Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

שיטת ממטרים השתנה לבודד השתן Exosomes

Published: January 16, 2015 doi: 10.3791/51158

Introduction

exosomes שתן הוא שלפוחית ​​פנימית קטנה של גופי multivesicular (MVB) נגזרים מכל סוגי התאים בתנאים נורמלים ופתולוגיים בחלל שתן כולל podocytes גלומרולרי, תאי אבובית כליה ותאים המצפים את מערכות ניקוז שתן המופיעות להיות מועשרים לmiRNAs 1 100 ננומטר -2. חוקרים רבים זיהו חלבונים שונים בexosomes מבודד משתן של אנשים בריאים, כמו גם אלה עם כליות ו / או מחלות שיטתיות 3-5. יכול להיות מבודד Exosomes בשיטות שונות כגון ultracentrifugation ההפרש דו-שלבים עם או בלי סוכרוז 6-7, שילוב מסנן nanomembrane עם ultracentrifugation 8-9, או 10-11 ממטרים. יש לנו לאחרונה פיתחתי שיטה פשוטה, מהירה, מדרגי ויעילות לבודד exosomes שתן ולזהות מירנה וסמנים ביולוגי חלבון 11. למרות שניתן לאתרם סמנים ביולוגיים במגוון רחב של נוזלים ביולוגיים שונים, urine הוא הבחירה הנוחה ביותר עבור חולים עם מחלות הכליות ודרכי שתן, כי ניתן להשיג אותו בכמויות גדולות באופן יחסי שאינו פולשנית.

למרות שיש כמה שיטות לבודד exosomes שתן 6-11, ההליך הנפוץ ביותר תלוי בultracentrifugation ההפרש עם 30% כרית סוכרוז. למרות ששיטה זו היא יעילה ואיכות exosomes וכתוצאה מכך מבודדת עם הליך זה היא גבוהה, הטכניקה עצמה דורשת כוח אדם מיומן, והוא, שדורש כמה צעדי ultracentrifugation זמן רב. שיטות אחרות, כגון סינון ומשקעים, פותחו עבור הבידוד של exosomes, כולל אחד שמשתמש מגיב ממטרים קניינית (כלומר, ExoQuick-TC: מערכת Biosciences; Mountain View, CA). למרות משקעים באמצעות מגיב זה הוא מהיר וקל יחסית, טוהר exosomes מבודד הוא נמוך בהשוואה לספיד ultracentrifugationod. לאחרונה לעומת שש שיטות לבידודה של exosomes שתן, כולל שינוי של שיטת המשקעים באמצעות ExoQuick-TC שפיתחנו במעבדה שלנו 11. מצאנו ששיטת משקעים שונה זו הניבה כמויות גבוהות יותר של חלבון, מירנה, וmRNAs וההליך עצמו היה מהיר יותר וקל יותר ליישום מאשר ultracentrifugation. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול הניסוי של שיטת המשקעים שונה שלנו באופן הדרגתי, ונכלול דיון על היתרונות והחסרונות של שיטה זו בהשוואה לשיטות אחרות של בידוד exosome. שיטת המשקעים שונה כרוכה ממטרים ראשוניים של חלקיקי exosome, ואחריו הסרת חלבון התם-Horsfall, אשר מתואם עם חלבוני exosomal, וידוע כדי להפחית את תשואת exosome משתן של. מצאנו ששינויים אלה הגדילו את התשואה וטוהר של הכנת exosomal משתן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה:. השלבים כרוכים בבידוד של exosomes השתן תוך שימוש בשיטת המשקעים שונה באים לידי ביטוי באיור 1 הצעדים הראשוניים כרוכים בהסרת תאים מתים גדולים ופסולת תא על ידי צנטריפוגה. גלולה הסופית המתקבלת מsupernatant שנאסף מכל שלב שלאחר מכן תואמת את exosome, אשר מומס בפתרון בידוד להפקה נוספת של החלבון, RNA, ו- DNA.

1. איסוף שתן

  1. לפני איסוף שתן, להכין מעכבי פרוטאז קוקטייל על פי הוראות היצרן ולהוסיף 3.125 מיליליטר של הקוקטייל הזה לקיבול סטרילי ריק. הצינור המכיל מעכבי פרוטאז קוקטייל אז יכול להיות מופץ למתנדבים לאיסוף שתן.
    הערה: הסיבה להוספת מעכבי פרוטאז היא למזער פירוק חלבונים בדגימת השתן. למרות שאנו במיוחד משמשים מעכבי פרוטאז קוקטייל מSigma, ניתן להחליף מעכבי פרוטאז זמינים מסחרי אחרים.
  2. לאסוף כ 10 מיליליטר של השתן הראשון-חלל. לעבד את השתן מייד לאחר האיסוף ללא אחסון או קירור. לבודד את exosomes השתן בשני עותקים בשיטת המשקעים שונה; אחד מהכפילויות הוא לDNA, RNA המוחלט ומיצוי חלבון, ואילו השני הוא לכימות של חלקיקי exosome שתן.
    הערה: דגימת שתן 24 שעות ניתן לאסוף עבור בידוד exosome ידי אחסון ב 4 מעלות צלזיוס.

