Introduction
尿中エキソソームは、miRNAの1のために濃縮されるように見える尿排水システムをライニング糸球体足細胞、尿細管細胞と細胞を含む尿空間での正常および病的条件下での全ての細胞型から派生多胞体（MVB）の100nmの小さな内部小胞である-2。多くの研究者が明確な健康な個体の尿から単離されたエキソソーム中のタンパク質だけでなく、腎臓および/ または体系的疾患3-5のものを検出した。エキソソームは、超遠心8-9、または沈殿10-11にナノ膜フィルターを組み合わせ、スクロース6-7の有無にかかわらずそのような二段階の差動超遠心分離などの異なる方法を用いて単離することができる。我々は最近、尿中エキソソームを分離し、miRNAおよびタンパク質バイオマーカー11を検出するための、簡単、迅速、スケーラブルで効果的な方法を開発した。バイオマーカーは、異なる生物学的流体の様々な検出可能であるが、ウルナインは、比較的非侵襲的な方法で大量に得ることができるため、腎臓および尿路の疾患を有する患者のために最も便利な選択である。
尿中エキソソーム6-11を単離するためのいくつかの方法があるが、最も一般的に使用される手順は、30％ショ糖クッションで差超遠心分離に依存する。この方法は効率的であり、この手順を用いて単離し、得られたエキソソームの品質が高レベルである間は、技術自体は、熟練者を必要とし、時間がかかり、いくつかの超遠心分離工程を必要である。例えば濾過、沈殿などの他の方法は、独自の沈殿試薬を使用するものを含む、エキソソームの単離のために開発されている（ すなわち 、ExoQuick-TC：システムBiosciences社;マウンテンビュー、CA）。この試薬を用いて降水量は、高速かつ比較的容易であるが、分離エキソソームの純度は超遠心メタに比べて低いOD。我々は最近、我々の研究室で開発された11 ExoQuick-TCを使用して沈殿法の修正を含む尿中エキソソームの単離のための6つのメソッドを、比較した。我々は、この修正された沈殿法は、タンパク質に、miRNA、およびmRNAのより高い量を得た手順自体は速く、超遠心分離法よりも実装が簡単であることがわかった。ここでは、段階的に私たちの修正された沈殿法の実験的なプロトコルを記述し、エキソソーム単離の他の方法と比較して、この技術の利点と欠点の議論が含まれています。修正された沈殿法は、エキソソームのタンパク質と相関し、そして尿からエキソソーム収率が低下することが知られているタム - ホースフォールタンパク質を除去することによりエキソソーム粒子の初期析出を伴う。我々は、これらの修正が尿からエキソソーム調製物の収率および純度を増加させることを見出した。
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Protocol
注：変更された沈殿法を用いて尿中エキソソームの単離に含まれるステップは、 図1に示されている最初のステップは、遠心分離によって大きな死細胞を除去し、細胞破片を含む。その後の各工程から回収した上清から得られた最終ペレットは、タンパク質、RNA、およびDNAのさらなる抽出の分離溶液に溶解させたエキソソームに対応する。
尿の1.コレクション
- 尿採取の前に、製造業者の説明書に従って、プロテアーゼ阻害剤カクテルを調製し、空の無菌容器にこのカクテルの3.125ミリリットルを加える。プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むチューブは、その後、尿収集ボランティアに配布することができる。
NOTE：プロテアーゼ阻害剤を添加する理由は、尿試料中のタンパク質分解を最小にすることである。我々は、特にからプロテアーゼ阻害剤カクテルを使用しましたがシグマ、他の市販のプロテアーゼ阻害剤を置換することができる。 - 最初のボイド尿の約10ミリリットルを収集します。ストレージまたは冷蔵せずにすぐに収集した後に尿を処理します。修正された沈殿法を用いて、二重に尿中エキソソームを分離。他の尿エキソソーム粒子の定量化のためであるが、重複の一つは、DNA、全RNAおよびタンパク質抽出のためにある。
注：24時間の尿サンプルを4℃で保存することによってエキソソームの単離のために収集することができる。
細胞の破片とタム·ホースフォールタンパク質（THP）の2の除去
- 15ミリリットル遠心管に尿サンプルを転送します。遠心分離機37℃で10分間17000×gで尿10mlの細胞および細胞破片（ 図1）を除去する。
- ピペットを使用して、さらなる処理のために上清を新しいチューブに移す。分離溶液500μlでペレットを再懸濁（250mMのスクロース、10mMの害しよ最終濃度200 mg / ml）で37℃で：DL-ジチオスレイトール（DTTと10分間インキュベートし、続いてエタノールアミン、pHは7.6）。
NOTE：DTT歩留まりの低下につながる、エキソソームを捕捉THPを分解するために添加される。上澄みの転送中に邪魔されずにペレットを残すように注意してください、そして上清をペレットの明確であることを確認する。 - 渦ペレットサンプル毎に2分間、ペレットが完全に溶解するまで。その後、溶解したペレットに分離溶液500μlを追加します。
- 直ちに、ペレットに分離液を加えた後、37℃で10分間17000×gで遠心する。ピペットで上清およびそれ以前回収した上清と組み合わせること。
- SDS-PAGE分析のために分離液50μl中にペレットを再懸濁する。
注：PBSまたはTBS、ペレットを再懸濁し、代わり分離溶液を使用することができる。
エキソソームペレットの3.絶縁
- 収集されたsupernの11ミリリットルにatant、ExoQuick-TC試薬の3.3ミリリットルを追加し、少なくとも12時間、4℃でインキュベートする。
NOTE：ExoQuick-TC試薬に対する上清の体積の比は、エキソソーム収量を増加または減少させるように調整することができる。私たちは、追加された試薬の少ないボリュームがエキソソームの小さい収量を生産することを観察した。 - インキュベーション後、25℃で30分間遠心分離を10,000×gでのサンプル/ ExoQuick-TCミックスを。
- SDS-PAGE分析のために上清を新しいチューブに移す。
- エキソソームペレットを、DNA、RNAおよびタンパク質抽出及びCD9 ELISA 11を用いて、エキソソーム粒子の定量化のために-80℃で保存することができる。
NOTE：エキソソームペレットが限ら凍結融解による1年間-80℃で保存することができる。
エキソソームペレットの4バイオマーカーの検出と解析
- 下流の分析のために、DNA / RNA /タンパク質の単離キットおよびRNA単離キを使用してエキソソームペレットからDNA、RNAおよびタンパク質を抽出製造業者の説明書に従ってトン。試料を2μlの260での吸光度と280nmのを測定することにより、ナノドロップ分光光度計を用いて濃度を決定する。
- のTaqManマイクロRNAアッセイを用いて定量的リアルタイムRT-PCR（定量PCR）を実行するか、miRNA特異的プライマー（我々の場合、我々は、ヒトのmiR-192及びmiR-1207-5p特異的アッセイを使用）。
- SDS-PAGE分析のために、一次元電気泳動により4〜12％Bis-Trisゲルおよび別個のタンパク質サンプルを使用する。製造業者の説明書に従って銀染色キットを用いてゲルを可視化する。
- 製造業者の指示に従ってPVDF膜を用いたウエスタンブロット分析を行う。ウェスタンブロット検出で101のタンパク質またはTSG101腫瘍感受性遺伝子とタンパク質XまたはALIXとマウスモノクローナル抗体相互作用、アポトーシスに連結された遺伝子-2に対するウサギポリクローナル抗体を使用する。オープンアクセスNIH ImageJソフトウェア（http://rsbweb.nih.gov/ij/）によるバンドの密度を定量化するか、同様のプログラム。
- 製造業者の指示に従ってCD9 ELISAキットを用いて得られた尿中エキソソーム粒子の数を定量化する。
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Representative Results
尿中エキソソームは、腎上皮細胞から分泌されるタンパク質に、miRNAとmRNAのバイオマーカーを運ぶ。これらのエキソソームの単離および検出は、糖尿病性腎症などの腎疾患の早期検出に有用な診断ツールを提供してもよい。ヒト被験者から採取した尿サンプルからエキソソームを単離するためのいくつかの方法がある。我々は以前、尿エキソソーム分離の6つのメソッドを比較し、タンパク質、mRNA、およびmiRNAレベル11を結果として調査した。ここに私たちの目的は、詳細に我々は尿中エキソソームの効率的な分離のために開発した修正された沈殿法を記述することでした。
図1は、修正された沈殿法を用いて、尿中エキソソームの単離に関与する様々なステップの概略的な代表的なフローチャートを記述する。重複エキソソームのOne得られたペレットは、エキソソーム粒子の相対的な定量化を提供してくれCD9 ELISAキットを用いて、CD9を測定する。 260および280nmでの吸光度を測定することにより、ナノドロップ分光光度計を用いて定量したキアゲンDNA / RNA /タンパク質ミニキット収量DNA、RNAおよびタンパク質を用いて処理し、他のペレット。
