Summary
新生血管的角膜（内华达州）可复杂多视觉病症。利用控制，碱烧伤模型，角膜NV的量化级别可以生产为新生血管性疾病的潜在治疗角膜NV和评价机理研究。
Abstract
在正常条件下，角膜没有血管，这透明度是保持良好的视觉敏锐度是必不可少的。新生血管的角膜，其可通过创伤，角膜移植术或感染性疾病引起的，的（NV）的分解角膜的所谓的“血管生成特权'和形成了多个视觉病症甚至可能导致失明的基础。虽然有几个可用的治疗方案，基本医疗需要角膜新生血管的病症仍然呈现未得到满足的。为了开发安全，有效，有针对性的治疗，需要角膜NV和药物干预的可靠模型。在这里，我们描述了在小鼠碱烧伤角膜新生血管模型。这个协议规定了一个控制的碱烧伤角膜损伤，施用感兴趣的药理化合物，其结果的可视化应用程序的方法。这种方法可以证明拉琴TAL为研究角膜NV和其他新生血管性疾病的机制和机会进行干预。
Introduction
角膜盲是导致失明的第四个最常见的原因，负责所有案件1约4％。角膜新生血管（NV）在很多这些疾病，包括疱疹性角膜炎（失明的西方主导的感染原因）和沙眼（感染性失明的主要原因之一）2的显著作用。目前的治疗包括类固醇，非类固醇消炎药（NSAID），抗-VEGF治疗药物，以及环孢菌素A以及常规或激光外科手术技术3。然而，角膜基于NV的病症的严重衰弱的性质，能够治疗角膜NV的手术设施，以及缺乏一个表现强劲的药理选项的缺乏导致最近专家圆桌会议的结论是，尽管现存的治疗，最根本的医疗需求通过这些疾病仍然呈现未满足4。
人的角膜共有5层，3层细胞（上皮，基质和内皮细胞）和2接口（鲍曼膜和弹力膜）。它作为机械屏障和折射面的眼睛。其透明的本质是其组成部分的一种微妙的平衡的结果，是不可或缺的正常功能5。通常无血管，角膜接收血液从沿其外缘从睫状体和眼动脉供给运行微血管。当刺激促进这些船只的血管新生，让他们成长对角膜的中心，因此限制了视力6角膜NV的发生。角膜血管生成包括hemangiogenesis和淋巴管生成，从而导致血管和淋巴管从对角膜的中心角膜缘血管街机向内生长。这导致角膜“血管生成特权”，增加角膜混浊及纤维化，角膜拉破坏明细Y一代和水肿7。角膜NV的精确触发很多，从传染病的响应，如沙眼的化学诱导的状态造成的传统药物，工业化学品，甚至是化学战剂。
这一过程的分子机制都没有，迄今为止，充分的特点;然而，一些关键球员已经确定。在正常条件下的角膜具有独特的“血管生成特权'通过抗血管生成因子（例如可溶性VEGF-R1）8冗余阵列保持。然而，响应于外部刺激（例如，损伤），会有的促血管生成因子（ 例如 VEGF-A）的局部表达上调。这提示促和抗血管生成的因素的基础角膜的血管生成的特权，并导致hemangiogenesis，lymphangeogenesis和炎症，因此造成角膜病变，甚至失明9的平衡。
<P类=“jove_content”>鉴于这种高度衰弱的病理未满足的医疗需求，这是感兴趣的领域有角膜NV的可靠动物模型。在这里，我们提出这样一个模式：控制碱烧伤。基于使用滤纸圈各种眼损伤模型自20世纪70年代10已被使用。 1989年，一群哈佛医学院眼科特点的中央角膜碱烧伤的标准模型兔基于浸泡一块圆形滤纸用氢氧化钠（NaOH），并把它应用到角膜在一个特定的范围内浓度11。自那时以来，这种技术已被改编为在小鼠12-14使用。近日，王实验室研究组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂SAHA在使用鼠标角膜碱烧伤模型角膜15内华达州的发病的治疗效果。这里介绍的小鼠角膜碱烧伤模型的方法是建主要是对其他两篇论文14,16的前期工作。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：以下协议和代表性的成果使用HDAC抑制剂SAHA作为一个例子化合物。然而，该协议是决不限于使用SAHA，并且被推荐为测试可溶性化合物对角膜新生血管形成的影响的一般方法。将需要小的修改进行稀释的程度，以及频率和应用的持续时间来进行。另外，是易溶于水的化合物将能够在没有二甲基亚砜的待施用。
道德声明：所有的动物实验只应在遵守国家法律和制度规定进行。这个协议被批准用于由美国杜兰大学实验动物管理和使用委员会使用。
1。材料的制备（按使用顺序排列）
- 切一块纤维素滤纸（11微米）到2毫米圈。
- 通过制备的NaOH中的1M溶液在500毫升蒸馏水H 2 O：将20克NaOH的在室温下储存。注意：NaOH溶液的腐蚀性，能引起碱烧伤。
- 通过在37.5毫升的1×PBS中的20毫克/毫升氯胺酮的终浓度和4毫克/毫升的甲苯噻嗪稀释加入10ml 20毫克/毫升的甲苯噻嗪的100 mg / ml的氯胺酮和2.5ml制备的麻醉剂鸡尾酒。
- 通过在100毫升过滤的PBS中溶解500毫克盐酸丙美卡因的制备盐酸丙美卡因0.5％的溶液（用于局部镇痛）。
- 通过溶解8克氯化钠，0.2克的KCl，1.44克Na 2 HPO 4，和0.23克的NaH 2 PO 4在900ml蒸馏水H 2 O的制备1×PBS中调整至7.4的pH值。使溶液至1,000 ml的终体积用蒸馏水H 2 O和过滤器，以确保无菌。
- 通过在1ml的DMSO中溶解26.4毫克SAHA的制备在〜100毫米1000×储液SAHA在二甲亚砜（DMSO）中。稀释至1倍（〜10微米）溶液在过滤的PBS中为每个使用。存储该原液，在-20℃下长达一个月。注意：DMSO是一种已知的毒素和致突变物。
- 制备多聚甲醛（PFA）固定为4％的溶液。在化学罩，溶解4克煤灰，90毫升的PBS。使混合物达到65℃并滴定至pH为7.4。一旦PFA溶解，使溶液至100毫升的最终体积。储存于4℃最多一个月。注意：PFA是一种已知的过敏，致癌性和毒性。
- 通过稀释5毫升山羊血清和500微升的Triton X-100的进94.5毫升PBS中制备1X封闭缓冲液。
- 通过稀释500微升的Triton X-100的进99.5毫升PBS中制备1X洗涤缓冲液。
2。碱烧伤与复合治疗
- 浸泡一个圆形滤纸，〜2毫米的直径，在1M的NaOH溶液。
- 麻醉小鼠注射100毫克/千克氯胺酮和5毫克/公斤甲苯噻嗪，WHICH是〜每25克鼠标步1.3 100微升麻醉鸡尾酒。麻醉应约1-2分钟，以设置英寸麻醉深度可轻轻捏动物的脚趾或尾巴来确定，如果麻醉足以应该没有回应。注意事项：应注意确保鼠标不屈服于麻醉诱导低温。
- 使用滴管，降幅达0.5％盐酸丙美卡因局部适用于角膜表面进行局部麻醉。
- 用无菌镊子，拿起一块氢氧化钠浸泡滤纸。如果您发现过量的NaOH抱住或滤纸滴落，简单地点击在干燥的滤纸浸泡过的滤纸吸收多余的。将一块NAOH浸泡滤纸上的角膜中央。搁置30秒，以产生急性碱烧伤〜2×2平方毫米的面积。手术显微镜是有助于正确放置滤纸。注意：只有一只眼睛的小鼠的Should与其他作为控制受伤。
- 取出滤纸。使用10毫升注射器，轻轻冲洗眼睛10毫升的1X PBS洗两次，洗去残留的1 M氢氧化钠。
- 立即申请一滴1X萨哈工作液（或车辆控制由PBS稀释DMSO不含萨哈）局部角膜。重复应用3x/day 14天。注意：在此期间，局部用抗生素软膏不推荐，因为它可能与损伤的发展，并且该化合物的递送干扰。使用液体抗生素溶液，如3％庆大霉素溶液代替。
- 直接进行临床评估（以下协议3）或牺牲鼠标和去核的眼睛角膜平山（协议4以下）或常规石蜡/冰冻病理。
3。临床评估
- 以盲法进行小鼠每天检查手术显微镜下和点Corneal NV基于角膜混浊，内华达州，和容器的大小。使用至少两个观测并记录最后的得分，它是2的平均值。
- 分数角膜混浊的规模为0-4。 0 =完全清楚; 1 =轻微混浊，虹膜和瞳孔清晰可见; 2 =轻微不透明，虹膜和瞳孔仍检测; 3 =不透明，学生几乎检测不到; 4 =完全不透明的，没有考虑到学生的。
- 分数NV的规模为0-3。 0 =无新生血管; 1 =新血管在角膜缘; 2 =新生血管跨越角膜缘，接近角膜中心; 3 =新生血管跨过角膜中心。
- 分数容器大小的规模为0-3。 0 =无新生血管; 1 =新生血管的手术显微镜下检测; 2 =新生血管手术显微镜下很容易看到; 3 =新生血管很容易看到没有显微镜。
- 使用数码相机，带眼的代表性图像在7天和14天。
4。角膜染色和平板支架
- 修复去核的眼睛在4％PFA至少1小时，在4°C。
- 转眼球为1x PBS中，使用镊子小心取出多余的组织。
- 与手术显微镜的辅助下，可以使用一针（18号）或微刀穿孔眼的pericorneal区域（注意：这应该从眼睛释放流体）。
- 从在第4.3.1节提出的穿孔使用一对外科剪刀从后部部分切开眼（角膜）的前部。
- 传输角膜放回4％PFA供固定过夜，4℃。
- 丢弃4％PFA（注意：PFA是危险的，必须按照制度规定进行报废处理）和冲洗角膜三次PBS洗涤，去除残留的煤灰。
- 孵育在1x封闭缓冲液中至少2小时，在室温下透化的组织，并防止第一抗体的非特异性结合。
- 在1x封闭液适用于初级抗体，在100-500倍稀释。 （ 例如大鼠抗小鼠PECAM-1，用于检测血管1:100，兔抗小鼠-LYVE-1为用于检测巨噬细胞中检测淋巴管在1:500和/或大鼠anti-mouse-F4/80在1:100）。孵育在4℃下过夜。
- 在室温下，每次洗6次用1×洗涤缓冲液1小时，以充分除去未结合的一抗。
- 在1x封闭缓冲液中以500-1000倍稀释应用的二次抗体。 （ 例如，488nm的荧光标记的山羊抗大鼠IgG抗体在1:800或594 nm的荧光标记的山羊抗兔IgG抗体在1:800）。孵育在4℃下过夜。
- 用1×PBS，每次1小时，在室温下洗涤3次，以完全除去未结合的第二抗体。
- 转移角膜到新鲜的1X PBS，并与手术显微镜的帮助下，仔细并使四片刀口从外围向仙呃。这应该划分角膜分成四个象限约等于大小（由此产生的形状看起来应该很像蝴蝶），并允许它平躺在一张幻灯片。
- 安装带有安装介质适用于荧光成像。为获得最佳结果，样品应立即成像和拍摄的数字照片，但也可以存储于避光，4℃几周
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Representative Results
经过碱烧伤，角膜NV发生在一个可预见的，时间依赖性。 图1展示了无论是在未经处理的动物（ 图1A），并与HDAC抑制剂SAHA（ 图1B对待动物之间的新生血管和角膜混浊形成了鲜明的差异）在7天的时间点。
图2A和2B展示未处理的对照眼原发性PECAM-1和LYVE-1染色和二抗Alexa Fluor 488和594染色（分别）的角膜平面安装。 图2C和图2D显示出每日用处理过的眼睛的同一染色在HDAC抑制剂SAHA，注意在这两个hemangiogenesis和淋巴管的急剧下降。
图3A和3B提供了一个详细看看两个污渍。 PECAM-1提供一个标记为BLO外径血管（ 图3A），而LYVE-1特异性结合的淋巴管（ 图3B）。两个场的叠加显示在图3C中 ，允许hemangiogenesis 与淋巴管生成的比较以及在不同的细胞形态的比较。
以下PFA固定（步骤4.1），你可以使用传统的切片协议（在上述协议不详细）生成的眼睛要么冰冻或石蜡包埋切片。虽然这并不让入侵一台安装了做定量的同级别，角膜矢状切面可以告诉你的角膜厚度及眼内管的相对深度。 图3D-F显示了角膜的矢状面，冰冻切片和任一F4/80（巨噬细胞染色），DAPI（核染色）或合并图像。
图1。一个未经治疗的眼碱烧伤后七天内进展角膜新生血管（A）代表图像。 （ 二）眼睛的代表图像处理，每天三次，我们感兴趣的化合物（的HDAC抑制剂SAHA）。注意在角膜混浊和新生血管的差异。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图2。未处理的对照组（A和B）和萨哈的代表性图像处理（C和＆＃160;后D）角膜7天碱烧伤（血管内皮细胞染色PECAM-1的A和C），宽视场图像。 （B和D）淋巴管内皮细胞染色与LYVE-1的宽视场图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3（A），血管内皮细胞染色与PECAM-1（B）淋巴管内皮细胞染色与LYVE-1。 （ 三）合并PECAM-1/LYVE-1染色。 （D）的巨噬细胞中的矢状冰冻切片F4/80染色。 （E）的DAPI ST在矢状切冰冻切片癌宁细胞核。 （六）合并F4/80和DAPI染色。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这里介绍的协议导致hemangiogenesis，淋巴管生成和炎症的重现性水平，使其成为理想的系统来研究这三个（相互）的进程。虽然这种方法产生了集中角膜NV，已开发造成更多的定向NV，即缝合角膜17和植入表达丸粒18的生长因子的几种方法，也可能有兴趣。我们的协议是专为在成年小鼠的使用，提供了一个易于使用的动物模型，同时还允许一个实验室采取了一系列尚未公布的大型哺乳动物的分子和转基因技术的充分利用。上述协议和代表性的结果的细节上C57BL/6J背景中使用鼠标。白化小鼠也将是合适的，并且可以提供更容易的成像;然而，最近的一项研究表明，小白鼠的新生血管反应可能不如戏剧性的19。此外，与一些其他新生血管模型，角膜NV可以拿下了检查，通过手术显微镜，甚至通过肉眼。如果需要新血管形成的程度，更严格的定量分析，染色的平面安装的数字图像可以通过许多软件包进行分析，对如何用Photoshop CS4这样做的例子可以看出，在康纳等人 。近自然议定书纸“量化在小鼠氧诱导视网膜病变”20。
盐酸丙美卡因是作为一种外用溶液（它可能是这个家庭的其他成员也同样可以接受的）应用氨基酯镇痛。即使动物被放置在该过程全身麻醉，我们认为附加的局部镇痛伦理必要性，以防止撤消疼痛的角膜。当务之急是PBS的用来稀释你的化合物和冲洗眼睛被过滤并在整个日保持清洁E工作步骤（检查是否有污染的每次使用前明显迹象）。 PBS是要求根据个别实验室的传统;任何等同的平衡盐溶液应该达到期望的结果。同样，这里介绍的免疫组化协议的修改可以被称为，如果从其他来源抗体使用（ 即需要稀释度）。
此过程的最技术上具有挑战性的部分是氢氧化钠浸泡过的滤纸的初始位置和角膜的解剖。我们建议两种技术先于实际的程序实施。滤纸必须放置在角膜的中心，以促进新血管形成的所有面相同的水平。任何偏移度将创建变性高水平的从小鼠到小鼠。角膜剥离需要大量手巧的。眼睛可能响应于试图穿透pericorneal区域变形。我们推荐使用锋利的，小的针头，使最初的切割和内释放压力。在经过最初的穿刺制成，一对外科剪刀的可插入的孔，并用于沿着从后眼杯分离出眼睛的前一条假想的线切割。工作缓慢而仔细地应该产生一个完整的角膜。
应当指出的是，虽然该协议的主要目的是为了测定各种化合物的效力在治疗角膜碱烧伤它也有可用于研究角膜伤口重新epitheliaztion，角膜纤维化，角膜缘上皮干的电位细胞更新。此外，它可以作为探索病理hemangiogenesis，淋巴管生成和炎症的机制的一般模型。与该协议可以执行相对容易，以及它的非侵入性的性质，提出了用于体内化合物的筛选，药效测定一个有吸引力的机会s和转基因小鼠模型相对于病理性血管生成特性。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢新余李博士在准备稿件的帮助。 SW是由杜兰大学，总统的研究委员会新研究者奖从得克萨斯大学西南医学中心，美国国立卫生研究院资助EY021862，从研究职业发展奖，以防止盲目性基础，一个明亮的焦点奖，年龄相关性黄斑变性研究一个启动基金资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 18 G Needle | BD | 305918 | |
| 10 ml Syringe | BD | 306575 | |
| 25 G Needle | BD | 305916 | |
| Anti-F4/80 (rat anti-mouse) | AbD Serotech | MCA497RT | |
| Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) | Abcam | ab14917 | |
| Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) | BD | 553370 | |
| Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat) | Invitrogen | A11006 | |
| Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit) | Invitrogen | A11012 | |
| Camera | Tucsen | TCC 5.0 ICE | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DMSO | Sigma | D4540-1L | Caution: Mutagenic, Toxic |
| Forceps (Blunt), Iris | WPI | 15915 | |
| Forceps (Sharp), Dumont #4 | WPI | 500340 | |
| KCl | Fisher | P217-500 | |
| Ketamine Solution | MedVet | RXKETAMINE | Controlled substance, proper license required for use. |
| Light Source for Microscope | AmScope | LED-14M-YA | |
| Microscope (Stereo 7X-45X) | AmScope | SM-1B | |
| Mounting Medium, VECTASHIELD | Vector | H-1000 | |
| NaCl | Fisher | S271-10 | |
| NaH2PO4 | Fisher | S397-500 | |
| NaOH | Fisher | S318-1 | Caution: Corrosive |
| Paraformaldehyde | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic | |
| Proparacaine Hydrochloride | Sigma | P4554-1G | |
| Scissors (5 mm blade), Vanas | WPI | 14003 | |
| Goat Serum | MPBio | 92939249 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-6508 | |
| Xylazine Solution | MedVet | RXANASED-20 |
References
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