Introduction
Esosomi urinari sono piccole vescicole interne di 100 nm di corpi multivescicolari (MVB) derivate da tutti i tipi di cellule in condizioni normali e patologiche nello spazio urinario compresi podocytes glomerulare, cellule tubulari renali e cellule che rivestono le sistemi di drenaggio urinario che sembrano essere arricchito per miRNA 1 -2. Molti ricercatori hanno rilevato proteine distinte in esosomi isolate da urine di soggetti sani e quelli con renale e / o malattie sistematiche 3-5. Esosomi possono essere isolati con metodi diversi, come due fasi ultracentrifugazione differenziale con o senza saccarosio 6-7, combinando filtro nanomembrana con ultracentrifugazione 8-9, 10-11 o precipitazione. Abbiamo recentemente sviluppato un metodo semplice, veloce, scalabile ed efficace per isolare esosomi urinari e rilevare miRNA e biomarcatori proteici 11. Sebbene biomarker possono essere rilevati in una varietà di diversi fluidi biologici, urine è la scelta più conveniente per i pazienti con malattie del rene e del tratto urinario perché può essere ottenuta in grandi quantità in modo relativamente non invasivo.
Anche se ci sono diversi metodi per isolare esosomi urinarie 6-11, la procedura più comunemente usato dipende ultracentrifugazione differenziale con un cuscino di saccarosio 30%. Mentre questo metodo è efficiente e la qualità dei exosomes risultanti isolati con questa procedura è alta, la tecnica si richiede personale specializzato ed è, richiede diversi passaggi ultracentrifugazione richiede tempo. Altri metodi, come la filtrazione e precipitazioni, sono stati sviluppati per l'isolamento di esosomi, tra cui uno che utilizza un reagente di precipitazione proprietario (cioè, ExoQuick-TC: Biosciences System; Mountain View, CA). Anche se le precipitazioni usando questo reagente è veloce e relativamente facile, la purezza dei esosomi isolate è basso rispetto alla meth ultracentrifugazioneod. Recentemente abbiamo confrontato sei metodi per l'isolamento di esosomi urinari, tra cui una modifica del metodo di precipitazione mediante ExoQuick-TC, che abbiamo sviluppato nel nostro laboratorio 11. Abbiamo scoperto che questo metodo di precipitazione modificato prodotto maggiori quantità di proteine, miRNA e mRNA e la procedura in sé era più veloce e più facile da implementare che ultracentrifugazione. Qui, descriviamo il protocollo sperimentale del nostro metodo di precipitazione modificato in modo graduale, e comprendono una discussione sui vantaggi e gli svantaggi di questa tecnica rispetto ad altri metodi di isolamento exosome. Il metodo di precipitazione modificato prevede una precipitazione iniziale di particelle exosome, seguita dalla rimozione di proteina di Tamm-Horsfall, che è correlato con le proteine exosomal, e noto per ridurre exosome resa dalle urine. Abbiamo trovato che tali modifiche aumentato la resa e la purezza della preparazione exosomal dall'urina.
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Protocol
NOTA:. I passi necessari per l'isolamento dei esosomi urinari con il metodo di precipitazione modificato sono illustrati nella Figura 1 Le fasi iniziali prevedono la rimozione di grandi cellule morte e detriti cellulari mediante centrifugazione. Il pellet finale ottenuto dal supernatante raccolto da ciascun passo successivo corrisponde al exosome, che viene sciolto in soluzione di isolamento per l'ulteriore estrazione di proteine, RNA e DNA.
1. Raccolta delle urine
- Prima della raccolta delle urine, preparare con inibitori della proteasi cocktail secondo le istruzioni del produttore e aggiungere 3,125 ml di questo cocktail per una presa sterile vuota. La provetta contenente il cocktail di inibitori delle proteasi può quindi essere distribuito ai volontari per la raccolta delle urine.
NOTA: La ragione per l'aggiunta di inibitore della proteasi è quello di minimizzare la degradazione della proteina nel campione di urina. Anche se abbiamo usato un particolare cocktail inibitore della proteasi daSigma, altri inibitori della proteasi disponibili in commercio possono essere sostituiti. - Raccogliere circa 10 ml di urina prima nullo. Processo urine subito dopo la raccolta, senza la conservazione o refrigerazione. Isolare le exosomes urinarie in duplicato utilizzando il metodo di precipitazione modificato; uno dei duplicati è per DNA, RNA totale e l'estrazione delle proteine, mentre l'altra è per la quantificazione delle particelle exosome urinarie.
NOTA: Un campione di urine delle 24 ore può essere raccolto per l'isolamento exosome memorizzando a 4 ° C.
2. Rimozione dei detriti cellulari e Tamm-Horsfall Protein (THP)
- Trasferire i campioni di urina a 15 ml provette. Centrifugare 10 ml di urina a 17.000 xg per 10 min a 37 ° C per eliminare cellule e detriti cellulari (Figura 1).