2. ההסרה של פסולת תא וחלבון התם-Horsfall (THP)

  1. העבר את דגימות שתן של 15 מיליליטר צינורות צנטריפוגה. צנטריפוגה 10 מיליליטר של שתן ב17,000 XG במשך 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס לחסל תאים ופסולת תא (איור 1).
  2. בעזרת פיפטה, להעביר את supernatant לצינור טרי לעיבוד נוסף. Resuspend גלולה ב 500 μl של פתרון בידוד (250 מ"מ סוכרוז, trieth מ"מ 10anolamine, pH 7.6) ואחריו דגירה 10 דקות עם DL-dithiothreitol (DTT: מ"ג / מיליליטר ריכוז 200 סופי) על 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: DTT מתווסף לבזות THP, שלוכד את exosomes, שהוביל לירידה בתשואות. תשמור על עצמך לעזוב את הכדור ללא הפרעה במהלך העברת supernatant, ולאשר כי supernatant ברור של גלולה.
  3. דגימות גלולה וורטקס כל 2 דקות עד גלולה הוא נמס לגמרי. ואז להוסיף 500 μl של פתרון בידוד לגלולה המומס.
  4. מייד לאחר התוספת של פתרון בידוד לגלולה, צנטריפוגות ב 17,000 XG במשך 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. Pipet supernatant ולשלב עם supernatant שנאסף קודם לכן.
  5. Resuspend את הכדור ב 50 μl של פתרון בידוד לניתוח SDS-PAGE.
    הערה: PBS או TBS יכול לשמש במקום פתרון בידוד לresuspend גלולה.

3. בידוד של Exosome גלולה

  1. עד 11 מיליליטר של supern נאסףatant, להוסיף 3.3 מיליליטר של מגיב ExoQuick-TC ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 12.
    הערה: היחס של נפח supernatant למגיב ExoQuick-TC יכולה להיות מותאם כדי להגדיל או להקטין את תשואת exosomal. הבחנו כי כרכים פחותים של מגיב הוסיף לייצר תשואות קטנות יותר של exosomes.
  2. לאחר דגירה, צנטריפוגות תמהיל המדגם / ExoQuick-TC ב10,000 XG למשך 30 דקות ב -25 מעלות צלזיוס.
  3. מעביר את supernatant לצינור טרי לניתוח SDS-PAGE.
  4. גלולה exosome ניתן לאחסן ב -80 ° C ל- DNA, RNA ומיצוי חלבון וכימות של חלקיקי exosome באמצעות CD9 11 ELISA.
    הערה: גלולה exosome ניתן לאחסן ב -80 ° C למשך שנה 1 עם הקפאה להפשרה מוגבלת.

4. ביומרקר באיתור ובניתוח של Exosome גלולה

  1. עבור ניתוחים במורד הזרם, לחלץ DNA, RNA וחלבון מגלולת exosome באמצעות DNA / RNA / ערכת בידוד החלבון וקי בידוד RNAt על פי הוראות היצרן. לקבוע ריכוזים באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop על ידי מדידת הספיגה ב 260 ו280nm עם 2 μl של מדגם.
  2. לבצע בזמן אמת RT-PCR (qPCR) באמצעות מבחני microRNA TaqMan (במקרה שלנו, השתמש miR-192- וmiR-1207-5p ספציפי מבחני אנושיים) או פריימרים מירנה ספציפיים.
  3. לניתוח SDS-PAGE, להשתמש 4-12% ג'ל Bis-טריס ודגימות חלבון נפרדים על ידי אלקטרופורזה חד-ממדית. דמיין ג'ל באמצעות ערכת צביעת כסף בהתאם להוראות היצרן.
  4. לבצע ניתוח כתם מערבי באמצעות ממברנות PVDF בהתאם להוראות הניתנות על ידי היצרן. השתמש נוגדן polyclonal ארנב גן-2 X צמוד אפופטוזיס אינטראקציה חלבון או אליקס ונוגדנים חד שבטי עכבר כדי גן רגישות גידול 101 חלבון או TSG101 באיתור הכתם המערבי. לכמת את הצפיפות של הלהקות על ידי גישה פתוחה תוכנת NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) אותכנית דומה.
  5. לכמת את מספר חלקיקי exosome שתן שהושגו באמצעות ערכת ELISA CD9 לפי הוראות יצרן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

