Introduction
Exosomes urinário são pequenas vesículas internas de 100 nm de corpos multivesiculares (MVB) derivados de todos os tipos de células em condições normais e patológicas no espaço urinário incluindo podocytes glomerular, células tubulares renais e células que revestem os sistemas de drenagem urinária que parecem ser enriquecido para miRNAs 1 -2. Muitos investigadores detectaram proteínas distintas em exossomas isoladas a partir da urina de indivíduos saudáveis, bem como aqueles com insuficiência renal e / ou doenças sistemáticas 3-5. Os exossomas podem ser isoladas utilizando métodos diferentes, tais como de dois passos de ultracentrifugação diferencial com ou sem sacarose 6-7, combinando filtro nanomembrane com ultracentrifugação 8-9, 10-11 ou precipitação. Recentemente, desenvolveu um método simples, rápido, escalável e eficaz para isolar exossomos urinárias e detectar miRNA e biomarcadores de proteínas 11. Embora biomarcadores pode ser detectada numa variedade de diferentes fluidos biológicos, urina é a escolha mais conveniente para os doentes com doenças do rim e do tracto urinário, porque pode ser obtido em grandes quantidades de forma relativamente não invasivo.
Embora existam vários métodos para isolar exossomas urinário 6-11, o processo mais vulgarmente usado depende ultracentrifugação diferencial com uma almofada de sacarose a 30%. Enquanto este método é eficiente e a qualidade das resultantes isolados exossomas com este procedimento é alta, a técnica em si requer pessoal especializado e é, que exige vários passos de ultracentrifugação demorado. Outros métodos, tais como filtração e precipitação, têm sido desenvolvidos para o isolamento de exossomas, incluindo um que utiliza um reagente de precipitação proprietário (ou seja, ExoQuick-TC: Biosciences sistema; Mountain View, CA). Embora a precipitação utilizando este reagente é rápido e relativamente fácil, a pureza dos isolados exossomas é baixa em comparação com o met ultracentrifugaçãood. Recentemente, em comparação seis métodos para o isolamento de exossomas urinário, incluindo uma modificação do método de precipitação utilizando ExoQuick-TC que nós desenvolvemos no nosso laboratório 11. Descobrimos que este método de precipitação modificada produziu maiores quantidades de proteína, miRNA e mRNAs e o procedimento em si foi mais rápido e mais fácil de implementar do que ultracentrifugação. Aqui, nós descrevemos o protocolo experimental do nosso método de precipitação modificado de forma gradual, e incluem uma discussão sobre as vantagens e desvantagens da técnica em comparação com outros métodos de isolamento de exossomas. O método envolve uma precipitação modificado precipitação inicial de partículas de exossoma, seguido de remoção de proteína Tamm-Horsfall, que está correlacionada com proteínas exosomal, e conhecido por reduzir a produção de urina a partir de exossoma. Descobrimos que essas modificações aumentaram o rendimento e a pureza da preparação exosomal a partir de urina.
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Protocol
NOTA:. As etapas envolvidas no isolamento dos exossomas urinário, utilizando o método de precipitação modificados são ilustrados na Figura 1 Os passos iniciais envolvem a remoção de grandes células mortas e detritos celulares por centrifugação. O sedimento final obtido a partir do sobrenadante recolhido a partir de cada etapa subsequente corresponde à exosoma, que é dissolvido em solução de isolamento por extracção adicional da proteína, ARN, e ADN.
1. Coleta de Urina
- Antes da recolha de urina, cocktail inibidor de protease de preparar de acordo com as instruções do fabricante e adicionar 3,125 ml de este cocktail para um receptáculo vazio e estéril. O tubo contendo a mistura de inibidores de protease pode então ser distribuída aos voluntários para a recolha de urina.
Observação: A razão para a adição de inibidor de protease é o de minimizar a degradação das proteínas na amostra de urina. Apesar de termos usado especificamente um cocktail inibidor de protease deSigma, outros inibidores de protease disponíveis comercialmente pode ser substituído. - Recolher cerca de 10 ml de urina primeiro-void. Processar a urina imediatamente após a coleta, sem armazenamento ou refrigeração. Isolar os exossomos urinário em duplicata, utilizando o método de precipitação modificado; um de ambos os resultados para o DNA, o RNA total e a extracção de proteínas, enquanto que o outro é para a quantificação de partículas de exossoma urinário.
NOTA: Uma amostra de urina de 24 horas pode ser recolhida para o isolamento exosome armazenando a 4 ° C.
2. remoção de restos celulares e Tamm-Horsfall Protein (THP)
- Transferir as amostras de urina para tubos de centrífuga de 15 ml. Centrifugar 10 ml de urina em 17.000 xg durante 10 min a 37 ° C para eliminar as células e os resíduos celulares (Figura 1).
- Usando uma pipeta, transferir o sobrenadante para um tubo fresco para processamento adicional. Ressuspender o sedimento em 500 ul de solução de isolamento (250 mM de sacarose, 10 mM que provaanolamine, pH 7,6) seguido por 10 min de incubação com DL-ditiotreitol (DTT: concentração final de 200 mg / ml) a 37 ° C.
NOTA: DTT é adicionado para degradar THP, que aprisiona exossomos, levando à diminuição da produtividade. Tome o cuidado de deixar o pellet imperturbável durante a transferência do sobrenadante, e confirmar que o sobrenadante é claro de pellet. - De amostras de sedimentos de vórtice cada 2 min, até o pelete estar completamente dissolvido. Em seguida adicionar 500 ul de solução de isolamento para o sedimento dissolvido.
- Imediatamente após a adição da solução de isolamento para o sedimento, centrifugar a 17.000 xg durante 10 min a 37 ° C. Pipeta-se o sobrenadante e combinam-se com o sobrenadante recolhido anteriormente.
- Ressuspender o sedimento em 50 ul de solução de isolamento por análise de SDS-PAGE.
NOTA: PBS ou TBS pode ser usado em vez de solução de isolamento para ressuspender o sedimento.
3. Isolamento de exossomo Pellet
- Para 11 ml do supern recolhidosatant, adicionar 3,3 ml de reagente ExoQuick-TC e incubar a 4 ° C durante pelo menos 12 horas.
NOTA: O índice de volume de sobrenadante de reagente ExoQuick-TC pode ser ajustada para aumentar ou diminuir o rendimento exosomal. Observou-se que volumes menores de reagente adicionado produzir rendimentos menores de exossomos. - Após a incubação, centrifugar a mistura amostra / ExoQuick-TC a 10.000 xg durante 30 min a 25 ° C.
- Transferir o sobrenadante para um tubo fresco para a análise de SDS-PAGE.
- O sedimento de exossoma pode ser armazenado a -80 ° C para o ADN, ARN e proteína de extracção e quantificação de partículas de exossoma utilizando ELISA CD9 11.
NOTA: O sedimento exossoma pode ser armazenado a -80 ° C durante 1 ano com a congelação e descongelação limitada.
4. detecção e análise de exossomo Pellet Biomarker
- Para as análises a jusante, extrair DNA, RNA e proteínas a partir do sedimento exossoma utilizando o / ARN / ADN kit de isolamento de proteína e um ki de isolamento de ARNt de acordo com as instruções do fabricante. Determinar as concentrações por espectrofotometria Nanodrop medindo a absorvância a 260 nm e 280 nm com 2 ul de amostra.
- Realizar quantitativa em tempo real de RT-PCR (qPCR) utilizando ensaios microRNA TaqMan (em nosso caso, foi utilizada humanos miR-192- e específicos miR-1207-5p-ensaios) ou iniciadores específicos de miARN.
- Para a análise de SDS-PAGE, 4-12% usar Bis-Tris gel e amostras de proteínas separadas por electroforese unidimensional. Visualizar géis utilizando o kit de coloração com prata de acordo com as instruções do fabricante.
- Realizar a análise de Western blot utilizando membranas de PVDF de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Use anticorpo policlonal de coelho para ligados a apoptose gene-2 interagindo proteína X ou ALIX e anticorpo monoclonal mouse para gene de susceptibilidade tumor 101 proteína ou TSG101 na detecção de western blot. Quantificar a densidade das bandas de acesso aberto software NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ouum programa semelhante.
- Quantificar o número de partículas de exossoma urinários obtidos utilizando um kit de ELISA CD9, conforme as instruções do fabricante.
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Representative Results
Exosomes urinário transportar proteínas, miRNA e mRNA biomarcadores secretadas a partir de células epiteliais renais. O isolamento e detecção destes exossomas podem fornecer uma ferramenta de diagnóstico útil para a detecção precoce de doenças renais tais como nefropatia diabética. Existem vários métodos para o isolamento de exossomas a partir de amostras de urina colhidas de indivíduos humanos. Anteriormente, em comparação seis métodos de isolamento exosome urina e investigados resultante de proteína, níveis de mRNA e miRNA 11. Nosso objetivo foi descrever em detalhes o método de precipitação modificado temos desenvolvido para o isolamento eficiente de exossomos urinário.
A Figura 1 descreve o diagrama de fluxo esquemático representativo de vários passos envolvidos no isolamento de exossomas urinário, utilizando o método de precipitação modificado Um dos exossomas duplicado.pelete obtida é medida para CD9 utilizando o kit de ELISA CD9, o que nos dá a quantificação relativa de partículas de exossoma. A outra pelota processados utilizando Qiagen ADN / ARN / proteína mini-kit de rendimentos de DNA, RNA e proteínas, que foram quantificadas utilizando Nanodrop espectrofotómetro por medição da absorvância a 260 e 280 nm.
A Figura 2 é a reprodução modificada dos resultados na análise de SDS-PAGE e detecção biomarcador utilizando análise de Western blot (adaptado da referência 11). Nas pistas com urina e não transformados primeiro sedimento urinário, uma banda de proteína que corresponde a 90 a 100 kDa foi observada, indicando a presença de proteína e remoção de THP, respectivamente. Enquanto nas pistas com sobrenadante final e exossoma sedimento, a banda correspondente à proteína de THP não foi observada, indicando a remoção de THP nos passos anteriores, terapeby aumentar o rendimento de exossoma sedimento. Para aceder a pureza e sensibilidade dos peletes de exossoma, detecção por transferência Western de biomarcadores, tais como Alix e TSG101 foi empregue. Detectamos Alix e TSG101 mesmo quando pequenas quantidades de amostra foram utilizadas, o pellet exosome significativamente puro para análise de biomarcadores e ausência de proteínas solúveis abundantes incluindo THP. A análise densitométrica dos western blots foi realizada para quantificar e medir o nível de detecção (dados não mostrados).
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Discussion
A maioria dos métodos que envolvem a precipitação de exossomas a partir de urina não abordam a remoção da rede polimérica formada pela proteína Tamm-Horsfall (THP). Esta proteína está presente em grandes quantidades na urina, onde entra em armadilhas putativamente exossomas inicial durante a centrifugação a baixa velocidade. Em nosso método modificado reduzimos THP usando DTT antes da precipitação exosome. Como mostrado na Figura 2, uma quantidade mais elevada de THP foi observado na urina e não transformados pelota, sem THP no sobrenadante final e exossoma sedimento, indicando a remoção da proteína. A quantificação de proteína na pelete indicado seis vezes mais elevado rendimento, e em CD9 ELISA quantificação do sedimento, observou-se que o rendimento de exossoma por ml de urina foi cinco vezes mais elevados do que o método de precipitação não modificada (resultados não mostrados 11). Os biomarcadores Alix 6 e 8 TSG101 foram detectadas no sedimento exossomas; só podemos detectar essas proteínas utilizando concentradoamostras no método de precipitação não modificado. Observamos, também, os níveis mais elevados de miARN (isto é, o miR-192 e miR-1207-5p) e a expressão de ARNm (ou seja, TSG101, PDCD6IP e AQP2 12) utilizando o método de precipitação com 11 modificado. As vantagens e desvantagens deste método de precipitação modificado são mostrados na Tabela 1.
| Vantagens | Desvantagens |
| Passos fáceis simples e requer pouco conhecimento em relação ao executar | Baixa pureza das proteínas obtidas a partir de exossomas urinário |
| Não requer um passo ultracentrifugação | Devido à ausência dos passos ultracentrifugações, o sedimento urinário exossoma obtido não é tão pura como em relação ao sedimento obtido a partir de exossoma métodos ultracentrifugações |
| Usa pequeno volume de Urine amostra para isolamento de exossomos | Para obter a proteína pura para análise específica, seriam necessários passos de purificação de proteína, tais como cromatografia de afinidade |
| Obteve boa quantidade de miRNA, mRNA e proteínas de exossomos urinárias em comparação com não-modificado método de precipitação | Poucos passos extras necessários com a adição de DTT para reduzir o aprisionamento por proteína de Tamm-Horsfall em comparação com não-modificado método de precipitação |
| Especificidade e sensibilidade dos biomarcadores analisados foram semelhantes aos obtidos e analisados utilizando o método Ultracentrifugação | |
| Exossomas urinárias podem ser isolados a partir de grande número de amostras de cada vez, adequado para ensaios clínicos | |
| Menos hands-on tempo, em comparação com os métodos ultracentrifugações |
Tabela 1. Vantagens e desvantagens da precipita modificadoção método para o isolamento de exossomas urinária.
Nós concluímos que a nossa modificação do método de precipitação é uma maneira simples, rápida e eficiente para isolar exossomos urinário e é uma alternativa adequada para o método de ultracentrifugação, que é trabalhoso e requer equipamento caro. Nosso método não requer nenhum passo ultracentrifugação, é fácil de executar, e requer menos passos, enquanto continua a fornecer um alto rendimento ou exosomes puros para análises moleculares subsequentes. Também mostram que os rendimentos de miARN e ARNm utilizando este método são elevados, e, portanto, pode ser utilizada directamente em aplicações de ARN de perfil subsequentes a jusante. No entanto, nota-se que uma limitação deste método é a qualidade da proteína obtida, a qual não é tão pura como a obtida usando os métodos de ultracentrifugação de gradiente de sacarose, e requer passos adicionais de purificação antes de utilização em análises de proteómica jusante. Estamos neste momento a avaliar a utilidade deste method utilizando amostras de urina obtidas de pacientes com nefropatia diabética.
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Disclosures
Taxas de publicação deste artigo foram pagos pela SBI Biosciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning 15 ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
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