- Utilizzando una pipetta, trasferire il surnatante in una nuova provetta per ulteriori elaborazioni. Risospendere il pellet in 500 ml di soluzione di isolamento 250 mM di saccarosio, mette alla prova (10 mManolamine, pH 7,6), seguito da 10 minuti di incubazione con DL-ditiotreitolo (DTT: concentrazione finale 200 mg / ml) a 37 ° C.
NOTA: DTT si aggiunge a degradare THP, che intrappola esosomi, con conseguente riduzione della resa. Fare attenzione a lasciare il pellet indisturbata durante il trasferimento del surnatante, e confermare che il surnatante è chiaro di pellet. - Campioni di sedimenti di Vortex ogni 2 minuti fino a quando il pellet è completamente sciolto. Poi aggiungere 500 ml di soluzione di isolamento al pellet disciolto.
- Immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione di isolamento al pellet, centrifugare a 17.000 xg per 10 min a 37 ° C. Pipettare il supernatante e si combinano con il supernatante raccolto precedente.
- Risospendere il pellet in 50 ml di soluzione di isolamento per l'analisi SDS-PAGE.
NOTA: PBS o TBS possono essere utilizzati al posto di soluzione di isolamento per risospendere il pellet.
3. Isolamento di Exosome Pellet
- Per 11 ml di supern raccoltaatant, aggiungere 3,3 ml di reagente ExoQuick-TC e incubare a 4 ° C per almeno 12 ore.
NOTA: Il rapporto tra volume di supernatante di reagente ExoQuick-TC può essere regolata per aumentare o diminuire la resa exosomal. Abbiamo osservato che minori volumi di reagente aggiunto producono rendimenti più piccole di esosomi. - Dopo l'incubazione, centrifugare la miscela campione / ExoQuick-TC a 10.000 xg per 30 min a 25 ° C.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta per l'analisi SDS-PAGE.
- Il pellet exosome può essere conservato a -80 ° C per il DNA, RNA e proteine estrazione e la quantificazione delle particelle exosome utilizzando CD9 ELISA 11.
NOTA: Il pellet exosome può essere conservato a -80 ° C per 1 anno con congelamento e scongelamento limitata.
4. Biomarker rilevazione e l'analisi di Exosome Pellet
- Per le analisi a valle, estrarre il DNA, RNA e proteine dal pellet exosome utilizzando il DNA / RNA / Kit di isolamento delle proteine e un ki isolamento RNAt secondo le istruzioni del produttore. Determinare le concentrazioni utilizzando uno spettrofotometro Nanodrop misurando l'assorbanza a 260 e 280 nm con 2 ml di campione.
- Eseguire quantitativa real time RT-PCR (qPCR) usando saggi microRNA TaqMan (nel nostro caso, abbiamo utilizzato umani miR-192- e miR-1207-5p-specifici test) o primer miRNA specifici.
- Per l'analisi SDS-PAGE, utilizzare 4-12% Bis-Tris gel e campioni di proteine separati da unidimensionale elettroforesi. Visualizza gel usando il kit di colorazione argento secondo le istruzioni del produttore.
- Eseguire l'analisi Western Blot utilizzando membrane PVDF secondo le istruzioni fornite dal produttore. Utilizzare anticorpo policlonale di coniglio all'apoptosi-linked gene-2 interagendo proteina X o ALIX e anticorpo monoclonale mouse per tumore gene di suscettibilità 101 proteine o TSG101 nella rilevazione Western Blot. Quantificare la densità delle bande da open access software NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) oun programma simile.
- Quantificare il numero di particelle exosome urinari ottenuti con un kit ELISA CD9 secondo le istruzioni del produttore.
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Representative Results
Esosomi urinarie trasportano proteine, miRNA e mRNA biomarcatori secreti dalle cellule epiteliali renali. L'isolamento e la rilevazione di questi esosomi possono fornire un utile strumento diagnostico per la diagnosi precoce delle malattie renali come la nefropatia diabetica. Ci sono diversi metodi per l'isolamento di esosomi da campioni di urina raccolti da soggetti umani. Abbiamo precedentemente confrontato sei metodi di isolamento urine exosome e studiato conseguente proteine, i livelli di mRNA e miRNA 11. Il nostro obiettivo era quello di descrivere in dettaglio il metodo di precipitazione modificato abbiamo sviluppato per l'isolamento efficace di esosomi urinarie.
Figura 1 descrive il diagramma di flusso rappresentante schematicamente varie fasi coinvolte nel isolamento di esosomi urinarie utilizzando il metodo di precipitazione modificato. Uno dei exosome duplicatopellet ottenuto è misurato per CD9 utilizzando il kit CD9 ELISA, che ci fornisce la relativa quantificazione di particelle exosome. L'altra pellet trasformati utilizzando mini kit Qiagen DNA / RNA / proteine rendimenti DNA, RNA e proteine, quantificati utilizzando Nanodrop spettrofotometro misurando l'assorbanza a 260 e 280 nm.
Figura 2 è la riproduzione modificata dei risultati sulle analisi SDS-PAGE e rilevazione biomarker utilizzando l'analisi western blot (adattato dal riferimento 11). In corsie con greggio urina e prima pellet urinaria, una banda proteica corrispondente a 90 a 100 kDa è stata osservata indicando la presenza e la rimozione di proteine THP, rispettivamente. Mentre in corsie con surnatante finale e exosome pellet, la band proteina corrispondente al THP non è stato osservato, che indica la rimozione delle THP nei passi precedenti, therEby aumento della quantità di exosome pellet. Per accedere alla purezza e la sensibilità dei pellets exosome, rilevamento macchia occidentale di biomarcatori quali Alix e TSG101 è stato impiegato. Abbiamo rilevato Alix e TSG101 anche quando basse quantità di campione sono stati utilizzati indicando pellet exosome significativamente puro per analisi biomarker e la mancanza di proteine solubili abbondanti compreso THP. Analisi densitometrica dei western blot è stato fatto per quantificare e misurare il livello di rilevamento (dati non mostrati).
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Discussion
La maggior parte dei metodi che comportano la precipitazione di esosomi da urine non affrontano la rimozione della rete polimerica formata da proteina di Tamm-Horsfall (THP). Questa proteina è presente in grandi quantità nelle urine, dove intrappola putativamente esosomi durante iniziale centrifugazione a bassa velocità. Nel nostro metodo modificato abbiamo ridotto THP con DTT prima precipitazione exosome. Come mostrato in figura 2, una maggiore quantità di THP è stata osservata nelle urine non trasformati e pellet, senza THP nel supernatante finale e exosome pellet, indicando la rimozione della proteina. La quantificazione di proteine nel pellet indicato sei volte maggiore resa, e CD9 ELISA quantificazione del pellet, è stato osservato che il rendimento di exosome per ml di urina è stato cinque volte superiore rispetto al metodo di precipitazione non modificato (risultati non mostrati 11). I biomarcatori Alix 6 e TSG101 8 sono stati rilevati nel pellet exosome; abbiamo potuto rilevare solo queste proteine utilizzando concentraticampioni nel metodo di precipitazione non modificato. Abbiamo anche osservato i più alti livelli di miRNA (cioè, miR-192 e miR-1207-5p) e l'espressione di mRNA (cioè, TSG101, PDCD6IP e AQP2 12) utilizzando il metodo di precipitazione modificato 11. I vantaggi e svantaggi di questo metodo di precipitazione modificato sono riportati in Tabella 1.
| Vantaggi | Svantaggi |
| Facile semplici passi e richiede poca esperienza rispetto a effettuare | Basso purezza delle proteine ottenute da esosomi urinarie |
| Non richiede un passo ultracentrifugazione | A causa dell'assenza dei passi ultracentrifugazione, il pellet exosome urinario ottenuto non è così puro rispetto al pellet exosome ottenuti con metodi di ultracentrifugazione |
| Usi piccolo volume di Urine campioni per l'isolamento di esosomi | Per ottenere proteina pura per analisi specifiche, sarebbero necessarie fasi di purificazione di proteine come la cromatografia di affinità |
| Ottenuto buona quantità di miRNA, mRNA e di proteine da esosomi urinario rispetto ai non-modificato il metodo di precipitazione | Pochi passaggi aggiuntivi necessari con l'aggiunta di DTT per ridurre intrappolamento da proteina di Tamm-Horsfall rispetto ai non-modificato il metodo di precipitazione |
| La specificità e la sensibilità dei biomarcatori analizzati erano simili a quella ottenuta e analizzati utilizzando il metodo ultracentrifugazione | |
| Esosomi urinarie possono essere isolati dal gran numero di campioni in un momento, adatto per percorsi clinici | |
| Meno hands-on tempo rispetto ai metodi ultracentrifugazione |
Tabella 1. Vantaggi e svantaggi di precipitazioni modificatoMetodo zione per l'isolamento exosome urinaria.
Concludiamo che la nostra modifica del metodo di precipitazione è un veloce, modo semplice, efficace per isolare esosomi urinario ed è una valida alternativa al metodo ultracentrifugazione, che è ad alta intensità di manodopera e richiede attrezzature costose. Il nostro metodo non richiede passo ultracentrifugazione, è facile da eseguire, e richiede meno passaggi, pur fornendo un alto rendimento o exosomes puri per analisi molecolari successive. Mostriamo anche che i rendimenti di miRNA e mRNA utilizzando questo metodo sono alti, e quindi possono essere utilizzati direttamente nelle successive applicazioni RNA profiling a valle. Tuttavia, si nota che una limitazione di questo metodo è la qualità della proteina ottenuta, che non è così puro come quello ottenuto utilizzando i metodi gradiente di saccarosio ultracentrifugazione, e richiede ulteriori fasi di purificazione prima del loro impiego in analisi proteomica valle. Attualmente stiamo valutando l'utilità di questo method utilizzando campioni di urina prelevati da pazienti con nefropatia diabetica.
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Disclosures
Spese di pubblicazione di questo articolo sono stati pagati da SBI Biosciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning 15 ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
- Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
- Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
- Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
- Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
- Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
- Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
- Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
- Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).