exosomes שתן לשאת סמנים ביולוגיים חלבון, מירנה וmRNA המופרשים מתאי האפיתל כליות. הבידוד וזיהוי של exosomes אלה עשויים לספק כלי אבחון יעילים לגילוי מוקדם של מחלות כליה, כגון נפרופתיה סוכרתית. ישנן מספר שיטות לבידודה של exosomes מדגימות שתן שנאספו מבני אדם. השווינו בעבר שש שיטות של בידוד exosome השתן וכתוצאה מכך חקרנו חלבון, רמות ה- mRNA, ומירנה 11. המטרה שלנו כאן הייתה לתאר בפירוט את שיטת המשקעים שונה שפיתחנו לבידוד יעיל של exosomes שתן.

איור 1
איור 1 מתאר את תרשים זרימת הנציג סכמטי של המעורבים בבידוד של exosomes שתן צעדים שונים בשיטת המשקעים שונה. אחד exosome הכפולגלולה המתקבלת נמדדת לCD9 באמצעות ערכת ELISA CD9, אשר מספקת לנו את הכימות היחסי של חלקיקי exosome. גלולה אחרת מעובד באמצעות תשואות Qiagen DNA / RNA / חלבון מיני ערכת DNA, RNA וחלבון, שהיו לכמת באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop על ידי מדידת הספיגה ב 260 ו- 280 ננומטר.

איור 2
איור 2 הוא הרבייה שונה של התוצאות על ניתוח SDS-PAGE וזיהוי סמנים ביולוגי באמצעות ניתוח מערבי כתם (מותאם מהתייחסות 11). בנתיבים עם שתן לא מעובד וגלול שתן ראשון, להקת חלבון המתאימה 90 עד 100 kDa נצפה המציין הנוכחות וההסרה של חלבון THP בהתאמה. בעוד שבנתיבים עם supernatant סופי וגלול exosome, להקת החלבון המתאימה לTHP לא נצפתה, המציין את הסרת THP בשלבים המוקדמים יותר, יסEby הגדלת התשואה של גלולה exosome. כדי לגשת לטוהר והרגישות של כדורי exosome, איתור כתם המערבי של סמנים ביולוגיים כגון אליקס וTSG101 הועסק. אנחנו הבחנו אליקס וTSG101 גם כאשר כמויות נמוכות של מדגם שמשו מצביעות גלולה exosome טהורה באופן משמעותי לניתוח סמן ביולוגי והעדר חלבונים המסיסים בשפע כולל THP. ניתוח densitometric של הכתמים המערביים נעשה לכמת ולמדוד את רמת זיהוי (מידע לא מוצג).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

רוב השיטות הכרוכות במשקעים של exosomes משתן אינן מתייחסות להסרת של רשת פולימרים הוקמה על ידי חלבון התם-Horsfall (THP). חלבון זה נמצא בכמויות גדולות בשתן, שבו מלכודות putatively זה exosomes במהלך צנטריפוגה מהירות נמוכה ראשונית. בשיטה שונה שלנו אנחנו מופחתים THP באמצעות DTT לפני הממטרים exosome. כפי שניתן לראות באיור 2, סכום גבוה יותר של THP נצפה בשתן והגלול לא מעובד, ללא THP בsupernatant הסופי והגלול exosome, המצביע על הסרת החלבון. כימות של חלבון בגלולה מצויינים תשואה גבוהה פי שישה, ועל כימות CD9 ELISA של גלולה, היא נצפתה תשואה של exosome לכל מיליליטר של שתן הייתה גבוהים פי חמישה מאשר בשיטת הממטרים ללא שינוי (תוצאות לא מוצגות 11). הסמנים הביולוגיים אליקס 6 וTSG101 8 התגלו בגלולת exosome; אנחנו יכולים רק לזהות חלבונים אלה באמצעות מרוכזיםדגימות בשיטת הממטרים ללא שינוי. אנו הבחנו גם ברמות הגבוהות ביותר של מירנה (כלומר, miR-192 וmiR-1207-5p) וביטוי mRNA (כלומר, TSG101, PDCD6IP ו -12 AQP2) תוך שימוש בשיטת המשקעים שונה 11. היתרונות וחסרונות של שיטת משקעים שונה זו מוצגים בטבלה 1.

יתרונות חסרונות
צעדים פשוטים קלים ודורשים מומחיות קטנה ביחס לביצוע טוהר נמוך של החלבונים המתקבל מexosomes השתן
אינו מחייב צעד ultracentrifugation בשל היעדר צעדי ultracentrifugation, גלולה exosome השתן המתקבלת היא לא טהורה כמו בהשוואה לגלולת exosome התקבלה משיטות ultracentrifugation
משתמש נפח קטן של Urinמדגם דואר לבידודה של exosomes כדי לקבל חלבון טהור לניתוח ספציפי, יהיו צורך בצעדי טיהור חלבון כגון זיקת כרומטוגרפיה
השיג כמות טובה של מירנה, mRNA וחלבונים מexosomes שתן בהשוואה ללא-שינוי שיטת ממטרים צורך בתוספת של DTT צעדים נוספים כדי לצמצם כמה מלכוד על ידי חלבון התם-Horsfall בהשוואה למי שאינה שונה בשיטת ממטרים
סגוליות ורגישות של הסמנים הביולוגיים ניתחו היו דומים לזה שהתקבל ונותח באמצעות שיטת ultracentrifugation
יכול להיות מבודד exosomes שתן ממספר גדול של דגימות בכל פעם, מתאים לשבילים קליניים
ידיים על פחות זמן בהשוואה לשיטות ultracentrifugation

יתרונות 1. שולחן וחסרונות של precipita שונהשיטת tion לבידוד exosome שתן.

אנו מסיקים כי השינוי של שיטת המשקעים שלנו הוא דרך פשוטה, מהירה ויעילה לבודד exosomes שתן והוא חלופה ראויה לשיטת ultracentrifugation, שהוא עתיר עבודה ודורשת ציוד יקר. השיטה שלנו לא דורשת צעד ultracentrifugation, היא קל לביצוע, ודורשת פחות שלבים, תוך מתן תשואה גבוהה או exosomes הטהור לניתוחים מולקולריים שלאחר מכן. כמו כן, אנו מראים כי התשואות של מירנה וmRNA בשיטה זו הן גבוהות, ולכן ניתן להשתמש ישירות ביישומי פרופיל RNA במורד הזרם שלאחר מכן. עם זאת, נציין, כי הגבלה של שיטה זו היא באיכות של החלבון שהתקבל, שאינו טהור כמו שהושג באמצעות שיטות ultracentrifugation שיפוע סוכרוז, ודורשת צעדי טיהור נוספים לפני הניצול בניתוחי proteomic במורד הזרם. בימים אלו אנו בוחנים את התועלת של ספיד זהod באמצעות דגימות שתן שהתקבלו מחולים עם נפרופתיה סוכרתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

עמלות פרסום לכתבה זו שולמו על ידי Biosciences SBI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning 15 ml Centrifuge Tube Corning (Sigma Aldrich) CLS430791
Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich P8340
Centrifuge Sorvall
DL-dithiothreitol Sigma Aldrich D9779 used at final concentration of 200 mg/ml
Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well Invitrogen NP0321BOX For SDS-PAGE analysis
ECL Advance Western blotting detection kit GE Healthcare Life Sciences RPN2135 For western blot detection of biomarkers
Exoquick-TC Reagent System Biosciences (SBI) EXOTC50A-1 For exosome isolation
Exosome CD9 ELISA Complete Kit System Biosciences (SBI) EXOEL-CD9-A-1 For exosome quantification
AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit Qiagen 80004 For DNA, RNA, Protein isolation
Rneasy MinElute Cleanup kit Qiagen 74204
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific For Protein Quantification
ProteoSilver Sliver Stain Kit Sigma Aldrich PROTSIL1-1KT For staining SDS-PAGE gels
Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System Life Technologies For running the SDS-PAGE gels
TaqMan microRNA assays Life Technologies For RT-PCR assays
qBasePlus v1.5 software Biogazelle NV For analysis of RT-PCR assay data
Rabbit polyclonal antibody to ALIX Millipore For western blot detection of biomarkers
Mouse monoclonal antibody to TSG101 Abcam For western blot detection of biomarkers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
  2. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
  3. Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
  4. Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
  5. Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
  6. Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
  7. Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
  8. Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
  9. Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
  10. Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  11. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  12. Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).

Tags

רפואה גיליון 95 רפואת Translational exosomes שתן RNA כתם מערבי חלבון התם-Horsfall
שיטת ממטרים השתנה לבודד השתן Exosomes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M.,More

Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158, doi:10.3791/51158 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter