Summary
Kärlnybildning (NV) av hornhinnan kan komplicera flera visuella patologier. Med hjälp av en kontrollerad, alkali-brännskada modell, kan en mätbar nivå av hornhinnans NV tas fram för mekanistiska studier av hornhinnan NV och utvärdering av potentiella terapier för neovaskulära sjukdomar.
Abstract
Under normala förhållanden är hornhinnan avaskulär och denna transparens är nödvändig för att upprätthålla god synskärpa. Kärlnybildning (NV) på hornhinnan, vilket kan orsakas av trauma, keratoplastik eller smittsam sjukdom, bryter ner den så kallade angiogena privilegium "av hornhinnan och utgör grunden för flera visuella sjukdomar som även kan leda till blindhet. Även om det finns flera behandlingsalternativ som finns, den grundläggande medicinska behov presenteras av korneala neovaskulära sjukdomar förblir ouppfyllda. För att utveckla säkra, effektiva och målinriktade terapier, krävs en tillförlitlig modell av hornhinnans NV och farmakologisk behandling. Här beskriver vi ett alkali-brännskada hornhinneneovaskularisation modell i mus. Detta protokoll ger en metod för applicering av en kontrollerad alkali-brännskada på hornhinnan, kan administrering av en farmakologisk förening av intresse, och visualisering av resultatet. Denna metod skulle kunna visa sig instrumenteringtal för att studera de mekanismer och möjligheter till ingripande i hornhinnan NV och andra neovaskulära sjukdomar.
Introduction
Hornhinnan blindhet är den fjärde vanligaste orsaken till blindhet, svarar för cirka 4% av alla fall 1. Hornhinneneovaskularisation (NV) spelar en viktig roll i många av dessa sjukdomar, inklusive herpeskeratit (den ledande infektiösa orsaken till blindhet i väst) och trakom (den vanligaste orsaken till smitt blindhet i världen) 2. Nuvarande behandlingar inkluderar steroider, icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID), anti-VEGF-terapier, och cyklosporin A såväl som konventionella eller laser kirurgiska tekniker 3. Men allvarligt försvagande natur hornhinnan NV baserade sjukdomar, bristen på kirurgiska anläggningar som kan behandla corneal NV, och avsaknaden av ett starkt utföra farmakologisk alternativet ledde en ny expert rundabordssamtal för att dra slutsatsen att, trots de ännu existerande terapier, den grundläggande medicinska behov presenteras av dessa sjukdomar är fortsatt otillfredsställda 4.
Den mänskliga hornhinnanbestår av 5 lager, 3 cell-lager (epitel, stroma och endotel) och 2-gränssnitt (Bowman membran och Descemet membran). Den fungerar som en mekanisk barriär och brytande ytan för ögat. Dess öppna karaktär är följden av en känslig balans av sina komponenter och är en integrerad del av sin rätta funktion 5. Normalt avaskulära mottar hornhinnan blod från mikrokärl som löper längs sin yttre kant, som matas från ciliära och oftalmiska artärerna. Hornhinnan NV uppstår när en stimulans främjar angiogenes av dessa fartyg så att de kan växa mot mitten av hornhinnan och därmed begränsa synen 6. Hornhinnan angiogenes inkluderar hemangiogenesis och lymfangiogenes, vilket resulterar i inväxt av blodkärl och lymfkärl från limbus vaskulära arkad mot mitten av hornhinnan. Detta leder till en uppdelning av hornhinnan "angiogena privilegium", en ökning av hornhinnans opacitet och fibros, störningar i hornhinnan layers och ödem 7. De exakta utlösare av hornhinnans NV är många, allt från en reaktion på infektionssjukdomar, såsom trakom till en kemiskt inducerad tillstånd orsakade traditionella läkemedel, industrikemikalier, eller till och med kemiska stridsmedel.
De molekylära mekanismerna för denna process inte är, än så länge, helt karakteriseras; dock har några nyckelspelare identifierats. Under normala betingelser hornhinnan har en unik "angiogena privilegium" som upprätthålls av en redundant array av anti-angiogena faktorer (t.ex. lösliga VEGF-R1) 8. Emellertid, som svar på en yttre stimulans (såsom en skada) kommer det att finnas en lokal uppreglering av pro-angiogena faktorer (t ex VEGF-A). Detta tips för balans av pro-och anti-angiogena faktorer som ligger bakom hornhinnan s angiogena privilegium, och leder till hemangiogenesis, lymphangeogenesis, och inflammation, därför orsakar hornhinnan skadas och till och med blindhet 9.
<p class = "jove_content"> Med tanke på det medicinska behovet av denna mycket försvagande patologi, är det av intresse för området för att få en tillförlitlig djurmodell av hornhinnans NV. Här presenterar vi en sådan modell: kontrollerad alkali-brännskador. Olika modeller ögonskador som bygger på att använda filter papper ringar har använts sedan 1970-talet 10. År 1989, en grupp av Harvard Medical School ögonläkare tecknas en standardmodell av en central hornhinnan alkali-brännskada i kanin baserat på blötläggning en bit cirkulärt filterpapper med natriumhydroxid (NaOH) och tillämpa den på hornhinnan vid en specifik rad koncentrationer 11. Sedan dess har denna teknik är anpassad för att användas i mus 12-14. Nyligen Wang labbet studerade de terapeutiska effekterna av histonedeacetylase (HDAC) hämmare SAHA i patogenesen av hornhinnans NV använda en mus hornhinnan alkali-brännskada modell 15. Metoden för musen hornhinnan alkali-brännskademodell presenteras här byggdesfrämst på tidigare arbete av två andra tidningar 14,16.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Följande protokoll och representativa resultat använder HDAC hämmare SAHA som exempel föreningen. Men detta protokoll på något sätt begränsad till användning av SAHA, och rekommenderas som en generell metod för att testa effekterna av lösliga föreningar på hornhinneneovaskularisering. Mindre ändringar behöver göras för utspädningsgraden samt frekvens och varaktighet av ansökan. Dessutom kommer föreningar som är lättlösligt i vatten kunna administreras i frånvaro av DMSO.
Etiska riktlinjer: Alla djurförsök ska endast utföras i enlighet med nationell lagstiftning och institutionella regler. Protokollet godkändes för användning vid Tulane University Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Beredning av material (i den ordning de används)
- Skär en bit av cellulosafilterpapper (11 nm) i 2 mm cirklar.
- Bered en 1 M lösning av NaOH genomupplösning av 20 g NaOH i 500 ml destillerat H2O Förvara i rumstemperatur. VARNING: NaOH-lösningar är frätande och kan orsaka alkali-brännskador.
- Förbered ett bedövningsmedel cocktail genom utspädning 10 ml av 100 mg / ml ketamin och 2,5 ml av 20 mg / ml xylazin i 37,5 ml av 1 x PBS för en slutkoncentration av 20 mg / ml ketamin och 4 mg / ml xylazin.
- Bered en 0,5% lösning av proparakain hydroklorid (för topisk analgesi) genom upplösning av 500 mg av proparakain hydroklorid i 100 ml filtrerat PBS.
- Förbered 1x PBS genom att lösa 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, och 0,23 g NaH 2 PO 4 i 900 ml destillerat H2O Justera till 7,4 pH. Värm lösningen till en slutlig volym av 1000 ml med destillerat H2O och filter för att säkerställa sterilitet.
- Förbered 1000 x stamlösningar av SAHA vid ~ 100 mM i dimetylsulfoxid (DMSO) genom upplösning av 26,4 mg av SAHA i 1 ml DMSO. Späd till 1x (~ 10 ^ M)lösning i filtrerad PBS för varje användning. Förvara stamlösning vid -20 ° C i upp till en månad. VARNING: DMSO är en känd toxin och mutagent.
