 = 5 6.5) से जीवित कोशिकाओं की संख्या में विभाजित विकास दर को परिभाषित करें.
      3. (= 2 एक्स 10 5 शुरुआत में) पिछले समय बिंदु पर मौजूद कोशिकाओं की कुल संख्या के लिए विकास दर से गुणा करके कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना.
      4. मतलब रिपोर्ट7; एक रेखीय प्रवृत्ति लाइन के निर्माण के लिए मानक विचलन.
    17. पारित होने के 6 से शुरू, यांत्रिक हदबंदी enzymatic पृथक्करण की जगह है. 10 मिनट के लिए 150 XG पर centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला हटाने सेल कुल हदबंदी समाधान के 200 μl में गोली resuspend, एक P200 के साथ 7-8X resuspend और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 10 मिनट सेते हैं.
    18. एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त और मुख्य महाप्रबंधक के 800 μl जोड़ने के लिए एक P200 के साथ 7-8X Resuspend. (जीवित और मृत दोनों) कक्षों की गणना और उनकी व्यवहार्यता की स्थापना. 5 सीजीएम की मिलीलीटर और एक T25 सेमी 2 फ्लास्क को हस्तांतरण में Resuspend 2 x 10 5 कोशिकाओं.
  4. Vivo में सेल ट्रैकिंग के लिए NPCs के वायरल पारगमन
    नायब:, वायरल पारगमन की दक्षता सत्यापित transduced और nontransduced NPCs के साथ एक समानांतर विकास की अवस्था का निर्माण करने के लिए. इसके अलावा, कि neurosphere कोशिकाओं के गठन की पूर्ण संख्या एक सेल तैयारी के भीतर मौजूद प्रतिरूप दक्षता हैtion या (propidium आयोडाइड, पीआई) के साथ डीएनए सामग्री से एक कोशिका चक्र विश्लेषण, सेल स्थिति के आगे संकेत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. संक्रमित कोशिकाओं का प्रतिशत अच्छा नहीं होना चाहिए, तो वायरल पारगमन के प्रोटोकॉल कोशिकाओं का एक ही आबादी के साथ एक दूसरी बार दोहराया जा सकता है. संक्रमण का स्तर संतोषजनक है और विकास की अवस्था जंगली प्रकार की कोशिकाओं के साथ प्राप्त की है कि इसी तरह एक बार, transduced NPCs विस्तार और / या प्रत्यारोपित किया जा सकता है.
    1. Neurospheres फसल और एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करते हैं. 10 मिलीलीटर सीजीएम में उच्च घनत्व (एक T75 सेमी 2 फ्लास्क में 1.5 x 10 6 कोशिकाओं) में कोशिकाओं थाली.
    2. 12 घंटा एक तीसरी पीढ़ी lentiviral वेक्टर pRRLsin की 3 एक्स 10 6 टीयू / एमएल जोड़ने के बाद. पीपीटी-एचसीएम्वी ई. के साथ इंजीनियर β-galactosidase (lacZ) या हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ कोलाई व्युत्पन्न.
    3. 48 घंटा बाद में, 10 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र फसल और एक 1:1 के अनुपात में कक्षों replate.
    4. के बादइन विट्रो में 3 अंश संक्रमण की दक्षता की जांच करें. प्रवाह cytometry सामान्यतः संक्रमण प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और संक्रमण के संतोषजनक स्तर आमतौर पर सकारात्मक कोशिकाओं के 75-95% की सीमा में होना स्वीकार कर लिया है. मार्कर अभिव्यक्ति के रखरखाव को सत्यापित करने के लिए विस्तार से 3 आगे मार्ग के बाद फिर से संक्रमण की दक्षता की जांच करें.
  5. Neurosphere ठंड
    1. 10 मिनट के लिए 300 XG पर एक T25 सेमी 2 फ्लास्क, अपकेंद्रित्र से neurospheres फसल, और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
    2. 10% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के साथ मध्यम (सीजीएम ठंड के 1 एमएल के साथ गोली Resuspend.
    3. एक ठंड कंटेनर के भीतर -80 डिग्री सेल्सियस पर cryovials रखें.
    4. कम से कम 24 घंटे के बाद महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एक cryobox और स्टोर करने के लिए कोशिकाओं को बढ़ने, या लंबे समय तक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए (एन 2) लाने.
  6. Neurosphere विगलन
    नायब: लंबे समय तक संपर्क ओ के जहरीले प्रभाव से बचने के लिएDMSO के साथ एफ NPCs, विगलन प्रक्रिया जितनी तेजी से होना चाहिए.
    1. से cryovial निकालें -80 सी / एन 2 डिग्री और सूखी बर्फ पर रखें.
    2. लगभग सभी सेल निलंबन defrosted और ठंडी निलंबन का केवल एक छोटा सा टुकड़ा रहता है जब तक जल्दी से, एक पानी के स्नान पर शीशी पिघलना.
    3. Prewarmed ताजा सीजीएम के 5 मिलीलीटर के साथ सेल निलंबन Resuspend.
    4. 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र.
    5. ताजा सीजीएम के 5 मिलीलीटर के साथ धीरे सतह पर तैरनेवाला, resuspend निकालें और एक साफ, अनुपचारित T25 सेमी 2 फ्लास्क में सेल निलंबन थाली.
  7. 1.7) एनपीसी लक्षण वर्णन
    नायब: पिछले धोने पीबीएस कवक विकास या संदूषण को रोकने के लिए 0,05% सोडियम पीबीएस के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, और coverslides 2-3 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है.

    नायब: intracellular मार्करों के लिए दाग अवरुद्ध समाधान में पीबीएस के लिए एक permeabilizing एजेंट जोड़ें. प्राथमिक एंटीबॉडी के स्रोत बकरी, गोजातीय सीरम albumi है तोN (बीएसए) या बकरी के अलावा अन्य के सीरम का इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

