Introduction
Urinary exosomer er små interne vesikler på 100 nm af multivesikulære organer (MVB) afledt af alle celletyper under normale og patologiske forhold i urin rum herunder glomerulære podocytter, nyretubuli og celler foring urin drænsystemer, der synes at blive beriget for miRNA 1 -2. Mange forskere har opdaget forskellige proteiner i exosomer isoleret fra urin fra raske individer såvel som dem med nyre- og / eller systematiske sygdomme 3-5. Exosomer kan isoleres ved hjælp af forskellige metoder, såsom totrins forskellen ultracentrifugering med eller uden saccharose 6-7 kombinere nanomembrane filter med ultracentrifugering 8-9, eller udfældning 10-11. Vi har for nylig udviklet en enkel, hurtig, skalerbar og effektiv metode til at isolere urin exosomer og opdage miRNA og protein biomarkører 11. Selv biomarkører kan påvises i en række forskellige biologiske fluider, urIne er den mest bekvemme valg for patienter med sygdomme i nyrerne og urinvejene, fordi det kan opnås i store mængder i en relativt ikke-invasiv måde.
Selv om der er flere metoder til at isolere urin exosomer 6-11, den mest anvendte procedure er baseret på forskellen ultracentrifugering med en saccharosepude 30%. Selv om denne fremgangsmåde er effektiv og kvaliteten af de resulterende exosomer isoleret med denne procedure er høj, selve teknikken kræver uddannet personale og er tidskrævende, kræver adskillige ultracentrifugering trin. Andre metoder, såsom filtrering og udfældning, er blevet udviklet til isolering af exosomer, herunder en, der bruger en navnebeskyttet udfældningsreagens (dvs. ExoQuick-TC: System Biosciences; Mountain View, CA). Selv udfældning ved hjælp af dette reagens er hurtig og relativt let, renheden af exosomer isoleret er lavt i forhold til ultracentrifugering method. Vi har for nylig sammenlignet seks metoder til isolering af urin exosomer, herunder en modifikation af nedbør under anvendelse af ExoQuick-TC, som vi har udviklet i vores laboratorium 11. Vi fandt, at dette ændrede nedbør metode gav større mængder af protein, miRNA og mRNA og selve proceduren var hurtigere og lettere at implementere end ultracentrifugering. Her beskriver vi forsøgsprotokollen af vores ændrede nedbør metode på en trinvis måde, og inkluderer en diskussion af fordele og ulemper ved denne teknik sammenlignet med andre metoder til exosome isolation. Den modificerede nedbør fremgangsmåde involverer en indledende udfældning af exosom-partikler, efterfulgt af fjernelse af Tamm-Horsfall protein, som er korreleret med exosomal proteiner og kendt for at reducere exosome udbytte fra urin. Vi fandt, at disse ændringer øget udbytte og renhed af præparatet exosomal fra urin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK:. De involverede i isoleringen af urin exosomer ved hjælp af den modificerede nedbør metode trin er illustreret i figur 1 De indledende trin involverer fjernelse af store døde celler og cellerester ved centrifugering. Den endelige pellet opnået fra supernatanten opsamlet fra hver efterfølgende trin svarer til exosomet, som opløses i isolation opløsning til yderligere ekstraktion af protein, RNA og DNA.
1. Indsamling af urin
- Forud for urinopsamling, forberede protease inhibitor cocktail ifølge producentens anvisninger, og der tilsættes 3,125 ml af denne cocktail til en tom steril beholder. Røret indeholdende protease inhibitor cocktail kan derefter fordeles til frivillige til urinopsamling.
BEMÆRK: Grunden til tilsætning af proteaseinhibitor er at minimere proteinnedbrydning i urinprøven. Selvom vi specifikt anvendes en protease inhibitor cocktail fraSigma, kan andre kommercielt tilgængelige proteasehæmmere være substitueret. - Saml ca 10 ml af første-void urin. Proces urinen umiddelbart efter opsamling uden opbevaring eller køling. Isoler urin exosomer i to eksemplarer ved hjælp af den modificerede nedbør metode; en af de to bestemmelser for DNA, total RNA og protein ekstraktion, mens den anden er til kvantificering af urin exosom partikler.
BEMÆRK: Et 24 timers urinprøve kan indsamles til exosom isolation ved opbevaring ved 4 ° C.
2. Fjernelse af cellerester og Tamm-Horsfall Protein (BBE)
- Overførsel urinprøver til 15 ml centrifugerør. Centrifugen 10 ml urin ved 17.000 xg i 10 minutter ved 37 ° C for at fjerne celler og cellerester (figur 1).
- Med pipette overføres supernatanten til et nyt rør til videre behandling. Resuspender pellet i 500 pi isolation opløsning (250 mM sucrose, 10 mM som prøveranolamine, pH 7,6) efterfulgt af 10 minutters inkubering med DL-dithiothreitol (DTT: slutkoncentration 200 mg / ml) ved 37 ° C.
BEMÆRK: DTT sættes til nedbryde THP, som fanger exosomer, hvilket fører til nedsat udbytte. Vær omhyggelig med at forlade pillen uforstyrret under overførsel af supernatanten, og bekræft, at supernatanten er klar til pellet. - Vortex pellet prøver hver 2 min, indtil pelleten er fuldstændig opløst. Derefter tilsættes 500 pi isolation løsning på opløst pellet.
- Umiddelbart efter tilsætning af isolation løsning til pelleten, centrifugeres ved 17.000 xg i 10 minutter ved 37 ° C. Pipetter supernatanten og kombinere med supernatanten opsamlet tidligere.
- Pellet resuspenderes i 50 pi isolation løsning til SDS-PAGE analyse.
BEMÆRK: PBS eller TBS kan anvendes i stedet for isolation løsning for at resuspendere pelleten.
3. Isolering af exosome Pellet
- Til 11 ml af den indsamlede supernatant tilsættes 3,3 ml ExoQuick-TC reagens og inkuberes ved 4 ° C i mindst 12 timer.
BEMÆRK: Forholdet mellem volumen af supernatant til ExoQuick-TC reagens kan justeres for at øge eller mindske exosomal udbytte. Vi observerede, at mindre mængder af tilsat reagens producere mindre udbytter af exosomer. - Efter inkubering centrifugeres prøven / ExoQuick-TC blanding ved 10.000 xg i 30 minutter ved 25 ° C.
- Supernatanten overføres til et frisk rør for SDS-PAGE analyse.
- Exosomet pellet kan opbevares ved -80 ° C for DNA, RNA og protein-ekstraktion og kvantificering af exosom partikler under anvendelse CD9 ELISA 11.
BEMÆRK: exosomet pellet kan opbevares ved -80 ° C i 1 år med begrænset nedfrysning og optøning.
4. Biomarkør detektion og analyse af exosome Pellet
- For downstream analyser ekstrahere DNA, RNA og protein fra exosomet pellet ved hjælp af DNA / RNA / Protein isolation kit og en RNA-isolering kit i overensstemmelse med producentens anvisninger. Bestem koncentrationer ved hjælp af en NanoDrop spektrofotometer ved at måle absorbansen ved 260 og 280 nm med 2 pi prøve.
- Udfør kvantitativ real time RT-PCR (qPCR) ved hjælp af TaqMan microRNA analyser (i vores tilfælde, vi brugte humane miR-192- og miR-1207-5p-specifikke assays) eller miRNA-specifikke primere.
- For SDS-PAGE analyse anvendes 4-12% Bis-Tris gel og separate proteinprøver ved endimensional elektroforese. Visualiser geler ved hjælp af sølvfarvning kit ifølge producentens anvisninger.
- Udfør western blot analyse under anvendelse af PVDF-membraner i overensstemmelse med instruktionerne fra producenten. Brug kanin polyklonalt antistof mod apoptose-bundet gen-2 interagerende protein X eller ALIX og muse-monoklonalt antistof til tumor modtagelighed gen 101 protein eller TSG101 i western blot detektion. Kvantificere tætheden af båndene med åben adgang NIH ImageJ software (http://rsbweb.nih.gov/ij/) elleret lignende program.
- Kvantificer antallet af urin exosom-partikler opnået ved anvendelse af en CD9 ELISA-kit ifølge producentens anvisninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Urinary exosomer bære protein, miRNA og mRNA biomarkører udskilles fra nyrerne epitelceller. Isoleringen og påvisning af disse exosomer kan være et nyttigt diagnostisk værktøj til tidlig opdagelse af nyresygdomme såsom diabetisk nefropati. Der er flere metoder til isolering af exosomer fra urinprøver indsamlet fra mennesker. Vi har tidligere sammenlignet seks metoder til urin exosome isolation og undersøgt resulterende protein, mRNA og miRNA niveauer 11. Vores mål her var at beskrive i detaljer modificerede nedbør metode, vi har udviklet til effektiv isolering af urin exosomer.
Figur 1 beskriver skematisk repræsentative rutediagram for forskellige trin i isoleringen af urin exosomer anvendelse af den modificerede nedbør metode. En af de to eksemplarer exosometpellet opnåede målt for CD9 hjælp af CD9 ELISA kit, som giver os den relative kvantificering af exosom partikler. Den anden pellet behandles ved hjælp af Qiagen DNA / RNA / Protein mini kit udbytter DNA, RNA og protein, som blev kvantificeret ved anvendelse NanoDrop spektrofotometer ved at måle absorbansen ved 260 og 280 nm.
Figur 2 er den modificerede reproduktion af resultaterne på SDS-PAGE analyse og biomarkør påvisning ved Western blot-analyse (tilpasset fra henvisning 11). I bane med ubehandlet urin og første urin pellet, et protein bånd svarende til 90 til 100 kDa blev observeret angiver tilstedeværelsen og fjernelse af THP-protein hhv. Mens der i baner med endelige supernatant og exosome pellet blev proteinet bånd svarende til THP ikke observeret, hvilket indikerer fjernelse af THP i de tidligere trin, therEby øge udbyttet af exosome pellet. For at få adgang til renhed og følsomhed exosom pellets blev western blot detektion af biomarkører såsom Alix og TSG101 ansat. Vi har registreret Alix og TSG101 selv når små mængder af prøven blev brugt indikerer signifikant ren exosom pellet for biomarkør analyse og fravær af rigelige opløselige proteiner, herunder THP. Densitometrisk analyse af Western blots blev gjort for at kvantificere og måle niveauet af detektion (data ikke vist).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fleste metoder med udfældning af exosomer fra urin ikke fat fjernelse af det polymere netværk dannet af Tamm-Horsfall protein (BBE). Dette protein er til stede i store mængder i urinen, når den -sagerne fælder exosomer under indledende lavhastighedscentrifugering. I vores modificeret fremgangsmåde vi reduceret THP hjælp DTT før exosome udfældning. Som vist i figur 2, blev en større mængde af THP observeret i uforandret urin og pellet, med ingen THP i den endelige supernatant og exosome pellet, indikerer fjernelse af proteinet. Kvantificering af protein i pelleten angivet seks gange højere udbytte og CD9 ELISA kvantificering af pelleten, blev det observeret, at udbyttet af exosom per ml urin blev fem gange højere end den umodificerede nedbør metoden (resultater ikke vist 11). De biomarkører Alix 6 og TSG101 8 blev påvist i exosomet pellet; vi kunne kun påvise disse proteiner under anvendelse af koncentreretprøver i den umodificerede nedbør metoden. Vi observerede også de højeste niveauer af miRNA (dvs. miR-192 og miR-1207-5p) og mRNA ekspression (dvs. TSG101, PDCD6IP og AQP2 12) ved hjælp af den modificerede nedbør metode 11. Fordelene og ulemperne ved denne modificerede nedbør metode er vist i tabel 1.
| Fordele | Ulemper |
| Nemme enkle trin og kræver relativt lille ekspertise til at udføre | Lav renhed af proteinerne fremstillet af Urinary exosomer |
| Kræver ikke en ultracentrifugering skridt | På grund af fravær af ultracentrifugering trin urinvejene exosom opnåede pellet er ikke så rent som sammenlignet exosomet pellet opnået fra ultracentrifugering metoder |
| Bruger lille volumen Urine prøve til isolering af exosomer | For at opnå rent protein til specifik analyse, ville protein oprensningstrin såsom affinitetskromatografi være nødvendigt |
| Opnået god mængde af miRNA, mRNA og proteiner fra Urinary exosomer i forhold til ikke-modificerede nedbør metode | Par ekstra trin er nødvendige ved tilsætning af DTT til at reducere indfangning af Tamm-Horsfall protein sammenlignet med ikke-modificerede nedbør metode |
| Specificitet og følsomhed biomarkører analyserede var svarede til den opnåede og analyseret ved anvendelse af ultracentrifugering metode | |
| Urinary exosomer kan isoleres fra store antal af prøver på et tidspunkt, der er egnet til kliniske forsøg | |
| Mindre hands-on tid i forhold til ultracentrifugering metoder |
Tabel 1. Fordele og ulemper ved modificeret nedbørtion metode til urin exosome isolation.
Vi konkluderer, at vores ændring af nedbør metode er en enkel, hurtig, effektiv måde at isolere urin exosomer og er et egnet alternativ til ultracentrifugering metoden, som er arbejdskrævende og kræver dyrt udstyr. Vores metode kræver ingen ultracentrifugeringstrin, er let at udføre og kræver færre trin, mens det stadig giver et højt udbytte eller rene exosomer til efterfølgende molekylære analyser. Vi viser også, at udbyttet af miRNA og mRNA ved hjælp af denne metode er høje, og derfor kan anvendes direkte i efterfølgende downstream RNA profilering applikationer. Bemærk dog, at en begrænsning af denne fremgangsmåde er kvaliteten af det opnåede protein, som ikke er så ren som den, der opnås ved hjælp af saccharose ultracentrifugering metoder og kræver yderligere oprensningstrin forud for udnyttelsen i downstream proteomikanalyser. Vi er i øjeblikket at vurdere nytten af dette method hjælp urinprøver opnået fra patienter med diabetisk nefropati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bekendtgørelsesgebyrer til denne artikel blev betalt af SBI Biosciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning 15 ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
- Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
- Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
- Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
- Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
- Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
- Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
- Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
- Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).
