Summary
Neovascularisatie (NV) van het hoornvlies kan compliceren meerdere visuele pathologieën. Met behulp van een gecontroleerde, alkali-brandwonden-model, kan een kwantificeerbare niveau van de cornea NV worden geproduceerd voor mechanistische studie van het hoornvlies NV en evaluatie van potentiële therapieën voor neovascular aandoeningen.
Abstract
Onder normale omstandigheden, het avasculaire hoornvlies, en deze transparantie is essentieel voor het handhaven van goede gezichtsscherpte. Neovascularisatie (NV) van het hoornvlies, die kan worden veroorzaakt door trauma, keratoplastie of besmettelijke ziekte, breekt de zogenaamde angiogene privilege "van de hoornvlies en vormt de basis van meerdere visuele pathologieën die zelfs kan leiden tot blindheid. Hoewel er verschillende behandeling opties beschikbaar, de fundamentele medische noodzaak door het hoornvlies neovascular pathologieën blijft onvervulde. Om een veilige, effectieve en doelgerichte therapieën te ontwikkelen, is een betrouwbaar model van het hoornvlies NV en farmacologische interventie vereist. We beschrijven hier een alkali-brandwond corneale neovascularisatie model in de muis. Dit protocol verschaft een werkwijze voor het aanbrengen van een gecontroleerde alkali-brandwonden aan het hoornvlies, toedienen van een farmacologische verbinding van belang en visualisatie van het resultaat. Deze methode zou kunnen blijken instrumentatieTal voor het bestuderen van de mechanismen en mogelijkheden voor interventie in de cornea NV en andere neovascular aandoeningen.
Introduction
Hoornvlies blindheid is de vierde meest voorkomende oorzaak van blindheid, verantwoordelijk voor ongeveer 4% van alle gevallen 1. Corneale neovascularisatie (NV) speelt een belangrijke rol in veel van deze ziekten, waaronder herpetische keratitis (de voornaamste infectieuze oorzaak van blindheid in de West) en trachoom (de belangrijkste oorzaak van besmettelijke blindheid) 2. Huidige therapieën omvatten steroïden, niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAIDs), anti-VEGF therapie en cyclosporine A evenals conventionele of laser chirurgische technieken 3. De sterk ondermijnende aard van corneale NV basis pathologieën, het gebrek aan chirurgische faciliteiten kunnen behandelen cornea NV en het ontbreken van een sterk presterende farmacologische optie leidde een recent deskundige ronde tafel te concluderen dat, ondanks de bestaande therapieën, de fundamentele medische behoefte door deze pathologieën nog onvervulde 4.
Het menselijk hoornvliesbestaat uit 5 lagen, 3 cellulaire lagen (epitheel, stroma en endotheel) en 2 interface (Bowman membraan en Descemet membraan). Het functioneert als een mechanische barrière en brekend oppervlak voor het oog. Het transparante karakter is het gevolg van een delicaat evenwicht tussen de componenten en is een integraal onderdeel van de juiste functie 5. Normaal avasculaire, het hoornvlies bloed uit microvessels die langs de buitenrand die worden gevoed vanuit de ciliaire en oogheelkundige slagaders. Cornea NV treedt op wanneer een stimulus angiogenese bevordert deze vaartuigen waardoor ze groeien naar het midden van het hoornvlies en dus zicht 6 beperken. Corneale angiogenese omvat hemangiogenesis en lymfevaten, die resulteren in de ingroei van bloedvaten en lymfevaten van de limbale vasculaire arcade naar het midden van het hoornvlies. Dit leidt tot een afbraak van het hoornvlies "angiogene privilege", een verhoging van het hoornvlies en fibrose, verstoring van de cornea layers, en oedeem 7. De precieze triggers van het hoornvlies NV zijn talrijk, variërend van een reactie op infectieziekten zoals trachoom een chemisch geïnduceerde toestand veroorzaakt traditionele medicijnen, industriële chemicaliën, of zelfs stoffen voor chemische oorlogvoering.
De moleculaire mechanismen van dit proces niet, nog zo, volledig gekarakteriseerd; Er zijn echter een paar belangrijke spelers geïdentificeerd. Onder normale omstandigheden het hoornvlies bezit een unieke 'angiogene privilege' onderhouden door een Redundant Array of anti-angiogene factoren (zoals oplosbare VEGF-R1) 8. In reactie op een externe stimulus (bijvoorbeeld letsel), zal er een lokaal verhoogde expressie van pro-angiogene factoren (zoals VEGF-A). Deze tips het saldo van pro-en anti-angiogene factoren die angiogene voorrecht het hoornvlies ten grondslag ligt, en leidt tot hemangiogenesis, lymphangeogenesis, en ontsteking, dus waardoor de cornea pathologie en zelfs blindheid 9.
<p class = "jove_content"> Aangezien de medische behoefte van deze zeer slopende pathologie, is het van belang het veld om een betrouwbaar diermodel van hoornvlies NV hebben. Hier presenteren we een dergelijk model: gecontroleerd alkali-brandwonden. Diverse eye-verwonding modellen op basis van het gebruik van filterpapier ringen worden al sinds 1970 10. In 1989, een groep van de Harvard Medical School oogartsen gekenmerkt een standaardmodel van een centrale cornea alkali-brandwonden bij konijnen op basis van het weken een cirkelvormig stukje filterpapier met natriumhydroxide (NaOH) en toe te passen op het hoornvlies bij een bepaald bereik van concentraties 11. Sindsdien is deze techniek aangepast voor gebruik in de muis 12-14. Onlangs, Wang lab bestudeerden de therapeutische effecten van histone deacetylase (HDAC) inhibitor SAHA in de pathogenese van corneale NV een muis hoornvlies alkali-brandwonden model 15. De methodiek van de muis hoornvlies alkali-brandwonden hier gepresenteerde model werd gebouwdvooral op het voorafgaande werk van twee andere kranten 14,16.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Het volgende protocol en representatieve resultaten te gebruiken de HDAC inhibitor SAHA als voorbeeld verbinding. Echter, dit protocol is geenszins beperkt tot het gebruik van SAHA, en wordt aanbevolen als een algemene methode om de effecten van de oplosbare bestanddelen op corneale neovascularisatie testen. Kleine aanpassingen moeten worden gemaakt verdunningsgraad en frequentie en duur van de toepassing. Bovendien zullen verbindingen die gemakkelijk oplosbaar zijn in water kunnen bij afwezigheid van DMSO worden toegediend.
Ethische verklaring: Alle dierproeven mogen alleen in overeenstemming met de nationale wetgeving en institutionele regelgeving worden uitgevoerd. Dit protocol werd goedgekeurd voor gebruik door Tulane University Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Voorbereiding van Materialen (in volgorde van gebruik)
- Knip een stuk cellulose filterpapier (11 micrometer) in 2 mm cirkels.
- Bereid een 1 M oplossing van NaOH dooroplossen van 20 g NaOH in 500 ml gedestilleerd H2O Bewaren bij kamertemperatuur. LET OP: NaOH oplossingen zijn corrosief en kunnen alkali-brandwonden veroorzaken.
- Bereid een verdoving cocktail door verdunning 10 ml 100 mg / ml ketamine en 2,5 ml 20 mg / ml xylazine in 37,5 ml 1x PBS gedurende een eindconcentratie van 20 mg / ml ketamine en 4 mg / ml xylazine.
- Bereid een oplossing van 0,5% van proparacaïne hydrochloride (voor topische analgesie) door 500 mg proparacaïne hydrochloride in 100 ml gefiltreerd PBS.
- Bereid 1x PBS door het oplossen van 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 en 0,23 g NaH 2 PO 4 in 900 ml gedestilleerd H2O Pas tot 7,4 pH. Breng de oplossing tot een eindvolume van 1000 ml met gedestilleerd H2O en filter om steriliteit te waarborgen.
- Bereid voorraadoplossingen 1000 x SAHA bij ~ 100 mM in dimethylsulfoxide (DMSO) door oplossen van 26,4 mg SAHA in 1 ml DMSO. Verdun een 1x (~ 10 uM)oplossing gefiltreerd PBS voor elk gebruik. Bewaar de stockoplossing bij -20 ° C gedurende maximaal een maand. LET OP: DMSO is een bekend toxine en mutageen.
- Een oplossing van paraformaldehyde (PFA) voor bevestiging 4%. Onder een chemische kap, los op in 90 ml PBS 4 g PFA. Breng het mengsel op 65 ° C en titreren tot een pH van 7,4. Zodra de PFA is opgelost, vervolgens wordt de oplossing tot een eindvolume van 100 ml. Bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal een maand. LET OP: PFA is een bekend allergeen, kankerverwekkend en giftig.
- Bereid 1x blokkerende buffer door verdunning 5 ml geit serum en 500 pl Triton X-100 in 94,5 ml PBS.
- Bereid 1x wasbuffer door verdunning van 500 pl Triton X-100 in 99,5 ml PBS.
2. Alkali-Burn Injury & Compound Treatment
- Dompel een rond stuk filterpapier, ~ 2 mm in diameter, in een oplossing van 1 M NaOH.
- Verdoven de muis met een injectie van 100 mg / kg ketamine en 5 mg / kg xylazine, which is ~ 100 ul van de narcose cocktail van stap 1.3 per 25 g muis. Anesthesie moet rekening -1-2 min te stellen inch diepte van anesthesie kan worden bepaald door zacht knijpen de teen of de staart van het dier, als anesthesie voldoende zou er geen respons. Opmerking: Zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen de muis niet bezwijken voor anesthesie geïnduceerde hypothermie.
- Met behulp van een pipet, topisch een daling van 0,5% proparacaïne hydrochloride toepassing op het hoornvlies voor lokale analgesie.
- Met behulp van een steriel pincet, pick-up een stuk van NaOH gedrenkt filtreerpapier. Als u merkt dat teveel NaOH vastklampen aan of druipen van het filterpapier, tikt u in het kort de geweekte filterpapier op een droog stukje filtreerpapier om het overtollige te absorberen. Leg het stuk NAOH gedrenkt filtreerpapier op het centrale hoornvlies. Laat het gedurende 30 sec tot een acute alkali-branden van ~ 2 x 2 mm 2 in het gebied genereren. Een chirurgische microscoop is nuttig in de juiste plaatsen van het filterpapier. Opmerking: Alleen een oog van de muis should worden verwond met andere dienen als controle.
- Verwijder het filter papier. Met behulp van een injectiespuit 10 ml voorzichtig spoel het oog met 10 ml 1x PBS twee keer weg te wassen resterende 1 M NaOH.
- Breng onmiddellijk een druppel 1x SAHA werkende oplossing (of een voertuig controle bestaande uit PBS verdund DMSO die geen SAHA) lokaal aan het hoornvlies. Herhaal toepassing 3x/dag gedurende 14 dagen. Let op: tijdens deze periode een actueel antibiotische zalf niet wordt aanbevolen als het kan interfereren met de ontwikkeling van het letsel en de levering van de verbinding. Gebruik een vloeibaar antibioticum oplossing zoals 3% Gentamicine oplossing plaats.
- Ga direct naar Klinische Beoordeling (Protocol 3 hieronder) of offeren de muis en het ophelderen van de ogen hoornvlies plat mount (Protocol 4 hieronder) of conventionele paraffine / bevroren histologie.
3. Clinical Assessment
- Voer een dagelijkse onderzoek van de muizen in een blinde manier onder een chirurgische microscoop en scoren corneal NV op basis van het hoornvlies, NV, en de omvang van het schip. Gebruik minstens twee waarnemers en registratie van een eindmeting is het gemiddelde van de twee.
- Score hoornvlies op een schaal van 0-4. 0 = helemaal duidelijk; 1 = licht troebel, iris en pupil goed zichtbaar; 2 = een beetje ondoorzichtig, iris en pupil nog steeds detecteerbaar; 3 = ondoorzichtig, leerlingen nauwelijks waarneembaar; en 4 = volledig ondoorzichtig met geen uitzicht op de leerling.
- Scoren NV op een schaal van 0-3. 0 = geen neovessels; 1 = neovessels in de corneale limbus; 2 = neovessels verspreid over het hoornvlies limbus en het naderen van het hoornvlies centrum; 3 = neovessels verspreid over het hoornvlies centrum.
- Score scheepsgrootte op een schaal van 0-3. 0 = geen neovessels; 1 = neovessels aantoonbaar onder chirurgische microscoop; 2 = neovessels gemakkelijk gezien onder chirurgische microscoop; 3 = neovessels goed zichtbaar zonder microscoop.
- Met een digitale camera, representatieve beelden van het oog 7 dagen en 14 dagen.
4.Verkleuring van de cornea en Flat Mounts
- Fix ontkernde oog in 4% PFA gedurende ten minste 1 uur bij 4 ° C.
- Breng het oog op PBS 1x en een tang om voorzichtig te verwijderen overtollige weefsel.
- Met behulp van een chirurgische microscoop gebruiken een naald (18 gauge) of micro-mes om de pericorneaal gebied van het oog perforeren (opmerking: dit zou afgeven van vloeistof uit het oog).
- Uit de perforatie in paragraaf 4.3.1 gebruiken een paar chirurgische schaar om het voorste deel van het oog (hoornvlies) vanaf het achterste gedeelte gesneden.
- Breng het hoornvlies terug in 4% PFA voor fixatie nacht bij 4 ° C.
- Gooi de 4% PFA (LET OP: PFA is gevaarlijk en moet worden afgevoerd in overeenstemming met de institutionele regelgeving) en spoel het hoornvlies drie keer met 1x PBS om eventuele resten van PFA verwijderen.
- Incubeer in 1x blokkerende buffer gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur om het weefsel doorlaatbaar en voorkomt niet-specifieke binding van het primaire antilichaam.
- Solliciteer primair antilichaam in 1x blokkerende buffer, bij een 100-500 voudige verdunning. (Bijv. rat anti-muis-PECAM-1 voor het detecteren van bloedvaten 1:100 konijn-antimuis-LYVE-1 lymfevaten detecteren van 1:500 en / of rat anti-mouse-F4/80 voor het detecteren macrofagen bij 1:100). Incubeer bij 4 ° C gedurende de nacht.
- Was zesmaal met 1 x wasbuffer gedurende 1 uur elke keer bij kamertemperatuur volledig verwijderen van niet-gebonden primair antilichaam.
- Breng een secundair antilichaam in 1x blokkerende buffer bij een 500-1.000 voudige verdunning. (Bijvoorbeeld een 488 nm fluorescerend gelabeld geit anti-rat-IgG bij 1:800 of 594 nm fluorescent gelabeld geit anti-konijn-IgG bij 1:800). Incubeer bij 4 ° C gedurende de nacht.
- Was driemaal met 1x PBS gedurende 1 uur elk bij kamertemperatuur volledig verwijderen van ongebonden secundair antilichaam.
- Breng het hoornvlies in de frisse 1x PBS en, met behulp van een chirurgische microscoop, zorgvuldig maken vier insnijdingen van de periferie naar het centER. Dit moet het hoornvlies te verdelen in vier kwadranten van ongeveer gelijke grootte (de resulterende vorm moet zien er nogal als een vlinder) en laat het plat op een dia.
- Monteer met een montage medium geschikt voor fluorescerende beeldvorming. Voor de beste resultaten moeten de monsters onmiddellijk worden afgebeeld en digitale foto's genomen, maar kan worden opgeslagen voor enkele weken beschermd tegen licht bij 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na alkali-brandwonden, hoornvlies NV treedt op voorspelbare, tijdsafhankelijke wijze. Figuur 1 toont het grote verschil in zowel neovascularisatie en corneale opaciteit tussen een onbehandeld dier (figuur 1A) en een dier behandeld met de HDAC inhibitor SAHA (Figuur 1B ) op de 7 dag tijdstip.
Figuren 2A en 2B tonen een corneale vlakke bevestiging van een onbehandelde controle-oog met primaire PECAM-1 en LYVE-1 kleuring en secundaire Alexa Fluor 488 en 594 kleuring (respectievelijk). Figuren 2C en 2D tonen dezelfde vlekken op een oog dagelijks behandeld met de HDAC inhibitor SAHA, let op de dramatische daling van zowel hemangiogenesis en lymfangiogenese.
Figuren 3A en 3B een gedetailleerde blik op de twee vlekken. PECAM-1 dient een marker voor de blood vaartuigen (figuur 3A), terwijl LYVE-1 bindt specifiek aan de lymfevaten (Figuur 3B). Een overlapping van de twee velden is getoond in figuur 3C, waarbij vergeleken hemangiogenesis versus lymfangiogenese en een vergelijking van de verschillende celmorfologie.
Na PFA fixatie (stap 4.1), kunt u conventionele snijden protocollen (niet vermeld in het protocol hierboven) gebruiken om ofwel bevroren of paraffine ingebedde secties van het oog te genereren. Hoewel dit niet dezelfde mate van kwantificering van de invasie die een platte berg niet toestaat, kan sagittale secties van het hoornvlies te laten zien dikte van het hoornvlies en de relatieve diepte van de buizen in het oog. Figuren 3D-F toont sagittale, bevroren delen van het hoornvlies en ofwel F4/80 (macrofaag vlekken), DAPI (nucleaire kleuring), of een samengevoegde afbeelding.
Figuur 1. Progressie van het hoornvlies neovascularisatie zeven dagen na alkali-brandwonden. (A) representatief beeld van een onbehandelde oog. (B) representatief beeld van een oog behandeld drie keer per dag met onze verbinding van belang (de HDAC inhibitor SAHA). Let op het verschil in het hoornvlies en neovascularisatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Representatieve beelden van een onbehandelde controle (A en B) en een SAHA behandeld (C en & #160, D) hoornvlies zeven dagen na alkali-brandwonden A en C) Breed beeld van vasculaire endotheliale cel kleuring met PECAM-1 (.. (B en D) Breed beeldveld van lymfatische endotheelcellen kleuring met LYVE-1. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. (A) vasculaire endotheelcel kleuring met PECAM-1. (B) lymfatische endotheelcellen kleuring met LYVE-1. (C) Samengevoegd PECAM-1/LYVE-1 kleuring. (D) F4/80 kleuring van macrofagen in een sagittale vriescoupe. (E) DAPI staining van celkern in een sagittale snede bevroren sectie. (F) Samengevoegd F4/80 en DAPI kleuring. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde protocol resulteert in reproduceerbare niveaus van hemangiogenesis, lymfangiogenese, en ontsteking, waardoor het een ideaal systeem om deze drie (samenhangende) processen te bestuderen. Hoewel deze methode levert gecentraliseerde hoornvlies NV, verschillende methoden die zijn ontwikkeld om meer gerichte NV, namelijk het hechten van het hoornvlies 17 veroorzaken en geïmplanteerd groeifactor uitdrukken pellets 18, misschien ook interessant. Ons protocol is ontworpen voor gebruik in de volwassen muis, het verstrekken van een eenvoudig te diermodel gebruiken en daarbij tevens een lab om optimaal te profiteren van een scala aan moleculaire en transgene technieken nog niet beschikbaar voor grotere zoogdieren. Het bovenstaande protocol en representatieve resultaten detail het gebruik van muizen op een C57BL/6J achtergrond. Albinomuizen zou ook geschikt zijn en kunnen voorzien in eenvoudiger beeldvorming; Uit een recente studie blijkt dat de neovasculaire reactie albino muizen niet zo dramatisch 19 kan zijn. Verder, in tegenstelling tot verschillendeandere neovascularisatie modellen, kan het hoornvlies NV worden gemaakt met het onderzoek door middel van een chirurgische microscoop of zelfs met het blote oog. Als een meer rigoureuze kwantificering van de mate van neovascularisatie nodig is, kan digitale beelden van de gebrandschilderde platte berg via een aantal software pakketten worden geanalyseerd, kan een voorbeeld van hoe dit te doen met Photoshop CS4 te zien in Conner, et al.. recente Nature Protocols paper "Kwantificering van zuurstof geïnduceerde retinopathie in de muis" 20.
Proparacaïne hydrochloride een amino ester analgeticum toegepast als een actueel oplossing (het is mogelijk dat andere leden van deze familie eveneens aanvaardbaar zouden zijn). Alhoewel het dier onder narcose voor de procedure wordt gebracht, achten wij extra actueel analgesie een ethische noodzaak om undo pijn te voorkomen aan het hoornvlies. Het is noodzakelijk dat de PBS gebruikt om uw verbinding te verdunnen en spoel het oog worden gefilterd en in de hele th schoon gehoudene procedure (op zichtbare tekenen van verontreiniging voor elk gebruik). PBS is geboden op basis van individuele lab traditie; gelijkwaardige gebalanceerde zoutoplossing moet het gewenste resultaat. Evenzo kan herzieningen van de immunohistochemie protocol hier gepresenteerde genoemd worden want als antilichamen uit andere bronnen worden gebruikt (dat wil zeggen de mate van verdunning nodig).
De meest technisch uitdagende delen van deze procedure zijn de eerste plaatsing van de NaOH geweekt filterpapier en de dissectie van het hoornvlies. Wij adviseren dat beide technieken voorafgaand aan de feitelijke procedure worden beoefend. Filterpapier moet in het midden van het hoornvlies worden geplaatst met het oog op een gelijk niveau van neovascularisatie van alle kanten te promoten. Enige mate van offset een hoge variabiliteit creëren van muis tot muis. Hoornvlies dissectie vereist een goede deal van handvaardigheid. Het oog is vervormt als reactie op een poging om de pericorneaal regio perforeren.Wij raden u aan een scherpe, kleine naald om de eerste snede te maken en laat de druk in. Na een punctie is gemaakt, kan een paar chirurgische schaar worden ingebracht in het gat en die langs een denkbeeldige lijn tussen de voorste van het oog van de achterste oogschelp te snijden. Langzaam en voorzichtig werken moet een intacte cornea opleveren.
Opgemerkt moet worden dat hoewel het primaire doel van dit protocol is de efficiëntie van verschillende verbindingen assay behandelen corneale alkalische brandwonden heeft ook het potentieel om te worden gebruikt voor corneale wond opnieuw epitheliaztion, cornea fibrose en limbale epitheliale stamcellen bestuderen celvernieuwing. Voorts dient het als een algemeen model om de mechanismen van pathologische hemangiogenesis, lymfangiogenese en ontsteking verkennen. Het relatieve gemak waarmee het protocol kan worden uitgevoerd, en de invasieve aard, biedt een aantrekkelijke mogelijkheid voor in vivo samengestelde screening, doeltreffendheidonderzoeks en karakterisering van transgene muismodellen opzichte van pathologische angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor Dr Xinyu Li's hulp bij de voorbereiding van het manuscript. SW werd ondersteund door een Startup fonds van Tulane University, voorzitter van de Raad voor Onderzoek New Investigator Award van UT Southwestern Medical Center, NIH Grant EY021862, een loopbaanontwikkeling onderscheiding van het onderzoek naar Blindheid stichting voorkomen, en een Bright Focus Award in leeftijdsgebonden maculaire degeneratie Onderzoek .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 18 G Needle | BD | 305918 | |
| 10 ml Syringe | BD | 306575 | |
| 25 G Needle | BD | 305916 | |
| Anti-F4/80 (rat anti-mouse) | AbD Serotech | MCA497RT | |
| Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) | Abcam | ab14917 | |
| Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) | BD | 553370 | |
| Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat) | Invitrogen | A11006 | |
| Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit) | Invitrogen | A11012 | |
| Camera | Tucsen | TCC 5.0 ICE | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DMSO | Sigma | D4540-1L | Caution: Mutagenic, Toxic |
| Forceps (Blunt), Iris | WPI | 15915 | |
| Forceps (Sharp), Dumont #4 | WPI | 500340 | |
| KCl | Fisher | P217-500 | |
| Ketamine Solution | MedVet | RXKETAMINE | Controlled substance, proper license required for use. |
| Light Source for Microscope | AmScope | LED-14M-YA | |
| Microscope (Stereo 7X-45X) | AmScope | SM-1B | |
| Mounting Medium, VECTASHIELD | Vector | H-1000 | |
| NaCl | Fisher | S271-10 | |
| NaH2PO4 | Fisher | S397-500 | |
| NaOH | Fisher | S318-1 | Caution: Corrosive |
| Paraformaldehyde | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic | |
| Proparacaine Hydrochloride | Sigma | P4554-1G | |
| Scissors (5 mm blade), Vanas | WPI | 14003 | |
| Goat Serum | MPBio | 92939249 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-6508 | |
| Xylazine Solution | MedVet | RXANASED-20 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. Global estimates of visual impairment. Br. J. Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2010).
- Whitcher, J., Srinivasan, M., Upadhyay, M. Corneal Blindness: A Global Perspective. Bull. World Health Org. 79 (3), 214-221 (2003).
- Gupta, D., Illingworth, C. Treatments for corneal neovascularization: a review. Cornea. 30 (8), 927-938 (2011).
- Cursiefen, C., et al. Consensus statement on indications for anti-angiogenic therapy in the management of corneal diseases associated with neovascularisation: outcome of an expert roundtable. Br. J. Ophthalmol. 96 (1), 3-9 (2012).
- Delmonte, D., Kim, T. Anatomy and Physiology of the Cornea. J. Cataract Refract. Surg. 37 (3), 588-598 (2011).
- Cursiefen, C., Seitz, B., Dana, M. R., Streilein, J. W. Angiogenesis and lymphangiogenesis in the cornea. Pathogenesis, clinical implications and treatment options. Der Ophthalmologe. 100 (4), 292-229 (2003).
- Chang, J., Gabison, E., Kato, T., Azar, D. Corneal Neovascularization. Curr. Opin Ophthalmol. 12 (4), 242-249 (2001).
- Ambati, B., et al. Corneal Avascularity is due to Soluble VEGF Receptor-1. Nature. 443 (7114), 993-997 (2006).
- Cursiefen, C., et al. VEGF-A Stimulates Lymphangiogenesis and Hemangiogenesis in Inflammatory Neovascularization via Macrophage Recruitment. J. Clin. Invest. 113 (7), 1040-1050 (2004).
- Jiri, O. Paper Strips and Rings as Simple Tools for Standardization of Experimental Eye Injuries. Ophthal. Res. 1975 (7), 363-367 (2009).
- Ormerod, L., Abelson, M., Kenyon, K. Standard Models of Corneal Injury Using Alkali-Immersed Filter Discs Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30 (10), 2148-2153 (1989).
- Saika, S., et al. Therapeutic effects of adenoviral gene transfer of bone morphogenic protein-7 on a corneal alkali injury model in mice. Lab. Invest. 85 (4), 474-486 (2005).
- Ferrari, G., Bignami, F., Giacomini, C., Franchini, S., Rama, P. Safety and efficacy of topical infliximab in a mouse model of ocular surface scarring. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (3), 1680-1688 (2013).
- Sosne, G., Christopherson, P., Barrett, R., Fridman, R. Thymosin-beta4 modulates corneal matrix metalloproteinase levels and polymorphonuclear cell infiltration after alkali injury.Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46 (7), 2388-2395 (2005).
- Li, X., et al. Inhibition of Multiple Pathogenic Pathways by Histone Deacetylase Inhibitor SAHA in a Corneal Alkali-Burn Injury Model. Mol. Pharm. 10 (1), 307-318 (2013).
- Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmol. 86 (3), 322-328 (2008).
- Bucher, F., Parthasarathy, A., Bergua, A., Onderka, J., Regenfuß, B., Cursiefen, C., Bock, F. Topical Ranibizumab inhibits inflammatory corneal hem- and lymphangiogenesis. Acta Ophthalmol. , (2012).
- Hajrasouliha, A., Sadrai, Z., Chauhan, S., Dana, R. b-FGF induces corneal blood and lymphatic vessel growth in a spatially distinct pattern. Cornea. 31 (7), 804-809 (2012).
- Rogers, M., et al. The albino mutation of tyrosinase alters ocular angiogenic responsiveness. Angiogenesis. 16 (3), 639-646 (2013).
- Connor, K., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological. Nat. Protoc. 4 (11), 1565-1573 (2009).