図2は、（参照11から適応）ウェスタンブロット分析を用いてSDS-PAGE分析およびバイオマーカーの検出での結果の変更された再生である。未処理の尿及び第尿ペレットを示す90kDaの100に観察されたに対応するタンパク質バンドのレーンでそれぞれTHPタンパク質の存在と除去。最後の上清およびエキソソームペレットとレーンに、THPに対応するタンパク質バンドが観察されなかったが、前のステップでTHPを除去することを示す、THERイービエキソソームペレットの収率を増加させる。エキソソームペレットの純度および感度にアクセスするには、そのようなアリックスとTSG101のようなバイオマーカーのウェスタンブロット検出を使用した。私たちは、サンプルの低量はバイオマーカー解析およびTHPを含む豊富な可溶性タンパク質の不在のために大幅に純粋なエキソソームペレットを示す使用された場合でも、アリックスとTSG101を検出した。ウェスタンブロットのデンシトメトリー分析を定量化および検出のレベルを測定するために行った（データは示さず）。
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Discussion
尿からエキソソームの沈殿を含むほとんどのメソッドは、タム - ホースフォールタンパク質（THP）によって形成されたポリマーネットワークの除去に取り組んでいない。このタンパク質は、推定上のトラップが初期低速遠心分離中エキソソーム尿中に多量に存在する。私たちの修正された方法では、エキソソーム降水前にDTTを使用してTHPを減少させた。 図2に示すように、THPのより高い量は、タンパク質の除去を示し、最後の上清およびエキソソームペレットでないTHPで、未処理の尿及びペレットで観察された。ペレット中のタンパク質の定量は、6倍高い収率を示し、そしてペレットのCD9 ELISA定量には、尿1mlあたりエキソソームの収率が（結果は11には示されていない）未修飾の沈殿法の5倍高かった観察された。バイオマーカーアリックス6とTSG101 8はエキソソームペレットで検出された。我々は唯一の集中を使ってこれらのタンパク質を検出することができた未修飾の沈殿法のサンプル。我々はまた、修正された沈殿法11を使用したmiRNA（ すなわち 、のmiR-192及びmiR-1207-5p）とmRNA発現（ すなわち 、TSG101、PDCD6IPとAQP2 12）の最高レベルを観察した。この修正された沈殿法の利点と欠点を表1に示す。
| メリット | デメリット |
| 簡単に簡単な手順と実行するための相対的な少し専門知識が必要 | 尿中エキソソームから得られたタンパク質の低純度 |
| 超遠心分離工程を必要としない | による超遠心分離工程が存在しないため、得られた尿エキソソームペレットを超遠心分離法から得られたエキソソームペレットと比較して、純粋でない |
| Urinの小さなボリュームを使用するエキソソームの単離のための電子サンプル | 特定の分析のための純粋なタンパク質を得るためには、アフィニティークロマトグラフィーなどのタンパク質精製工程が必要とされる |
| 非改変沈殿法と比較して尿中エキソソームからmiRNAは、mRNAおよび蛋白質の良い量を得 | 非改変沈殿法に比べタム - ホースフォールタンパク質によって捕捉を減らすためにDTTを添加して必要とされるいくつかの追加のステップ |
| 分析されたバイオマーカーの特異性および感度が得られるものと類似しており、超遠心分離法を用いて分析 | |
| 尿中エキソソームは臨床試験に適した、一度に多数の試料から単離することができる | |
| 少ないハンズオンタイム超遠心分離法に比べ |
修正されたprecipitaの表1.長所と短所尿中エキソソームを単離するためのション方法。
我々は、沈殿法の我々の修正尿エキソソームを単離するための単純、迅速かつ効率的な方法であり、労働集約的であり、高価な装置を必要とする超遠心法、適切な代替物であると結論付けている。本手法では、全く超遠心分離工程を必要としない、実施が容易であり、さらに、その後の分子解析のための高収量や純エキソソームを提供しながら、より少ない手順が必要です。また、この方法を用いてmiRNAおよびmRNAの収率が高いため、そのまま次の下流のRNAプロファイリングの用途に使用できることを示している。しかし、我々はこの方法の制限は、ショ糖勾配超遠心分離法を用いて得られる限り純粋でない得られたタンパク質の品質は、前下流プロテオーム解析において利用する追加の精製工程を必要とすることに注意。我々は現在、このメタの有用性を評価されている糖尿病性腎症の患者から得られた尿試料を用いて作ろ。
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Disclosures
この記事の発行手数料はSBIバイオサイエンス社支払われた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning 15 ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
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