Introduction
Urine exosomen zijn kleine interne blaasjes van 100 nm van multivesiculaire lichaampjes (MVB), afkomstig van alle soorten cellen onder normale en pathologische omstandigheden in de urine ruimte, met inbegrip van de glomerulaire podocytes, niertubuli-cellen en epitheelcellen van de urine drainagesystemen die lijken te worden verrijkt voor miRNAs 1 -2. Veel onderzoekers hebben verschillende eiwitten aangetroffen in exosomen geïsoleerd uit urine van gezonde individuen evenals die met nier- en / of systematische ziekten 3-5. Exosomes kan worden geïsoleerd met behulp van verschillende methoden zoals tweestaps differentiële ultracentrifugatie met of zonder sucrose 6-7 combineert nanomembrane filter met ultracentrifugatie 09/08, 11/10 of precipitatie. Recent hebben wij een eenvoudige, snelle, schaalbare en effectieve methode om urine exosomen te isoleren en op te sporen miRNA en eiwit biomarkers 11. Hoewel biomarkers kan worden gedetecteerd in verschillende biologische vloeistoffen, urine is de meest geschikte keuze voor patiënten met nier- en urinewegen omdat het kan worden verkregen in grote hoeveelheden in een relatief niet-invasieve wijze.
Hoewel er verschillende manieren om urine exosomes isoleren 6-11, de meest gebruikte procedure is gebaseerd op differentiële ultracentrifugatie met een 30% sucrose kussen. Hoewel deze methode is efficiënt en de kwaliteit van de resulterende exosomes geïsoleerd met deze werkwijze is hoog, de techniek zelf vereist geschoold personeel en is tijdrovend en vereist verscheidene stappen ultracentrifugatie. Andere werkwijzen, zoals filtratie en precipitatie, zijn ontwikkeld voor de isolatie van exosomes, waaronder een die een eigen precipitatiereagens gebruikt (dwz ExoQuick-TC: System Biosciences, Mountain View, CA). Hoewel precipitatie met dit reagens snel en relatief eenvoudig, de zuiverheid van de geïsoleerde exosomes is laag in vergelijking met de ultracentrifugatie method. We hebben onlangs vergeleken zes voor de isolering van urine exosomes, waaronder een modificatie van de precipitatie methode met ExoQuick-TC dat we in ons laboratorium ontwikkeld 11. We vonden dat deze gewijzigde neerslag methode leverde hogere hoeveelheden eiwit, miRNA, en mRNA's en de procedure zelf sneller en eenvoudiger te implementeren dan ultracentrifugering was. Hier beschrijven we de experimentele protocol van onze gewijzigde neerslag methode stapsgewijs, en onder meer een bespreking van de voor- en nadelen van deze techniek in vergelijking met andere methoden van exosome isolement. De gemodificeerde precipitatie werkwijze omvat een initiële precipitatie van exosome deeltjes, gevolgd door verwijdering van Tamm-Horsfall eiwit, dat wordt gecorreleerd met exosomaal eiwitten en bekende exosome opbrengst van urine te verminderen. We vonden dat deze wijzigingen verhoogde de opbrengst en zuiverheid van de exosomaal preparaat uit urine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking. De stappen die betrokken zijn bij de isolatie van de urine exosomes met de gemodificeerde precipitatie werkwijze worden geïllustreerd in de Figuur 1 De eerste stappen omvatten het verwijderen van grote dode cellen en celresten door centrifugatie. De uiteindelijke pellet verkregen uit de vanuit elke volgende stap supernatant overeen met de exosoom, dat wordt opgelost in isolatieoplossing voor verdere extractie van eiwitten, RNA en DNA.
1. Het verzamelen van urine
- Vóór urine inzameling bereiden proteaseremmer cocktail volgens de instructies van de fabrikant en voeg 3.125 ml van deze cocktail een lege steriele houder. De buis met de proteaseremmer cocktail kan vervolgens worden gedistribueerd naar vrijwilligers voor urine collectie.
OPMERKING: De reden voor het toevoegen proteaseremmer om eiwitafbraak te beperken in het urinemonster. Hoewel we specifiek gebruikt een proteaseremmer cocktail vanSigma, kunnen andere commercieel verkrijgbare proteaseremmers worden vervangen. - Verzamel ongeveer 10 ml van de eerste leegte urine. Verwerk de urine onmiddellijk na monstername zonder opslag of koeling. Isoleer de urine exosomes in duplo met de gemodificeerde precipitatie methode; één van de duplo voor DNA, totaal RNA en eiwit-extractie, terwijl de andere is voor het kwantificeren van urine exosome deeltjes.
OPMERKING: Een 24 uur urine kan worden verzameld voor exosome isolatie door opslag bij 4 ° C.
2. Verwijdering van de Cel Debris en Tamm-Horsfall Protein (THP)
- Transfer urinemonsters 15 ml centrifugebuizen. Centrifugeer 10 ml urine bij 17.000 xg gedurende 10 min bij 37 ° C om cellen en celresten (figuur 1) te elimineren.
- Met behulp van een pipet het supernatant naar een nieuwe buis voor verdere verwerking. Resuspendeer de pellet in 500 ui van isolatie-oplossing (250 mM sucrose, 10 mM beproeftanolamine, pH 7,6) gevolgd door 10 min incubatie met DL-dithiothreitol (DTT: eindconcentratie van 200 mg / ml) bij 37 ° C.
OPMERKING: DTT toegevoegd aan THP die exosomes opsluit afbreken, wat leidt tot verminderde opbrengsten. Zorg ervoor dat de pellet ongestoord tijdens de overdracht van het supernatant te verlaten, en bevestigen dat het bovenstaande is duidelijk van pellet. - Vortex pellet samples elke 2 min totdat de pellet volledig is opgelost. Voeg vervolgens 500 ul van isolatie oplossing van de opgeloste pellet.
- Onmiddellijk na de toevoeging van isolatie oplossing van de pellet gecentrifugeerd bij 17.000 xg gedurende 10 min bij 37 ° C. Pipetteer het supernatant en combineer met eerder verzamelde supernatant.
- Resuspendeer de pellet in 50 ul van isolatie oplossing voor SDS-PAGE-analyse.
OPMERKING: PBS of TBS kan worden gebruikt in plaats van isolatie oplossing van het pellet te resuspenderen.
3. Isolatie van exosome Pellet
- Tot 11 ml van de verzamelde supernatant, voeg 3,3 ml ExoQuick-TC reagens en incuberen bij 4 ° C gedurende ten minste 12 uur.
OPMERKING: De verhouding van het volume supernatant aan ExoQuick-TC reagens kan worden aangepast aan verhogen of exosomaal opbrengst verlagen. We zagen dat mindere hoeveelheden toegevoegd reagens van kleinere opbrengsten van exosomen. - Na incubatie gecentrifugeerd sample / ExoQuick-TC mengsel bij 10.000 xg gedurende 30 min bij 25 ° C.
- Breng het supernatant naar een nieuwe buis voor SDS-PAGE-analyse.
- De exosome pellet kan worden opgeslagen bij -80 ° C voor DNA, RNA en eiwit-extractie en kwantificering van exosome deeltjes met CD9 ELISA 11.
OPMERKING: De exosome pellet kan worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende 1 jaar met beperkte bevriezen en ontdooien.
4. Biomarker detectie en analyse van exosome Pellet
- Voor stroomafwaartse analyses extract DNA, RNA en eiwit van de exosoom pellet met de DNA / RNA / eiwit isolatie kit en een RNA isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant. Bepaal concentraties met een Nanodrop spectrofotometer door het meten van absorptie bij 260 en 280 nm met 2 pl monster.
- Uitvoeren van kwantitatieve real-time RT-PCR (qPCR) met behulp van TaqMan microRNA assays (in ons geval, gebruikten we de menselijke miR-192- en miR-1207-5p-specifieke assays) of miRNA-specifieke primers.
- Voor SDS-PAGE-analyse, gebruik 4-12% Bis-Tris gel en gescheiden eiwitmonsters door ééndimensionale elektroforese. Visualiseren gels met de zilverkleuring kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer western blot analyse met PVDF membranen volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik konijn polyklonale antilichaam tegen apoptose-gebonden gen-2 interactie eiwit X of ALIX en muis monoklonaal antilichaam tegen tumor gevoeligheid gen 101 eiwit of Tsg101 in de western blot detectie. Kwantificeren van de dichtheid van de bands door open toegang NIH ImageJ software (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ofeen soortgelijk programma.
- Kwantificeren het aantal urine exosome deeltjes verkregen met een CD9 ELISA kit volgens de instructies van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Urine exosomen dragen eiwit, miRNA en mRNA biomarkers afgescheiden van renale epitheelcellen. De isolatie en detectie van deze exosomes kan een nuttig diagnostisch hulpmiddel voor vroege detectie van nier- ziekten zoals diabetische nefropathie. Er zijn verschillende methoden voor de isolatie van exosomen van urinemonsters verzameld van menselijke proefpersonen. We hebben eerder dan zes werkwijzen urine exosome isolatie en onderzocht resulterende eiwit, mRNA en miRNA niveaus 11. Ons doel hier was om te beschrijven in detail de gewijzigde neerslag methode die we hebben ontwikkeld voor een efficiënte isolatie van urine exosomen.
Figuur 1 beschrijft schematisch representatief stroomschema van verschillende stadia van de isolatie van urine exosomes toepassing van de gemodificeerde precipitatiewerkwijze. Eén van de dubbele exosomepellet verkregen wordt gemeten voor CD9 behulp van de CD9 ELISA-kit, die ons voorziet van de relatieve kwantificatie van exosome deeltjes. De andere pellet verwerkt met behulp van Qiagen DNA / RNA / eiwit mini kit opbrengst DNA, RNA en eiwitten, die werden gekwantificeerd middels Nanodrop spectrofotometer door het meten van de absorptie bij 260 en 280 nm.
Figuur 2 is de gemodificeerde weergave van de resultaten van SDS-PAGE-analyse en biomarker detectie met Western blot analyse (aangepast van referentie 11). In lanen met onverwerkte urine en eerste urine pellet, een eiwitband die overeenkomt met 90 tot 100 kDa waargenomen vermelding de aanwezigheid en verwijdering van THP eiwit respectievelijk. Terwijl in lanen met de definitieve supernatant en exosome pellet, het eiwit band die overeenkomt met THP werd niet waargenomen, met vermelding van de verwijdering van THP in de eerdere stappen, therEby de opbrengst van exosome pellet. Om toegang te krijgen tot de zuiverheid en de gevoeligheid van de exosome pellets, western blot detectie van biomarkers, zoals Alix en Tsg101 werkzaam was. We hebben geconstateerd Alix en Tsg101 zelfs bij lage hoeveelheden van het monster werden gebruikt aangeeft aanzienlijk pure exosome pellet voor biomerkeranalyse en afwezigheid van overvloedige oplosbare eiwitten met inbegrip van THP. Densitometrische analyse van de Western blots werd gedaan kwantificeren en meten van de detectiegrens (gegevens niet getoond).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meeste methoden waarbij het neerslaan van exosomen uit urine niet te pakken verwijdering van de polymere netwerk gevormd door Tamm-Horsfall eiwit (THP). Dit eiwit is aanwezig in grote hoeveelheden in urine, waar het vermoedelijk vallen exosomes tijdens de eerste lage snelheid centrifugatie. In het gewijzigde methode gereduceerd we THP middels DTT vóór exosome precipitatie. Zoals getoond in figuur 2, werd een grotere hoeveelheid THP waargenomen in ongewijzigde urine en pellet, zonder THP in het uiteindelijke supernatant en pellet exosome, aangeeft verwijdering van het eiwit. Kwantificering van eiwit in de pellet aangegeven zesmaal hoger rendement, en CD9 ELISA kwantificering van de pellet werd waargenomen dat de opbrengst van exosome per ml urine werd vijf maal hoger dan de ongemodificeerde precipitatie methode (resultaten niet getoond 11). De biomarkers Alix 6 en Tsg101 8 werden gedetecteerd in de exosome pellet; we slechts sporen deze eiwitten met geconcentreerdmonsters in het ongemodificeerde precipitatiemethode. We zagen ook de hoogste niveaus van miRNA (dwz, miR-192 en miR-1207-5p) en mRNA expressie (dat wil zeggen, Tsg101, PDCD6IP en AQP2 12) met behulp van de gewijzigde neerslag methode 11. De voor- en nadelen van deze gewijzigde precipitatie werkwijze zijn weergegeven in tabel 1.
| Voordelen | Nadelen |
| Gemakkelijke stappen en vergt relatief weinig expertise om te presteren | Lage zuiverheid van de eiwitten verkregen uit urine exosomes |
| Heeft een ultracentrifuge stap niet nodig | Door afwezigheid van de Ultracentrifugatie stappen de urine exosoom pellet verkregen niet zo zuiver als vergelijking met de exosoom pellet verkregen Ultracentrifugatie methodes |
| Maakt gebruik van klein volume van Urine monster voor isoleren van exosomes | Om zuiver eiwit te verkrijgen voor specifieke analyse zou eiwitzuiveringsstappen zoals affiniteitschromatografie nodig |
| Verkregen goede hoeveelheid miRNA, mRNA en eiwitten uit urine exosomes vergelijking met niet-gemodificeerde precipitatiewerkwijze | Enkele extra stappen nodig met toevoeging van DTT te entrapment verminderen Tamm-Horsfall eiwit vergeleken met ongemodificeerde precipitatiewerkwijze |
| Specificiteit en gevoeligheid van de biomarkers geanalyseerde waren vergelijkbaar met die verkregen en gebruikt ultracentrifuge geanalyseerd | |
| Urine exosomes kan worden geïsoleerd uit groot aantal monsters op een moment in klinische trails | |
| Minder hands-on tijd in vergelijking met Ultracentrifugatie methoden |
Tabel 1. Voor- en nadelen van gemodificeerde precipitatie methode voor urine exosome isolement.
We concluderen dat onze modificatie van de precipitatie methode is een eenvoudige, snelle, efficiënte manier om urine exosomes isoleren en is een geschikt alternatief voor de ultracentrifuge, hetgeen arbeidsintensief en vereist dure apparatuur. Onze methode vereist geen ultracentrifugeren stap, is gemakkelijk uit te voeren, en vereist minder stappen, terwijl het toch een hoge opbrengst of pure exosomen voor verdere moleculaire analyses. We tonen ook dat de opbrengst van miRNA en mRNA met deze methode zijn hoog, en kan daarom direct worden gebruikt in volgende stroomafwaartse RNA profiling toepassingen. We merken echter op dat een beperking van deze werkwijze is de kwaliteit van het verkregen eiwit, die niet zo zuiver als dat verkregen met de sucrose gradiënt ultracentrifugatie methoden, en vereist bijkomende zuiveringsstappen voorafgaand aan gebruik in stroomafwaartse proteoomanalyse. We zijn momenteel de beoordeling van het nut van deze method met urine van patiënten met diabetische nefropathie monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Publicatie vergoedingen voor dit artikel werden betaald door SBI Biosciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning 15 ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
- Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
- Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
- Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
- Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
- Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
- Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
- Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
- Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).