    नायब: intracellular मार्कर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में एक permeabilizing एजेंट उपयोग के लिए दाग.
    1. एक 24 अच्छी तरह से थाली के तल पर एक 13 मिमी कांच coverslide रखें. एक छोटी सी बूंद बनाने के लिए प्रत्येक coverslide के शीर्ष पर कोटिंग समाधान के 150 μl जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए सेते हैं, 5% सीओ 2.
    2. Neurospheres फसल और एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए अलग कर देना.
    3. लाइव कक्षों की गणना और 80,000 cells/35 μl प्राप्त करने के लिए पतला. कोमल आकांक्षा से coverslide से कोटिंग समाधान के अतिरिक्त हटा दें, और सेल निलंबन के 35 μl थाली.
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट सेते हैं, 5% सीओ 2. कोशिकाओं पालन करना शुरू कर दिया है, तो जल्दी से विपरीत चरण माइक्रोस्कोप पर जांच ले.
    5. उचित खुराक (1 टेबल देखें) और एंटीबायोटिक दवाओं (पीई के साथ बेसल माउस मध्यम मिश्रण से भेदभाव मध्यम तैयारn / Strep).
    6. भेदभाव मध्यम के 400 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, 5% सीओ 2.
    7. 3 DIV के बाद, ताजा भेदभाव मध्यम से मध्यम के परिवर्तन आधा.
    8. 6 DIV के बाद, मध्यम हटाने और पीबीएस के साथ एक बार धोने. एक रासायनिक हुड के तहत पीबीएस हटाने और prewarmed 4% paraformaldehyde (पीएफए) 4% sucrose के 300 μl जोड़ें. कमरे के तापमान (आर टी) में 5 मिनट के लिए सेते हैं. पीएफए ​​निकालें और पीबीएस के साथ 3x धो लो.
    9. Immunocytochemistry के साथ आगे बढ़ना, पीबीएस हटाने और पीबीएस 10% सामान्य बकरी सीरम (NGS) (अवरुद्ध समाधान) के साथ ब्लॉक, और आरटी पर 1 घंटा सेते हैं.
    10. अवरुद्ध समाधान निकालें और पीबीएस 1% NGS के साथ पतला वांछित प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें. वैकल्पिक रूप से, 120 मिनट आरटी पर 4 डिग्री सीओ / n या, सेते हैं.
    11. ऊष्मायन के बाद, पीबीएस के साथ 2x धो लो. पीबीएस 1% NGS के साथ पतला उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं. आरटी पर 60 मिनट सेते हैं.
    12. धो पीबीएस के साथ 2x और 4 के साथ नाभिक जवाबी दाग ​​',6-diamidino-2 phenylindole (DAPI) पीबीएस अंधेरे में आरटी पर 3 मिनट के लिए एजेंट permeabilizing साथ 1:20,000 पतला. पीबीएस के साथ और आसुत जल के साथ एक बार दो बार धोएं.
    13. एक गिलास ऊतक स्लाइड पर बढ़ते मध्यम की एक बूंद रखो और संदंश के साथ बढ़ते मध्यम सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ coverslide माउंट. धीरे बढ़ते मध्यम से अधिक बाहर निचोड़ coverslide दबाएँ. बढ़ते मध्यम सूख जाता है जब तक आरटी पर अंधेरे में coverslide छोड़ दो और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

C57BL 6 / चूहों में 2. मेलिन Oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (MOG) प्रेरित प्रायोगिक ऑटोइम्युनिटी

  1. पायस की तैयारी
    1. एक गिलास बीकर में [अन्यथा पूरी Freund के सहयोगी (सीएफए) के रूप में परिभाषित] और MOG (पेप्टाइड 35-55) के 200 ग्राम, पर विचार माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग के 4 मिलीग्राम / एमएल युक्त अधूरा Freund के सहायक से बना एक पायस तैयार कि पायस की कुल राशि प्रति माउस 300 μl हो जाएगा.
      नायब: Appropriaसीएफए में MOG प्रतिरक्षित चूहों के ते नियंत्रण केवल सीएफए के साथ प्रतिरक्षित चूहों हैं. MOG प्रतिरक्षित चूहों में रोग शुरू होने की उम्मीद विचरण 11.3 (1.8 ±) डीपीआई है.

      नायब: जरूरत पायस की कुल मात्रा की गणना, छुटकारा चूहों की संख्या के रूप में दो बार के रूप में ज्यादा मात्रा पर विचार करें. कांच के बने पदार्थ पायस के भाग के कचरे को कम करने के लिए Plasticware को प्राथमिकता दी जानी चाहिए.
      1. एक गिलास सिरिंज हमेशा बर्फ पर पायस रखने के बारे में 30 मिनट के लिए एक 19 जी सुई मिश्रण जोत के साथ.
      2. पायस तैयार है, तो सत्यापित पानी पर पायस की एक छोटी राशि ड्रॉप करने के लिए. यह है और फैलाने नहीं करता है के रूप में ड्रॉप रहता ही अगर पायस इंजेक्शन के लिए तैयार है.
      3. केवल सीएफए के साथ चूहों के नियंत्रण समूह छुटकारा. प्रयोगात्मक चूहों का इलाज सीएफए में MOG साथ (MOG प्रतिरक्षित). MOG में रोग शुरू होने की उम्मीद विचरण चूहों 11.3 (1.8 ±) डीपीआई है प्रतिरक्षित.
    2. 1 मिलीलीटर प्लास्टिक सिरिंज एक 19 जी सुई स्थानांतरणएन डी पायस aspirate. बुलबुले से बचने के लिए एक 25 जी के साथ सुई बदलने के लिए और बर्फ पर सिरिंज छोड़ दें. पायस से भर सीरिंज इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार हैं और मानव संसाधन के एक जोड़े के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए.
  2. प्रतिरक्षण
    1. एक वार्मिंग बॉक्स में (महिला 6-8 सप्ताह पुराने) चूहों प्लेस और के बारे में 10 मिनट पूंछ नस को चौड़ा करने के लिए अनुमति देने के लिए प्रतीक्षा करें.
    2. एक माउस restrainer को वार्मिंग बॉक्स से एक माउस स्थानांतरण. माउस के किसी भी आंदोलन से बचने के लिए restrainer बंद करें.
    3. बुलबुले बनाने से परहेज काली खांसी विष (5 ग्राम / एमएल) के 100 μl के साथ एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज भरें. धीरे धीरे पूंछ नस में समाधान इंजेक्षन. खून बह रहा है प्लग करने के लिए कागज के एक टुकड़े के साथ कुछ सेकंड के लिए सुई और प्रेस निकालें.
    4. वापस पिंजरे में माउस रखें और सभी चूहों के लिए एक ही प्रक्रिया को दोहराने.
    5. निरंतर isoflurane साँस लेना (1-2%, 2 एल / मिनट) के साथ एक माउस anesthetize और स्तर पर पायस subcutaneously के 100 μl इंजेक्षनदो flanks और पूंछ (300 μl पायस / माउस) के आधार के. धीरे धीरे पायस के रिसाव से परहेज, सिरिंज हटा दें.
    6. , एक कान छेदने के साथ माउस को चिह्नित पिंजरे में चूहों डाल दिया और पूरी वसूली तक की जांच. सभी चूहों के लिए दोहराएँ.
    7. 48 घंटे के बाद (2 दिनों के बाद टीकाकरण, डीपीआई) दोहराने खंड 2.2.3.
  3. EAE चूहों के व्यवहार विश्लेषण
    1. 5 डीपीआई से शुरू, दैनिक चूहों का वजन और तालिका 1 में वर्णित पैमाने स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग करके अपने हरकत प्रदर्शन की निगरानी.

पूंछ नस में तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के 3. इंजेक्शन (चतुर्थ)

  1. सेल तैयार
    1. 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा हार्वेस्ट neurospheres.
    2. सतह पर तैरनेवाला निकालें और सेल कुल हदबंदी समाधान के 200 μl जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट सेते हैं, 5% सीओ 2.
    3. धीरे 10-12x (avoidin resuspendजी एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए जब तक एक P200 के साथ बुलबुले) और सीए 2 + और ​​2 मिलीग्राम + बिना बेसल मध्यम के साथ 800 μl के लिए ले.
    4. सेल व्यवहार्यता परख और 10 6 cells/150 μl के अंतिम घनत्व प्राप्त करने के लिए सीए 2 + और ​​2 मिलीग्राम + बिना बेसल मध्यम के साथ निलंबन पतला करने के लिए एक महत्वपूर्ण दाग का उपयोग करके कक्षों की गणना. उपयोग करें जब तक बर्फ पर सेल निलंबन रखें.
  2. एनपीसी चतुर्थ इंजेक्शन
    नायब: एकल कक्ष निलंबन में आदर्श हदबंदी और हवा के बुलबुले के अभाव नस रोड़ा और फलस्वरूप मौत में परिणाम हो सकता है जो एम्बोली गठन बनाम clumps / समुच्चय या तो के जोखिम को कम करने पर विचार करने के लिए दो महत्वपूर्ण पहलू हैं.
    1. रोग (16-18 डीपीआई) के शिखर पर, वजन और चूहों से स्कोर. सजातीय समूहों के क्रम में उनके स्कोर के अनुसार चूहों से वितरित करें.
    2. एक वार्मिंग बॉक्स में चूहों प्लेस और के बारे में 10 मिनट पूंछ नस को चौड़ा करने के लिए अनुमति देने के लिए प्रतीक्षा करें. एक माउस restrainer को वार्मिंग बॉक्स से एक माउस स्थानांतरण. माउस के किसी भी आंदोलन से बचने के लिए restrainer बंद करें.
    3. सेल निलंबन के 150 μl के साथ एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज भरें और सभी बुलबुले को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें. धीरे धीरे पूंछ नस में समाधान इंजेक्षन. खून बह रहा है (आंकड़े 6A और 6B) प्लग करने के लिए कागज के एक टुकड़े के साथ कुछ सेकंड के लिए सुई और प्रेस निकालें.
    4. पिंजरे में माउस प्लेस और वसूली तक की जांच. सभी चूहों के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ.

4. महाकुण्ड (आईसीवी) में तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के इंजेक्शन

  1. सेल तैयार
    1. 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifuging द्वारा हार्वेस्ट NPCs.
    2. सतह पर तैरनेवाला निकालें और सेल कुल हदबंदी समाधान के 200 μl जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट सेते हैं, 5% सीओ 2.
    3. धीरे एक सी प्राप्त करने के लिए जब तक एक P200 के साथ 10-12x resuspendपक्ष निलंबन और सीए 2 + और ​​2 मिलीग्राम + बिना बेसल मध्यम के साथ 800 μl के लिए ले.
    4. कक्षों की गणना और वांछित सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए सीए 2 + और ​​2 मिलीग्राम + बिना बेसल मध्यम के साथ निलंबन पतला. उपयोग करें जब तक बर्फ पर सेल निलंबन रखें.
  2. 4.2) एनपीसी ICV इंजेक्शन
    1. रोग (16-18 डीपीआई) के शिखर पर, वजन और चूहों से स्कोर. सजातीय समूहों के क्रम में उनके स्कोर के अनुसार चूहों से वितरित करें.
    2. निरंतर isoflurane साँस लेना (1-2%, 2 एल / मिनट) के तहत एक stereotaxic तंत्र पर माउस रखें. कान सलाखों के साथ माउस का सिर सुरक्षित. तो मुंह और नाक टुकड़े दोनों को समायोजित. माउस के सिर फ्लैट और तय है सुनिश्चित करें.
    3. Povidone आयोडीन (पीवीपी-I) के साथ माउस के सिर झाड़ू और खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए सिर के पीछे भाग में त्वचा में कटौती करने के लिए एक चीरा बनाते हैं.
    4. एक micromanipulator का प्रयोग, एक microl की नोक डालनेगर्दन के पीछे midline में बरकरार मांसपेशियों और स्नायुबंधन के माध्यम से डब और एटलस बांस के बीच फांक में आईटीईआर सिरिंज. सुई का तुला भाग 22 में वर्णित के रूप में, पूरी लंबाई के लिए डब की आंतरिक सतह के साथ निकट संपर्क में रखा जाता है.
    5. धीरे धीरे सुई डालने और कुछ मिनट रुको. ऑपरेटर सुई सेल तैयारी इंजेक्शन लगाने शुरू करने से पहले माउस खोपड़ी, करने के लिए "आदी" होने का एहसास पहचान जानने के लिए होती है. धीरे धीरे (3-5 मिनट के भीतर) कोशिकाओं की मात्रा इंजेक्षन. इंजेक्शन के बाद अतिरिक्त कुछ सेकंड के लिए जगह में सुई छोड़ दो और धीरे धीरे सिरिंज हटा दें.
    6. त्वचा को सिलाई और पूरी वसूली तक एक वसूली पिंजरे में माउस जगह.

5. ऊतक प्रसंस्करण

  1. गहराई से 0.5 मिलीग्राम ketamine (100 मिलीग्राम / एमएल), 0.25 मिलीग्राम xylazine (23.32 मिलीग्राम / एमएल) और 4.25 मिलीलीटर बाँझ पानी का मिश्रण के साथ चूहों बेहोश करना और transcardically डब्ल्यू, छिड़कनाखारा EDTA के साथ ashing और 4% पीएफए ​​के साथ फिक्सिंग. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए 4% पीएफए ​​में कशेरुका स्तंभ और दिमाग और पोस्टफिक्स दोनों निकालें पीबीएस में ऊतक धो लें, हड्डियों से रीढ़ की हड्डी डोरियों को हटाने और 4 डिग्री सेल्सियस पर (पीबीएस) में 30% sucrose में ऊतक कम से कम 48 घंटा छोड़ 2 के रूप में वर्णित, इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर) परिसर में ऊतकों शामिल करें और तरल नाइट्रोजन के साथ फ्रीज तस्वीर.
  2. 10-12 माइक्रोन मोटी स्लाइस में ऊतकों में कटौती करने के लिए एक सूक्ष्म प्रयोग करें.
  3. वैकल्पिक रूप से, agarose में ताजा ऊतक एम्बेड और एक vibratome 50-80 माइक्रोन मोटी स्लाइस का उपयोग ऊतक में कटौती.
  4. दोनों ही मामलों में, 5-Bromo-4-क्लोरो 3 indolyl-β परमाणु β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने के लिए डी galactopyranoside (एक्स लड़की) के घोल में 37 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन सेते हैं.
  5. Astrocytes (50 माइक्रोग्राम / एमएल), न्यूरॉन्स के लिए antineuronal परमाणु प्रतिजन (NeuN) के लिए antiglial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) का उपयोग करते हुए 5 माइक्रोन स्लाइस और डबल दाग में β-लड़की + कोशिकाओं से युक्त वर्गों (1 & recut# 956; जी / एमएल) और undifferentiated तंत्रिका कोशिकाओं (10 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए antiNestin.
  6. वर्गों 1.7.11 और 1.7.12 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें. कई stainings लिए विभिन्न fluorophores साथ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग सुनिश्चित करें.
  7. GFP लेबल कोशिकाओं से युक्त ऊतकों के लिए कदम के रूप में 5.1-5.3 में समझाया आगे बढ़ना है और कई stainings के साथ आगे बढ़ना.
  8. स्लाइड्स पर बढ़ते मध्यम से कुछ बूँदें जोड़ें और एक ऊतक coverslip के साथ कवर किया.
  9. साथ दाग वर्गों के लिए बायोटिन संयुग्मित एंटीबॉडी (तालिका 2 देखें, एबीसी समाधान) avidin बायोटिन परिसर का एक समाधान तैयार है और 45 मिनट के लिए आंदोलन में छोड़ दें.
  10. अंतर्जात peroxidase की गतिविधि को ब्लॉक करने के लिए 1% एच 2 ओ 2 के साथ स्लाइस 5 मिनट सेते हैं.
  11. पीबीएस के साथ दो बार धोएं.
  12. आरटी पर 1hr के लिए एबीसी समाधान के साथ सेते हैं.
  13. पीबीएस के साथ दो बार धोएं.
  14. 3,3 '-diaminobenzidine समाधान और 0.3% एच 2 ओ 2 के साथ सेते हैं. प्रतिक्रिया के लिए संयुक्त राष्ट्र की निगरानी करेंएक माइक्रोस्कोप der और जैसे ही टुकड़ा ब्राउन (आमतौर पर लगभग 5-10 मिनट) शुरू हो रही है के रूप में पीबीएस के साथ धो लो.
  15. पीबीएस के साथ दो बार धोने और कदम 5.7 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ना.

सामग्री और अभिकर्मकों की व्यापक सूची तालिका 2 में दिखाया गया है.

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Representative Results

एनपीसी व्युत्पत्ति और लक्षण
SVZ dissections यांत्रिक और enzymatic पृथक्करण (चित्रा 1 ए) के माध्यम से 6-8 सप्ताह पुराने C57BL 6 / चूहों की (एन = 5-7 चूहों / पूल) पूल पर प्रदर्शन कर रहे हैं. सीजीएम में संवर्धन के कुछ ही दिनों के बाद मुक्त अस्थायी neurospheres (आंकड़े 1 ए और 1 बी) के गठन के लिए शुरू. प्राथमिक क्षेत्रों एकत्र और यंत्रवत् हर 4-5 DIV passaged हैं. Passaging पर, रहते हैं और मृत कोशिकाओं की संख्या का पता लगाया और संचयी सेल नंबर एक विकास वक्र (चित्रा 1C) उत्पन्न करने के लिए साजिश रची है. यह इस प्रकार एनपीसी तैयारी की वैश्विक स्थिरता का मूल्यांकन करने के लिए एक अप्रत्यक्ष पैरामीटर प्रदान करने, प्रसार दर का संकेत देता है. और undifferentiated तंत्रिका कोशिकाओं के (जैसे nestin) (2A चित्रा); neurospheres के रूप में proliferating करते हैं, NPCs mitotic गतिविधि के मार्कर (5 ग्राम / एमएल phospho-histone H3, PHH3) व्यक्त करते हैं. Therapeutically ई हो रहे हैं कि undifferentiated NPCsEAE में fficacious प्रत्यारोपण के बाद CD44 (5 ग्राम / एमएल), VLA-4 (10 माइक्रोग्राम / एमएल) की α4 सबयूनिट (चित्रा 2 एफ) शामिल है कि कोशिका की सतह आसंजन अणुओं व्यक्त करना चाहिए. उचित भेदभाव परिस्थितियों में चढ़ाया करते हैं, NPCs ऐसे astroglial मार्कर GFAP (चित्रा -2) के रूप में तीन तंत्रिका प्रजातियों, चित्रा (2 बी), के विशिष्ट मार्करों व्यक्त, neuronal मार्कर microtubule प्रोटीन 2 (एमएपी -2 जुड़े; / एमएल 5 ग्राम ) (चित्रा 2 डी) और oligodendroglial मार्करों O4 (5 ग्राम / एमएल) और माइलिन बुनियादी प्रोटीन (MBP, 10 माइक्रोग्राम / एमएल) (चित्रा 2 ई), इस प्रकार NPCs तीन मुख्य तंत्रिका प्रजातियों की ओर multipotent हैं कि इस बात की पुष्टि. विवो में प्रतिरोपित कोशिकाओं की पहचान की सुविधा के लिए, NPCs ऐसे GFP के रूप में stably एक्सप्रेस रिपोर्टर जीन करने के लिए इंजीनियर lentiviruses साथ transduced कर रहे हैं. Transduced NPCs (neurospheres proliferating के रूप में आंकड़े 3 ए और 3 दोनों व्यक्त GFPसी) के रूप में भी वृद्धि कारक वापसी (3B चित्रा) पर इन विट्रो में फर्क है. पारगमन की दक्षता को सत्यापित करने के लिए, GFP की अभिव्यक्ति (कि काफी समय से प्रोटीन के स्तर पर शुरू की transgene की मजबूत अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है) के रूप में जल्दी सेल पारगमन के बाद 3 अंश के रूप में शुरू करने, प्रवाह cytometry से विश्लेषण किया है. इन विट्रो में NPCs के लिए तीसरी पीढ़ी lentiviruses आवेदन, हम लगातार प्रसार में प्रकट विषाक्तता और न ही परिवर्तन न तो, कई स्वतंत्र प्रयोगों (चित्रा -3 सी) से अधिक GFP के उच्च स्तर दिखा कोशिकाओं की> 90% का निरीक्षण, विकास जंगली प्रकार का घटता है और जब तुलना Lenti-GFP transduced NPCs (चित्रा 3 डी).

क्रोनिक EAE प्रेरण
यह एमएस के रोग और नैदानिक ​​घटनाओं का सबसे स्मरण दिलाता है के बाद से EAE, एमएस की सबसे विशेषता मॉडलों में से एक है. शहरी को MOG35 -55 नेतृत्व के साथ C57BL 6 / चूहों का टीकाकरणEAE के एक पुराने फार्म की टी. प्रेरण चरण (preclinical) के दौरान रोग शुरुआत (11.3 ± 1.8 डीपीआई) जब निकट, MOG चूहों के वजन (चित्रा -4 ए) खोने शुरू प्रतिरक्षित. प्रेरक / आक्रमण चरण की शुरुआत में (शिखर नैदानिक; 16.8 ± 3.2 डीपीआई) EAE चूहों (3.5 ± 0.7 अंक) रोग के शिखर तक पहुँचने, और शीघ्र ही बढ़ता जा के बाद वे अंत में पुरानी दौरान स्थिर है कि एक प्रगतिशील और आंशिक वसूली दिखाने बाद लगभग 30 डीपीआई से चरण (स्थिर नैदानिक) (2.8 ± 0.9 अंक) (चित्रा 4 बी). Vivo में ऊतक विकृति के साथ रखा intravital माइक्रोस्कोपी 23 या चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग 24 या तो कुछ की जांच EAE, सहित कई अध्ययनों, प्रेरक / आक्रमण चरण (16-22 डीपीआई) अवसर के आदर्श खिड़की (वू) के शिखर में पहचान की है लंबे समय से सूजन EAE सीएनएस भर माध्यमिक डी से बचाने के लिए इरादा स्टेम कोशिकाओं के साथ प्रणालीगत प्रयोगात्मक उपचार के प्रदर्शन करने के लिए जो मेंamage.

एनपीसी इंजेक्शन
Syngeneic NPCs मस्तिष्क (चित्रा 5A) और रीढ़ की हड्डी (आंकड़े 5 ब डी) में दोनों, चित्रा (6) सीएनएस क्षति की परिवाहकीय क्षेत्रों में लगभग विशेष रूप से पाए जाते हैं EAE चूहों में प्रणालीबद्ध इंजेक्शन, अप करने के लिए 45 दिन, प्रत्यारोपण (डीपीटी) पोस्ट वर्णित के रूप में 5. चतुर्थ. कुछ NPCs NeuN (चित्रा 5D) व्यक्त परिवाहकीय क्षेत्र से बाहर ले जाते समय NPCs preferentially, एक अपरिपक्व, nestin + (चित्रा 5C) phenotype बनाए रखने इंजेक्शन. ध्यान से, NPCs स्वस्थ नियंत्रण में चतुर्थ इंजेक्शन नाड़ी मार्ग (चित्रा 5E) के माध्यम से सीएनएस में प्रवेश करने में विफल. चतुर्थ एनपीसी इंजेक्शन के बाद, इंजेक्शन NPCs की बड़ी संख्या के रूप में जल्दी 10 डीपीटी (चित्रा 5F) के रूप में, इस तरह के जिगर, पेट, तिल्ली, फेफड़े और गुर्दे, लेकिन नहीं दिल के रूप में गैर सीएनएस अंगों के स्तर पर पाए जाते हैं. गैर सीएनएस जमते NPCs पूरी तरह से thes के बाहर मंजूरी दे दी है 30 डीपीटी (चित्रा 5G) द्वारा ई परिधीय अंगों.

चित्रा 1
चित्रा 1. वयस्क चूहों के SVZ से NPCs के अलगाव और stably विस्तार योग्य एनपीसी लाइनों की पीढ़ी. एक योजनाबद्ध stably विस्तार योग्य की पीढ़ी के मुख्य महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व, और इंजेक्शन माउस NPCs की तैयारी. बी, इन विट्रो में Neurospheres. सी neurospheres हर 4-5 दिनों passaged कर रहे हैं, NPCs सुसंस्कृत. रहते हैं और मृत कोशिकाओं की संख्या एकत्र और संचयी सेल नंबर एक विकास की अवस्था उत्पन्न करने के लिए साजिश रची है. बी में पैमाने बार 200 मीटर है. सी में डाटा एसडी ± कोशिकाओं का मतलब संचयी संख्या में हैं (n = 3).

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चित्रा 2. NPCs विशेषता. एक,, भेदभाव की स्थिति में 6 DIV बाद, NPCs astroglial (GFAP की ओर multipotent हैं, proliferating माउस neurospheres PHH3 कोर histone प्रोटीन (हरा) एक्सप्रेस, और प्रकार छठी मध्यवर्ती रेशा प्रोटीन nestin (लाल). इ सी में लाल), neuronal (एमएपी-2, डी में हरा) और oligodendroglial (O4, ई में हरी;) और MBP, ई में लाल प्रजातियों. की मात्रा GFAP-, एमएपी 2, और 6 DIV पर O4 व्यक्त कोशिकाओं इन विट्रो में एनपीसी भेदभाव बी में पता चला रहे हैं के बाद. बी में डाटा एसडी ± के रूप में मतलब% कर रहे हैं (n = 3). CE में स्केल सलाखों leukocy को विनियमित मुख्य कोशिका की सतह आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति की cytometry विश्लेषण 50 माइक्रोन. एफ, फ्लो हैंते परिस्त्राव माउस neurospheres में. चित्रा 2 एफ Pluchino एट अल से reproduced है. 2

चित्रा 3
Lentiviruses रिपोर्टर जीन (जैसे GFP. ए और बी, एक 3 पीढ़ी Lenti-GFP वेक्टर के साथ transduced किया गया है कि neurospheres (ए) और फर्क NPCs (बी) के चरण विपरीत छवियाँ. प्रवाह cytometry विश्लेषण व्यक्त साथ NPCs के चित्रा 3. पारगमन ए सी में NPCs की, जंगली प्रकार (transduced नहीं) और neurospheres हर 4-5 दिनों passaged रहे हैं Lenti-GFP transduced NPCs सुसंस्कृत. रहते हैं और मृत कोशिकाओं की संख्या एकत्र कर रहे हैं और संचयी सेल नंबर एक विकास की अवस्था उत्पन्न करने के लिए साजिश रची. में पैमाने पर पट्टीए और बी 200 माइक्रोन है. सी में डाटा एसडी ± कोशिकाओं का मतलब संचयी संख्या में हैं (n = 3).

चित्रा 4
चित्रा 4. पुरानी EAE के कार्यात्मक विशेषता. कुल एक ओवर MOG और सीएफए प्रतिरक्षित C57BL 6 / चूहों में निगरानी के एक दैनिक, वजन 40 डीपीआई का पालन करें. बी, एक कुल से अधिक MOG और सीएफए प्रतिरक्षित C57BL 6 / चूहों में दैनिक EAE स्कोर निगरानी 40 डीपीआई के ऊपर का पालन करें . डाटा एसडी ± के रूप में मतलब संख्या (n = 10 चूहों / समूह) व्यक्त कर रहे हैं.

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रणालीबद्ध NPCs migr इंजेक्शनEAE चूहों की पैरेन्काइमा में खा लिया. एई, vibratome कटौती (70 माइक्रोन) मस्तिष्क (ए) और रीढ़ की हड्डी (बी) की एक्स लड़की धुंधला EAE चूहों से ऊतक वर्गों प्रत्यारोपित β-लड़की + कोशिकाओं दिखा, syngenic NPCs के साथ चतुर्थ इंजेक्शन ( परिवाहकीय सीएनएस क्षेत्रों के भीतर बने नैदानिक ​​के अंत तक परिवाहकीय सीएनएस क्षेत्रों के भीतर बने नीले कक्ष) (106 डीपीआई) का पालन करें. सी, β-लड़की + चतुर्थ. इंजेक्शन NPCs (नीला), एक nestin + (ब्राउन) phenotype बनाए रखने में. डी , कुछ पलायन NPCs जब तक वे परिवाहकीय क्षेत्र से बाहर ले जाने के रूप में NeuN + (ब्राउन) व्यक्त करते हैं. ई, एक दिखावा इलाज EAE माउस से एक प्रतिनिधि रीढ़ की हड्डी अनुभाग में एक्स लड़की धुंधला हो जाना. .. स्केल सलाखों, 20 माइक्रोन FG, सीएनएस के अलावा अन्य ऊतकों का विश्लेषण आईसी पता चलता है कि - चतुर्थ. इंजेक्शन NPCs (नीले कक्ष) के लगभग सभी अंगों तक पहुंचने या (. जैसे फेफड़े, जिगर, तिल्ली, हृदय, आंत, गुर्दे) बुद्धिहिन 10 डीपीटी (एफ), लेकिन 30 डीपीटी (G) द्वारा एक ही अंगों से मंजूरी दे दी है. आंकड़े 5F जी Pluchino एट अल से reproduced है, जबकि 5 ए, ई, संदर्भ 5 से reproduced है रु. 2

चित्रा 6
.. EAE साथ चूहों में NPCs के प्रणालीगत इंजेक्शन की EAE मुख्य महत्वपूर्ण कदम के साथ चूहों में NPCs के प्रणालीगत इंजेक्शन के लिए प्रोटोकॉल के 6 चित्र योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व: इंजेक्शन सीएएम की तैयारी एकल कक्ष व्यक्त करने से NPCs अलग सेल संस्कृति कक्ष (एक) , लक्षित किया है कि इंजेक्शन NPCs के vivo का पता लगाने की दिशा में प्रेरक / आक्रमण रोग चरण (बी) के चरम पर EAE चूहों की पूंछ नस में इंजेक्शन के लिएसीएनएस (सी), इंजेक्शन NPCs (डी) के चिकित्सीय plasticity के तंत्र के अध्ययन की अनुमति में विवो ऊतक रोग के अध्ययन के लिए. डी में, में हरे रंग की कोशिकाओं oligodendrocytes हैं, गहरे नीले रंग की कोशिकाओं axons हैं, हल्के नीले रंग की कोशिकाओं NPCs प्रतिरोपित कर रहे हैं, नारंगी कोशिकाओं astrocytes हैं, और लाल कोशिकाओं endothelial कोशिकाओं हैं.

<टीडी> 2.5
स्कोर लोकोमोटर प्रतिक्रियाएँ
0 सामान्य माउस. बीमारी का कोई प्रत्यक्ष लक्षण
1 लंगड़ा पूंछ: पूंछ की पूरी ढीलापन, और एक माउस उठाया है जब पूंछ की नोक पर कर्लिंग का अभाव
1.5 पिछले अंग कमजोरी: एक waddling चाल पर चलने जब माउस सामयिक और संक्षिप्त trippings से पता चलता है
2 लंगड़ा पूंछ और पिछले अंग कमजोरी: अपनी पीठ पर रख दिया गया है, तो माउस अपनी सामान्य स्थिति में नहीं बदल सकते हैं
आंशिक पिछले अंग पक्षाघात: माउस नहीं रह दुम मुद्रा बनाए रखने या चलने के लिए हिंद अंग का उपयोग कर सकते हैं, लेकिन अभी भी कुछ हद तक एक या दोनों hindlimbs स्थानांतरित कर सकते हैं, forelimbs अप्रभावित रहते हैं
3 पूरा पिछले अंग पक्षाघात: hindlimbs में आंदोलन का कुल नुकसान. माउस केवल अप्रभावित रहते हैं जो अपने forelimbs, पर खुद को खींचता. इस चरण में चूहे को पिंजरे फर्श, लंबे sipper ट्यूबों, और निर्जलीकरण को रोकने के लिए हाइड्रेटिंग समाधान के दैनिक चमड़े के नीचे इंजेक्शन पर भोजन दिया जाता है. चूहों घावों या उपचार से ठीक नहीं है कि त्वचा के घावों का विकास करते हैं, तो वे नम्रता से मार डाला जाएगा
3.5 Forelimb कमजोरी: एक ऊर्ध्वाधर ग्रिड पर जगह, माउस चढ़ाई करने में सक्षम नहीं है और धीरे - धीरे गिरता है
4 मरणासन्न राज्य
5 माउस मानवीय endpoints के अनुसार मृत पाया या मारी गईं

टाble 1. नैदानिक ​​लक्षण और EAE चूहों में आरोही पक्षाघात के पांच चरण पैमाने.

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Discussion

दैहिक स्टेम सेल आधारित चिकित्सा ऐसे MS2 11 के रूप में जीर्ण सूजन सीएनएस विकारों के इलाज के लिए सबसे होनहार रणनीतियों में से एक के रूप में उभर रहे हैं. उनके उपचारात्मक प्रभाव को बनाए रखने के लिए तंत्र अभी भी पूरी तरह से स्पष्ट किए जाने की जरूरत है, neurodegenerative रोगों के विभिन्न प्रयोगात्मक मॉडल में एनपीसी प्रत्यारोपण का महत्वपूर्ण प्रभाव कोशिकाओं जल्द ही मानव अध्ययन में लागू किया जा सकता है कि स्टेम कुछ हद तक उत्तेजक विश्वास को जन्म दिया है. बहरहाल, हम कुछ महत्वपूर्ण मुद्दों का सामना करना है और इस तरह (multipotent बनाम अल्लोजीनिक, pluripotent बनाम ऑटोलॉगस) प्रत्यारोपण के लिए आदर्श स्टेम सेल के स्रोत की पहचान और सबसे अच्छा मार्ग के रूप में कुछ अनुत्तरित प्रश्न, को संबोधित करने की जरूरत है इस तरह के अभिनव के उपचारों के किसी भी संभावित मानव आवेदनों की परिकल्पना से पहले प्रशासन की.

Neurodegenerative रोगों कुछ स्थानिक (जैसे सीमित होने के साथ उनके pathophysiologies में मतभेद है. में रीढ़ की हड्डीजूरी, स्ट्रोक) अन्य एक स्थानिक अस्थायी प्रसार (जैसे एमएस) के द्वारा होती जा रही है. यह मस्तिष्क क्षति की कई साइटों की उपस्थिति को दूर करने की एक अतिरिक्त चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है जहां उत्तरार्द्ध, के लिए अपर्याप्त या बस unfeasible हो सकता है (स्टेम सेल) के फोकल इंजेक्शन, पूर्व के लिए एक उपयुक्त इलाज हो सकता है कि व्युत्पन्न.

लगातार सबूत नसों में प्रसव पर्यावरण भावना और विशेष रूप से घर क्षति की साइट (एस) की ओर करने के लिए स्टेम कोशिकाओं के आंतरिक क्षमता द्वारा समर्थित सेल प्रशासन के लिए एक वैध (और कम आक्रामक) प्रोटोकॉल, का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं दिखाया गया है. हालांकि, क्लीनिक में प्रणालीगत एनपीसी के उपचारों के अनुवाद अभी या साइटों नहीं हो सकता है कि इस तरह के परिधीय गैर सीएनएस अंगों में प्रतिरोपित कोशिकाओं के संभावित संचय (जैसे फेफड़ों, तिल्ली, लिम्फ नोड्स, और गुर्दे) के रूप में कुछ सीमाएं, द्वारा बाधा है विवो में स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रियाओं की. जबकि इस अविशिष्ट accumलक्ष्य सीएनएस के बाहर इंजेक्शन NPCs की आबादी जल्दी पुरानी EAE2 साथ चूहों में मंजूरी दे दी है, लंबी अवधि के एनपीसी हठ (या कुछ मामलों में विशेष लक्ष्य) के सबूत माध्यमिक lymphoid अंगों (जैसे. लिम्फ नोड्स और तिल्ली) के स्तर पर है EAE5 19,20 relapsing के साथ चूहों में प्रणालीगत इंजेक्शन के बाद. प्रतिरोपित NPCs की बड़ी संख्या को गैर सीएनएस अंगों की ओर recirculate तथ्य यह है कि अनिवार्य रूप से सीएनएस में NPCs की पूर्ण संख्या को कम करने, एक कमजोर पड़ने प्रभाव पैदा करता है. दिलचस्प है, प्रणालीबद्ध सीएनएस 19,20 के बाहर विशेष रूप से जमते भी जब NPCs (प्रतिरक्षा विनियामक कार्यों के माध्यम से उदाहरण के लिए) therapeutically प्रभावशाली इंजेक्शन. और सीएनएस को लक्षित इंजेक्शन NPCs के समग्र चिकित्सीय प्रभाव केवल 5 या लिम्फ नोड्स केवल 19 तुलना कर रहे हैं. इस कारण surroundin की आणविक घटकों के लिए अलग प्रतिक्रिया है, जो कोशिकाओं का अभिन्न plasticity, भाग में हो सकता हैजी microenvironment. विशेष रूप से, एक हाथ पर प्रत्यारोपित NPCs भड़काऊ साइटोकिन्स की उपस्थिति महसूस कर सकते हैं और प्रतिरक्षा modulatory तंत्र 16 के माध्यम से उनके उपचारात्मक प्रभाव डालती है, दूसरी ओर वे अंततः ट्यूमर 25,26 के गठन के लिए अग्रणी शत्रुतापूर्ण microenvironments के साथ संपर्क में आ सकता है. इन कारणों के लिए, पसंदीदा विकल्प सीएनएस में इंजेक्शन NPCs ध्यान केंद्रित करने के लिए वर्तमान में है. जैसे, (एक काठ या कुण्ड संबंधी मार्ग के माध्यम से) intrathecal प्रशासन अभी भी नैदानिक ​​परीक्षणों में प्रशासन के सबसे स्वीकार किए जाते हैं भावी मार्ग है. हालांकि, multifocality और एमएस घावों के रोग विविधता तरह के एक दृष्टिकोण की प्रभावकारिता को सीमित कर सकता.

यहाँ हम प्रणालीबद्ध (चतुर्थ और आईसीवी दोनों) पुरानी EAE, सबसे स्टू में से एक से प्रभावित चूहों में NPCs इंजेक्षन करने के लिए क्रमिक वयस्क SVZ और, से माउस तंत्रिका progenitors, अलग बनाए रखने और चिह्नित करने के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल का वर्णनएमएस के मॉडल की मृत्यु हो गई. अपेक्षाकृत सरल और सीधा, इन प्रोटोकॉल को ध्यान में रखा जाना चाहिए कि कुछ महत्वपूर्ण कदम उपस्थित हालांकि. सबसे पहले, यह एक stably विस्तार योग्य और स्वस्थ कोशिका तैयार करने को प्राप्त करने के लिए अनिवार्य है. प्रोटोकॉल भर में वर्णित है, कोशिकाओं की स्थिरता परोक्ष रूप से उनके विकास दर को देखकर अनुमान लगाया जा सकता है. आदर्श रूप में, neurospheres हर 4-5 DIV और मार्ग पर कोशिका मृत्यु का प्रतिशत (10% से कम) बहुत ही कम होना चाहिए 150-200 माइक्रोन की एक व्यास तक पहुंच जाना चाहिए. इसके अलावा, neurospheres माइक्रोस्कोप में एक कॉम्पैक्ट और नियमित रूप से गोल आकार पेश करना होगा. lentiviruses साथ संक्रमण कोशिकाओं के अस्तित्व और स्थिरता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. एक इष्टतम संक्रमण प्राप्त करने के लिए, यह 3 एक्स 10 6 टीयू / एमएल प्राप्त करने के लिए पर्याप्त रुचि के वायरस की एक अनुमापन प्राप्त करने के लिए अनिवार्य है. एक हाथ पर वायरस का एक कम राशि संक्रमित कोशिकाओं का एक छोटा सा प्रतिशत के लिए नेतृत्व करेंगे, जबकि वास्तव में, दूसरे हाथ पर एक उच्च राशि का उपयोग woulडी की संभावना (संक्रमित होने की जीन पर निर्भर) एक विषाक्तता प्रभाव पैदा होती हैं. NPCs को एकीकृत वायरस के साथ कई बार संक्रमित हो सकता है, करना चाहिए transgene सकारात्मक व्यवहार्य कोशिकाओं के कम प्रतिशत को पहली पारगमन नेतृत्व का परिणाम. यह nontransduced जंगली प्रकार, साथ स्थिरता और व्यवहार्यता मापदंडों के अंतर प्रयोगात्मक तुलना हमेशा के लिए एक अच्छा अभ्यास है NPCs नियंत्रित करता है. पुरानी EAE के शामिल होने का सवाल है, सबसे समस्याग्रस्त हिस्सा पायस की तैयारी का प्रतिनिधित्व करती है. बताया गया है, कांच के बने पदार्थ और बर्फ हर समय उपयोग किया जाना चाहिए. पायस की तैयारी 30-45 मिनट लगते हैं, और यह पानी पर गिरा जब यह फैलाने नहीं है केवल जब इंजेक्शन के लिए तैयार माना जा सकता है. पायस पानी में dissipates, यह बात अभी तक तैयार नहीं है और आगे सम्मिश्रण की आवश्यकता है.

सेल प्रशासन के समय में चतुर्थ इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान अच्छा सटीकता महत्वपूर्ण है. सबसे पहले, यह के रूप में करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण हैएकत्रित कोशिकाओं के इंजेक्शन के रूप में चिमनी के पास सेल निलंबन, इंजेक्शन माउस की नसों में बाधा डालती है और इसके तत्काल मौत का कारण हो सकता है. नस में सुई की सही स्थिति को विश्वास दिलाता हूं, यह रक्त की सिरिंज कुछ microliters साथ महाप्राण के लिए अच्छा अभ्यास है. सही स्थान पाया जाता है जब तक सिरिंज में आने से कोई खून के मामले में, ऑपरेटर धीरे से पिछड़े या आगे सुई बढ़ना चाहिए. केवल इस बिंदु पर सेल निलंबन धीरे धीरे इंजेक्शन जा सकता है. महत्वपूर्ण बात है, ऑपरेटर आम तौर पर तरल आसानी नस में बहना चाहिए क्योंकि सिरिंज पर कोई दबाव लागू करने के लिए आवश्यक नहीं होना चाहिए. एक अनुचित इंजेक्शन अनिवार्य रूप से इंजेक्शन साइट को इसी एक चमड़े के नीचे सूजन में परिणाम होगा.

यह बहुत निकट भविष्य में प्रणालीबद्ध NPCs2, 27, आनुवंशिक रूप से संशोधित या नहीं, खुद को एक चिकित्सकीय विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं, साथ ही प्रतिरक्षा एम पहुंचाने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण उपलब्ध कराने सकता है कि इंजेक्शन ध्यान देने योग्य हैसीधे सीएनएस 28 में odulatory और / या neuroprotective दवाओं और समर्थक remyelinating एजेंटों. इसलिए, NPCs की प्रणालीगत प्रसव से संबंधित कुछ सीमाएँ, दोनों चतुर्थ मौजूद नहीं है. और आईसीवी. मार्गों अंततः कोशिकाओं का केन्द्र इंजेक्शन उपचार के सोने के मानक प्रोटोकॉल का गठन नहीं हो सकता है, जहां उन रोगों में मान्य वैकल्पिक चिकित्सकीय दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व कर सकते.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों समीक्षकों पांडुलिपि की समीक्षा करने और सबूत के संपादन के लिए Jayden स्मिथ धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी (NMSs, आंशिक अनुदान आरजी-4001-A1) से समर्थन प्राप्त हुआ है, इतालवी मल्टीपल स्केलेरोसिस एसोसिएशन (AISM, 2010/R/31 दे सकते), इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय (GR08-7), जीवन, बैंका Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) ईआरसी-2010-STG अनुदान समझौते के तहत कोई 260,511-SEM_SEM और यूरोपीय समुदाय (ईसी) 7 फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) के लिए पंख अनुदान करार n * डिग्री के नीचे; 280772 - Ione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
EBSS Sigma E2888
L-Cystein Sigma Aldrich C7352
Papain Worthington 30H11965
EDTA Fisher Scientific D/0700/50
Mouse NeuroCult basal medium Stem Cell Technologies 05700
NeuroCult proliferation supplements Stem Cell Technologies 05701
Heparin Sigma H3393
Basic fibroblast growth factor Peprotech 100-18B-1000
Epidermal growth factor Peprotech AF-100-15-1000
Pen/Strep Invitrogen 1514012
Matrigel (coating solution) BD Biosciences 354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) Stem Cell Technologies 05704
Accumax eBioscience 00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg PAA Laboratories H15-011
Myco trace PAA Laboratories Q052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Immunofluorescence
Normal goat serum PAA Laboratories B11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether Sigma Aldrich T8787
Mouse anti Nestin Abcam ab11306
Rabbit anti GFAP DAKO 203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10)  Abcam ab14955
Rabbit anti MAP-2 Abcam ab32454
Rat anti MBP AbD SEROTEC MCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 Millipore MAB345
DAPI Invitrogen D1306
Mounting solution DAKO S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incomplete Sigma Aldrich F5506
Mycobacterium tuberculosis DIFCO H37Ra
MOG(35–55)  Espikem
Pertussis toxin List Biological Laboratories 181
Tissue processing
Iris scissor straight Fine Sciences Tools 14060-09
Blunt/bended forceps Fine Sciences Tools 11080-02
Brain slicer Zivic Instruments BSMAS005-1
Surgical blades Swann-Morton 324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar) Boehringer Ingelheim 01LC0030
Xylazine (Rompun) Bayer 32371
Stereotaxic frame KOPF Model 900
Hamilton syringe Hamilton 7762-04
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 158127
VECTASTAIN Elite ABC Kit Vector Laboratories PK-6100

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 86 दैहिक तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं neurodegenerative विकारों पुनर्योजी चिकित्सा एकाधिक काठिन्य प्रयोगात्मक autoimmune इंसेफैलोमाईलिटिस प्रणालीगत प्रसव नसों intracerebroventricular
क्रोनिक EAE के साथ चूहों में तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के प्रणालीगत इंजेक्शन
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Donegà, M., Giusto, E., Cossetti, C., Schaeffer, J., Pluchino, S. Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE. J. Vis. Exp. (86), e51154, doi:10.3791/51154 (2014).

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