Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Системная Инъекция стволовых нервных / клеток-предшественников у мышей с хроническим ЕАЕ

Published: April 15, 2014 doi: 10.3791/51154
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Clinical Neurosciences, John Van Geest Centre for Brain Repair, University of Cambridge, UK, 2NIHR Biomedical Research Center, University of Cambridge, UK

Summary

Трансплантация нервных стволовых клеток / клеток-предшественников (NPC) держит большие обещания в регенеративной неврологии. Системная доставка НПС превратился в эффективный, низкий инвазивными, и терапевтически очень действенным протокола для доставки стволовых клеток в головном и спинном мозге грызунов и приматов, пострадавших от экспериментального хронического воспалительного повреждения центральной нервной системы.

Abstract

Нервные клетки стволовых / предшественники (NPC) являются перспективным источником стволовых клеток для трансплантации подходов, направленных на ремонт головного мозга или восстановления в регенеративной неврологии. Эта директива возникла из обширного доказательства того, что ремонт мозг достигается после очаговой или системного трансплантации NPC в нескольких доклинических моделях неврологических заболеваний.

Эти экспериментальные данные выявили маршрут доставки клеток в качестве одного из основных препятствий восстановительного лечения стволовых клеток при заболеваниях головного мозга, что требует срочного оценку. Интрапаренхимальные прививки стволовых клеток представляет собой логический подход к решению этих патологий, характеризующихся изолированных и доступных поражений головного мозга, таких как травмы спинного мозга и болезни Паркинсона. К сожалению, этот принцип плохо применима для состояний, характеризующихся мультифокальным, воспалительного и распространяемой (как во времени и пространстве) природы, в том числе рассеянного склероза (РС). Как ориентации, такие, мозг по систэмический доставка NPC стала низкой инвазивные и терапевтически эффективный протокол для доставки клеток в головном и спинном мозге грызунов и приматов, пострадавших от экспериментального хронического воспалительного повреждения центральной нервной системы (ЦНС).

Этот альтернативный способ доставки клеток зависит от избирательное действие лекарственных средств на пораженные `органы NPC, в частности их врожденную способность к (I) ощутить среды через функциональных молекул клеточной адгезии и воспалительных цитокинов и рецепторов хемокинов; (II) пересечь протекающие анатомические барьеры после внутривенного (IV). Или интрацеребровентрикулярное (ICV) инъекции; (III) накапливать на уровне множественной периваскулярной сайт (ы) воспалительного головного и спинного мозга повреждение; и (IV) оказывают замечательную ткани трофические и иммунные регуляторные эффекты на различных хост клеток-мишеней в естественных условиях.

Здесь мы опишем методы, которые мы разработали для IV. и <EM> ICV поставка сингенным НПС у мышей с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелит (ЕАЕ), а модели хронического ЦНС воспалительной демиелинизации и предусматривают системную доставку стволовых клеток в качестве ценного методики для избирательного выбора в воспаленном мозгу в регенеративной неврологии.

Introduction

Убедительные доказательства возникла из в естественных условиях исследования, свидетельствующих о терапевтической эффективности трансплантации соматических нервных стволовых клеток / предшественников (NPC) в животных моделях ЦНС расстройств 1-8. Тем не менее, ряд вопросов, связанных с доставкой стволовых клеток в организм хозяина требуют тщательного рассмотрения, прежде чем эти экспериментальные результаты могут быть переведены в клинической практике. Особенно существенным препятствием на пути развития (nonhematopoietic) восстановительного лечения стволовыми клетками для мультифокальными, хронических воспалительных заболеваний головного мозга является выявление идеального маршрута впрыска NPC. Фирма понимание патофизиологии целевой болезни (фокусное или мультифокальной; первичный воспалительный или первичный дегенеративный), и осторожной анализа технико-экономических и риска проблем, связанных с методами доставки в определении оптимального протокола для доставки стволовых клеток.

В то время как фокусное ( (например, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона, головного и спинного мозга травматические повреждения, и инсульт), тот же самый подход может оказаться быть практически не представляется возможным в условиях, таких как MS, где мультифокальный, хронический, и пространственно распространены поражение ЦНС накапливается с течением времени. В этом последнем случае, ориентации координационные инъекции клеток в отдельных поражений также препятствует ограниченных возможностей пересаженных НПС мигрировать на большие расстояния в пределах паренхимы ЦНС, тем самым побуждая идентификацию альтернативных, более подходящих способов ЦНС ориентации с менее инвазивных трансплантации NPC .

Большие перспективы появились из наблюдений, что НПС нацелены внутричерепной опухоли (например,. Глиомы) у мышей при введении внутривенно вне CNS9. После этого семеннойв естественных условиях доказательства стволовых клеток pathotrophism 10, обширные данные были накоплены, относящиеся к целесообразности и терапевтической эффективностью системного трансплантации НПС на лабораторных животных с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелит (ЕАЕ), в качестве модели воспалительного повреждения ЦНС, либо через внутривенное (IV) или интрацеребровентрикулярное (ICV). NPC впрыска 1,2,5,6,8 .. Мы сначала показали, что это зависит от возможностей пересаженных НПС, чтобы цели и введите воспаленную ЦНС, и впоследствии участвовать несколько межклеточный Коммуникационные программы в конкретных микросреды в естественных условиях 11. Для того, чтобы особый акцент сделан на ЦНС, NPC доставляются непосредственно в спинномозговую жидкость (ликвор) циркуляции путем инъекции ICV, или в кровоток через внутривенной инъекции. После ввода либо в кровоток или CSF, пересаженные НПС активно взаимодействуют смозг крови (BBB) ​​или крови цереброспинальной жидкости (BCSFB) барьеры и введите паренхимы ЦНС. Это взаимодействие между трансплантата NPC и BBB (или BCSFB) регулируется определенным набором молекул клеточной адгезии поверхности NPC (кулачков) и при содействии выражения высокого уровня CAM контр-лигандов на активированных эндотелиальных / Эпендимоциты 12-14. Примерами таких САМ включают рецептор для гиалуроната, CD44, и межклеточной адгезии (ICAM) -1 лиганд очень поздно антигена (VLA) -4 5,15,16 (что, в лейкоцитах, несут ответственность взаимодействия с активированным эпендимных и эндотелиальные клетки), и в гораздо меньшей степени лимфоцитов функции ассоциированный антиген (МАФ) -1 и P-селектина гликопротеина лиганда (PSGL) -1. НПС также выразить широкий спектр рецепторов хемокинов, в том числе CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 и CXCR4 (но не выражают CCR3 и CCR7), которые функционально активны, как в пробирке и в естественных 5,16. Таким образом, systemicaLLY вводили НПС использовать эти камеры, вместе с G-белком рецептор (GPCR), чтобы накопить на уровне воспаленной ЦНС. И наоборот, НПС вводят системно в здоровых мышей не входят в ЦНС через сосудистой или спинномозговой жидкости космических маршрутов 2. ЦНС воспаление, или эндотелиальный / активация эпендимных клеток после системного цитокин или lypopolisaccharide (LPS) впрыска в качестве модели химически индуцированных энцефалита, поэтому необходимо для накопления системно вводили НПС в головном и спинном мозге 2. Таким образом, успешная нападения на ЦНС с системной терапии NPC зависит от идентификации конкретного окна заболевания возможностей (Ву), в котором головного и спинного среда шнур способствует накоплению и трансэндотелиальной миграции NPC. Такие условия обычно возникают в контексте острым и подострым воспалением 17. Как только войдя в ЦНС, пересаживают недифференцированные НПСБыло показано, что для улучшения Клинико-патологическая особенности мышей, а также более крупных, приматов с EAE. Это было описано, быть зависимым от минимальной замены клеток 2 и замечательной секреции иммунных регуляторных и нейропротективных факторов паракринных пределах периваскулярной ЦНС 2,5,6,18 против не-ЦНС воспаленные участки 19,20 (например, лимфатические узлы) в ответ на сигнализации воспалительных клеток, вызванное проникновения иммунных клеток 5.

Здесь мы опишем основные методологические аспекты системного введения соматических НПС в мышиной модели хронического ЕАЕ. В частности, мы определяем протоколы, которые мы поставили, чтобы (I) вытекают, расширить и подготовиться к трансплантации соматических НПС из субвентрикулярной зоне (SVZ) взрослых мышей C57BL / 6; (II) индуцируют хронический EAE в таких мышей и (III) выполнять терапевтически эффективное системное (IV или ICV) NPC трансплантацию ямышей НТО EAE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры с участием животных проводятся в соответствии с принципами лабораторной ухода за животными, утвержденных внутренних дел Великобритании под животных (научные процедур) действовать 1986 (Закон о госзакупках номер 80/2457 к СП).

1. Вывод соматических нервных стволовых / клеток-предшественников (NPC) из субвентрикулярной зоне (SVZ) головного мозга взрослых мышей

  1. Подготовка рассечение инструментов и средств массовой информации
    Примечание: Эти два решения должны быть подготовлены 1-2 ч до вскрытия инструменты готовы и предварительно нагретой при 37 º C, по крайней мере 20-30 минут перед использованием (это помогает разбавить папаин и оптимизирует активность фермента).
    1. Автоклав одну прямую резкое ножницы, одну маленькую хирургическую ножницами и два маленьких изогнутых зубчатые щипцы.
    2. "Пищеварение" решение: Подготовка два отдельных 50 мл пробирки с:
      Решение # 1: 25 мл сбалансированный солевой раствор (EBSS) + 10 мг этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) + 10 мг L-цистеин Эрла;и
      Решение № 2: 25 мл EBSS + 50 мг папаин.
    3. Подготовьте "Завершить ростовой среды» (CGM): полное мыши базальной среды мыши распространения добавок, гепарин 0,002%, основной фактор роста фибробластов (BFGF, 10 нг / мл), эпидермальный фактор роста (EGF, 20 нг / мл) и антибиотики (ручка / Стрептококковое).
  2. Мозг рассечение
    NB: удаление височных костей может легко повредить ткани из-за их резкости. Чтобы избежать этого, надежно прикрепить кости с пинцетом и вытащить, пока весь кость была удалена.
    1. Для каждого подготовки НПС, отбраковки смещением шейных позвонков п = 5-7, 4-8 недельных мышей C57BL / 6.
    2. Очисти с 70% этанола (в воде) волос из отбракованных мышей и сократить за ушами с прямой резкой ножницами снять головку;
    3. Сделайте срединный разрез с помощью небольшой хирургической ножницами разрезать кожу над черепом. Используя щипцы, сложить два пятна на коже, чтобы выставкахе череп.
    4. С небольшой хирургической ножницами выполняют две маленькие порезы на основании черепа и удалить кости под Понс / мозга (вентральной черепа). Продолжать, потянув временные кости. С той же ножницами выполнить разрез вдоль всей черепа, начиная от основания, чтобы луковицы, не повреждая поверхность мозга. Кроме того, выполнить разрез между лобных костей и глаз, чтобы облегчить удаление из теменных костей. С двумя щипцы начать удаление череп, потянув каждый из теменных костей наружу. Хотя потянув, обратите внимание на мозговые оболочки, которые могут повредить мозг, когда кости удаляются.
    5. После того, как череп был удален, скользить щипцы между мозгом и черепом, чтобы полностью отделить мозговых оболочек оставили. Осторожно поднимите мозг от черепа. Обрежьте зрительные нервы, чтобы освободить мозг и, наконец, собирают мозг в трубку с холодным фосфатным буферным раствором (PBS).
    6. Держите трубку на льду апг повторите эту же процедуру для всех мышей.
  3. Анализы Рассечение СВЗ, нейросфера формирования и обслуживания
    Среднее число клеток х разбавление фактором х 10 4

    Где 10 4 представляет собой превращение общего объема гематоцитометр камеры (общий объем = 0,1 мм 3 -> 10-4 см 3 -> 10-4 мл). При рассмотрении коэффициент разбавления, как один сделано с CGM и с витальной окраски, должны быть приняты во внимание. Например, если 160 клетки были подсчитаны в угловых квадратах 4, конечная плотность (клеток / мл) клеточной суспензии будет:

    160/4 х 5 (разведение с CGM) х 2 (разведение с витальной окраски) х 10 4
    1. Включите рассечение капюшона, оснащенного вскрытии микроскопом.
    2. Очистите все поверхности с 70% этанола (в воде), и спрей с анти решения Mycoplasma, чтобы снизить риск заражения.
    3. Крышкадно стакан с стерильную марлю (для сохранения заточены инструменты) и залейте его 70%-ного этанола (в воде). Замочите в стакане две пары щипцов, одну пару микро ножницы и хирургического лезвия.
    4. Поместите весь мозг на мозг-среза матрицы.
    5. Использование двух лезвий выполнить корональной секционирования 2 мм от переднего полюса мозга, за исключением оптических путей, и 3 мм кзади от предыдущего разреза; и поместите ткань на чистую чашку Петри.
    6. Под микроскопом рассекает изолировать СВЗ ткани и нарезать 1 мм 3 части, используя иридэктомия ножницы. Повторите эти действия для всех мозгов.
      1. Хорошо перемешать два решения (раздел 1.1.2) выше и фильтруют через 0,22 мкм фильтр сразу же после того, как мозг иссекали и SVZs готовы быть переварены.
    7. Передача разделы в 30 мл раствора "пищеварения", осторожно ресуспендируют с a10 мл пипетки и инкубировать 30 мин при 37 ° C в 5% CO 2. Каждые 15 мин осторожно встряхните трубки 2-3х.
    8. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин.
    9. Удалить супернатант и не ресуспендируют осадок в 200 мкл с помощью пипетки ПГС первого с P1000, а затем с P200 пипетки (10-20-кратным каждый), до получения суспензии отдельных клеток.
    10. Возьмите подвеску до 5 мл с CGM и перенести в T25 см 2 колбы.
    11. Через 5-7 дней в пробирке (DIV) нейросферы сформируют. Сбор суспензии в 15 мл трубки и центрифуги 10 мин при 150 х г.
    12. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл CGM.
      не отделить нейросферы механически пассажей клеток 100-150X с P200 пипетки, до получения суспензии отдельных клеток и принять его до 1 мл с CGM.
    13. Развести клеточной суспензии, например 10 мкл клеточной суспензии в 40 мкл CGM, чтобы получить разведение 1:05, и хорошо перемешать. Смешайте 10 мкл разбавлятьэ клеточной суспензии с 10 мкл витальной окраски и хорошо перемешать.
    14. Заполните подсчета гемоцитометр камеру с 10 мкл 1:1 клеточной суспензии: жизненно решений пятно. Отдельно подсчитать количество живых (белые) и мертвых (синий) клеток в угловых квадратов 4. Для определения количества клеток / мл, нанесите следующий расчет:
    15. Ресуспендируйте 2 х 10 5 клеток в 5 мл CGM и перевода к T25 см 2 колбы;
    16. Повторите разделы 1.3.11-1.3.12 каждые 4-5 DIV. Со второй прохождения расширения года, оценить жизнеспособность клеток жизненной пятно исключения и начать строить непрерывную кривую роста при посеве НПС на клоновых плотности (8000 клеток/см2), как описано 21. Держите числа клеток и повторите процедуру каждые 4-5 DIV. Чтобы создать непрерывную кривую роста, выполните следующие действия:
      Примечание: Для того, чтобы иметь хорошую подготовку клеток, после 4-5 DIV сферы должны достигли диаметр 150-200 мкм. Чтобы иметь хорошую оценку тон клеток плотность, важно найти оптимальный коэффициент разбавления, чтобы иметь хорошо распределены, непересекающиеся клеток по всему гематоцитометр. В идеале, должна быть в пределах 50-200 общего числа клеток. При подсчете, только клетки, состоящие на площади, не касаясь границ должны быть рассмотрены. Кроме того, жизнеспособность клеток является решающим фактором, чтобы иметь здоровую подготовку. Важно отметить, что она должна быть больше 90%. Линейная кривая роста является еще одним показателем здорового клеточного препарата.
      1. Подсчитайте количество живых и мертвых клеток (например, 1,3 х 10 6).
      2. Определить скорость роста деления количества живых клеток по количеству высеянных клеток (например, 1,3 х 10 6/2 х 10 5 = 6,5).
      3. Рассчитать общее количество клеток путем умножения скорости роста для общего числа клеток, присутствующих в предыдущей момент времени (в начале = 2 х 10 5).
      4. Пожаловаться на среднее7; стандартное отклонение построить линейного тренда.
    17. С течением 6, механической диссоциации заменяется ферментативной диссоциации. После центрифугирования при 150 мкг в течение 10 мин, удалить супернатант, ресуспендируют осадок в 200 мкл клеток совокупного решения диссоциации, ресуспендируйте 7-8x с P200 и инкубировать 10 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
    18. Ресуспендируют 7-8x с P200, чтобы получить суспензии отдельных клеток и добавить 800 мкл ПГС. Граф клеток (как живых и мертвых) и установить их жизнеспособность. Ресуспендируйте 2 х 10 5 клеток в 5 мл CGM и перевода к T25 см 2 колбы.
  4. Вирусный трансдукция НПС для отслеживания клеток в естественных условиях
    Примечание: Чтобы проверить эффективность вирусной трансдукции, построить параллельную кривой роста с трансдуцированные и nontransduced NPC. Кроме того, клональной эффективность, то есть абсолютное количество клеток, образующих нейросфер присутствуют в клеточной подготовТион или анализ клеточного цикла по содержанию ДНК (с пропидийиодидом, PI), могут быть использованы в качестве дополнительных признаков состояния клеток. Если процент инфицированных клеток не должно быть хорошо, протокол вирусной трансдукции можно повторить во второй раз с тем же популяции клеток. Как только уровень инфекции является удовлетворительным и кривая роста аналогична полученной с клетками дикого типа, трансдуцированных НПС может быть расширена и / или пересажены.
    1. Урожай нейросферы и получить суспензии отдельных клеток. Пластина клеток при высокой плотности (1,5 х 10 6 клеток в T75 см 2 колбы) в 10 мл CGM.
    2. После 12 ч добавить 3 х 10 6 ТУ / мл третьего поколения лентивирусный вектора pRRLsin. ППТ-HCMV инженерии с Е. палочка, полученных β-галактозидазы (LacZ), либо с зеленым флуоресцентным белком (GFP).
    3. 48 час спустя, сбора клеток центрифуги при 300 мкг в течение 10 мин и replate клетки в соотношении 1:1.
    4. После3 места в пробирке проверки эффективности инфекции. Проточная цитометрия обычно используется для проверки эффективности инфекции, а также удовлетворительный уровень инфекции является общепринятым быть в диапазоне 75-95% положительных клеток. Проверьте еще раз, эффективность инфекции после еще 3 проходов расширения для проверки поддержание экспрессии маркеров.
  5. Нейросфера замерзания
    1. Урожай нейросферы от T25 см 2 колбу, центрифуге при 300 х г в течение 10 мин, и отбросить супернатант.
    2. Ресуспендируют гранул с 1 мл среды замораживания (ПГС с 10% диметилсульфоксида (ДМСО).
    3. Поместите криопробирки при -80 ° С в течение замораживания контейнера.
    4. После по меньшей мере 24 ч перемещения клеток в cryobox и хранить при -80 ° С в течение нескольких месяцев, или довести до жидкого азота (N 2) для более длительного хранения.
  6. Нейросфера оттаивания
    Примечание: Чтобы избежать токсические эффекты длительном контакте Oе НПС с ДМСО, процесс оттаивания должен быть как можно быстрее.
    1. Снимите криопробирку от -80 ° C / N 2 и держать его на сухом льду.
    2. Быстро разморозить флакон на водяной бане, пока почти все суспензию клеток не размораживают и только небольшой кусок ледяной суспензии остается.
    3. Ресуспендируют клеточной суспензии с 5 мл свежей предварительно нагретой ПГС.
    4. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин.
    5. Удалить супернатант, ресуспендируют осторожно 5 мл свежего CGM и пластины клеточной суспензии в чистой, необработанной T25 см 2 колбы.
  7. 1.7) NPC характеристика
    NB: последней промывки PBS может быть заменен на 0,05% азида натрия-PBS, чтобы предотвратить рост грибков или загрязнений, и coverslides которые хранили при 4 ° С в течение 2-3 недель.

    Примечание: Для того, чтобы окрасить для внутриклеточных маркеров добавить permeabilizing агента ФБР в блокирующем растворе. Если источником первичного антитела является коза, бычий сывороточный Albumiн (БСА) или сыворотке кроме козы должны быть использованы.

    Примечание: Для того, чтобы окрасить для внутриклеточных маркеров использовать permeabilizing агента в растворе первичного антитела.
    1. Поместите 13 мм стекла coverslide в нижней части 24-луночный планшет. Добавить 150 мкл покрытия раствора на верхней части каждой coverslide создать небольшую каплю. Инкубировать в течение по крайней мере 30 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
    2. Урожай нейросферы и отделить, чтобы получить суспензии отдельных клеток.
    3. Всего живые клетки и разбавляют до получения 80000 cells/35 мкл. Удалить избыток раствора для покрытия от coverslide осторожным стремления, и пластины с 35 мкл клеточной суспензии.
    4. Инкубировать 25 мин при 37 ° С, 5% СО 2. Быстро проверить на контраст фазовом микроскопе если клетки начали придерживаться.
    5. Подготовьте дифференциации среду путем смешивания базальной среды мыши с соответствующими добавками (см. таблицу 1) и антибиотиков (Пен / Стрептококковое).
    6. Добавить 400 мкл дифференциации среды и инкубировать при 37 ° С, 5% СО 2.
    7. После 3 DIV, изменение половина среды со свежим дифференциации среды.
    8. После 6 DIV, удалить среды и мыть один раз PBS. Под химической капот удалить PBS и добавить 300 мкл нагретого 4% параформальдегида (PFA) 4% сахарозы. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Снимите PFA и промыть 3 раза с PBS.
    9. Чтобы продолжить иммуноцитохимии, удалить PBS и блокируют с PBS 10% нормальной козьей сывороткой (NGS) (блокирующий раствор), и инкубируют 1 час при комнатной температуре.
    10. Удалить блокирующий раствор и добавить нужную первичного антитела, разбавленного PBS 1% NGS. Инкубируют при 4 ° CO / N или, альтернативно, 120 мин при комнатной температуре.
    11. После инкубации промыть 2x с PBS. Инкубировать с соответствующим вторичным антителом, разбавленного PBS 1% NGS. Инкубировать 60 мин при комнатной температуре.
    12. Вымойте 2x с PBS и против окрашивают ядра с 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) разбавляют 1:20000 с PBS permeabilizing агента в течение 3 мин при комнатной температуре в темноте. Промыть два раза с PBS и один раз дистиллированной водой.
    13. Поместите каплю монтажной среды на стекло ткани горкой и щипцами смонтировать coverslide с клетками, стоящих монтажную среду. Аккуратно нажмите на coverslide выжать избыток монтажной среды. Оставьте coverslide в темноте при комнатной температуре, пока монтажа среда не сушат и хранят при 4 ° С.

2. Миелина олигодендроцитов гликопротеин (MOG)-индуцированной Experimental Аутоиммунность в мышей C57BL / 6

  1. Приготовление эмульсии
    1. На стеклянном стакане готовить эмульсию, состоящую из неполном адъюванте Фрейнда, содержащего 4 мг / мл микобактерий туберкулеза [противном случае определяется как полном адъюванте Фрейнда (CFA)] и 200 мкг MOG 35-55 (пептид), учитывая, что общее количество эмульсии за мышь будет 300 мкл.
      NB: ассигнованиямиTE элементы управления MOG-иммунизированных мышей в CFA являются мыши, иммунизированные только CFA. Ожидаемая дисперсия начала заболевания в МНГ-иммунизированных мышей составляет 11,3 (± 1,8) точек на дюйм.

      Примечание: При расчете общего объема эмульсии необходимо, считают в два раза больше объема, как количество мышей иммунизировать. Стеклянная посуда должна быть предпочтительно Пластик, чтобы минимизировать отходы часть эмульсии.
      1. С стеклянный шприц держит 19 G иглы смесь в течение 30 мин, всегда сохраняя эмульсии на льду.
      2. Чтобы проверить, является ли эмульсия готова, падение небольшое количество эмульсии на воде. Эмульсию готов быть введен только тогда, когда перепад остается как есть, и не расходиться.
      3. Иммунизируйте контрольную группу мышей с только CFA. Лечить подопытных мышей (МНГ прививка) с MOG в CFA. Ожидаемая дисперсия начала заболевания в МНГ иммунизированных мышей составляет 11,3 (± 1,8) точек на дюйм.
    2. Передача 19 G иглу на 1 мл пластиковую шприцй аспирации эмульсии. Избегайте пузырей, изменить иглу с 25 г и оставить шприц на льду. Шприцы, наполненные эмульсии готовы использовать ее следует хранить на льду в течение нескольких часов.
  2. Иммунизация
    1. Поместите мышей (6-8 недель старые, женщины) в потепления поле и ждать около 10 минут, чтобы позволить хвостовую вену, чтобы расширить.
    2. Трансфер одну мышь из коробки потепления к фиксатор мыши. Закройте фиксатор, чтобы избежать движение мыши.
    3. Заполните 1 мл инсулиновый шприц со 100 мкл коклюшного токсина (5 мкг / мл), избегая пузыри. Медленно введите решение в хвостовую вену. Удалите иглу и нажмите на несколько секунд с лист бумаги, чтобы включить кровотечение.
    4. Наведите мышь обратно в клетку и повторить ту же процедуру для всех мышей.
    5. Обезболить мышь с непрерывной ингаляции изофлуран (1-2%, 2 л / мин) и вводят 100 мкл эмульсии подкожно на уровнеиз двух боках и в основание хвоста (300 мкл эмульсии / мышь). Медленно удалите шприц, избегая утечку эмульсии.
    6. Отметить мышь с уха панчер, поместите мышей в клетке, а регистрация до полного выздоровления. Повторите эти действия для всех мышей.
    7. Через 48 ч (2 дня после иммунизации, точек на дюйм) повторите раздел 2.2.3.
  3. Поведенческий анализ мышей EAE
    1. Начиная с 5 руб, взвесить мышей ежедневно и контролировать их опорно-двигательного аппарата выступления с помощью масштабного систему подсчета очков, описанный в таблице 1.

3. Инъекция стволовых нервных / клеток-предшественников в хвостовую вену (IV)

  1. Подготовка Сотовый
    1. Урожай нейросферы путем центрифугирования при 300 мкг в течение 10 мин.
    2. Удалить супернатант и добавить 200 мкл клеточной совокупного раствора диссоциации. Выдержите 10 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
    3. Аккуратно ресуспендирования 10-12х (avoidinг пузырьки) с Р200 до получения суспензии отдельных клеток и принять до 800 мкл с базальной среды без Са 2 + и Mg 2 +.
    4. Граф клеток с использованием витальным красителем для анализа жизнеспособности клеток и разбавления суспензии с базальной среды без Са 2 + и Mg 2 +, чтобы получить конечную плотность 10 6 клеток/150 мкл. Хранить клеточной суспензии на льду до использования.
  2. NPC впрыска IV
    NB: Идеальный диссоциации в суспензии отдельных клеток и отсутствие воздушных пузырьков два ключевых аспектов, чтобы рассмотреть, чтобы снизить риск либо сгустки / агрегатов против формирования эмболии, которые могли бы привести к окклюзии вены и последующей смерти.
    1. На пике заболевания (16-18 точек на дюйм), вес и набрать мышей. Распределить мышей в соответствии с их счетом, чтобы иметь однородные группы.
    2. Поместите мышей в условиях потепления поле и ждать около 10 минут, чтобы позволить хвостовую вену, чтобы расширить. Трансфер одну мышь из коробки потепления к фиксатор мыши. Закройте фиксатор, чтобы избежать движение мыши.
    3. Заполните 1 мл инсулиновый шприц с 150 мкл клеточной суспензии и не забудьте удалить все пузырьки. Медленно вводить раствор в хвостовую вену. Удалите иглу и нажмите на несколько секунд с лист бумаги, чтобы подключить кровотечения (6А и 6B).
    4. Наведите мышь в клетке, а регистрация до выздоровления. Повторите ту же процедуру для всех мышей.

4. Инъекция стволовых нервных / клеток-предшественников в цистерна (ICV)

  1. Подготовка Сотовый
    1. Урожай НПС путем центрифугирования при 300 мкг в течение 10 мин.
    2. Удалить супернатант и добавить 200 мкл клеточной совокупного раствора диссоциации. Выдержите 10 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
    3. Аккуратно ресуспендирования 10-12x с Р200 до получения одного грлокоть подвеска и принять до 800 мкл с базальной среды без Са 2 + и Mg 2 +.
    4. Граф клеток и разбавления суспензии с базальной среды без Са 2 + и Mg 2 + для получения желаемой плотности клеток. Хранить клеточной суспензии на льду до использования.
  2. 4.2) впрыска NPC ICV
    1. На пике заболевания (16-18 точек на дюйм), вес и набрать мышей. Распределить мышей в соответствии с их счетом, чтобы иметь однородные группы.
    2. Наведите мышь на стереотаксической аппарата при непрерывном изофлурана ингаляции (1-2%, 2 л / мин). Закрепите голову мыши с уха баров. Тогда регулировать как рот и нос штук. Убедитесь, что глава мыши является плоской и закреплена.
    3. Тампон голову мыши с повидон-йода (ПВП-я) и сделать надрез, чтобы сократить кожу в задней части головки выставить череп.
    4. Использование микроманипулятора, вставьте кончик мклИТЭР шприц в щель между затылком и атлас позвонка через неповрежденную мышц и связок в средней линии на задней части шеи. Изогнутая часть иглы удерживается в плотном контакте с внутренней поверхностью затылка по всей длине, как описано 22.
    5. Медленно вставьте иглу и подождите несколько секунд. Оператор подразумевается научиться распознавать чувство игла быть "на крючок" к черепу мыши, предварительного начать инъекционных подготовку клеток. Медленно введите объем клеток (в пределах 3-5 мин). Оставьте иглу на месте для дополнительных нескольких секунд после инъекции и снимите медленно шприц.
    6. Стежка до кожи и не разместить мышь в клетке восстановления до полного выздоровления.

5. Тканей Обработка

  1. Глубоко анестезировать мышей смесью 0,5 мл кетамина (100 мг / мл), 0,25 мл ксилазина (23,32 мг / мл) и 4,25 мл стерильной воды и transcardically заливать, шозоления с физиологическим-EDTA и фиксации с 4% PFA. Снимите обе позвонков столбцы и мозги и постфикс в 4% PFA в течение 12 часов при 4 ° С. Промойте ткань в PBS, удалите спинной мозг из костей и оставить ткани, по крайней мере 48 часов в 30% сахарозы (в ФБР) при 4 ° С Вставить ткани в оптимальной температуры режущей (OCT) соединения и оснастки заморозить жидким азотом, как описано 2.
  2. Используйте микротома сократить тканей в 10-12 толстыми ломтиками мкм.
  3. С другой стороны, вставлять свежий ткани в агарозы и сократить ткани, используя толстые ломтики Vibratome 50-80 мкм.
  4. В обоих случаях, инкубировать O / N при 37 ° С в 5-бром-4-хлор-3-индолил-β D-галактопиранозид (X-Gal) раствор для обнаружения β-галактозидазы ядерного.
  5. Пересекаемых секций, содержащих β-гал + клеток в 5 мкм ломтиками и двойной пятна с помощью antiglial фибриллярный кислый белок (GFAP) для астроцитов (50 мкг / мл), antineuronal ядерного антигена (NeuN) для нейронов (1 &# 956; г / мл) и antiNestin для недифференцированных нервных клеток (10 мкг / мл).
  6. Действуйте, как описано в разделах 1.7.11 и 1.7.12. Для нескольких окрашивания обязательно используйте вторичные антитела, конъюгированные с разными флуорофорами.
  7. Для тканях, содержащих GFP помечены клетки продолжить, как описано в шагах 5.1-5.3 и заполните многочисленных окрашивания.
  8. Добавить несколько капель монтажной среды к слайдам и накройте ткани покровное.
  9. Для срезах, окрашенных биотин сопряженные антитела приготовить раствор авидин биотин комплекса (раствор ABC, см. таблицу 2) и оставить в агитации в течение 45 мин.
  10. Инкубируйте ломтиками 5 мин с 1% H 2 O 2, чтобы блокировать активность эндогенной пероксидазы.
  11. Промыть два раза с PBS.
  12. Инкубировать с ABC раствор в течение 1 часа при комнатной температуре.
  13. Промыть два раза с PBS.
  14. Выдержите раствором 3,3 '-диаминобензидина и 0,3% H 2 O 2. Мониторинг реакции ипдер микроскопа и промывают PBS, как только кусок начинают получать коричневый (обычно около 5-10 мин).
  15. Мыть два раза с PBS и действуйте, как описано в шаге 5.7.

Полный список всех материалов и реагентов приведены в таблице 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NPC вывод и характеристика
SVZ вскрытия выполняются на пулах (п = 5-7 мыши / бассейн) из 6-8 недельных мышей C57BL / 6 с помощью механического и ферментативной диссоциации (рис. 1А). Через несколько дней культивирования в CGM, свободно плавающие нейросферы начать формирование (1А и 1В). Первичные сферы собраны и механически пассировать каждые 4-5 DIV. После пассирования, количество живых и мертвых клеток установлено и совокупные количества клеток нанесены для генерации кривой роста (рис. 1с). Это дает представление о скорости распространения, обеспечивая тем самым косвенно параметр для оценки глобальной стабильности препарата NPC. Когда пролиферирующих как нейросферы, NPC выразить маркеры митотической активности (фосфо-гистона H3, PHH3; 5 мкг / мл) и недифференцированных нервных клеток (например Нестин) (рис. 2А). Недифференцированные НПС, которые должны быть терапевтически еfficacious в EAE после трансплантации должна выражать клеточной поверхности молекул адгезии, которые включают CD44 (5 мкг / мл), α4 субъединицы VLA-4 (10 мкг / мл) (рис. 2F). Когда покрытием при соответствующих условиях дифференцировки, NPC выражать маркеры, характерные для трех линий нервных, (фиг. 2B), таких как астроглиального маркера GFAP (рис. 2в) нейронный маркер ассоциированный с микротрубочками белок-2 (МАР-2; 5 мкг / мл ) (рис. 2D) и олигодендроглиальных маркеры O4 (5 мкг / мл) и основного белка миелина (МВР; 10 мкг / мл) (рис. 2Е), что подтверждает, что НПС мультипотентны к трем основным нейронных линий. Для облегчения идентификации трансплантированных клеток в живом организме, НПС трансдуцируют с лентивирусы инженерных стабильно экспресс гены-репортеры, такие как GFP. Трансдуцированные НПС выразить GFP и как пролиферирующих нейросферы (рис. 3А и 3C), а также при дифференцировании в пробирке после снятия фактора роста (рис. 3б). Чтобы проверить эффективность трансдукции, выражение GFP анализировали с помощью проточной цитометрии, начиная уже в проходах 3 после трансдукции клеток (то есть позволяет достаточно времени, чтобы иметь надежную экспрессию введенного трансгена на уровне белка). При применении лентивирусов третьего поколения для НПС в пробирке, мы последовательно наблюдать> 90% клеток, показывающих высокие уровни GFP в течение нескольких независимых экспериментов (фиг. 3C), ни с открытой токсичности, ни изменений пролиферации, при сравнении кривых роста дикого типа и Lenti-GFP трансдуцированные НПС (рис. 3D).

Хронический индукции ЕАЕ
EAE является одним из наиболее охарактеризованных моделей MS, поскольку он повторяет большинство патологических и клинических событий МС. Иммунизация мышей C57BL / 6 с MOG35-55 приводит к РАЗВИТИЕт хроническую форму EAE. При приближении начала болезни (11,3 ± 1,8 точек на дюйм) в течение фазы индукции (доклинических), МНГ, иммунизированных мышей начать худеть (Рисунок 4A). В начале фазы эффектор / вторжения (пик клинической; 16,8 ± 3,2 точек на дюйм) мышей EAE достичь пика заболевания (оценка 3,5 ± 0,7), а вскоре после пика они показывают прогрессивное и частичное восстановление, что, наконец, стабилизирует течение хронических фаза (стабильная клиническая) от около 30 руб года (оценка 2,8 ± 0,9) (рис. 4В). Многочисленные исследования, в том числе некоторые исследования EAE любой из прижизненной микроскопии 23 или магнитно-резонансной томографии 24 в паре с в естественных тканей патологии, определили в пике фазы эффектор / вторжения (16-22 точек на дюйм) идеальное окно возможностей (Ву) , в котором для выполнения системных экспериментальные методы лечения с помощью стволовых клеток, предназначенных для ввода хронически воспаленные EAE ЦНС и защитить его от вторичного гAmage.

Впрыска NPC
Сингенные НПС вводят системно у мышей EAE (рис. 6) находятся почти исключительно в периваскулярных областях повреждения ЦНС, как в мозге (рис. 5А) и спинного мозга (Цифры 5B-D), до 45 дней после трансплантации (ДПТ), как описано 5. IV. впрыском НПС преимущественно сохраняют незрелой, Нестин + (рис. 5C) фенотип, в то время как несколько НПС перемещается из периваскулярной области выразить Neun (рис. 5D). Следует отметить, что НПС вводили внутривенно в здоровых не войти ЦНС через сосудистую маршрута (Рисунок 5E). После внутривенного NPC инъекции, значительное число введенных НПС находятся на уровне не-CNS органов, таких как печень, кишечник, селезенка, легкие и почки, но не сердце, а уже в 10 диоптрий (рис. 5F). Номера для ЦНС, аккумулирующие НПС полностью очищены от Фес е периферические органы на 30 диоптрий (рис. 5G).

Рисунок 1
Рисунок 1. Выделение НПС от СВЗ взрослых мышей и генерация стабильно расширяющихся линий NPC., Схематическое изображение основных критических шагов поколения стабильно расширения, и подготовка для инъекций НПС мыши. B, Нейросферы в пробирке. C , НПС культивировали как нейросферы пассируют каждые 4-5 дней. Номера живых и мертвых клеток собирают и совокупные количества клеток нанесены для генерации кривой роста. Бар масштаб в B составляет 200 мкм. Данные в C представляют собой среднее общее число клеток ± SD (n = 3).

Gure 2 "FO: контент-ширины =" 5 дюймов "FO: Пребывание" / files/ftp_upload/51154/51154fig2highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51154/51154fig2.jpg "/>
Рисунок 2. НПС характеристика., Пролиферирующие нейросферы мыши выразить PHH3 основной гистонов белка (зеленый), а также тип VI промежуточное нити белка Нестин (красный). BE, После 6 DIV в условиях дифференцировки, NPC мультипотентны к астроглиальных (GFAP, красный в C), нейронов (MAP-2, зеленый в D) и олигодендроглиальных (O4, зеленые в Е, и ПМБ, красные в Е) линий. Количественная оценка GFAP-МАП-2-и О4-экспрессирующие клетки в 6 DIV после NPC дифференциация в пробирке показаны в B. Данные в B являются как среднее ± SD% (N = 3). Шкала бар в CE являются 50 мкм. F, проточной цитометрии экспрессии основных клеточных поверхностных молекул адгезии, регулирующих leukocyТе экстравазация в нейросферы мыши. Рисунок 2F воспроизводится от Pluchino др.. 2

Рисунок 3
Рисунок 3. Трансдукция НПС с лентивирусы экспрессии генов репортер (например GFP. А и В, Фаза контрастные изображения нейросферы (A) и дифференцируя НПС (B), которые были трансдуцированных с 3-го поколения Lenti-GFP вектора. Проточной цитометрии из НПС в А. С, дикого типа (не трансдуцированных) и Ленти-GFP трансдуцированных НПС культивировали, как нейросферы пассируют каждые 4-5 дней. Номера живых и мертвых клеток собирают и совокупные количества клеток нанесены для генерации кривой роста. Бар масштаб вА и В составляет 200 мкм. Данные в C представляют собой среднее общее число клеток ± SD (n = 3).

Рисунок 4
Рисунок 4. Функциональная характеристика хронической EAE. A, ежедневно вес мониторинга в MOG-и CFA-иммунизированных мышей C57BL / 6 по общей следить за 40 руб. B, ежедневная ЕАЕ мониторинг счет в MOG-и CFA-иммунизированных мышей C57BL / 6 по общей следить за 40 руб . Данные представлены в виде средних чисел ± стандартное отклонение (п = 10 мышей / группа).

Рисунок 5
Рисунок 5. Системно вводят NPCs Migrели в паренхиме мышей EAE. А.Е., X-гал окрашивание Vibratome огранки (70 мкм) головного мозга (А) и спинного мозга (В) тканей разделы мышей EAE вводили внутривенно с сингенными НПС, показывая пересаженных β-гал + клеток ( голубые клетки) сохраняющиеся в периваскулярных областях ЦНС до конца клиническое наблюдение (106 точек на дюйм). C, β-гал + IV. впрыском НПС (синие) сохраняющиеся в периваскулярных областях ЦНС, сохранить нестин + (коричневый) фенотип. D , Мало мигрирующие НПС выразить NeuN + (коричневый) до тех пор, как они двигаются из периваскулярной области. Е, Х-гал окрашивание в представительном спинного разделе шнура от мнимого обращению EAE мыши. . Шкала бары, 20 мкм FG, Анализ, кроме ЦНС тканей показывает, что микросхемы -. Или внутривенно. Впрыском НПС (синие клетки) достичь практически все органы (. Например легких, печени, селезенки, сердца, кишечника, почек) остроумиегин 10 диоптрий (F), но будут очищены от тех же органов на 30 диоптрий (G). 5А-Е воспроизведено из работы 5, в то время как показатели 5F-G воспроизводится из Pluchino соавт. 2

Рисунок 6
. Рисунок 6 Схематическое изображение протокола для системной инъекции НПС у мышей с ЕАЕ Основные важных шагов в области системной инъекции НПС в мышей с EAE:. От подготовка инъекций CAM выражая одну ячейку в отрыве НПС комната культуры клеток (А) , к инъекции в хвостовую вену мышей EAE на пике фазы эффектор / вторжение болезни (B), к обнаружению в естественных инжектированных НПС, которые целевогоЦНС (С), к ткани патологических исследований в естественных условиях, позволяющих изучение механизмов терапевтического пластичности вводили НПС (D). В D, зеленые клетки в это олигодендроциты, темно-синие клетки аксоны, светло-голубой клетки пересаживают НПС, оранжевые клетки астроциты, и красные клетки эндотелиальные клетки.

<TD> 2.5
Счет Опорно-двигательного аппарата Ответы
0 Нормальная мышь. Нет явных признаков болезни
1 Limp хвост: полное вялость хвоста, и отсутствие скручивания на кончике хвоста, когда мышь взял
1.5 Hind слабость конечностей: мышь показывает случайные и краткие отключений при ходьбе на переваливаясь походка
2 Limp хвост и задних конечностей слабость: когда его кладут на спину, мышь не может повернуть в нормальное положение
Частичное паралич задних конечностей: мышь больше не может использовать задние конечности для поддержания крупу позу или ходить, но все еще может двигаться один или оба задних конечностей, в некоторой степени, передние конечности остаются в силе
3 Полный паралич задних конечностей: полная потеря движения в задних конечностей. Мышь тащит себя только на его передних конечностей, которые остаются в силе. Мыши на этом этапе даются еду на пол клетки, длинные Sipper труб, а также ежедневной подкожной инъекции увлажняющих растворов для предотвращения обезвоживания. Если мышей развивается язвы или повреждения кожи, которые не восстановить с лечением, они будут убиты гуманно
3.5 Передних конечностей слабость: когда место на вертикальной сетке, а мышь не находится в состоянии подняться и медленно падает
4 Умирающий государство
5 Мышь найден мертвым или взятые в соответствии с гуманными конечных точек

ТаBLE 1. Пять этап масштаб клинических признаков и восходящего паралича у мышей EAE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Терапии соматических стволовых клеток, основанные становятся одним из наиболее перспективных стратегий для лечения хронических воспалительных заболеваний ЦНС, таких как MS2 11. Хотя механизмы поддерживающие их терапевтический эффект все еще должны быть полностью выяснены, значительное влияние трансплантации NPC в различных экспериментальных моделях нейродегенеративных заболеваний привело к несколько провокационной убеждение, что стволовые клетки могут вскоре стать в исследованиях на людях. Тем не менее, прежде чем предусматривать любые потенциальные человека применения таких инновационных методов лечения, которые мы должны столкнуться с некоторыми ключевые вопросы и решения некоторых без ответов вопросы, такие как выявление идеального источника стволовых клеток для трансплантации (аутологичных против аллогенной плюрипотентные против мультипотентных) и лучший маршрут администрации.

Нейродегенеративные заболевания различаются по своим pathophysiologies, причем некоторые из них пространственно ограничены (например,. Спинного мозга вЖюри, инсульт), а другие из которых характеризуется пространственной временной распространения (например MS). Оно происходит, что фокусное инъекция (стволовых) клеток может быть подходящим средством для лечения бывший, хотя это может быть недостаточным или просто невозможным для последнего, где присутствие нескольких сайтах повреждения мозга представляет собой дополнительную проблему, которая будет преодолена.

В соответствии данные показали, что внутривенное доставки может представлять допустимый (и низкую инвазивными) протокол для управления клеток, поддерживаемых внутренней способности стволовых клеток к чувству окружающей среды и, в частности дом в направлении сайт (ы) повреждения. Тем не менее, перевод системных NPC терапии в клиниках по-прежнему препятствуют несколько ограничений, таких как возможного накопления трансплантированных клеток в периферических органах, не ЦНС (например, легких, селезенки, лимфатических узлов и почек), которые могут или не могут быть сайты местных воспалительных реакций в естественных условиях. Хотя это неспецифическая асситавляет инжектированных НПС из целевой ЦНС быстро очищается у мышей с хроническим EAE2, есть свидетельства долгосрочного NPC настойчивости (или в некоторых случаях исключительной таргетинга) на уровне вторичных лимфоидных органах (например. лимфатических узлов и селезенки) после системной инъекции в мышей с рецидивирующим EAE5 19,20. Тот факт, что значительное число пересаженных НПС рециркуляции к не-CNS органов создает эффект разбавления, неизбежно сокращение абсолютного числа НПС в ЦНС. Интересно, что системно вводили НПС являются терапевтически эффективными (например, через иммунных регулирующих действий) даже тогда, когда накапливается исключительно из ЦНС 19,20. И общие терапевтические эффекты вводили НПС, направленные на ЦНС только 5 или лимфатические узлы только 19 сопоставимы. Это может отчасти из-за внутренней пластичности клеток, которые по-разному реагируют молекулярных компонентов surroundinг микросреда. Примечательно, что, если, с одной стороны пересаженные НПС может чувствовать присутствие воспалительных цитокинов и оказывают свое терапевтическое действие через иммунных механизмов модуляторных 16, с другой стороны, они могут вступать в контакт с враждебными микросреды, в конечном счете, приводящих к образованию опухолей 25,26. По этим причинам, предпочтительный вариант в настоящее время сосредоточиться инъекционные НПС в ЦНС. Таким образом, интратекальное (через поясничного или полостной маршрута) по-прежнему наиболее принимаются потенциальный путь введения в клинических испытаниях. Тем не менее, мультифокальность и патологическая неоднородность MS поражений может ограничить эффективность такого подхода.

Здесь мы опишем эффективный протокол для изоляции, поддерживать и охарактеризовать мыши нервные клетки-предшественники от взрослого СВЗ и последовательно, как системно (как IV и ICV) придать РНУ мышей, страдающих хроническими EAE, одном из самых стуумер модели MS. Несмотря на то, относительно прост и понятен, эти протоколы представить некоторые важные шаги, которые должны быть приняты во внимание. Сначала, он является обязательным для получения стабильно расширяемой и здоровый клеточный препарат. Как описано во всем протокола, стабильность клеток может быть косвенно сделать вывод, смотря на их скорости роста. В идеале, должна достигать нейросферы диаметр 150-200 мкм каждые 4-5 DIV и процент гибели клеток на проходов должна быть очень низкой (менее 10%). Кроме того, нейросферы должны представить компактный и обычный круглую форму в микроскоп. Инфекция с лентивирусы может влиять на выживание и стабильности клеток. Для получения оптимального инфекции, необходимо в обязательном порядке получить титрования вируса интереса, достаточного для получения 3 х 10 6 ТУ / мл. В самом деле, в то время как, с одной стороны низкое количество вируса приведет к небольшой процент инфицированных клеток, с другой стороны, использование большого количества Woulд вероятно, приведет к эффекту токсичности (сильно зависит от гена, которые будут инфицированы). НПС могут быть заражены несколько раз с интегрирующих вирусов, следует исход первого трансдукции приводят к низким процентом трансгенных положительных жизнеспособных клеток. Это всегда хорошая практика, чтобы иметь внутрирегиональной экспериментальную сравнение устойчивость и жизнеспособность параметров с дикого типа, nontransduced, контролирует NPC. Что касается индукции хронического ЕАЕ, наиболее проблематичным часть представлена ​​подготовки эмульсии. Как описано, изделия из стекла и льда должна быть использование в любое время. Приготовление эмульсии занимает 30-45 минут, и его можно рассматривать готов быть введен только тогда, когда он не рассеивать при падении на воде. Если эмульсия рассеивает в воде, это означает, что еще не готов и требует дальнейшего смешивание.

Высокая точность во время процедуры внутривенной инъекции во время введения клеток является критической. Во-первых, это чрезвычайно важно иметь какИнгл суспензию клеток, как инъекции агрегированных клеток может помешать вены введенного мыши и привести к его немедленной смерти. Для обеспечения правильного положения иглы в вену, это хорошая практика для аспирации с шприцев несколько мкл крови. В случае отсутствия крови, поступающей в шприце, оператор должен медленно двигаться иглу вперед или назад, пока правильное расположение не найдено. Только в этот момент может клеточную суспензию медленно вводили. Важно отметить, что оператор должен, как правило, не требуется применять никакого давления на шприц, так как жидкость должна легко поступать в вены. Ненадлежащее инъекции неизбежно приведет к подкожной набухания, соответствующей в месте инъекции.

Стоит отметить, что в самом ближайшем будущем системно вводили NPCs2, 27, генетически модифицированные или нет, сами по себе могут представлять собой терапевтический вариант, а также обеспечивая важный инструмент для доставки иммунную мodulatory и / или нейропротективные наркотики и про remyelinating агенты непосредственно в ЦНС 28. Таким образом, в то время как некоторые ограничения, связанные с системной доставки НПС существуют, как IV. и ICV. маршруты в конечном итоге может представлять действительный альтернативный терапевтический подход в тех заболеваний, при которых фокусное инъекция клеток может не составляют золотой стандартный протокол лечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарят Джейден Смит для критически рассмотрения и редактирования доказательство рукопись. Эта работа получила поддержку от Национального общества рассеянного склероза (НМС, частичных грантов RG-4001-A1), итальянский Рассеянный склероз Ассоциация (AISM, грант 2010/R/31), итальянский Министерство здравоохранения (GR08-7), Крылья для жизни, Banca Agricola Popolare ди Рагуза (BAPR), Европейского исследовательского совета (ERC) в соответствии с соглашением ERC-2010-StG грант № 260511-SEM_SEM и 7-й Рамочной программы Европейского сообщества (ЕС) (FP7/2007-2013) по гранту соглашения н * град; 280772 - IONE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
EBSS Sigma E2888
L-Cystein Sigma Aldrich C7352
Papain Worthington 30H11965
EDTA Fisher Scientific D/0700/50
Mouse NeuroCult basal medium Stem Cell Technologies 05700
NeuroCult proliferation supplements Stem Cell Technologies 05701
Heparin Sigma H3393
Basic fibroblast growth factor Peprotech 100-18B-1000
Epidermal growth factor Peprotech AF-100-15-1000
Pen/Strep Invitrogen 1514012
Matrigel (coating solution) BD Biosciences 354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) Stem Cell Technologies 05704
Accumax eBioscience 00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg PAA Laboratories H15-011
Myco trace PAA Laboratories Q052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Immunofluorescence
Normal goat serum PAA Laboratories B11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether Sigma Aldrich T8787
Mouse anti Nestin Abcam ab11306
Rabbit anti GFAP DAKO 203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10)  Abcam ab14955
Rabbit anti MAP-2 Abcam ab32454
Rat anti MBP AbD SEROTEC MCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 Millipore MAB345
DAPI Invitrogen D1306
Mounting solution DAKO S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incomplete Sigma Aldrich F5506
Mycobacterium tuberculosis DIFCO H37Ra
MOG(35–55)  Espikem
Pertussis toxin List Biological Laboratories 181
Tissue processing
Iris scissor straight Fine Sciences Tools 14060-09
Blunt/bended forceps Fine Sciences Tools 11080-02
Brain slicer Zivic Instruments BSMAS005-1
Surgical blades Swann-Morton 324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar) Boehringer Ingelheim 01LC0030
Xylazine (Rompun) Bayer 32371
Stereotaxic frame KOPF Model 900
Hamilton syringe Hamilton 7762-04
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 158127
VECTASTAIN Elite ABC Kit Vector Laboratories PK-6100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ben-Hur, T., et al. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 41, 73-80 (2003).
  2. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, 688-694 (2003).
  3. Chu, K., Kim, M., Jeong, S. W., Kim, S. U., Yoon, B. W. Human neural stem cells can migrate, differentiate, and integrate after intravenous transplantation in adult rats with transient forebrain ischemia. Neurosci. Lett. 343, 129-133 (2003).
  4. Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14, 634-644 (2008).
  5. Pluchino, S., et al. Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism. Nature. 436, 266-271 (2005).
  6. Einstein, O., et al. Intraventricular transplantation of neural precursor cell spheres attenuates acute experimental allergic encephalomyelitis. Mol. Cell Neurosci. 24, 1074-1082 (2003).
  7. Chu, K., et al. Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus in adult rats. Brain Res. 1023, 213-221 (2004).
  8. Jeong, S. W., et al. Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage. Stroke. 34, 2258-2263 (2003).
  9. Aboody, K. S., et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12846-12851 (2000).
  10. Muller, F. J., Snyder, E. Y., Loring, J. F. Gene therapy: can neural stem cells deliver. Nat. Rev. Neurosci. 7, 75-84 (2006).
  11. Martino, G., Pluchino, S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nat. Rev. Neurosci. 7, 395-406 (2006).
  12. Deckert-Schluter, M., Schluter, D., Hof, H., Wiestler, O. D., Lassmann, H. Differential expression of ICAM-1, VCAM-1 and their ligands LFA-1, Mac-1, CD43, VLA-4, and MHC class II antigens in murine Toxoplasma encephalitis: a light microscopic and ultrastructural immunohistochemical study. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 457-468 (1994).
  13. Hemmer, B., Archelos, J. J., Hartung, H. P. New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis. Nat. Rev. Neurosci. 3, 291-301 (2002).
  14. Butcher, E. C., Picker, L. J. Lymphocyte homing and homeostasis. Science. 272, 60-66 (1996).
  15. Rampon, C., et al. Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44. Stem Cells. 26, 1673-1682 (2008).
  16. Pluchino, S., et al. Human neural stem cells ameliorate autoimmune encephalomyelitis in non-human primates. Ann. Neurol. 66, 343-354 (2009).
  17. Martino, G., Pluchino, S., Bonfanti, L., Schwartz, M. Brain regeneration in physiology and pathology: the immune signature driving therapeutic plasticity of neural stem cells. Physiol. Rev. 91, 1281-1304 (2011).
  18. Aharonowiz, M., et al. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiple sclerosis. PLoS ONE. 3, e3145 (2008).
  19. Pluchino, S., et al. Immune regulatory neural stem/precursor cells protect from central nervous system autoimmunity by restraining dendritic cell function. PLoS One. 4, (2009).
  20. Einstein, O., et al. Neural precursors attenuate autoimmune encephalomyelitis by peripheral immunosuppression. Ann. Neurol. 61, 209-218 (2007).
  21. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J. Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
  22. Furlan, R., Pluchino, S., Marconi, P. C., Martino, G. Cytokine gene delivery into the central nervous system using intrathecally injected nonreplicative viral vectors. Methods Mol. Biol. 215, 279-289 (2003).
  23. Constantin, G. Visualization and analysis of adhesive events in brain microvessels by using intravital microscopy. Methods Mol. Biol. 239, 189-198 (2004).
  24. Politi, L. S., et al. Magnetic-resonance-based tracking and quantification of intravenously injected neural stem cell accumulation in the brains of mice with experimental multiple sclerosis. Stem Cells. 25, 2583-2592 (2007).
  25. Melzi, R., et al. Co-graft of allogeneic immune regulatory neural stem cells (NPC) and pancreatic islets mediates tolerance, while inducing NPC-derived tumors in mice. PLoS One. 5, (2010).
  26. Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, (2009).
  27. Ben-Hur, T., et al. Effects of proinflammatory cytokines on the growth, fate, and motility of multipotential neural precursor cells. Mol. Cell Neurosci. 24, 623-631 (2003).
  28. Giusto, E., Donega, M., Cossetti, C., Pluchino, S. Neuro-immune interactions of neural stem cell transplants: From animal disease models to human trials. Exp. Neurol. , (2013).

Tags

Immunology выпуск 86 нервные клетки Соматические шток / предшественники нейродегенеративные расстройства регенеративной медицины рассеянный склероз экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит системную доставку внутривенный интрацеребровентрикулярное
Системная Инъекция стволовых нервных / клеток-предшественников у мышей с хроническим ЕАЕ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donegà, M., Giusto, E.,… More

Donegà, M., Giusto, E., Cossetti, C., Schaeffer, J., Pluchino, S. Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE. J. Vis. Exp. (86), e51154, doi:10.3791/51154 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter