Summary
角膜の新生血管形成（NV）は、複数の視覚的な病状を複雑にする可能性がある。制御、アルカリ火傷モデルを利用して、角膜NVの定量化可能なレベルは、血管新生性疾患のための潜在的な治療法の角膜NVと評価のメカニズムの研究のために製造することができる。
Abstract
通常の条件下では、角膜は無血管であり、この透明性が良好な視力を維持するために不可欠である。外傷、角膜移植や感染症が原因で発生することができ、角膜の新生血管形成（NV）は、角膜のいわゆる「血管新生の特権」を分解し、さらには失明につながる可能性があり、複数の視覚的な病理の基礎を形成します。利用可能ないくつかの治療の選択肢がありますが、角膜新生血管の病変によって提示された基本的な医学的必要性が満たされていないままです。 、安全で、有効で、標的療法を開発するために、角膜NVおよび薬理学的介入の信頼性のあるモデルが必要である。ここでは、マウスにアルカリ火傷角膜新生血管形成モデルについて説明します。このプロトコルは、角膜、興味のある薬理学的化合物を投与し、その結果の可視化への制御されたアルカリ火傷を適用するための方法を提供する。この方法は、instrumen証明することができた角膜NVと他の血管新生性疾患に介入するためのメカニズムと機会を研究するためのTAL。
Introduction
角膜失明はすべてのケース1の約4％に責任失明の第四の最も一般的な原因です。角膜血管新生（NV）は、ヘルペス性角膜炎（西の失明の主な感染原因）とトラコーマ（世界的な感染失明の主な原因）2を含むこれらの病態の多くの重要な役割を果たしている。現在の治療は、ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）、抗VEGF療法と同様に従来のまたはレーザ手術技術3シクロスポリン Aを含む。しかし、角膜NV基づく病状の深刻な衰弱性質上、外科角膜NVを治療することができる施設、好調理学的選択肢の欠如の不足は、現存の治療法にもかかわらず、それを締結する基本的な医療ニーズを、最近の専門家の円卓会議を主導これらの病理によって提示されたが4満たされていないままです。
ヒトの角膜5層、3細胞層（上皮細胞、間質および内皮）および2インターフェイス（ボーマン膜とデスメ膜）で構成されています。それは、目には機械的な障壁や屈折面として機能します。その透明な性質は、その構成要素の微妙なバランスの結果であり、その適切な機能5に不可欠である。通常は無血管、角膜は毛様体および眼動脈から供給され、その外縁に沿って実行されている微小血管から血液を受け取る。刺激が彼らが角膜の中心に向かって成長し、そのためのビジョン6を制限することができ、これらの血管の新生を促進する際の角膜NVが発生します。角膜血管新生は、角膜の中心に向かって輪部血管アーケードからの血管やリンパ管の内部成長につながる、これhemangiogenesisやリンパ管が含まれています。これは角膜の「血管新生の特権」、角膜混濁および線維症の増加、角膜LAの崩壊の崩壊につながるyers、および浮腫7。角膜NVの正確なトリガーは数多くあり、そのような化学的に誘発された状態へのトラコーマなどの感染性疾患に対する応答に至るまで、伝統的な医薬品、工業薬品、さらには化学兵器を引き起こした。
このプロセスの分子メカニズムは、まだ、完全に特徴付けられていない。しかし、いくつかの重要な選手が同定されている。通常の条件下では、角膜（例えば、可溶性VEGF-R1のような）抗血管新生因子8の冗長アレイによって維持されるユニークな「血管新生特権'有する。しかし、（このような損傷のような）外部刺激に反応して、血管新生促進因子（ 例えば VEGF-A）の局所的なアップレギュレーションがあるでしょう。これは、先端角膜の血管新生特権の根底炎症および抗血管新生因子のバランス、従って角膜の病理及び失明さえ9を引き起こし、hemangiogenesis、lymphangeogenesis、および炎症をもたらす。
<Pクラス= "jove_contentは">この非常に衰弱させる病理学の満たされていない医療ニーズを考えると、角膜NVの信頼できる動物モデルを持っている分野に関心がある。制御アルカリ火傷：ここでは、そのようなモデルを提示する。濾紙環の使用に基づく様々な眼損傷モデル1970 10が使用されてきた。 1989年には、ハーバード大学医学部の眼科医のグループは、水酸化ナトリウム（NaOH）の円形濾紙を浸漬し、特定の範囲の角膜にそれを適用することに基づいてウサギ角膜中央アルカリ火傷の標準モデルを特徴づけ濃度11。それ以来、この技術は、マウス12-14での使用に適合されている。最近では、王の研究室では、マウスの角膜アルカリ火傷モデル15を使用して角膜NVの病因におけるヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤SAHAの治療効果を検討した。ここで紹介するマウスの角膜アルカリ火傷モデルの方法論は、建設されました主に2他の論文14,16の前の仕事に。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：以下のプロトコルおよび代表的な結果は、実施例化合物として、HDAC阻害剤SAHAを使用しています。しかしながら、このプロトコルは、SAHAの使用に限定されるものではなく、角膜新生血管形成に対する可溶性化合物の効果を試験するための一般的な方法として推奨される。軽微な変更は、希釈の度合いだけでなく、周波数と印加時間のために作られる必要がある。また、水に容易に可溶性である化合物は、DMSOの非存在下で投与することができるようになる。
倫理的な声明：すべての動物実験は、国内法や制度の規制を遵守して実施されるべきである。このプロトコルは、チューレーン大学機関動物実験委員会で使用するために承認された。
1。材料の調製（使用順に）
- 2ミリメートルの円形にセルロース濾紙（11ミクロン）の部分をカット。
- で、NaOHの1Mの溶液を調製H 2 Oを500mlの蒸留中のNaOHを20g溶解室温で保管してください。注意：NaOHのソリューションは、腐食性であり、アルカリ火傷を引き起こす可能性があります。
- 100 mg / mlのケタミンおよび20 mg / mlのケタミンおよび4 mg / mlのキシラジンの最終濃度のために1X PBSを37.5ミリリットル中20 mg / mlのキシラジンの2.5ミリリットルの10ミリリットルを希釈することにより麻酔薬のカクテルを用意してください。
- 濾過PBS 100mlにプロパラカイン塩酸塩500mgを溶解することによって（局所鎮痛のため）プロパラカイン塩酸塩の0.5％溶液を調製する。
- 8グラムのNaCl、KClを0.2グラム、1.44グラムのNa 2 HPO 4、蒸留H 2 Oの900ミリリットルのNaH 2 PO 4の0.23グラムを溶解することにより1X PBSを準備7.4のpHに調整する。無菌性を確保するために、 蒸留水とフィルターとの千ミリリットルの最終容量に解決策をもたらす。
- 1mlのDMSOにSAHAの26.4ミリグラムを溶解させて、ジメチルスルホキシド（DMSO）に〜100mmとSAHAの千Xストック溶液を準備します。 1Xに希釈（〜10μM）それぞれの使用のために濾過したPBS中でソリューションを提供します。最大1ヶ月間-20℃で保存溶液を保管してください。注意：DMSOは、既知の毒素や変異原である。
- 固定用のホルムアルデヒド（PFA）の4％溶液を調製します。化学フードの下で、PBSを90mlに、PFAの4グラムを溶解する。 65℃まで混合物を持参し、7.4のpHに滴定する。 PFAを溶解した後、最終容量100mlの溶液をもたらす。最長1ヶ月間、4℃で保存してください。注意：PFAは、アレルギー性の発ガン性、および毒性があることが知られている。
- PBS 94.5中へヤギ血清およびTriton X-100500μlの5mlの希釈することにより、ブロッキング緩衝液または1x調製する。
- PBSを99.5ミリリットルにトリトンX-100の500 ulの希釈することにより1X洗浄バッファーを準備します。
2。傷害·物の処理にアルカリバーン
- 1 MのNaOH溶液中に、直径〜2mmの濾紙のラウンド片を浸す。
- WH、100 mg / kgのケタミンおよび5 mg / kgのキシラジンの注射でマウスを麻酔ICHは、25グラムのマウスあたりのステップ1.3からの麻酔カクテル〜100μlである。麻酔は麻酔が無応答でなければなりません十分であれば、静かに動物の足指や尾をつまんで決定することができる〜麻酔深度インチに設定する1〜2分を取る必要があります。注意：お手入れは、マウスが麻酔誘発性低体温症に屈するしないように注意する必要があります。
- スポイトツールを使用して、局所的に地元の鎮痛のため角膜表面に0.5％プロパラカイン塩酸の滴を適用します。
- 滅菌ピンセットを使用して、NaOHを浸した濾紙を拾う。あなたは過剰NaOHをにしがみついたり、ろ紙から滴下気付いた場合は、簡単に過剰を吸収するために、ろ紙の乾燥片に浸したろ紙をタップします。角膜中央部にNAOH浸した濾紙を置きます。エリア内の〜2×2ミリメートル2の急性アルカリ火傷を発生させる30秒間そのままにしておきます。手術用顕微鏡は、適切に、ろ紙を置くのに役立ちます。注：マウスのSの片目だけをhouldは、他のコントロールとして機能してけがをする。
- フィルター紙を取り除きます。 10ミリリットルの注射器を使用して、静かに残留1MのNaOHを洗い流し回1X 10mlのPBSで目を洗い。
- すぐに角膜に局所1X SAHAのドロップ作業溶液（またはSAHAを含まないPBSで希釈し、DMSOからなる車両制御）を適用。 14日間、アプリケーション1日3回を繰り返します。注：それは傷害の開発や化合物の送達を妨げる可能性として、この期間中に局所抗生物質軟膏はお勧めできません。代わりに、このような3％ゲンタマイシン液などの液体抗生物質溶液を使用してください。
- 臨床的評価（以下のプロトコール3）に直接進むか、マウスを犠牲にして、角膜のフラットマウント（プロトコール下記4）または従来のパラフィン/冷凍組織学のために目を脱核。
3。臨床的評価
- 手術用顕微鏡下で盲検法でマウスの毎日の検査を行うとCスコア角膜混濁、ネバダ、容器の大きさに基づいてornealネバダ州。少なくとも2オブザーバーを使用し、2の平均である最終的なスコアを記録。
- 0-4の規模で角膜混濁スコア。 0 =完全にクリア; 1 =わずかに曇っ、虹彩と瞳孔見やすい。 2 =わずかに不透明、虹彩と瞳孔依然として検出;ほとんど検出3 =不透明、生徒;と瞳孔の無い景色を完全に不透明4 =。
- 0-3の規模でネバダ州のスコア。 0 =いいえ新生血管;角膜輪部の1 =新生血管; 2 =新生血管、角膜輪部に及ぶと角膜中心に近づく。角膜中心にまたがる3 =新生血管。
- 0-3の規模で船舶のサイズをスコア。 0 =いいえ新生血管;手術用顕微鏡下で検出可能な1 =新生血管;簡単に手術用顕微鏡下で見る2 =新生血管;簡単に顕微鏡なしで見られる3 =新生血管。
- デジタルカメラを使用して、7日と14日に、目の代表的な画像を取る。
4。角膜染色とフラットマウント
- 4℃で少なくとも1時間、4％PFA中で除核の目を修正しました。
- PBSを1Xと慎重に余分な組織を除去するために鉗子を使用するように目を移す。
- 手術用顕微鏡を用いて、（これは、目から流体を解放する必要があります注意してください）、目の角膜周囲領域に穿孔する針（18ゲージ）またはマイクロナイフを使用しています。
- セクション4.3.1で行われたミシン目からの後方部分から目（角膜）の前方部分をカットする外科はさみを使用しています。
- 4℃で一晩固定のために戻って、4％PFA中に角膜を転送
- 4％PFA（注意：PFAは危険ですと制度の規制に従って、廃棄しなければならない）を破棄し、残留PFAを除去するために、1X PBSで角膜を3回すすいでください。
- 組織を透過性にし、一次抗体の非特異的結合を防止するために室温で少なくとも2時間、1×ブロッキング緩衝液中でインキュベートする。。
- 100〜500倍希釈で、1×ブロッキングバッファーで一次抗体を適用します。マクロファージを検出するための（1:100で血管を検出するための例えば 、ラット抗マウスPECAM-1、1:500でリンパ管を検出するためのウサギ抗マウスLYVE-1、および/ またはラットanti-mouse-F4/80 1:100）。 4℃で一晩インキュベートする。
- 完全に非結合一次抗体を除去し、室温で各回1時間、1×洗浄バッファーで6回洗浄する。
- 1Xは500〜1,000倍希釈でブロッキング緩衝液中で二次抗体を適用します。 （ 例えば 488 nmの蛍光は1:800でヤギ抗ラットIgGとタグ付きまたは594 nmの蛍光は1:800でヤギ抗ウサギIgGとタグ付けされた）。 4℃で一晩インキュベートする。
- 完全に未結合の二次抗体を除去し、室温で1時間毎に1×PBSで3回洗浄する。
- 新鮮な1X PBSに角膜を転送して、手術用顕微鏡を用いて、慎重にセントに向けて周囲から4切開を作るER。これは、ほぼ等しい大きさの4つの象限に角膜を分割（その結果、形状がかなり蝶のようになります）で、それをスライドに平らにできるようにする必要があります。
- 蛍光イメージングのための封入剤の適切でマウントします。最適な結果を得るために、サンプルは直ちに画像化されるべきであり、デジタル写真を撮影するが、4℃で光から保護して数週間保存することができる
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Representative Results
アルカリ熱傷後、角膜NVは、予測可能な、時間依存的に発生します。1は 、未処理の動物（ 図1A）とHDAC阻害剤SAHA（ 図1Bで処理された動物の間での血管新生および角膜混濁の両方でスタークの違いを実証している）7日の時点で。
図2Aおよび2Bは 、一次PECAM-1とLYVE-1染色および二次のAlexa®488および594染色（それぞれ）で処理していない対照眼の角膜のフラットマウントを証明は2Cおよび2Dは 毎日処置した眼で同じ染色を示し HDAC阻害剤SAHAは、hemangiogenesisやリンパ管の両方の劇的な減少に注意してください。
図3Aと図3Bは、2汚れの詳細な情報を提供しています。 PECAM-1は、BLOのためのマーカーを提供していますOD槽（ 図3A）、LYVE-1は、リンパ管（ 図3B）に特異的に結合する。二つのフィールドのオーバーレイはリンパ管対 hemangiogenesisの比較、ならびに異なる細胞形態の比較を可能にする、 図3Cに示されている。
PFA固定（ステップ4.1）に続いて、目の凍結またはパラフィン包埋切片のどちらを生成する（上記のプロトコルでは詳述しない）従来の切片プロトコルを使用することができます。これは、フラットマウントがない侵略の定量化と同じレベルのことはできませんが、角膜の矢状切片はあなたの角膜の厚さや眼内のチューブの相対的な深さを表示することができます。3D-Fは、角膜の矢状、凍結切片を示している図とF4/80（マクロファージ染色）のいずれか、DAPI（核染色）、または合成画像。
図1。未処理の目の7日間、アルカリ熱傷後角膜血管新生の進行。（A）の代表画像。 （B）目の代表的な画像は、我々の目的の化合物（HDAC阻害剤SAHA）で1日3回処理した。角膜混濁および新生血管形成の違いに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。未処理のコントロール（AとB）とSAHAの代表的な画像（Cと＆＃扱わ160、D 7日間アルカリ熱傷後）、角膜（AとC）PECAM-1と血管内皮細胞染色の広視野画像。 （BとD）LYVE-1とリンパ管内皮細胞染色の広視野画像は、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3 PECAM-1（A）血管内皮細胞染色（B）LYVE-1とリンパ内皮細胞染色。 （C）は PECAM-1/LYVE-1染色をマージ。 （D）は矢状凍結切片中のマクロファージのF4/80染色。 （E）DAPI ST矢状カット凍結切片に細胞核のaining。 （F）は 、F4/80およびDAPI染色を吸収合併。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで紹介するプロトコルは、これらの3（相互に）プロセスを研究するための理想的なシステム作り、hemangiogenesis、リンパ管、および炎症の再現可能なレベルになる。この方法は、集中角膜NVを生成するが、より多くの監督ネバダ、すなわち角膜17の縫合、ペレット18を表現移植し、成長因子を引き起こすために開発されているいくつかの方法が、また、関心があるかもしれない。我々のプロトコルはまた、大型の哺乳動物のためまだ利用できません分子·遺伝子組換え技術のホストを最大限に活用するために実験室を可能にしながら、動物モデルを使用して簡単に提供し、成体マウスで使用するために設計されています。上記のプロトコルおよび代表的な結果を詳細C57BL/6Jバックグラウンド上でマウスの使用。アルビノマウスはまた、適切であろうと、容易に画像化を提供することができる;しかし、最近の研究では、アルビノマウスの新生血管応答は19ほど劇的ではないかもしれないことを示している。さらに、いくつかのとは異なり、他の血管新生モデルは、角膜NVは、手術用顕微鏡を通して、あるいは肉眼で検査して採点することができる。血管新生の程度のより厳密な定量化が必要な場合には、染色されたフラットマウントのデジタル画像は、ソフトウェアパッケージの数を介して分析することができる、フォトショップCS4でこれを行う方法の例ら 、コナーに見ることができる。 20最近の自然プロトコル紙 「マウスの酸素誘発性網膜症の定量化」。
プロパラカイン塩酸塩を局所用溶液（これは、このファミリーの他のメンバーが同様に受け入れられることが可能である）として適用されるアミノエステル鎮痛薬である。動物は手続きのための全身麻酔下に置かれているにもかかわらず、我々は追加の局所鎮痛を角膜に元に戻すの痛みを防止するための倫理的な必要性を考える。それは、PBSがあなたの化合物を希釈し、目をフィルタリングすることがフラッシュするために使用され、目全体を清浄に保つことが不可欠ですE手順（各使用前に汚染の目に見える兆候を確認してください）。 PBSは、個々の研究室の伝統に基づいて求められている。任意の等価平衡塩溶液は、所望の結果を達成する必要があります。同様に、他のソースからの抗体を使用している場合は、ここで紹介する免疫組織化学プロトコルのリビジョンのために呼び出すことができます（ つまり、必要な希釈度）。
この手順の最も技術的に挑戦的な部分は、NaOHを浸漬濾紙の初期配置と角膜の切開である。我々は両方の技術が前に実際の手順に練習することをお勧めします。濾紙をすべての側面からの新生血管の同レベルを促進するために、角膜の中央に配置する必要があります。オフセットのいずれかの程度は、マウスからマウスへの変動性の高レベルを作成します。角膜の切開は手先の器用さの良い取引を必要とします。眼は、角膜周囲の領域を穿孔する試みに応答して変形する可能性がある。我々は最初のカットを作り、内部の圧力を解放するために、鋭い、小さなゲージの針を使用することをお勧めします。最初の穿刺が行われた後、外科用ハサミを穴に挿入し、後部眼杯から眼の前部を分離する仮想線に沿って切断するために使用することができる。じっくりと作業する無傷の角膜が得られるはずです。
