Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

En modifierad Nederbörd Metod för att isolera Urin exosomes

Published: January 16, 2015 doi: 10.3791/51158

Introduction

Urin exosomes är små interna blåsor på 100 nm av multivesikulära organ (MVB) härrör från alla celltyper under normala och sjukliga tillstånd i urin utrymme inklusive glomerulära podocyter, njur tubuliceller och celler som kantar urin dräneringssystem som verkar vara berikad för miRNA en -2. Många forskare har upptäckt distinkta proteiner i exosomes isolerade från urin hos friska individer samt de med nedsatt njur- och / eller systematiska sjukdomar 3-5. Exosomes kan isoleras med hjälp av olika metoder såsom tvåstegs differentiell ultracentrifuge med eller utan sackaros 6-7, kombinerar nanomembrane filter med ultracentrifuge 8-9, eller nederbörd 10-11. Vi har nyligen utvecklat en enkel, snabb, skalbar och effektiv metod för att isolera urin exosomes och upptäcka miRNA och protein biomarkörer 11. Även biomarkörer kan detekteras på en mängd olika biologiska vätskor, URine är det mest praktiska valet för patienter med sjukdomar i njurar och urinvägar eftersom det kan erhållas i stora mängder i en relativt icke-invasivt sätt.

Även om det finns flera metoder för att isolera urin exosomes 6-11, den vanligaste förfarande baseras på differential ultracentrifuge med en 30% sackaroskudde. Även om denna metod är effektiv och kvaliteten på de resulterande exosomes isolerade med detta förfarande är hög, tekniken i sig kräver kompetent personal och är tidskrävande, kräver flera ultracentrifugeringssteg. Andra metoder, såsom filtrering och nederbörd, har utvecklats för isolering av exosomer, inklusive en som använder ett eget utfällningsreagens (dvs ExoQuick-TC: System Biosciences, Mountain View, CA). Även nederbörd använda denna reagens är snabb och relativt lätt, är renheten av exosomes isolerade låg jämfört med ultracentrifuge methOD. Vi har nyligen jämfört sex metoder för isolering av urin exosomer, bland annat en modifiering av fällningsmetod som använder ExoQuick-TC som vi utvecklat i vårt laboratorium 11. Vi fann att denna modifierade utfällningsmetoden gav högre mängder protein, miRNA och mRNA och själva förfarandet var snabbare och enklare att genomföra än ultracentrifuge. Här beskriver vi den experimentella protokollet av vår modifierade utfällningsmetoden stegvis, och innehålla en diskussion om för- och nackdelar med denna teknik jämfört med andra metoder för Exosome isolering. Den modifierade utfällningsmetoden involverar en initial utfällning av Exosome partiklar, följt av avlägsnande av Tamm-Horsfall protein, som är korrelerad med exosomal proteiner, och känt för att reducera Exosome utbyte från urin. Vi fann att dessa modifieringar ökar utbytet och renheten av exosomal beredning från urin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Anmärkning. De steg som ingår i en isolering av den urin exosomes användning av den modifierade fällningsmetod illustreras i Figur 1 De initiala stegen involverar avlägsnandet av stora döda celler och celldebris genom centrifugering. Den slutliga pelleten erhållen från supernatanten samlas in från varje efterföljande steg motsvarar Exosome, som löses i isoleringslösning för ytterligare extraktion av protein, RNA och DNA.

1. Insamling av urin

  1. Före urinsamling, förbereda proteasinhibitorcocktail enligt tillverkarens anvisningar och till 3.125 ml av denna cocktail till en tom steril behållare. Röret innehållande proteasinhibitorcocktail den kan sedan distribueras till volontärer för urinuppsamling.
    OBS: Anledningen till att proteashämmare är att minimera proteinnedbrytning i urinprovet. Även om vi använde specifikt en proteashämmare cocktail frånSigma, kan andra kommersiellt tillgängliga proteashämmare vara substituerade.
  2. Samla ca 10 ml i första void urin. Process urinen omedelbart efter samlingen utan lagring eller kylning. Isolera urin exosomes i duplikat med den modifierade utfällningsmetoden; en av de båda analyserna för DNA, total RNA och protein extraktion, medan den andra är för kvantifiering av urin Exosome partiklar.
    OBSERVERA: En 24 tim urinprov kan uppbäras för Exosome isolering genom lagring vid 4 ° C.

2. Borttagning av cellrester och Tamm-Horsfall protein (THP)

  1. Överför urinprov till 15 ml centrifugrör. Centrifugera 10 ml urin vid 17.000 xg under 10 min vid 37 ° C för att eliminera celler och cellrester (Figur 1).
  2. Med användning av en pipett, överför supernatanten till ett nytt rör för vidare behandling. Återsuspendera pelleten i 500 | il av isoleringslösning (250 mM sackaros, 10 mM, som prövaranolamine, pH 7,6) följt av 10 min inkubation med DL-ditiotreitol (DTT: slutlig koncentration 200 mg / ml) vid 37 ° C.
    OBS: DTT läggs till förnedra THP, som fångar exosomes, vilket leder till minskade skördar. Var noga med att lämna pelleten ostört under överföring av supernatanten, och bekräftar att supernatanten är klar för pellets.
  3. Vortex pelletprover varje 2 min tills pelleten är helt upplöst. Tillsätt sedan 500 | il av isoleringslösning i den upplösta pelleten.
  4. Omedelbart efter tillsatsen av isoleringslösning till pelleten, centrifugera vid 17.000 xg under 10 minuter vid 37 ° C. Pipettera supernatanten och kombinera med supernatanten samlas tidigare.
  5. Återsuspendera pelleten i 50 pl av isoleringslösning för SDS-PAGE-analys.
    OBS: PBS eller TBS kan användas i stället för isoleringslösning för att resuspendera pelleten.

3. Isolering av Exosome Pellet

  1. Till 11 ml av den insamlade supernatant, tillsätt 3,3 ml ExoQuick-TC-reagens och inkubera vid 4 ° C under åtminstone 12 h.
    OBS: Förhållandet mellan volymen av supernatant till ExoQuick-TC reagens kan justeras för att öka eller minska exosomal utbyte. Vi observerade att mindre volymer läggs reagens producerar mindre utbyten av exosomes.
  2. Efter inkubation, centrifugera provet / ExoQuick-TC blandning vid 10.000 xg under 30 minuter vid 25 ° C.
  3. Överför supernatanten till ett nytt rör för SDS-PAGE-analys.
  4. Exosome pelleten kan lagras vid -80 ° C för DNA, RNA och protein extraktion och kvantifiering av Exosome partiklar med användning CD9 ELISA 11.
    OBS: Exosome pelleten kan lagras vid -80 ° C under 1 år med begränsad frysning och upptining.

4. Biomarker detektion och analys av Exosome Pellet

  1. För analyser nedströms, extrahera DNA, RNA och protein från Exosome pelleten med användning av DNA / RNA / protein-isoleringskit och en RNA-isolering kit enligt tillverkarens anvisningar. Bestäm koncentrationer med en Nanodrop spektrofotometer genom att mäta absorbansen vid 260 och 280 nm med 2 pl prov.
  2. Utför kvantitativ realtid RT-PCR (qPCR) använder TaqMan mikroRNA-analyser (i vårt fall använde vi humana MIR-192- och MIR-1207-5p-specifika analyser) eller miRNA-specifika primers.
  3. För SDS-PAGE-analys används 4-12% Bis-Tris-gel och separata proteinprover genom en-dimensionell elektrofores. Visualisera geler använder silverfärgning kit enligt tillverkarens anvisningar.
  4. Utför western blot-analys med hjälp av PVDF membran enligt instruktionerna från tillverkaren. Använd kanin polyklonal antikropp mot apoptos-kopplad gen-2 interagerande protein X eller ALIX och mus monoklonal antikropp till tumör känslighet gen 101 protein eller TSG101 i western blot-detektion. Kvantifiera densiteten hos banden genom öppen tillgång NIH ImageJ programvara (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ellerett liknande program.
  5. Kvantifiera antalet urin Exosome partiklar som erhållits med hjälp av en CD9 ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Urin exosomes bär protein, miRNA och mRNA biomarkörer utsöndras från njur epitelceller. Isoleringen och detektion av dessa exosomer kan ge ett användbart diagnostiskt verktyg för tidig upptäckt av njursjukdomar, såsom diabetesnefropati. Det finns flera metoder för isolering av exosomer från urinprov som samlats in från människor. Vi har tidigare jämfört sex metoder för urin Exosome isolering och undersökt resulte protein, mRNA, och miRNA nivåer 11. Vårt mål här var att i detalj beskriva den modifierade nederbörd metod vi har utvecklat för effektiv isolering av urin exosomes.

Figur 1
Figur 1 beskriver schematiskt representativ flödesschema över olika steg som är involverade vid isolering av urin exosomer användning av den modifierade fällningsmetoden. En av de två exemplar Exosomepellet erhålls mäts för CD9 använder CD9 ELISA-kit, vilket ger oss den relativa kvantifiering av Exosome partiklar. Den andra pelleten behandlas med hjälp av Qiagen DNA / RNA / protein Mini Kit utbyten DNA, RNA och protein, vilket kvantifierades med användning av Nanodrop spektrofotometer genom mätning av absorbansen vid 260 och 280 nm.

Figur 2
Figur 2 är den modifierade reproduktion av resultaten på SDS-PAGE-analys och biomarkör detektering under användning av western blot-analys (anpassat från referens 11). I spår med obearbetade urin och första urin pellet, ett proteinband som motsvarar 90-100 kDa observerades indikerande närvaron och avlägsnande av THP protein respektive. Även i körfält med slut supernatanten och Exosome pellet, var proteinbandet motsvarande THP inte observerats, vilket indikerar att avlägsna THP i de tidigare stegen, therEby öka utbytet av Exosome pellet. För att komma åt renhet och känslighet Exosome pellets, var western blot upptäckt av biomarkörer, såsom Alix och TSG101 anställd. Vi upptäckt Alix och TSG101 även när låga mängder av provet användes som indikerar betydligt ren Exosome pellets för biomarkör analys och frånvaro av rikliga lösliga proteiner inklusive THP. Densitometrisk analys av de västra blottar gjordes för att kvantifiera och mäta graden av detektion (data visas ej).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De flesta metoder som involverar utfällning av exosomer från urin behandlas inte avlägsnande av polymera nätverk som bildas av Tamm-Horsfall protein (THP). Detta protein finns i stora mängder i urinen, där den förmodat fällor exosomer under inledande låghastighetscentrifugering. I vår modifierad metod minskade vi THP använder DTT före Exosome nederbörd. Såsom visas i fig 2, observerades en högre mängd av THP observerats i obearbetat urin och pelleten, med ingen THP i den slutliga supernatanten och Exosome pelleten, vilket indikerar avlägsnande av proteinet. Kvantifiering av protein i pelleten indikerade sex gånger högre avkastning, och på CD9 ELISA kvantifiering av pelleten, observerades att utbytet av Exosome per ml urin fem gånger högre än den omodifierade utfällningsmetoden (resultaten visas inte 11). De biomarkörer Alix 6 och TSG101 8 upptäcktes i Exosome pellets; Vi kunde bara upptäcka dessa proteiner med användning av koncentreradprover i den omodifierade fällningsmetoden. Vi observerade även de högsta nivåerna av miRNA (dvs, MIR-192 och MIR-1207-5p) och mRNA-uttryck (dvs TSG101, PDCD6IP och AQP2 12) med den modifierade utfällningsmetoden 11. Fördelarna och nackdelarna med denna modifierade utfällningsmetod visas i tabell 1.

Fördelar Nackdelar
Enkla enkla steg och kräver relativt lite kunskap för att utföra Låg renhet av proteinerna som erhållits från urin exosomes
Kräver inte ett ultracentrifugesteg På grund av frånvaron av de ultracentrifuge steg, är den Urinary Exosome erhållna pelleten inte så ren som jämfört Exosome erhållna pelleten från ultracentrifugering metoder
Använder liten volym Urine provet för isolering av exosomes För att erhålla rent protein för specifik analys, skulle proteinreningssteg såsom affinitetskromatografi behövas
Erhållen bra mängd miRNA, mRNA och proteiner från urin exosomes jämfört med icke-modifierat fällningsmetoden Några extra steg som krävs med tillsats av DTT att minska entrapment av Tamm-Horsfall protein jämfört med icke-modifierat fällningsmetoden
Specificitet och sensitivitet av biomarkörer analyserade liknade den som erhölls och analyserades med hjälp av ultracentrifugeringsmetod
Urin exosomer kan isoleras från stort antal prover på en gång, som lämpar sig för kliniska spår
Mindre praktisk tid jämfört med ultracentrifuge metoder

Tabell 1. Fördelar och nackdelar med modifierad precipitationsmetod för urin Exosome isolering.

Vi drar slutsatsen att vår modifiering av fällningsmetoden är ett enkelt, snabbt och effektivt sätt att isolera urin exosomes och är ett lämpligt alternativ till ultracentrifugemetoden, vilket är arbetskrävande och kräver dyr utrustning. Vår metod kräver ingen ultracentrifugesteg, är lätt att utföra och kräver mindre steg, samtidigt som det ger en hög avkastning eller rena exosomes för efterföljande molekylära analyser. Vi visar också att utbytena av miRNA och mRNA med denna metod är höga, och därmed kan användas direkt i efterföljande nedströms RNA profilering applikationer. Vi noterar dock att en begränsning av denna metod är kvaliteten på proteinet erhålls, vilket inte är lika ren som den som erhålls med hjälp av de sukrosgradient ultracentrifugeringsmetoder, och kräver ytterligare reningssteg före utnyttjande i nedströms proteomik analyser. Vi är för närvarande bedöma nyttan av denna method använder urinprov som erhållits från patienter med diabetesnefropati.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Publicerings avgifter för denna artikel betalades av SBI Biosciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning 15 ml Centrifuge Tube Corning (Sigma Aldrich) CLS430791
Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich P8340
Centrifuge Sorvall
DL-dithiothreitol Sigma Aldrich D9779 used at final concentration of 200 mg/ml
Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well Invitrogen NP0321BOX For SDS-PAGE analysis
ECL Advance Western blotting detection kit GE Healthcare Life Sciences RPN2135 For western blot detection of biomarkers
Exoquick-TC Reagent System Biosciences (SBI) EXOTC50A-1 For exosome isolation
Exosome CD9 ELISA Complete Kit System Biosciences (SBI) EXOEL-CD9-A-1 For exosome quantification
AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit Qiagen 80004 For DNA, RNA, Protein isolation
Rneasy MinElute Cleanup kit Qiagen 74204
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific For Protein Quantification
ProteoSilver Sliver Stain Kit Sigma Aldrich PROTSIL1-1KT For staining SDS-PAGE gels
Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System Life Technologies For running the SDS-PAGE gels
TaqMan microRNA assays Life Technologies For RT-PCR assays
qBasePlus v1.5 software Biogazelle NV For analysis of RT-PCR assay data
Rabbit polyclonal antibody to ALIX Millipore For western blot detection of biomarkers
Mouse monoclonal antibody to TSG101 Abcam For western blot detection of biomarkers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
  2. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
  3. Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
  4. Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
  5. Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
  6. Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
  7. Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
  8. Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
  9. Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
  10. Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  11. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  12. Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).

Tags

Medicin Translationell medicin exosomes urin RNA western blot Tamm-Horsfall protein
En modifierad Nederbörd Metod för att isolera Urin exosomes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M.,More

Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158, doi:10.3791/51158 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter