Summary
Здесь мы опишем метод для анализа изменений в инициации мРНК перевода эукариотических клеток в ответ на стресс условия. Этот метод основан на разделении скорости на градиентах сахарозы на перевод рибосом из не-переводные рибосом.
Abstract
Точный контроль трансляции мРНК имеет основополагающее значение для эукариотической гомеостаза клеток, особенно в ответ на физиологической и патологической стресса. Изменения этой программы может привести к росту поврежденных клеток, отличительной чертой развития рака, или к преждевременной смерти клеток, таких как видно на нейродегенеративных заболеваний. Многое из того, что известно о молекулярную основу для поступательного контроля была получена из полисом анализа с использованием градиентной системы фракционирования плотности. Этот метод основан на ультрацентрифугирования цитоплазматических экстрактов на линейном градиенте сахарозы. После того, как спин завершена, система позволяет фракционирование и количественное определение центрифугировали зон, соответствующих различным перевод рибосом популяции, в результате чего профиль полисом. Изменения в профиле полисом свидетельствуют о изменениях или дефектов в инициации трансляции, которые происходят в ответ на различные виды стресса. Этот метод также позволяет оценить тыс.е роль специфических белков на инициации трансляции, а также измерять поступательное активность специфических мРНК. Здесь мы опишем наш протокол для выполнения профили полисом для оценки инициацию трансляции эукариотических клеток и тканей под либо нормальных или стрессовых условиях роста.
Introduction
Эукариотические клетки постоянно встречаемся ряд вредных физиологических и экологических условиях стресса, которые требуют быстрого реагирования адаптивного клеток. Реакция на стресс сотовый включает в себя точный баланс между анти-выживания и про-выживания действующих факторов. Разрушение этого баланса может иметь необратимые последствия, ведущие развитие человеческих патологий, таких как рак и нейродегенеративные заболевания. Во время первой стадии реакции на стресс, клетки активируют пути про-выживания, которые включают скоординированное управление изменениями в экспрессии генов на уровне трансляции мРНК.
перевод мРНК у эукариот является сложным клеточный процесс, который включает в скоординированных взаимодействия между инициации трансляции факторов (EIFS), специфическая РНК-связывающих белков (RBDS) и молекул РНК 1. перевод мРНК делится на три этапа: инициирование, удлинение и прекращение. Хотя все три фазы могут быть регуlatory механизмы, трансляционные механизмы контроля нацелены в основном на этапе инициирования перевода, который, таким образом, представляет собой ограничивающую скорость стадию синтеза белка 2.
Инициация трансляции является весьма приказал процесс, который начинается с формирования eIF2a.GTP.Met-тРНК я встретил тройной комплекс и его последующее связывание с 40S рибосомы субъединицы, что приводит к образованию комплекса предварительно инициации. Следующим шагом является привлечение в преиниационного комплекса к мРНК, которая включает деятельность инициации трансляции таких факторов, как eIF4F и eIF3. 48S преиниационного комплекс таким образом подвергается конкретные конформационные изменения, которые позволяют эту технику, чтобы начать сканирование 5'-нетранслируемой области мРНК, пока он не признает инициирующий кодон августа Большинство факторов инициации трансляции затем освобожден и 60S субъединицы набираются сформировать 80S рибосом комплекс компетентным для перевода,т, который начинается синтез точка белка (рис. 1). Более одного 80S monosome можно переводить же мРНК в то время, производя так называемые полисомы (или полирибосомы). Плотность полисом на мРНК отражает инициирование, удлинение и прекращение ставки и, следовательно, является мерой переводимости определенного транскрипта. Однако полисом профиль используется в основном для оценки изменений в трансляции мРНК на стадии инициирования. Здесь мы использовали протеасомную ингибитор как ингибитора инициации трансляции. Лечение раковых клеток с этим препаратом вызывает реакцию на стресс, характеризующийся активации стресс-киназы имени HRI который фосфорилирует фактор инициации трансляции eIF2a 3. Фосфорилирование eIF2a является одним из основных событий, приведших к ингибирования инициации трансляции в клетках млекопитающих 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол следует руководству утвержден этической экспертизы Совета Лаваль.
1. Подготовка клеточных культур и мозг Манипуляция
- Млекопитающих и клетках дрозофилы
- Расти HeLa шейки раковые клетки и Шнайдер Drosophila эмбриональные клетки в соответствии с рекомендациями American Type Culture Collection. Работа с клетками при низкой прохода.
- Пластина клеток в целях достижения 80% слияния день эксперимента. Для получения наилучших результатов используйте ~ 12 х 10 6 клеток для каждой экспериментальной состоянии. До принятия экстракты для анализа полисом, стимулировать перевод, добавив свежий полной среды, по крайней мере 90 мин.
- Изоляция Мозг: Изолировать мозги от мышей в возрасте от 9 до 16 дней после рождения. Эвтаназия включает CO 2 ингаляции после анестезии и смещения шейных позвонков. После жертвоприношения, изолировать весь мозг и либо место, ят при -80 ° С или непосредственно перенести его в холодную PBS 1X к немедленному использованию.
2. Подготовка градиента плотности Фракционирование система
- Промыть систему труб с 0,1% SDS в течение 5 мин.
- Промыть систему труб с 70% этанолом в течение 5 мин, а затем с RNaseZAP раствор в течение 5 мин, после чего ее промывки смесью DEPC воды.
- Насос воздух для сушки систему труб устройства.
3. Получение градиентах сахарозы
- Сделать 15% и 55% растворы сахарозы в 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 1,25 мМ MgCl 2, 150 мМ NaCl и 1 мМ DTT.
- Генерировать линейная 15-55% сахарозы градиент используя Isco Модель 160 градиент бывший, в соответствии с инструкциями изготовителя. Тем не менее, важно также контролировать скорость насоса перистальтический TRIS, чтобы избежать создание пузырьков или завихрений в градиентах. Хранить градиенты при 4 ° С до использования.
- Во время, когда программа градиент производитель работает, охладить ультрацентрифугу до 4 ° С
4. Подготовка Cell и мозг мыши Экстракты
- Подготовка клеточных экстрактов
- Место пластина (ы) на льду и мыть клетки 3x холодной PBS 1X.
- Урожай клеток (~ 12 × 10 6) в 1 мл лизирующего буфера (20 мМ Tris-HCl при рН 7,4, 1,25 мМ MgCl 2, 150 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 1% Nonidet P40, 5 ед / мл ингибитора РНКазы, дополненной с полными мини ЭДТА без ингибитора протеазы коктейль таблеток), перенесите их в пробирку Эппендорф, и хорошо перемешать, передав им 15x через 1cc U100 инсулиновый шприц 28 G 1/2. Пусть клеточный лизат отдыхать на льду в течение 15 мин.
- Положите несколько капель клеточного лизата на слайд, чтобы оценить клеточный лизис, наблюдая при контрастном микроскопе фазы с использованием объектива 10X. Только ядра должны быть видны и никакие клеточные мембраны не должны быть видны свидетельствование для лизиса клеток. В качестве контроля наблюдатьunlysed клетки.
- Уточнение клеточного лизата центрифугированием при 11000 х г в течение 20 мин при 4 ° С и держать растворимый лизат, содержащий полирибосомы.
- Подготовка мозга мыши экстрактов
- Однородный весь изолированный мозг (~ 500 мг) на 10 ударов в ледяной Даунса гомогенизаторе с 2 мл лизирующего буфера и уточнить гомогената центрифугированием при 11000 х г в течение 15 мин при 4 ° С.
- Загрузить полученного супернатанта на подушке 50% сахарозы и приступить к седиментации в течение 2 часов при 200 000 х г в использовании Ультрацентрифуга ротор TH-641 при 4 ° С.
- Ресуспендируют полупрозрачный осадка, содержащего полирибосомы в 1 мл буфера для лизиса и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Пусть подвески отдохнуть на льду в течение 30 мин перед загрузкой на градиентов.
5. Загрузка Экстракты на градиентах сахарозы и ультрацентрифугированием
- Измерьте концентрациюРНК, присутствующего в цитоплазматической экстракта с помощью спектрофотометра. Осторожно и медленно загрузить ~ 20 OD 260 единиц экстракта на 15% до 55% градиенте сахарозы. Убедитесь в том, что есть 2-3 мм свободного пространства на поверхности трубы, чтобы избежать переполнения трубки во время центрифугирования.
- Центрифуга градиенты с помощью ультра-центрифуги в течение 2 часов 30 мин при 230 000 мкг в использовании ультрацентрифуге ротор TH-641 при 4 ° С. По окончании центрифугирования, удаления труб и разместить их на льду осторожно, чтобы не потревожить градиенты.
6. Фракционирование цитоплазматических экстрактов для полисом профилирования
- Поместите градиентах сахарозы на автоматизированной системы плотности фракционирования и приступить к автоматизированной фракционирования и сбора фракций (0,5 мл каждого), как описано производителем.
- Соберите каждую фракцию (~ 500 мкл) на отдельные Эппендорф с непрерывным контролем поглощения при 254 нм. В parallэль градиента операции фракционирования, профиль polyribosomal будете редактировать на листе бумаги. Вместо этого можно использовать блок сбора данных, прикрепленный к самописца, чтобы иметь электронный приобретение профиля полисом.
- В конце каждого запуска, передавать собранные Eppendorfs на сухом льду. В это время, как магазин собранных фракций при -80 ° С или непосредственно осадок белок-РНК комплексов следующим образом.
7. Белок Добыча и анализ
- К каждой фракции, собранной из градиенте сахарозы, добавление 2 объемами 100% холодного этанола и пусть РНК-белковых комплексов осадок при -20 ° С в течение ночи.
- Центрифуга друг РНК-белок осадок при 11000 мкг в течение 20 мин при 4 ° С, затем вымыть с 70% этанола. Сухая и ресуспендируют осадок в SDS-PAGE образца буфера перед выполнением вестерн-блоттинга с использованием специфических антител (см. рисунок 2).
8. Экстракция РНК инализ
- Осадок РНК-белковые комплексы, как в разделе 7.1. Ресуспендируют каждый РНК-белок осадок в буфере для лизиса, содержащего 0,1% SDS. Дайджест белкового компонента осадка с 2 мг / мл протеиназы К в течение 30 мин в водяной бане при 55 °.
- Извлечение РНК компоненты осадка добавлением 1 объема "фенол: хлороформ", 2 объемами хлороформа и 0,1 объема 2 М NaOAc рН 4 и центрифугированием при 10000 х г при 4 ° С в течение 20 мин. Осадок РНК из полученной водной фазы каждого образца в течение ночи при -20 ° С добавлением 1 объемом изопропанола и 0,2 мкг / мкл гликогена. Спин осадка в течение 1 часа при 10000 х г при 4 ° С. Вымойте РНК гранул с 70% холодного этанола.
- Ресуспендируют осадок РНК в небольшом объеме РНКазы свободной воды. Оцените количество и качество РНК с использованием спектрофотометра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как упомянуто выше, полисом профиль позволяет анализ изменений инициации трансляции в условиях стресса. Рисунок 1 представляет собой упрощенную вид инициации трансляции, которая, как описано ранее, многоэтапный процесс, включающий упорядоченную сборку инициации трансляции комплексов. В нормальных условиях роста, инициации трансляции комплексы превращаются в полирибосом чьи обнаружение полисом профиля свидетельствуют для активного инициации трансляции (рис. 2; Необработанные). В условиях стресса однако, инициации трансляции заблокирован в результате накопления 80S monosomes и сокращение полисом пиков (рис. 2; ингибитор протеасом).
Рисунок 1. Ы implified вид инициации трансляции. Инициация трансляции состоит из нескольких этапов: 1) Формирование eIF2a.GTP.Met-тРНК я встретил тройной комплекс, 2) объединение тройного комплекса с 40S рибосом формирования преиниационного комплекс 43S, 3) ассоциация 43S комплексов с мРНК образующего комплекс 48S преиниационного, 4) сканирование 5'-нетранслируемой области мРНК 48S рибосом, пока не достигнет и идентифицирует кодон инициации августа и 5) набор большой субъединицы рибосомы 60S к 48S формирование комплекса 80S и в этот момент полипептидов начинается синтез. Каждый шаг инициации трансляции является активность нескольких факторов инициации трансляции. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
upload/51164/51164fig2highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51164/51164fig2.jpg "ширина =" 500px "/>
Рисунок 2. Профили и анализ полисом полисом белков, ассоциированных с помощью вестерн-блоттинга в клетках HeLa (A - B). Цитоплазматическая экстракты получали из HeLa клеток, выращенных как в нормальных условиях (а) или после обработки ингибитором протеасомы в течение 4 часов (В ) и центрифугировали на 15-55% V / W линейного градиента сахарозы с. Полисом профили указаны в верхней панели. Позиции 40С рибосом, 60S рибосом, 80S monosomes и полисом указаны в каждом профиле. Фракции из верхней (15%) в нижней части (55%) градиента показаны слева направо. Фракции собирали и анализировали с помощью вестерн-блоттинга (нижние панели) с антителами против большой рибосомной L28 белка, а также с полисом-ассоциированный белок FMRP, которые служат элементами управления для целостности полисом 5,6. Обратите внимание, что третерпимостью и лечением с ингибитором протеасом снижает полисом пики с сопутствующим увеличением 80S monosomes указанием ингибирование инициации трансляции. Типичные профили, полученные из Шнайдер клетках дрозофилы и мышей мозга были описаны в других 7-10. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ полисом профиль на градиентах сахарозы позволяет измерять инициации трансляции на основе анализа плотности полисом, выделенных из клеток или тканей 9,11-14. Этот метод является лучшим (если не единственным) подход для измерения инициацию трансляции в естественных условиях. Он используется для контроля за поступательное статус выращивания клеток во время клеточного цикла 15, а также для оценки влияния различных видов стресса в том числе вирусных инфекций, гипоксии 13,16, радиации 17 и химических препаратов 18 используется в терапии, на инициации трансляции. Тем не менее, в то время как этот метод работает хорошо, чтобы оценить инициации трансляции клеточных культур и конкретных тканей, таких как мозге и печени, это еще предстоит установить, если она может быть использована для сравнения инициации трансляции нормальный сравнению с пораженных тканей и опухолей.
Изменения в профилях полисом может также произойти в условиях, которые изменяют перевода элонгацииТион или прекращение. В этих случаях, ингибирование элонгации скоростей перевода приведет к увеличению полисом пиков в то время как ингибирование прекращения должно привести к более крупных полисом по отношению к контролю. Напротив, ингибиторы инициации трансляции предотвратить реформирование полисом, потому что образование активных комплексов инициации трансляции блокируется. Это отражено в полисом профилей сокращением полисом пиков с сопутствующим увеличением 80-х годов monosomes. Поскольку ингибиторы перевод стойло инициации трансляции комплексы, ожидается, что оба 40S и 60S пики также будет увеличиваться. Тем не менее, очень часто увеличение только 80S monosomes наблюдается при ингибирования инициации трансляции. Причина, почему увеличение других рибосомных комплексов не наблюдается в настоящее время неизвестно. Одно из возможных объяснений может быть то, что случайное связь между тупик рибосомных комплексов может произойти во время добычи, ведущего к наблюдаемой сбора нефтиния только 80S monosomes.
Помимо анализа инициации трансляции, полисом техника профиль может помочь подтвердить личность инициации трансляции факторов (таких, как eIF4E, eIF4A и eIF4G) и идентифицировать новые регуляторы перевода. Как факторы инициации трансляции освобождаются от рибосом на последнем шаге инициации трансляции, они не должны быть обнаружены в течение перевод рибосом фракций. Объединение белков, таких как FMRP 14, SMN 19,20, TDRD3 21 с обеих полисом и не-полисом фракций показывает, что регулирующая роль этих белков в переводе не ограничивается стадией инициирования. Мониторинг ассоциацию белков с полисом также представляет собой мощное средство для оценки, как стрессовые условия могут повлиять на поступательное активность специфических белков. Однако, ассоциация специфических белков с полисом сам по себе не является достаточным для заключения поступательное ROLе, который затем должен быть подтвержден функциональных исследований. Наконец, метод полисом профиль позволяет определение поступательного активности специфических мРНК в различных условиях и для рассмотрения конкретных механизмов, регулирующих перевод например миРНК опосредованного репрессии трансляции 22. Общее использование анализа полисом может быть дополнительно расширен с использованием различных последовательных применений, в том числе генома микрочипов анализа и совсем недавно транскриптом масштабе рибосома профилирования 23-26 учетом надежной прогнозирования экспрессии белка и, что более важно предоставление нового мощного экспериментального инструмента для анализа поступательного контроля 23-27.
Как и в любой методологии, меры предосторожности должны быть приняты при выполнении полисом профилирование. В этом отношении несколько параметров, таких как клетки проход, лизиса клеток, количества клеточного экстракта для погрузки на градиенте и целостности РНК должны быть хорошо сontrolled. Оптимизация условий ультрацентрифугирования также требуется для того, чтобы получить лучшее разделение рибосомальной населения через градиентах сахарозы. Компоненты, которые составляют градиенты и лизирующего буфера, такой как сахароза и моющих средств, может дать оптическую плотность в диапазоне длин волн 254 нм. Таким образом, важно, чтобы включить контроль градиент, содержащий только буфер для лизиса. Наконец, сами градиенты должны быть обработаны с осторожностью, так как минимальное возмущение градиентов может вызвать огромные последствия для полисом профилей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
ПА является получателем стипендии "Пьер Дюран" факультет медицины Университета Лаваля. Эта работа была поддержана естественным наукам и инженерным исследовательского совета Канады (СС-CG095386) в РМ полисом фракционатор была приобретена через Канадский фонд инновационного гранта (СС-GF091050) в RMR М проводит новую CIHR награду следователь зарплаты.
Мы благодарны д-ра. Е. Ханджян, И. Gallouzi, С. Ди-Марко и А. Cammas за полезные советы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | |
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | |
| Culture medium and Supplements | |||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | |
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | |
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | |
| Penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | |
| Sucrose solutions | |||
| D-sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientist | B3925 | |
| Lysis buffer | |||
| Tris HCl | Fisher Scientist | BP153-500 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | |
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | |
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | |
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | |
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | |
| RNA Extraction | |||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | |
| Phenol:chloroform | Fisher Scientist | BP1754I-400 | |
| Chloroform | Fisher Scientist | C298-500 | |
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | |
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | |
| Antibodies | |||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | ||
References
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).
- Fournier, M. -J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell International. 10 (12), (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).
- Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs. Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).
- Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms. RNA. 15 (10), New York, N.Y. 1814-1821 (2009).
- Gareau, C., Houssin, E., et al. Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Khandjian, E. W., Huot, M. -E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).
- Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. Translational control of gene expression in the human brain. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).
- Stephens, S. B., Nicchitta, C. V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum. Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).
- Koritzinsky, M., Wouters, B. G. Hypoxia and regulation of messenger RNA translation. Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).
- Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes. Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).
- Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division. Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).
- Thomas, J. D., Johannes, G. J. Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia. RNA. 13, 1116-1131 (2007).
- Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components. Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).
- Fournier, M. -J., Coudert, L., et al. Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).
- Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator. Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).
- Béchade, C., Rostaing, P., et al. Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport. The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).
- Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules. Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).
- Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association. BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).
- Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), New York, N.Y. 414-421 (2007).
- Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Morris, D. R. Ribosomal footprints on a transcriptome landscape. Genome Biology. 10 (4), (2009).
