Summary
Batrachochytrium dendrobatidis infektion i padder kan elimineres ved hjælp af en reduceret koncentration (0,0025%) og kortere varighed (fem minutter bade i seks dage) af itraconazol, end der generelt bruges. Mindre dødelighed og færre negative bivirkninger blev observeret ved hjælp af denne ændrede behandling protokol.
Abstract
Padder oplever det største fald af alle hvirveldyr klasse og en førende årsag til disse fald er en svampeinfektion patogen, Batrachochytrium dendrobatidis (BD), der forårsager sygdommen chytridiomycosis. Captive erklæringsopgaver kolonier er vigtige i hele verden for truede paddearter og kan være den eneste livline til dem i kritisk truet af udryddelse. Er en prioritet i fangenskab ledere Fastholdelse sygdomsfrie kolonier, har endnu sikre og effektive behandlinger for alle arter og på tværs af livsstadier ikke blevet identificeret. Den mest udbredte kemoterapeutisk behandling er itraconazol, selvom doseringen almindeligvis anvendes, kan være skadelige for nogle individer og arter. Vi udførte en klinisk behandling forsøg for at vurdere, om en lavere og mere sikker men effektiv dosis af itraconazol kunne findes at helbrede Bd infektioner. Vi fandt, at ved at reducere koncentrationen af behandling fra 0,01 til 0,0025% og reducere behandlingens varighed fra 11-6 Dag på 5 min bade, kunne frøer blive helbredt af Bd infektion med færre bivirkninger og mindre behandling-associeret dødelighed.
Introduction
Padder er i øjeblikket oplever det største fald i biodiversiteten i alle hvirveldyr taxa 1.. Chytridiomycosis, en hudsygdom, forårsaget af chytrid svampepatogen Batrachochytrium dendrobatidis (BD), er en af de vigtigste årsager til disse dramatiske fald 2 Bd er den værste patogen på rekord for at forårsage tab af biodiversitet:. Det inficerer mere end 600 arter af padder og har forårsagede fald i mere end 300 arter, hvoraf så mange som 200 arter er blevet kritisk truede eller uddøde 2,3. Den padde chytrid svamp er ikke vært konkret, og det er uklart, hvilke kvaliteter af værten mulighed for Bd infektion til fremskridt forårsager alvorlige sygdomme. Chytridiomycosis forårsager dødsfald ved at forstyrre ion-kanaler i huden, hvilket resulterer i elektrolyt tab og hjertesvigt 4. Også Bd supernatant (indeholdende intet BD zoosporer) forårsager en immunreaktion i haletudser 5 leading forskere til at tro Bd producerer en giftig biprodukt 6.
Fordi mange arter er hastigt faldende, fangenskab erklæringsopgaver kolonier og avlsprogrammer er vigtige bevaringsforanstaltninger, og kan være den eneste livline for nogle arter. Etablering og opretholdelse af sygdomsfrie kolonier er en udfordring for padde management faciliteter. De nuværende kemoterapeutiske metoder til behandling af Bd-infektioner, selvom effektiv, kan være skadelige for de dyr, der er behandlet, og ingen enkelt behandlingsmetode har været en succes på tværs af arter og aldersklasser padder 7.
Få kliniske forsøg af behandlinger for Bd-infektion er blevet udført 7. De tre mest almindeligt anvendte metoder til behandling er varme terapi, chloramphenicol og itraconazol. Heat terapi er en nonchemotherapeutic behandlingsmulighed, der synes at have få bivirkninger, der kan bruges på flere livsstadier, og er genereltallierede effektiv. I et behandlingsforsøg, Chatfield og Richards-Zawacki 8 viste, at 96% af de behandlede dyr havde ryddet infektioner efter at være opstaldet ved 30 ° C i 10 dage. Selvom dette forsøg ikke var 100% succes, det giver et grundlag for andre at vurdere varme terapi for deres egne arter. Varme terapi, selv om effektive for mange arter, er upraktisk for mange alpine arter, der ikke kan forblive ved høje temperaturer i en længere periode. Chloramphenicol, et antibakterielt, er blevet anvendt med succes til behandling Bd i mange arter og inhiberer svampevækst in vitro. Som et antibakterielt, ikke chloramphenicol ikke angribe svampen specifikt, men har været kendt for at forårsage apoptose i eukaryote celler 9. Det er blevet spekuleret, at chloramphenicol terapi forårsager apoptose i huden, dræbe intracellulære sporangia, selv om den nøjagtige virkningsmekanisme er ukendt. Der foreligger ingen kliniske forsøg er gennemført, og derfordosis og behandlingstid er ikke vurderet, aktuelle behandlingsprotokoller kræver typisk nedsænkning for to til fire uger 10,11, hvilket gør denne behandling upraktisk for terrestriske padder. Chloramphenicol er også blevet begrænset i nogle lande til veterinær brug, fordi human eksponering er blevet forbundet med en sjælden form for aplastisk anæmi 12..
Itraconazol, en azol antifungale, er den mest almindeligt anvendte til behandling af Bd-infektion hos padder i fangenskab. Den mest udbredte protokol er badning dyr i en itraconazol løsning 0,01% i fem minutter om dagen i 11 dage i træk. Denne protokol stammer fra standarder, der anvendes til pattedyr administration, og mens effektive for padder, er det ikke baseret på kliniske forsøg i padder 11,13. Denne protokol kan skabe negative bivirkninger i visse arter, især i slægten Rana og haletudser og de seneste metamorphs 11.Haletudse behandling har været en succes ved hjælp af en meget lavere koncentration (0,0005%) af itraconazol, men var forbundet med depigmentering 14. Denne samme koncentration blev trialed på de seneste metamorphs og fundet at være forgæves på behandling af infektion 15. Fordi der er risiko for negative bivirkninger med itraconazol behandling, har nogle praktikere brugt halvdelen af sædvanlige koncentration (0,005%) for 11 på hinanden følgende dage, og fundet dette at være en succes i kurere Bd infektioner 16.
Nærværende undersøgelse er en sammenfatning af en klinisk behandling undersøgelse med itraconazol til behandling af Bd-infektion 15. Protokollen beskriver et forsøg på at finde den laveste dosis og behandlingstid, der er både sikker og effektiv til behandling af Bd inficerede dyr med itraconazol. Dyr anvendt i denne undersøgelse var de seneste metamorphs af Gulf Coast tudser, Incilius nebulifer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Godkendelse: Denne undersøgelse og dens metoder blev godkendt af Tulane University Animal brug og pleje Udvalg (Protokol nr. 0407.).
1.. Testning for Bd infektion
- Pensling for Bd
- Swab dyr med en steril vatpind fem gange på ventrum, fem gange på hvert lår, hver side, og hver gren for i alt 45 slag. Swabbing er en noninvasiv metode til prøveudtagning til Bd om padder hud.
- Forsigtigt rotere vatpinden under og mellem slag for at sikre den største mængde af DNA samles på vatpinden.
- Opbevar svaberprøver i 1,5 ml mikrorør ved -20 ° C.
- DNA Udvinding og qPCR analyse
- Uddrag genomisk DNA fra svaberprøver ved hjælp af en kommercielt tilgængelig DNA isolation kit, i overensstemmelse med instruktionerne for dyrs væv.
- Analyser ekstraherede DNA ved hjælp af kvantitativ real time PCR (qPCR) efter Boyle
- Fortynd DNA-ekstraktion prøver 1:10 med dobbelt demineraliseret vand.
- Tilføj 0,7 pi bovint serumalbumin (BSA) for at undgå PCR-hæmning.
- Medtag en intern positiv kontrol i hver prøve for at sikre, at PCR-hæmning var ikke påvirker resultater.
- Kør prøver med en positiv og en negativ kontrol og en række fortyndings standarder for at estimere zoospore (infektion) belastning.
2. Podning
- Kultur Bd
- Forbered trypton bouillon ved tilsætning af 10 g trypton 1 L omvendt osmose eller deioniseret vand, autoklaveret (121 ° C i 40 minutter) og fik lov til at afkøle. Efter afkøling til 23 ° C, tilsættes 1 ml penicillin-streptomycin.
- Grow Bd stamme (JEL411 fra J. Longcore, isoleret fra Guabal, Panama fra en Phyllomedusa lemur) i en trypton bouillon i syv dage ved 23 ° C.
- Overfør bRoth kultur trypton og agarplader.
- For at gøre plader tilsættes 10 g trypton og 10 g agar til 1 L omvendt osmose eller deioniseret vand og autoklave (121 ° C i 40 min.)
- Når autoklaveres blanding er cool nok til at røre, men før den stivner, hældes i petriskåle, 1/4-1/3 fuld, i en laminar strømning hætte.
- Når agar har størknet og afkølet helt, tilsættes 0,5 ml Bd bouillon til hver plade, og fordeles jævnt omkring pladen. Lad det tørre.
- Når pladerne er podet med Bd zoosporer, sæl plader med Parafilm.
- Lad pladerne inkuberes ved 23 ° C i fem til syv dage. Tjek zoospore bevægelse for at sikre rentabiliteten før podning.
- Flood plader til zoospore podning løsning
- Efter fem til syv dage i Bd inkubation og vækst, oversvømme hver plade med 5 ml alderen postevand og tillade zoosporer at indtaste medier i 10 min.
- Hæld zoospore suspension ind i en bærbar beholder.
- Vurdere zoospore fusion med hæmocytometer.
- Fortynd blandingen til en koncentration på 1 x 10 6 per 3 ml med alderen postevand.
- Podes dyr
- I individuelle 50 ml beholdere, vaccinere hvert dyr ved at hælde 3 ml inokulum blandingen over sin ventrum. Tillad ekstra inokulum at dryppe ned i bunden af podning container.
- Hvert dyr vil forblive i podning beholder i 24 timer for at sikre infektion.
- Efter 24 timer af podning, returnere dyr til individuelle desinficerede terrarier.
- Lade infektionen bygge for to uger. Bekræft infektion med vatpind og qPCR resultater, og begynde behandling.
- For BD-negative kontroller, oversvømmelse Bd-fri agarplader med 5 ml alderen vand fra hanen, og mock inoculate dyrene ved hjælp af de samme metoder som ovenfor.
3. Behandlingsregime
- Forbere behandling bad
- Tilføj 2,50 ml vandig itraconazol (1% Sporanox oral opløsning) til 1 L Amphibian Ringers opløsning (0,0025% itraconazol - det laveste effektive koncentration behandling).
- Amphibian Ringers Solution opskrift: 1 L omvendt osmose eller deioniseret vand, 6,6 g natriumchlorid, 0,15 g kaliumchlorid, 0,15 g calciumchlorid og 0,2 g natriumbicarbonat. Autoklave opløsning (121 ° C i 40 min), og lad det køle af til stuetemperatur.
- For 0,01% koncentration itraconazol behandling, tilsættes 10,00 ml vandig itraconazol (1% Sporanox oral opløsning) til 1 L Amphibian Ringers opløsning
- For 0,005% itraconazol koncentration behandling, tilsættes 5,00 ml vandig itraconazol (1% Sporanox oral opløsning) til 1 L Amphibian Ringers opløsning.
- For BD-positive og Bd-negative kontroller, bade dyr i Padde Ringers opløsning med nogen itraconazol.
- Tilføj 2,50 ml vandig itraconazol (1% Sporanox oral opløsning) til 1 L Amphibian Ringers opløsning (0,0025% itraconazol - det laveste effektive koncentration behandling).
- Behandling <ol>
- Placer de enkelte padder i desinficeret 50 ml beholdere med 35 ml behandling løsning.
- Sørg dyrene er fuldt dækket i fem minutter ved forsigtigt hvirvlende beholderen.
- Retur dyr desinficerede terrarier. Gentag for seks dage.
- Forsøgsdyr for BD-infektion på dagen behandling påbegyndes.
- Forsøgsdyr for BD-infektion en uge efter behandling er færdig, og en gang om ugen i fire uger for at sikre infektion har ryddet.
4.. Bd. som Biohazard
- Desinficere individuel terrarier ugentligt.
- Bade terrarier og behandling beholdere i en 10% blegemiddelopløsning bad.
- Skyl hver bleget container to gange med rindende vand.
- Lad beholdere til tørre i 24 timer før genbrug.
- Bær rene nitrilhandsker ved håndtering af dyr for at undgå krydskontamineringaf Bd patogen. Skift handsker mellem håndtering hvert dyr.
- Desinficere alle flydende affald forud for bortskaffelse ved at bringe opløsningen til 10% blegemiddel.
- Autoklavér alt fast affald, der potentielt udsættes for Bd før bortskaffelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Itraconazol behandling blev betragtet som en succes, hvis alle dyr blev Bd-negative fire uger, efter behandlingen sluttede. Før behandling påbegyndes to uger efter podning blev alle Bd-inokulerede dyr inficeret med en gennemsnitlig zoospore belastning af 1.121,7 (± 17.34), mens fire uger, efter behandlingen sluttede, BD-positive dyr kontrol havde en gennemsnitlig zoospore belastning af 16,765.12 ( ± 14643,08).
Behandling af Incilius nebulifer (n = 15) var en succes at bruge bade i 0,0025% itraconazol koncentration i fem minutter om dagen i seks dage. Denne lave koncentration dosis af itraconazol behandling var ikke signifikant forskellig i dødelighed sammenlignet med BD-positive kontroller (Cox regression: χ 2,1 = 2,17, exp (b) = 20.500, p = 0,339) (figur 1B), hvoraf mange hvem overlevede indtil slutningen af forsøget med Bd-infektion.
Bade 0,0025% itraconazole i 11 dage, og begge 0,005% og 0,0025% itraconazol i seks dage blev alle fundet at være effektive og sikre behandlingsmuligheder (figurerne 1A og 1B). Den anbefalede koncentration behandling og halvdelen koncentration for en behandling længde på 11 dage steg betydeligt dødelighed sammenlignet med BD-positive kontroller (Cox regression: 0,01% itraconazol χ 2,1 = 35,68, exp (b) = 307,54, p <0,01; 0,005% itraconazol χ 2,1 = 16,17, exp (b) = 9,40 , p <0,01) (figur 1A). De 0,01% itraconazol behandling i 11 dage forårsagede 100% mortalitet i I. nebulifer, og halvdelen af den koncentration (0,005% itraconazol i 11 dage) forårsagede 60% dødelighed (figur 1A). Obduktion og histopatologi for en lille delmængde af dyr, der døde under behandlingen blev udført. Intet dyr i denne undersøgelse døde af chytridiomycosis.
Figur 1. Forskelle i overlevelse på tværs af itraconazol behandlinger 15 (A) Incilius nebulifer:. 11d behandling (n = 15 for hvert itraconazol koncentration på 0,01, 0,005 og 0,0025%, n = 17 for BD-positive kontrolgruppe og n = 9 for Bd-negativ kontrolgruppe). (B) I. nebulifer: 6 d behandling (n = 15 for hvert itraconazol koncentration på 0,01, 0,005 og 0,0025%, n = 17 for BD-positive kontrolgruppe og n = 9 for Bd-negative kontrolgruppe). Sorte pile angiver den sidste dag af behandlingen. Solid linjer angiver overlevelse kontrolgrupper (sort = Bd-positive, grå = Bd-negativ). Brudte linjer angiver overlevelse itraconazol behandlingsgrupper (lysegrå prikker = 0,01%, Medium grå prikker = 0,005%, sorte prikker = 0,0025% itraconazol). (Dette tal er blevet ændret fra Brannelly et al. 15. Figur 1B og 1C). Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af denne protokol var vi i stand til sikkert og effektivt at reducere dosis behandling og tidspunkt for itraconazol behandling for BD i padder. Den laveste behandling dosis og tid (0,0025% i seks dage) var en vellykket behandling for subklinisk inficerede I. nebulifer. Effektiviteten af både en lavere dosis og behandlingstid demonstrere behovet for kliniske behandlingsforsøg for BD infektion behandlinger, da der er i øjeblikket ingen sikre og effektive behandlinger, der skal anvendes for alle arter og aldersklasser padder.
Dødsårsagen følge af itraconazol behandling er ukendt på dette punkt 11. Obduktion og histopatologi blev gennemført på en lille delmængde af individer, der døde under eller kort efter den periode, behandling i Brannelly et al. 15. studiet. Resultaterne af disse analyser var overbevisende med hensyn til dødsårsag, selv om det er klart, at ingen dyr dødeaf chytridiomycosis. Moderat autolyse fandt sted mellem død og modellen konservering, hvilket kan have påvirket vores evne til at opdage subtile forskelle mellem behandlingsgrupper.
Selv om denne protokol understøtter eksistensen af en sikker og effektiv behandling regime, flere retssager som denne har brug for at være i gang. En anden azol behandling, voriconazol, har vist sig at være effektiv i mindst én art 18. Voriconazol er mere stabil i en vandopløsning end itraconazol og har vist sig at være sikkert for haletudse brug 18. Selv om en enkelt dosis behandling af itraconazol og voriconazol er ens i prissætningen, voriconazol er langt dyrere for køb end itraconazol, førende forskere og fangenskab ledere til at vælge itraconazol mere regelmæssigt. På dette tidspunkt er der kun én publiceret undersøgelse har vist effektivt af voriconazol 18. For at vise effekten, skal afprøves flere arter.
<p class = "jove_content"> azolsvampemidler repræsenterer en type af svampedræbende kemoterapi, der hæmmer svampevækst 13. Der er andre behandlingsmetoder, der har til formål at dræbe svampepatogenet snarere end blot at reducere væksten. Bd. bliver dræbt in vitro ved temperaturer over 28 ° C, og varmen terapi har til formål at dræbe Bd i overhuden. Terbinafinhydrochlorid en alternativ svampedræbende der har haft succes til at behandle Bd infektion i nogle arter 19, virker ved at forårsage lysis af svampe celler. Antimykotika som direkte angriber patogenet kunne være mere succesfulde behandlinger, og mere arbejde der skal gøres for at afprøve lovende behandlingsmuligheder for Bd infektion.Itraconazol behandling har vist sig at være effektiv i subklinisk inficerede dyr, men behandling af klinisk chytridiomycosis har stort set været forgæves. Kun én undersøgelse til dato 20 har med succes behandlet terminalt jeg lle padder og behandlingen involverede en aggressiv kombination af elektrolyt og kemoterapi. Der er behov for en vellykket behandling muligheder for uhelbredeligt syge dyr, især for kritisk truede dyr i fangenskab kolonier, hvor beskyttelse af hver enkelt er afgørende for bevarelsen af arten.
Selvom reducere dosis og behandling tid var en succes for I. nebulifer har behandlingen ikke er blevet trialed på andre arter eller dyr med kliniske infektioner. Nogle arter og livsstadier er intolerante over for itraconazol behandling, så før du anvender en storstilet behandling regime bør fangenskab ledere retssag behandling på en lille delmængde af enkeltpersoner til at bestemme sikkerhed og effektivitet. Test af behandlede dyr i mindst fire uger efter afsluttet behandling er nødvendig for at udrydde lavt niveau infektion 7, og bør gennemføres efter hver behandlingsregime.
telt "> er afgørende for succes for bevarelse indsats og kolonier i fangenskab etablere sikre og effektive behandlingsmuligheder for BD infektioner i prioritet fangenskab erklæringsopgaver kolonier område for padde bevarelse indsats. Fastholdelse Bd gratis kolonier kan være den eneste livline for arter på randen af udryddelse .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Jeg vil gerne takke CL Richards-Zawacki om hjælp begrebsliggøre eksperimentelle design og bistå med materialer, A. Pessier om hjælp om et behandlingsregime og obduktion analyser MWH Chatfield, MJ Robak, K. Tasker og D. Lenger for hjælp i laboratorier og støtte og M. McFadden og P. Harlow på Taronga Zoo for brug af deres plads under optagelserne. Projektet blev delvist finansieret af Louisiana Department of Wildlife og fiskeri gennem Louisiana Environmental Education Kommissionen tilskud til LA Brannelly og Life Technologies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox | Janssen Pharmaceutica Inc. | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-100 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sterile cotton swabs | Medical and Wire Equipment | MW113 | |
| 1.5 ml Microtubes | Sarstedt | 73.703.217 | |
| Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69581 | |
| 7500 Real-time PCR | Applied Biosystems | 4351104 | |
| VIC IPC | Applied Biosystems | 4308323 | |
| BSA | Applied Biosystems | AM2618 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| Tryptone | Invitrogen | Q10029 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS430589 |
References
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Wake, D. B., Vredenburg, V. T. Colloquium paper: are we in the midst of the sixth mass extinction? A view from the world of amphibians. PNAS. 105, 11466-11473 (2008).
- Voyles, J., et al. Electrolyte depletion and osmotic imbalance in amphibians with chytridiomycosis. Dis. Aquat. Org. 77 (2), 113-118 (2007).
- Ramsey, J. P. Amphibian immune defenses against Batrachochytrium dendrobatidis: A war between host and pathogen. , (2011).
- McMahon, T. A., et al. Chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis has nonamphibian hosts and releases chemicals that cause pathology in the absence of infection. PNAS. 110 (1), 210-215 (2013).
- Berger, L., Speare, R., Pessier, A., Voyles, J., Skerratt, L. F. Treatment of chytridiomycosis requires urgent clinical trials. Dis. Aquat. Org. 92, 165-174 (2010).
- Chatfield, M. W. H., Richards-Zawacki, C. L. Elevated temperature as a treatment for Batrachochytrium dendrobatidis infection in captive frogs. Dis. Aquat. Org. 94 (3), 235-238 (2011).
- Karbowski, M., et al. Free radical-induced megamitochondria formation and apoptosis. Free Rad. Biol. Med. 26 (98), 396-409 (1999).
- Bishop, P. J., et al. Elimination of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis by Archey's frog Leiopelma archeyi. Dis. Aquat. Org. 84 (1), 9-15 (2009).
- Pessier, A. P., Mendelson, J. A Manual For Control of Infectious Diseases in Amphibian Survival Assurance Colonies and Reintroduction Programs. , IUCN/SSC Conservation Breeding Specialist Group. Apple Valley, MN. (2009).
- Page, S. W. Chloramphenicol 1. Hazards of use and the current regulatory environment. Aus. Vet. J. 68 (1), 1-2 (1991).
- Yoon, H. -J., Seo, M. H., Kim, J. -K. Pharmaceutical formulations for itraconazole. , (2005).
- Garner, T. W. J., Garcia, G., Carroll, B., Fisher, M. C. Using itraconazole to clean Batrachochytrium dendrobatidis infection, and subsequent depigmentation of Alytes muletensis tadpoles. Dis. Aquat. Org. 83, 257-260 (2009).
- Brannelly, L. A., Richards-Zawacki, C. L., Pessier, A. P. Clinical trials with itraconazole as a treatment for chytrid fungal infections in amphibians. Dis. Aquat. Org. 101 (2), 95-104 (2012).
- Jones, M. E. B., Paddock, D., Bender, L., Allen, J. L., Schrenzel, M. S., Pessier, A. P. Treatment of chytridiomycosis with reduced-dose itraconazole. Dis. Aquat. Org. 99 (3), 243-249 (2012).
- Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Dis. Aquat. Org. 60 (2), 141-148 (2004).
- Martel, A., et al. Developing a safe antifungal treatment protocol to eliminate Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians. Med. Mycol. 49 (2), 143-149 (2011).
- Bowerman, J., Rombough, C., Weinstock, S. R., Padgett-Flohr, G. E. Terbinafine hydrochloride in ethanol effectively clears Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians. J. Herpetol. Med. Surg. 20 (1), 24-29 (2010).
- Young, S., Speare, R., Berger, L., Skerratt, L. F. Chloramphenicol with fluid and electrolyte therapy cures terminally ill green tree frogs (Litoria caerulea) with chytridiomycosis. J. Zoo Wildlife Med. 43 (2), 330-337 (2012).