- Bered en 4% lösning av paraformaldehyd (PFA) för fixering. Enligt ett dragskåp, lös 4 g av PFA i 90 ml PBS. Värm blandningen till 65 ° C och titrera till ett pH av 7,4. När PFA är upplöst, bringa lösningen till en slutvolym av 100 ml. Förvaras vid 4 ° C i upp till en månad. VARNING: PFA är en känd för att vara allergiframkallande, cancerframkallande och giftiga.
- Bered 1x blockeringsbuffert genom att späda 5 ml getserum och 500 ul av Triton X-100 i 94,5 ml PBS.
- Bered 1x tvättbuffert genom att späda 500 | il Triton X-100 i 99,5 ml PBS.
2. Alkali-Brännskada & Förening Behandling
- Blöt en runda stycket av filterpapper, ~ 2 mm i diameter, i en lösning av 1 M NaOH.
- Bedöva musen med en injektion av 100 mg / kg ketamin och 5 mg / kg xylazin, WHich är ~ 100 pl av anestesi cocktail från steg 1,3 per 25 g mus. Anestesi bör ta ~ 1-2 min för att ställa in djup anestesi kan bestämmas genom att försiktigt klämma på tå eller svans av djuret, om anestesin är tillräcklig bör det finnas något svar. Obs: Var försiktig för att se till att musen inte ge efter för anestesi inducerad hypotermi.
- Med användning av en pipett, topiskt applicera en droppe 0,5% proparakain hydroklorid på hornhinnans yta för lokal analgesi.
- Med hjälp av steril pincett, plocka upp en bit av NaOH indränkt filterpapper. Om du märker överskott NaOH klamrar sig eller droppar från filterpapper, kort peka på indränkt filterpapper på en torr bit filterpapper för att absorbera överskottet. Placera bit NaOH indränkt filterpapper på den centrala hornhinnan. Lämna den i 30 sekunder för att skapa en akut alkali-bränna på ~ 2 x 2 mm 2 i området. Ett operationsmikroskop är till hjälp för korrekt placering av filterpapper. Obs: Endast ett öga på musen should skadas med den andra tjänstgör som kontroll.
- Ta bort filterpapper. Med hjälp av en 10 ml spruta, försiktigt skölja ögat med 10 ml 1x PBS två gånger för att tvätta bort resterande 1 M NaOH.
- Omedelbart tillämpa en droppe 1x SAHA arbetslösning (eller en fordonskontroll bestående av PBS utspädd DMSO innehåller ingen SAHA) lokalt på hornhinnan. Upprepa ansökan 3x/day i 14 dagar. Obs: under denna period en aktuell antibiotika salva rekommenderas inte eftersom det kan störa utvecklingen av skadan och leverans av föreningen. Använd en flytande antibiotisk lösning, exempelvis 3% Gentamicin lösning, i stället.
- Gå direkt till klinisk bedömning (protokoll 3 nedan) eller offra musen och enucleate ögonen för hornhinnans platt fäste (protokoll 4 nedan) eller vanlig paraffin / fryst histologi.
3. Klinisk bedömning
- Utför en daglig granskning av mössen i en blindad under ett operationsmikroskop och poäng corneal NV baserat på hornhinnegrumling, NV, och fartygsstorlek. Använd minst två observatörer och spela in en slutpoäng som är genomsnittet av de två.
- Betyg korneal opacitet på en skala från 0-4. 0 = helt klart; 1 = något grumlig, iris och pupill lätt synlig; 2 = nästan genomskinlig iris och elev fortfarande spåras; 3 = ogenomskinliga, elever knappt detekterbara; och 4 = helt ogenomskinlig ingen uppfattning av eleven.
- Score NV på en skala från 0-3. 0 = inga neovessels; 1 = neovessels vid hornhinnans limbus; 2 = neovessels spänner hornhinnans limbus och närmar sig hornhinnans centrum; 3 = neovessels spänner hornhinnans centrum.
- Betyg fartygsstorlek på en skala från 0-3. 0 = inga neovessels; 1 = neovessels detekterbara i kirurgisk mikroskop; 2 = neovessels lätta att se under kirurgisk mikroskop; 3 = neovessels lätt ses utan mikroskop.
- Genom att använda en digital kamera, ta representativa bilder av ögat vid 7 dagar och 14 dagar.
4.Korneal missfärgning och Flat Mounts
- Fix enukleerat öga i 4% PFA i minst en timme vid 4 ° C.
- För över ögat till 1x PBS och använda pincett för att försiktigt ta bort överflödig vävnad.
- Med hjälp av en kirurgisk mikroskop, använd en nål (18 gauge) eller mikro kniv för att perforera pericorneal regionen i ögat (notera: detta skulle frigöra vätska från ögat).
- Från perforeringen görs i avsnitt 4.3.1 använda ett par av kirurgiska saxar för att klippa den främre delen av ögat (hornhinnan), från den bakre delen.
- Överför kornea tillbaka in 4% PFA för fixering över natten vid 4 ° C.
- Släng 4% PFA (VARNING: PFA är farligt och måste kasseras i enlighet med de institutionella bestämmelser) och skölj hornhinnan tre gånger med 1x PBS för att avlägsna eventuella kvarvarande PFA.
- Inkubera i 1x blockeringsbuffert under minst 2 h vid rumstemperatur för att permeabilisera vävnaden och förhindra icke-specifik bindning av den primära antikroppen.
- Applicera primära antikroppen i 1x blockeringsbuffert, vid ett 100 till 500-faldig utspädning. (T ex rått-anti-mus-PECAM-1 för detektering av blodkärlen vid 1:100, kanin-anti-mus-LYVE-1 för detektering av lymfkärl vid 1:500, och / eller råtta anti-mouse-F4/80 för detektering av makrofager vid 1:100). Inkubera vid 4 ° C över natten.
- Tvätta sex gånger med 1x tvättbuffert under 1 timme varje gång vid rumstemperatur för att fullständigt avlägsna obunden primär antikropp.
- Applicera en sekundär antikropp i 1x blockerande buffert vid en 500-1000 faldig utspädning. (Till exempel en 488 nm fluorescent taggade get-anti-rått-IgG vid 1:800 eller en 594 nm fluorescerande märkta get-anti-kanin-IgG vid 1:800). Inkubera vid 4 ° C över natten.
- Tvätta tre gånger med 1 x PBS under 1 h vardera vid rumstemperatur för att fullständigt avlägsna obunden sekundär antikropp.
- För över hornhinnan till frisk 1x PBS och, med hjälp av ett operationsmikroskop, försiktigt göra fyra snitt från periferin mot center. Detta bör dela hornhinnan in i fyra kvadranter av ungefär samma storlek (den resulterande formen bör titta snarare som en fjäril) och låt den ligga plant på en bild.
- Montera med en monteringsmedel lämpliga för fluorescerande avbildning. För bästa resultat bör proverna avbildas omedelbart och digitala fotografier tagna, men kan förvaras i flera veckor skyddas från ljus vid 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter alkali-brännskador, inträffar hornhinnans NV på ett förutsägbart, tidsberoende sätt. Figur 1 visar den markanta skillnaden i både kärlnybildning och hornhinnegrumling mellan ett obehandlat djur (figur 1 A) och ett djur som behandlats med HDAC hämmare SAHA (Figur 1B ) på 7 dygn tidpunkt.
Figurerna 2A och 2B visar en korneal platt fäste av en obehandlad kontroll öga med primär PECAM-1 och LYVE-1-färgning och sekundär Alexa Fluor 488 och 594 färgning (respektive). Figurerna 2C och 2D visar samma färgning på ett öga behandlades dagligen med HDAC hämmare SAHA, notera den dramatiska minskningen i både hemangiogenesis och lymfangiogenes.