これは、このプロトコルの主な目的は、角膜アルカリ熱傷の治療における種々の化合物の有効性をアッセイするためにある間、それはまた、角膜創傷の再epitheliaztion、角膜線維症、および縁上皮幹を研究するために使用される可能性を秘めていることに留意すべきである細胞の再生。また、病理学的hemangiogenesis、リンパ管、および炎症のメカニズムを探求する一般的なモデルとなっています。プロトコルが行うだけでなく、その非侵襲的な性質、 インビボでの化合物スクリーニング、有効性試験のための魅力的な機会を提供することができる相対的な容易さsおよび病的血管新生に対するトランスジェニックマウスモデルの特徴付け。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、原稿を準備中の博士余市Liさんの助けに感謝しています。 SWがUTの南西医療センター、NIHグラントEY021862、失明基盤を防止するための研究からキャリア開発賞、加齢性黄斑変性症の研究における明るいフォーカス賞からの大統領の研究評議会の新しい研究者賞、チューレーン大学からのスタートアップ資金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 18 G Needle | BD | 305918 | |
| 10 ml Syringe | BD | 306575 | |
| 25 G Needle | BD | 305916 | |
| Anti-F4/80 (rat anti-mouse) | AbD Serotech | MCA497RT | |
| Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) | Abcam | ab14917 | |
| Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) | BD | 553370 | |
| Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat) | Invitrogen | A11006 | |
| Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit) | Invitrogen | A11012 | |
| Camera | Tucsen | TCC 5.0 ICE | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DMSO | Sigma | D4540-1L | Caution: Mutagenic, Toxic |
| Forceps (Blunt), Iris | WPI | 15915 | |
| Forceps (Sharp), Dumont #4 | WPI | 500340 | |
| KCl | Fisher | P217-500 | |
| Ketamine Solution | MedVet | RXKETAMINE | Controlled substance, proper license required for use. |
| Light Source for Microscope | AmScope | LED-14M-YA | |
| Microscope (Stereo 7X-45X) | AmScope | SM-1B | |
| Mounting Medium, VECTASHIELD | Vector | H-1000 | |
| NaCl | Fisher | S271-10 | |
| NaH2PO4 | Fisher | S397-500 | |
| NaOH | Fisher | S318-1 | Caution: Corrosive |
| Paraformaldehyde | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic | |
| Proparacaine Hydrochloride | Sigma | P4554-1G | |
| Scissors (5 mm blade), Vanas | WPI | 14003 | |
| Goat Serum | MPBio | 92939249 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-6508 | |
| Xylazine Solution | MedVet | RXANASED-20 |
References
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