Introduction
소변 엑소 좀은 miRNA가 1 농축 한 것으로 나타났습니다 소변 배수 시스템을 긋고 사구체 족 세포, 신장 세뇨관 세포와 세포를 포함 비뇨기 공간에서 정상 및 병적 인 상태에서 모든 종류의 세포에서 파생 된 multivesicular 기관 (MVB)의 100 나노 미터의 작은 내부 소포 있습니다 -2. 많은 연구자들은 건강한 사람의 소변뿐만 아니라 신장 및 / 또는 체계적인 질병에 3-5 가진 사람에서 분리 된 엑소 좀에 별개의 단백질을 발견했다. 엑소 좀은 8-9 초 원심 분리 또는 침전에 10-11 nanomembrane 필터를 조합, 예컨대 수크로오스 또는 6-7없이 두 단계 차동 초 원심 분리 등의 다양한 방법을 이용하여 분리 할 수있다. 우리는 최근에 소변 엑소 좀을 격리하며 miRNA의 단백질 바이오 마커 (11)를 검출하는, 간단하고, 빠르고, 확장 가능하고 효과적인 방법을 개발했다. 바이오 마커는 다양한 생물학적 다양한 유체에서 발견 될 수 있지만, UR오프라인은 비교적 비 침습적 방식으로 다량으로 얻을 수 있기 때문에 신장 및 요로 질환 환자를위한 가장 편리한 선택이다.
소변 엑소 좀을 6-11을 분리하는 방법은 여러 가지가 있지만, 가장 일반적으로 사용되는 절차는 30 % 자당 쿠션 차동 초 원심 분리에 따라 달라집니다. 이 방법은 효율적이며,이 절차와 절연 얻어진 엑소 좀의 품질이 높은 반면, 기술 자체는 숙련 된 사람이 필요하고 시간이 많이 소요되는 여러 단계를 초 원심 분리에 필요하다. 여과 및 침전 등의 다른 방법은, 독점적 인 침전 시약을 사용하는 것을 포함하여, 엑소 좀의 분리를 위해 개발 된 (즉, ExoQuick-TC : 시스템 생명 과학, 마운틴 뷰, CA). 이 시약을 사용하여 침전 빠르고 비교적 쉽지만, 절연 엑소 좀의 순도는 초 원심 메트 비해 낮다OD. 최근 우리는 우리 실험실에서 개발 ExoQuick 11-TC를 사용하여 침전 법의 변형을 포함 비뇨기 엑소 좀의 분리를위한 여섯 방법을 비교 하였다. 우리는이 수정 침전 법은 단백질, miRNA의, mRNA를 자체 빠르고 초 원심보다 쉽게 구현했다 절차의 높은 수량을 산출 한 것으로 나타났습니다. 여기, 우리는 단계적으로 수정 된 침전 법의 실험 프로토콜을 설명하고 엑소 분리하는 다른 방법에 비해이 기술의 장점과 단점에 대한 논의를 포함한다. 변성 침전 법은 exosomal 단백질과 상관하고, 소변 엑소 수율을 감소하는 것으로 알려져 탬-Horsfall 단백질 제거하여 엑소 입자의 초기 침전을 포함한다. 우리는 이러한 수정은 소변에서 exosomal 준비의 수율과 순도를 증가 것을 발견했다.
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Protocol
주 :. 변성 침전 법을 이용하여 엑소 좀 뇨의 분리에 관련된 단계는도 1에 도시되는 초기 단계 원심 분리에 의해 큰 사균의 제거 및 세포 파편을 포함한다. 각각의 후속 단계에서 수집 된 상층 액에서 얻은 최종 펠렛은 단백질, RNA 및 DNA의 분리를위한 추가의 추출 용액에 용해되는 엑소 좀에 대응한다.
소변 1. 컬렉션
- 소변 수집하기 전에, 제조업체의 지시에 따라 단백질 분해 효소 억제제 칵테일을 준비하고 빈 멸균 용기에이 칵테일의 3.125를 가하여. 프로테아제 저해제 칵테일을 포함하는 튜브이어서 소변 수집 지원자에게 분배 될 수있다.