Figur 3A och 3B ger en närmare titt på de två fläckar. PECAM-1 serverar en markör för bloOD kärlen (figur 3A), medan LYVE-1 binder specifikt till lymfkärlen (Figur 3B). En överlagring av de två fälten visas i figur 3C, vilket gör jämförelser av hemangiogenesis vs lymfangiogenes samt en jämförelse av olika cell morfologi.
Efter PFA fixering (steg 4,1), kan du använda konventionella sektione protokoll (inte anges i protokollet ovan) för att generera antingen frysta eller paraffin inbäddade delar av ögat. Även om detta inte är möjligt på samma nivå av kvantifiering av invasion som en platt fäste gör det kan sagittala sektioner av hornhinnans visa hornhinnans tjocklek och relativt djup av rören inom ögat. Figurerna 3D-F visar sagittal, frysta sektioner av hornhinnan och antingen F4/80 (makrofag färgning), DAPI (nukleär färgning), eller en sammanslagna bilden.
Figur 1. Progression av hornhinneneovaskularisering sju dagar efter alkali-brännskada. (A) representant bild av en obehandlad öga. (B) Representant bild av ett öga behandlas tre gånger per dag med vår förening av intresse (HDAC hämmare SAHA). Notera skillnaden i hornhinnegrumling och kärlnybildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa bilder av en obehandlad kontroll (A och B) och en SAHA behandlad (C och & #160, D) hornhinna sju dagar efter alkali-brännskada (A och C) Brett fält bild av vaskulär endotel cellfärgning med PECAM-1.. (B och D) Brett fält bild av lymfatiska endotelceller färgning med LYVE-1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. (A) Vascular endothelial cellfärgning med PECAM-1. (B) lymfatiska endotel cellfärgning med LYVE-1. (C) Sammanslagen PECAM-1/LYVE-1 färgning. (D) F4/80 färgning av makrofager i en sagittal fryst avsnitt. (E) DAPI-staining av cellkärnan i en sagittal snitt fryst avsnitt. (F) Sammanslagen F4/80 och DAPI färgning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet presenteras här ger reproducerbara nivåer hemangiogenesis, lymfangiogenes, och inflammation, vilket gör det till ett idealiskt system för att studera dessa tre (inbördes) processer. Även om denna metod ger centraliserad hornhinnans NV, flera metoder som har utvecklats för att ge mer riktad NV, nämligen suturering av hornhinnan 17 och implanterade tillväxt-faktorn uttrycker pellets 18, också kan vara av intresse. Vår protokoll är avsedd för användning i den vuxna musen, som ger en lättanvänd djurmodell samtidigt som det ger ett labb för att dra full nytta av en rad molekylära och transgena tekniker som ännu inte kan större däggdjur. Ovanstående protokoll och representativa resultat detalj användningen av möss på en C57BL/6J bakgrund. Albino möss skulle också vara lämpliga och kan ge för enklare bildbehandling; tyder emellertid på en färsk studie att den neovaskulära svaret hos albino möss inte kan vara så dramatisk 19. Vidare, till skillnad från fleraandra neovaskularisation modeller, kan hornhinnan NV görs med undersökning genom en kirurgisk mikroskop eller till och med blotta ögat. Om det krävs en mer noggrann kvantifiering av graden av kärlnybildning, kan digitala bilder av den färgade platta fästet analyseras via ett antal av programvarupaket, kan ett exempel på hur man kan göra det med Photoshop CS4 ses i Conner, et al. senaste Nature Protocols papper "Kvantifiering av syre-inducerad retinopati i musen" 20.
Proparakain hydroklorid är en aminoester smärtstillande appliceras som en aktuell lösning (det är möjligt att andra medlemmar av denna familj skulle vara lika acceptabelt). Även om djuret placeras under narkos för förfarandet, anser vi ytterligare aktuella smärtlindring en etisk nödvändighet för att förhindra att ångra smärta på hornhinnan. Det är absolut nödvändigt att PBS används för att späda din förening och spola ögat filtreras och hållas rena hela the förfarande (kolla efter synliga tecken på förorening före varje användning). PBS är påkallad utifrån enskilda lab tradition; Varje likvärdigt balanserad saltlösning bör uppnå det önskade resultatet. På samma sätt kan revideringar av immunohistokemi protokoll presenteras här kallas för om antikroppar från andra källor används (dvs graden av utspädning krävs).
De mest tekniskt utmanande delar av detta förfarande är den initiala placeringen av NaOH indränkt filterpapper och dissektion av hornhinnan. Vi rekommenderar att båda teknikerna övas innan själva proceduren. Filterpapper ska placeras i mitten av hornhinnan för att främja en likvärdig nivå på kärlnybildning från alla håll. Varje grad av förskjutning kommer att skapa en hög grad av variation från mus till mus. Hornhinnan dissektion kräver en hel del fingerfärdighet. Ögat är benägna att deformeras som svar på ett försök att perforera pericorneal regionen.Vi rekommenderar att du använder en skarp, liten nål för att göra den första snitt och släpper trycket inne. Efter en initial punktering görs, kan ett par av kirurgiska saxar införas i hålet och används för att skära längs en imaginär linje som separerar den främre delen av ögat från den bakre ögonkoppen. Arbeta långsamt och försiktigt bör ge en intakt hornhinna.
Det bör noteras att medan det primära syftet med detta protokoll är att analysera effekten av olika föreningar i behandling av hornhinnan alkali-brännskada den har också potential att användas för att studera hornhinnan sår åter epitheliaztion, korneal fibros, och limbus epitel stam cellförnyelsen. Dessutom fungerar den som en generell modell för att undersöka mekanismerna för patologisk hemangiogenesis, lymfangiogenes, och inflammation. Den relativa lätthet med vilken kan utföras protokollet, liksom dess icke-invasiv art, presenterar en tilltalande möjlighet för in vivo-förening screening, effektivitet testets, och karakterisering av transgena musmodeller med avseende på patologisk angiogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för Dr Xinyu Lis hjälp att förbereda manuskriptet. SW fick stöd av ett startfond från Tulane University, VD forskningsråd New Investigator Award från Southwestern Medical Center, NIH Grant EY021862, en utveckling utmärkelse karriär från forskning att förebygga blindhet stiftelse, och en ljus Focus Award Ålder makuladegeneration Research .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 18 G Needle | BD | 305918 | |
| 10 ml Syringe | BD | 306575 | |
| 25 G Needle | BD | 305916 | |
| Anti-F4/80 (rat anti-mouse) | AbD Serotech | MCA497RT | |
| Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) | Abcam | ab14917 | |
| Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) | BD | 553370 | |
| Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat) | Invitrogen | A11006 | |
| Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit) | Invitrogen | A11012 | |
| Camera | Tucsen | TCC 5.0 ICE | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DMSO | Sigma | D4540-1L | Caution: Mutagenic, Toxic |
| Forceps (Blunt), Iris | WPI | 15915 | |
| Forceps (Sharp), Dumont #4 | WPI | 500340 | |
| KCl | Fisher | P217-500 | |
| Ketamine Solution | MedVet | RXKETAMINE | Controlled substance, proper license required for use. |
| Light Source for Microscope | AmScope | LED-14M-YA | |
| Microscope (Stereo 7X-45X) | AmScope | SM-1B | |
| Mounting Medium, VECTASHIELD | Vector | H-1000 | |
| NaCl | Fisher | S271-10 | |
| NaH2PO4 | Fisher | S397-500 | |
| NaOH | Fisher | S318-1 | Caution: Corrosive |
| Paraformaldehyde | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic | |
| Proparacaine Hydrochloride | Sigma | P4554-1G | |
| Scissors (5 mm blade), Vanas | WPI | 14003 | |
| Goat Serum | MPBio | 92939249 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-6508 | |
| Xylazine Solution | MedVet | RXANASED-20 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. Global estimates of visual impairment. Br. J. Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2010).
- Whitcher, J., Srinivasan, M., Upadhyay, M. Corneal Blindness: A Global Perspective. Bull. World Health Org. 79 (3), 214-221 (2003).
- Gupta, D., Illingworth, C. Treatments for corneal neovascularization: a review. Cornea. 30 (8), 927-938 (2011).
- Cursiefen, C., et al. Consensus statement on indications for anti-angiogenic therapy in the management of corneal diseases associated with neovascularisation: outcome of an expert roundtable. Br. J. Ophthalmol. 96 (1), 3-9 (2012).
- Delmonte, D., Kim, T. Anatomy and Physiology of the Cornea. J. Cataract Refract. Surg. 37 (3), 588-598 (2011).
- Cursiefen, C., Seitz, B., Dana, M. R., Streilein, J. W. Angiogenesis and lymphangiogenesis in the cornea. Pathogenesis, clinical implications and treatment options. Der Ophthalmologe. 100 (4), 292-229 (2003).
- Chang, J., Gabison, E., Kato, T., Azar, D. Corneal Neovascularization. Curr. Opin Ophthalmol. 12 (4), 242-249 (2001).
- Ambati, B., et al. Corneal Avascularity is due to Soluble VEGF Receptor-1. Nature. 443 (7114), 993-997 (2006).
- Cursiefen, C., et al. VEGF-A Stimulates Lymphangiogenesis and Hemangiogenesis in Inflammatory Neovascularization via Macrophage Recruitment. J. Clin. Invest. 113 (7), 1040-1050 (2004).
- Jiri, O. Paper Strips and Rings as Simple Tools for Standardization of Experimental Eye Injuries. Ophthal. Res. 1975 (7), 363-367 (2009).
- Ormerod, L., Abelson, M., Kenyon, K. Standard Models of Corneal Injury Using Alkali-Immersed Filter Discs Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30 (10), 2148-2153 (1989).
- Saika, S., et al. Therapeutic effects of adenoviral gene transfer of bone morphogenic protein-7 on a corneal alkali injury model in mice. Lab. Invest. 85 (4), 474-486 (2005).
- Ferrari, G., Bignami, F., Giacomini, C., Franchini, S., Rama, P. Safety and efficacy of topical infliximab in a mouse model of ocular surface scarring. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (3), 1680-1688 (2013).
- Sosne, G., Christopherson, P., Barrett, R., Fridman, R. Thymosin-beta4 modulates corneal matrix metalloproteinase levels and polymorphonuclear cell infiltration after alkali injury.Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46 (7), 2388-2395 (2005).
- Li, X., et al. Inhibition of Multiple Pathogenic Pathways by Histone Deacetylase Inhibitor SAHA in a Corneal Alkali-Burn Injury Model. Mol. Pharm. 10 (1), 307-318 (2013).
- Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmol. 86 (3), 322-328 (2008).
- Bucher, F., Parthasarathy, A., Bergua, A., Onderka, J., Regenfuß, B., Cursiefen, C., Bock, F. Topical Ranibizumab inhibits inflammatory corneal hem- and lymphangiogenesis. Acta Ophthalmol. , (2012).
- Hajrasouliha, A., Sadrai, Z., Chauhan, S., Dana, R. b-FGF induces corneal blood and lymphatic vessel growth in a spatially distinct pattern. Cornea. 31 (7), 804-809 (2012).
- Rogers, M., et al. The albino mutation of tyrosinase alters ocular angiogenic responsiveness. Angiogenesis. 16 (3), 639-646 (2013).
- Connor, K., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological. Nat. Protoc. 4 (11), 1565-1573 (2009).