주 : 프로테아제 억제제를 첨가하는 이유는 소변에서 단백질 분해를 최소화하는 것이다. 우리는 특별히에서 프로테아제 억제제 칵테일을 사용하지만시그마, 다른 시판 프로테아제 억제제가 치환 될 수있다. - 처음 무효 소변의 약 10 ml의를 수집합니다. 즉시 수집 후 저장 또는 냉동하지 않고 소변을 처리합니다. 수정 된 침전 법을 사용하여 중복에 소변 엑소 좀을 분리; 다른 비뇨기 엑소 입자의 정량화 동안 중복 중 하나는, DNA, RNA 및 총 단백질 추출을위한 것이다.
참고 : 24 시간 소변 시료를 4 ℃에서 저장하여 엑소의 격리를 위해 수집 할 수 있습니다.
세포 파편과 탬-Horsfall 단백질 2. 제거 (THP)
- 15 ml의 원심 분리기 튜브에 소변 샘플을 전송합니다. 원심 분리기 37 ° C에서 10 분 동안 17,000 XG에 소변 10ml의 세포 및 세포 찌꺼기 (도 1)를 제거한다.
- 피펫을 사용하여, 추가 처리를 위해 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 차단 용액 500 μL의 펠렛을 재현 탁 (250 mM의 크로즈, 10 밀리미터 하시 느니라최종 농도 200 ㎎ / ㎖)에서 37 ° C : DL-디티 오 트레이 톨 (DTT 10 분 인큐베이션 anolamine, pH를 7.6).
참고 : DTT는 수확량 감소로 이어지는, 엑소 좀 트랩 THP를 저하 추가됩니다. 뜨는 전송하는 동안 방해받지 펠렛을 떠날주의, 상층 액은 펠릿이 없는지 확인합니다. - 소용돌이 펠렛 시료 펠릿까지 매 2 분을 완전히 용해시킨다. 그런 다음 용해 펠릿에 격리 솔루션의 500 μl를 추가합니다.
- 즉시 37 ℃에서 10 분 동안 17,000 XG에 분리 펠릿 용액, 원심 첨가 한 후. 피펫은 뜨는 및 이전 버전 수집 된 상층 액과 결합.
- SDS-PAGE 분석을위한 격리 솔루션의 50 μL에 펠렛을 재현 탁.
주 : TBS 또는 PBS 펠릿을 재현 탁 대신 분리가 사용될 수도있다.
엑소 펠렛 3. 분리
- 수집 된 supern 11 히드로atant, ExoQuick-TC 시약 3.3 ml에 추가하고 적어도 12 시간 동안 4 ° C에서 배양한다.
주 : TC-ExoQuick 시약을 상층 액 부피의 비는 증가 또는 exosomal 수율을 감소하도록 조정될 수있다. 우리는 추가 시약의 낮은 볼륨 엑소 좀 작은 수율을 생산하는 것을 관찰했다. - 부화 후, 원심 분리기 25 ° C에서 30 분 동안 10,000 XG에 샘플 / ExoQuick-TC 믹스.
- SDS-PAGE 분석을위한 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
- 엑소 좀 펠렛은 DNA, RNA 및 단백질 추출 및 CD9 11 ELISA를 이용한 엑소 입자의 정량화 -80 ° C에서 저장 될 수있다.
참고 : 엑소 펠릿이 제한 동결 융해와 1 년 동안 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.
4. 바이오 마커 검출 및 엑소 펠렛의 분석
- 하류 분석에서, DNA / RNA / 단백질 단리 키트 및 RNA 분리 KI를 사용하여 엑소 좀 펠렛으로부터 DNA, RNA 및 단백질을 추출제조업체의 지침에 따라 t. 샘플 2 μL의 260 nm와 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 Nanodrop 분광 광도계를 이용하여 농도를 결정한다.
- 정량 실시간 RT-PCR (qPCR에)의 TaqMan 마이크로 RNA 분석을 사용하여이 또는 miRNA에 특이 적 프라이머 (우리의 경우, 우리는 인간은 miR-192과의 miR-1207-5p 별 분석을 사용) 수행합니다.
- SDS-PAGE 분석을 위해 일차원 전기 영동을 4 내지 12 % 비스 -Tris 겔 분리 단백질 시료를 사용한다. 제조업체의 지시에 따라 실버 염색 키트를 사용하여 젤을 가시화.
- 제조업체의 지시 사항에 따라 PVDF 멤브레인을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다. 웨스턴 블롯 검출 종양 감수성 유전자 (101) 단백질 또는 TSG101에 세포 사멸 연결된 유전자-2 상호 작용하는 단백질 X 또는 ALIX와 마우스 단일 클론 항체에 토끼 폴리 클로 날 항체를 사용합니다. 오픈 액세스 NIH ImageJ에 소프트웨어에 의해 밴드의 밀도를 정량화 (http://rsbweb.nih.gov/ij/) 또는유사한 프로그램.
- 제조업체의 지시에 따라, CD9 ELISA 키트를 사용하여 얻어진 뇨 엑소 입자의 수를 정량화.
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Representative Results
소변 엑소 좀은 신장 상피 세포에서 분비되는 단백질의 miRNA와 mRNA의 바이오 마커를 수행한다. 이러한 엑소 좀의 분리 및 검출은 당뇨병 성 신증으로 신장 질환의 조기 발견을위한 유용한 진단 도구를 제공 할 수있다. 인간을 대상으로 수집 된 소변 샘플에서 엑소 좀의 분리를위한 몇 가지 방법이 있습니다. 우리는 이전에 소변 엑소 분리의 여섯 방법을 비교하여 단백질의 mRNA와 miRNA의 수준 (11) 결과 조사 하였다. 여기에 우리의 목표는 구체적으로 우리가 소변 엑소 좀을 효율적으로 분리를 위해 개발 한 수정 침전 법을 설명했다.
도 1은 변형 된 침전 법을 이용하여 엑소 좀 뇨의 분리에 관련된 여러 단계의 개략적 인 대표 흐름도를 설명한다. 하나의 중복 엑소얻어진 엑소 좀 펠릿 입자의 상대적인 정량 우리에게 제공 CD9 ELISA 키트를 사용하여 CD9을 측정한다. 260 및 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 정량 하였다 퀴아 DNA / RNA / 미니 키트 단백질 수율 DNA, RNA 및 단백질을 사용하여 처리 된 펠릿을 다른.
도 2는 (기준 (11)으로부터 적응) 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 SDS-PAGE 분석 및 바이오 마커의 검출에 결과 개질 재생이다. 미처리 소변과 제 비뇨기 펠릿 나타내는 90 kDa의 100 관찰에 대응하는 단백질 밴드 레인 각각 THP 단백질의 존재 및 제거. 최종 상등액과 펠렛으로 엑소 차선에서 THP에 대응하는 단백질 밴드가 관찰되지 않은 반면, 이전 단계에서의 THP 제거를 나타내는, 거기는EBY 엑소 좀 펠렛의 수율을 증가시킨다. 엑소 펠렛의 순도 및 감도에 액세스하려면, 같은 알릭스와 TSG101 같은 바이오 마커의 웨스턴 블롯 검출을 사용 하였다. 우리는 샘플의 낮은 수량 바이오 마커 분석 및 THP를 포함하여 풍부한 수용성 단백질의 부재에 대한 상당히 순수한 엑소 펠렛을 나타내는 사용 된 경우에도 알릭스와 TSG101을 발견했습니다. 웨스턴 블롯의 농도계 분석 정량 및 검출의 수준을 측정하기 위해 수행되었다 (데이타 미기재).
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Discussion
소변에서 엑소 좀 침전을 포함하는 대부분의 방법은 탬-Horsfall 단백질 (THP)에 의해 형성되는 고분자 네트워크의 제거를 해결하지 않습니다. 이 단백질은 추정되는 트랩 초기 저속 원심 엑소 좀 동안 소변에 다량으로 존재한다. 수정 된 방법에서 우리는 엑소 침전하기 전에 DTT를 사용하여 THP를 감소시켰다. 도 2에 도시 된 바와 같이, THP 더 많은 양이 단백질의 제거를 나타내는, 최종 상등액과 펠렛 엑소 아니 THP로, 미처리 펠릿 뇨에서 관찰되었다. 펠릿의 단백질의 정량은 여섯 배 높은 수율을 표시하고, 펠릿 CD9 ELISA 정량에, 그것은 (결과는도 11에 도시 생략) 소변 1 ㎖ 당 엑소의 수율 변성 침전 법 5 배 높았다 관찰되었다. 바이오 마커 알릭스 6 TSG101 8 엑소 펠릿 검출되었다; 우리는이 단백질이 집중 사용 하 감지 할 수변성 침전 법의 샘플. 우리는 또한 수정 된 침전 법 (11)를 사용하여 miRNA의 (즉,은 miR-192은 miR-1207-5p)와 mRNA 발현 (즉, TSG101, PDCD6IP 및 AQP2 12)의 가장 높은 수준을 관찰했다. 장점 및 변형이 침전 법의 단점은 표 1에 나타낸다.
| 장점 | 단점 |
| 쉽고 간단한 단계 및 수행하기 위해 상대적으로 약간의 전문 지식을 필요로 | 비뇨 엑소 좀에 의한 단백질의 저 순도 |
| 초 원심 분리 단계가 필요하지 않습니다 | 초 원심 분리 방법에서 얻은 엑소 좀 펠릿에 비해 인해 초 원심 분리 단계의 부재로 얻어 비뇨 엑소 펠렛 순수한 아니다 |
| Urin의 작은 볼륨을 사용합니다엑소 좀의 분리를위한 전자 샘플 | 특정 분석 순수한 단백질을 얻기에는, 친 화성 크로마토 그래피 등의 단백질 정제 단계는 필요한 것 |
| 비 변성 침전 법에 비해 소변에서 엑소 좀 좋은 miRNA의, 양의 mRNA 및 단백질을 수득 | DTT의 첨가에 필요한 몇 가지 추가 단계는 비 변성 침전 법에 비해 탬-Horsfall 단백질에 의해 포획을 감소 |
| 특이 바이오 마커 분석의 감도는 수득 된 것과 유사 하였다 및 초 원심 분리 방법을 이용하여 분석 | |
| 비뇨 엑소 좀은 임상 트레일 적합한, 한번에 다수의 샘플로부터 분리 할 수있다 | |
| 적은 손에 시간 초 원심 분리 방법에 비해 |
표 1. 장점 및 수정 강수의 단점소변 엑소 격리를위한 기 방법.
우리는 침전 법의 우리의 수정이 소변 엑소 좀을 분리하는 간단하고 빠르고 효율적인 방법이며 노동 집약적이며, 고가의 장비를 필요로 초 원심 분리 방법에 대한 적절한 대안이라고 결론 지었다. 아직 후속 분자 분석에 대한 높은 수율 또는 순수 엑소 좀을 제공하면서 우리의 방법은, 어떤 초 원심 분리 단계를 필요로하지 않는다 편리하게 수행 할 수 있으며, 적은 단계가 필요합니다. 또한이 방법을 이용하여 miRNA의 mRNA와의 수율이 높고, 따라서 직접 후속 하류 RNA 프로파일 애플리케이션에 사용될 수 있음을 보여준다. 그러나이 방법의 제한은 자당 구배 초 원심 분리 방법을 이용하여 얻어진 것과 같은 순수하지 얻어진 단백질의 품질이며, 하류 프로테옴 분석에서 앞서 이용 추가적인 정제 단계를 필요로주의. 우리는 현재이 메타의 유용성을 평가하고 있습니다OD 당뇨병 성 신증 환자에서 얻은 소변 샘플을 사용.
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Disclosures
이 기사에 대한 출판 비용은 SBI 생명 과학에 의해 지불했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning 15 ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
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