Summary
Batrachochytrium dendrobatidis infeksjon hos amfibier kan elimineres ved hjelp av en redusert konsentrasjon (0,0025%) og (fem-minutters bad for seks dager) kortere varighet av itrakonazol som er alminnelig brukt. Mindre dødelighet og færre negative bivirkninger ble observert ved hjelp av dette endret behandlingsprotokoll.
Abstract
Amfibier opplever størst nedgang i alle virveldyr klasse og en ledende årsak til disse avtar er en sopp patogen, Batrachochytrium dendrobatidis (BD), som forårsaker sykdommen chytridiomycosis. Captive attestasjons kolonier er viktig over hele verden for truede amfibier og kan være den eneste livline for dem i kritisk truet av utryddelse. Opprettholde sykdomsfrie kolonier er en prioritering av fangenskap ledere, har ennå trygge og effektive behandlinger for alle arter og på tvers av livsstadier ikke blitt identifisert. Den mest brukte kjemoterapeutisk behandling er itrakonazol, selv om doseringen vanligvis brukes kan være skadelig for noen individer og arter. Vi utførte en klinisk behandling studie for å vurdere om en lavere og tryggere, men effektive dose itrakonazol kan bli funnet å kurere Bd infeksjoner. Vi har funnet at ved å redusere behandlingskonsentrasjon 0,01 til 0,0025% og redusere behandlingsvarighet fra 11-6 Dager etter 5 min bad, kan frosker bli kurert for Bd infeksjon med færre bivirkninger og lavere dødelighet behandlings-assosiert.
Introduction
Amfibier er for tiden opplever størst nedgang i biologisk mangfold i alle virveldyr taxa en. Chytridiomycosis, en hudsykdom forårsaket av chytrid sopp patogen Batrachochytrium dendrobatidis (BD), er en av de viktigste årsakene til disse dramatiske nedgangen to BD er den verste patogen på posten for å forårsake tap av biologisk mangfold:. Det smitter over 600 arter av amfibier og har forårsaket nedgangen i mer enn 300 arter, hvorav så mange som 200 arter har blitt kritisk truet eller utryddet 2,3. Amfibier chytrid sopp er ikke vert bestemt, og det er uklart hvilke kvaliteter av verten tillate Bd smitte til fremgang forårsaker alvorlig sykdom. Chytridiomycosis forårsaker død ved å forstyrre ionekanaler i huden, noe som resulterer i tap av elektrolytt og hjertesvikt 4.. Også, Bd supernatant (inneholder ingen Bd zoosporer) forårsaker en immunrespons hos rumpetroll 5 leading forskere til å tro Bd produserer et giftig biprodukt 6.
Fordi mange arter er sterkt fallende, captive attestasjons kolonier og avlsarbeid er viktige bevaringstiltak, og kan være den eneste livline for noen arter. Etablere og vedlikeholde sykdomsfrie kolonier er en utfordring for amfibier ledelse fasiliteter. De aktuelle kjemoterapeutiske metoder for behandling av Bd infeksjoner, men effektive, kan være skadelig for dyrene blir behandlet, og ingen enkelt behandlingsmetode har vært vellykket over arter og aldersklasser av amfibier 7.
Noen kliniske studier av behandlinger for BD-infeksjon er utført 7. De tre mest brukte metodene for behandling er varme terapi, kloramfenikol og itrakonazol. Heat terapi er en nonchemotherapeutic behandlingsalternativ som ser ut til å ha noen bivirkninger, kan brukes på flere livsstadier, og er genereltalliert effektiv. I en behandlingsstudien, Chatfield and Richards-Zawacki 8 funnet at 96% av de behandlede dyr hadde fjernet infeksjoner etter å være plassert ved 30 ° C i 10 dager. Selv om denne studien var ikke 100% vellykket, det gir en baseline for andre å vurdere varme terapi for sine egne arter. Varme terapi, selv om effektive for mange arter, er upraktisk for mange fjellarter som ikke kan forbli ved høye temperaturer over en lengre tidsperiode. Kloramfenikol, en antibakteriell, har vært brukt med hell for å behandle Bd i mange arter, og hemmer soppvekst in vitro. Som et antibakterielt, ikke kloramfenikol ikke angripe soppen spesifikt, men er kjent for å forårsake apoptose i eukaryote celler 9. Det har vært spekulert i at kloramfenikol terapi forårsaker apoptose i huden, drepe intracellulære sporangia, selv om den eksakte virkningsmekanismen er ukjent. Selv om ingen klinisk studie har blitt gjennomført, og derfordose og behandlingstiden er ikke vurdert, aktuelle behandlingsprotokoller vanligvis krever neddykking for to til fire uker 10,11, noe som gjør denne behandlingen upraktisk for bakkenett amfibier. Kloramfenikol har også vært begrenset i noen land til veterinær bruk fordi human eksponering har vært forbundet med en sjelden form for aplastisk anemi 12.
Itrakonazol, en azol soppdrepende, er den mest brukte for behandling av Bd infeksjon i amfibier i fangenskap. Den mest brukte protokollen er bade dyr i en 0,01% itrakonazol løsning i fem minutter om dagen for 11 påfølgende dager. Denne protokollen ble avledet fra standarder som brukes for pattedyr administrasjon, og, mens effektive for amfibier, er det ikke basert på kliniske studier i amfibier 11,13. Denne protokollen kan føre til negative bivirkninger i enkelte arter, spesielt i slekten Rana og i rumpetroll og siste metamorphs 11.Rumpetroll behandlingen har vært vellykket å bruke en mye lavere konsentrasjon (0,0005%) av itrakonazol, men var assosiert med depigmentering 14. Denne samme konsentrasjon ble trialed på nyere metamorphs og funnet å være mislykket på å behandle infeksjon 15. Fordi det er risiko for negative bivirkninger med itrakonazolbehandling, har noen utøvere brukt en halvparten av vanlig konsentrasjon (0,005%) i 11 sammenhengende dager og fant dette å være vellykket i herding Bd infeksjoner 16.
Denne studien er en oppsummering av en klinisk behandling forsøk med itrakonazol å behandle Bd infeksjon 15. Protokollen beskriver et forsøk på å finne den laveste dose og behandlingstiden som er både sikkert og effektivt for behandling Bd infiserte dyr med itrakonazol. Dyr som brukes i denne studien var siste metamorphs av gulf coast padder, Incilius nebulifer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Godkjenning: Denne studien og dens metoder ble godkjent av Tulane University Animal bruk og vedlikehold Committee (protokoll ingen 0407.).
En. Testing for Bd Infeksjon
- Swabbing for Bd
- Vattpinne dyr med en steril vattpinne fem ganger på ventrum, fem ganger for hvert lår, på hver side, og hvert ben for en total av 45 slag. Swabbing er en ikke-invasiv metode for prøvetaking for BD på amfibier hud.
- Forsiktig rotere pinnen under og mellom slag for å sikre mest mulig av DNA er samlet på pinnen.
- Oppbevar vattpinner i 1,5 ml mikrorør på -20 ° C.
- DNA Utvinning og qPCR assay
- Utdrag genomisk DNA fra vattpinner ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig DNA isolert sett, i henhold til instruksjonene for animalsk vev.
- Analyser hentet DNA ved hjelp av kvantitativ real-time PCR (qPCR) etter Boyle
- Fortynne DNA-ekstraksjon prøvene 01:10 med dobbel-ionisert vann.
- Til 0,7 mL av bovint serum albumin (BSA) for å hindre at PCR-inhibering.
- Inkluder en intern positiv kontroll i hver prøve for å sikre PCR hemming ble ikke påvirker resultatene.
- Kjør prøver med en positiv og negativ kontroll og en serie av fortynning standarder for å beregne zoospore (infeksjon) belastning.
2. Inoculation
- Kultur Bd
- Forbered trypton buljong ved tilsetning av 10 g trypton til 1 L omvendt osmose eller deionisert vann, autoklavert (121 ° C i 40 min) og fikk avkjøles. Når avkjølt til 23 ° C, tilsett 1 ml penicillin-streptomycin.
- Grow Bd belastning (JEL411 fra J. Longcore, isolert fra Guabal, Panama fra en Phyllomedusa lemur) i en trypton buljong i sju dager ved 23 ° C.
- Overfør broth kultur å Tryptone og agar plater.
- For å lage plater, tilsett 10 g trypton og 10 g agar i en L omvendt osmose eller deionisert vann, og autoklav (121 ° C i 40 min).
- Når det autoklaverte blandingen er kjølig nok til å berøre, men før den blir stiv, helles i petriskåler, 01.04 til 01.03 full, i en laminær hette.
- Når agar har stivnet og helt avkjølt, tilsett 0,5 ml Bd buljong til hver plate og spredt jevnt rundt plate. La det tørke.
- Når platene er vaksinert med Bd zoosporer, tetningsplatene med Parafilm.
- Tillat plater å ruge på 23 ° C i fem til syv dager. Sjekk zoospore bevegelse for å sikre levedyktighet før vaksinasjonen.
- Flom plater for zoospore inokulasjon løsning
- Etter fem til syv dager med BD inkubasjon og vekst, flom hver plate med 5 ml alderen vann fra springen og la zoosporer å gå inn i mediene for 10 min.
- Hell zoospore suspension til en bærbar container.
- Anslå zoospore konsentrasjon med en hemocytometer.
- Fortynn blandingen til en konsentrasjon på 1 x 10 til 6 per 3 ml med alderen vann fra springen.
- Vaksinere dyr
- I individuelle 50 ml beholdere, vaksinere hvert dyr ved å helle 3 ml pode blandingen over sin ventrum. La det være tilstrekkelig inokulum å dryppe ned i bunnen av beholderen inokulering.
- Hvert dyr forblir i inokulering beholder i 24 timer for å sikre infeksjon.
- Etter 24 timer av vaksinasjonen, returnere dyr til individuelle desinfisert terraria.
- Tillat infeksjon å bygge i to uker. Bekreft smitte med vattpinne og qPCR resultater, og begynne behandlingen.
- For BD-negative kontroller, flom BD-free agar plater med 5 ml alderen vann fra springen, og mock inokulere dyrene ved hjelp av de samme metodene som ovenfor.
Tre. Behandlingsregime
- Forberedelsere behandling bath
- Legg 2,50 ml vandig itrakonazol (1% Sporanox Oral Solution) til en L Amphibian Ringers løsning (0,0025% itrakonazol - laveste effektive behandlings konsentrasjon).
- Amphibian Ringers løsning oppskrift: 1 L omvendt osmose eller deionisert vann, 6,6 g natriumklorid, 0,15 g kaliumklorid, 0,15 g kalsium-klorid, og 0,2 g natriumbikarbonat. Autoklav-løsning (121 ° C i 40 minutter) og kjøles til romtemperatur.
- For 0,01% itrakonazolbehandling konsentrasjon, legger 10,00 ml vandig itrakonazol (1% Sporanox Oral Solution) til en L Amphibian Ringers løsning
- For 0.005% itrakonazolbehandling konsentrasjon, tilsett 5,00 ml vandig itrakonazol (1% Sporanox Oral Solution) til en L Amphibian Ringers løsning.
- For BD-positive og BD-negative kontroller, bade dyr i Amphibian Ringers løsning uten itrakonazol.
- Legg 2,50 ml vandig itrakonazol (1% Sporanox Oral Solution) til en L Amphibian Ringers løsning (0,0025% itrakonazol - laveste effektive behandlings konsentrasjon).
- Behandling <ol>
- Plasser de enkelte amfibier i desinfiserte 50 ml beholdere med 35 ml av behandlingsoppløsningen.
- Sikre dyr er fullstendig dekket i fem minutter ved forsiktig å svinge beholderen.
- Returner dyr til desinfisert terraria. Gjenta for seks dager.
- Forsøksdyr for BD-smitte på dagen behandlingen starter.
- Forsøksdyr for BD-infeksjon en uke etter behandling er ferdig, og en gang i uken i fire uker for å sikre infeksjonen har ryddet.
4. Bd. som Biohazard
- Desinfiser individuell terraria ukentlig.
- Bade Terraria-og behandlings beholdere i en 10% blekemiddel bad.
- Skyll hver bleket beholder to ganger med rennende vann.
- Tillat beholdere for å tørke i 24 timer før det brukes igjen.
- Bruk rene nitrilhansker ved håndtering av dyr for å hindre krysskontamineringav Bd patogen. Skift hansker mellom håndtering av hvert dyr.
- Desinfisere alt flytende avfall før disponering ved å bringe løsningen til 10% blekemiddel.
- Autoklav alt fast avfall som er potensielt utsatt for Bd før avhending.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Itrakonazol behandling ble betraktes som vellykket dersom alle dyrene var Bd-negative fire uker etter behandlingen ble avsluttet. Før behandlingen påbegynnes, to uker etter vaksinasjonen, ble alle BD-inokulert dyr smittet, med en gjennomsnittlig zoospore belastning på 1,121.7 (± 17,34), mens fire uker etter at behandlingen ble avsluttet, BD-positive kontroll dyrene hadde en gjennomsnittlig zoospore belastning på 16,765.12 ( ± 14643,08).
Behandling av Incilius nebulifer (n = 15) var vellykket å bruke bad i 0,0025% itrakonazol konsentrasjon i fem minutter en dag i seks dager. Dette lav konsentrasjon dosering av itrakonazolbehandling var ikke signifikant forskjellig i dødelighet i forhold til BD-positive kontroller (Cox regresjon: χ 2,1 = 2,17, exp (b) = 20.500, p = 0,339) (Figur 1B), mange av hvem overlevde fram til slutten av rettssaken med Bd infeksjon.
Baths på 0,0025% itraconazole for 11 dager, og begge 0,005% og 0,0025% itrakonazol i seks dager ble alle funnet å være effektive og trygge behandlingstilbud (figur 1A og 1B). Den anbefalte behandlings konsentrasjon og halvparten at konsentrasjonen for en behandling lengde på 11 dager betydelig økt dødelighet sammenlignet med BD-positive kontroller (Cox regresjon: 0,01% itrakonazol χ 2,1 = 35,68, exp (b) = 307,54, p <0,01, 0,005% itrakonazol χ 2,1 = 16,17, exp (b) = 9,40 , p <0,01) (figur 1A). Den 0,01% itrakonazolbehandling for 11 dager forårsaket dødelighet 100% i I. nebulifer, og halvparten som konsentrasjon (0.005% itrakonazol for 11 dager) forårsaket dødeligheten 60% (figur 1A). Nekropsi og histopatologi etter en liten undergruppe av dyr som døde i løpet av behandlingen ble foretatt. Ingen dyr i denne studien døde av chytridiomycosis.
Figur 1. Forskjeller i overlevelse på tvers av itrakonazol behandlinger 15 (A) Incilius nebulifer:. 11. d-behandling (n = 15 for hvert itrakonazol konsentrasjon på 0,01, 0,005 og 0,0025%, n = 17 for Bd-positiv kontroll-gruppen og n = 9 for Bd-negativ kontrollgruppe). (B) I. nebulifer: 6 d-behandling (n = 15 for hvert itrakonazol konsentrasjon på 0,01, 0,005 og 0,0025%, n = 17 for Bd-positiv kontroll-gruppen og n = 9 for Bd-negativ kontrollgruppe). Svarte piler indikerer den siste dagen av behandlingen. Solid linjene indikerer overlevelse av kontrollgrupper (svart = BD-positive, grå = BD-negativ). Stiplede linjene indikerer overlevelse av itrakonazol behandlingsgruppene (lys grå prikker = 0,01%, Mellom grå prikker = 0,005%, svarte prikker = 0.0025% itrakonazol). (Dette tallet har blitt forandret fra Brannelly et al. 15, Figur 1B og 1C). Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av denne protokollen vi var i stand til å sikkert og effektivt redusere behandlingsdose og tid for itrakonazolbehandling for BD i amfibier. Den laveste behandlingsdose og tid (0,0025% for seks dager) var en vellykket behandling for subklinisk infisert I. nebulifer. Effektiviteten av både en lavere dose og behandlingstiden demonstrere behovet for kliniske behandlingsstudier for BD infeksjon behandlinger, som for tiden er det ingen trygge og effektive behandlinger som skal brukes for alle arter og aldersklasser av amfibier.
Dødsårsaken følge av itrakonazol behandling ikke er kjent på dette punktet 11.. Nekropsi og histopatologi ble utført på et lite undersett av individer som døde under eller kort tid etter behandlingsperioden i Brannelly et al. 15. studien. Resultatene av disse analysene var mangelfulle med hensyn til dødsårsaken, men det er klart at ingen dyr dødeav chytridiomycosis. Lett autolyse skjedde mellom død og prøven bevaring, noe som kan ha påvirket vår evne til å oppdage små forskjeller mellom behandlingsgruppene.
Selv om denne protokollen støtter eksistensen av en trygg og effektiv behandlingsregime, flere studier som dette trenger å være i gang. En andre azol behandling, vorikonazol, har vist seg å være effektiv i minst en art 18. Vorikonazol er mer stabilt i en vannløsning enn itrakonazol og har blitt vist å være trygg for tadpole bruk 18.. Selv om en enkelt dose av itrakonazol og vorikonazol behandling er like i pris, er vorikonazol mye dyrere for kjøp enn itrakonazol, ledende forskere og fange ledere til å velge itrakonazol mer regelmessig. På denne tiden, har bare én publisert studie demonstrerte effektivt av vorikonazol 18. For å demonstrere effekten, mer artene må trialed.
<p class = "jove_content"> azolfungicider representerer en type soppdrepende cellegift som hemmer soppvekst 13. Det finnes andre behandlingsmetoder som tar sikte på å drepe patogene sopp i stedet for bare å redusere veksten. Bd er drept in vitro ved temperaturer over 28 ° C og varmebehandling har som mål å drepe Bd i epidermis. Terbinafin hydroklorid, en alternativ soppdrepende som har vært vellykket på behandling Bd infeksjon i noen arter 19, fungerer ved å forårsake lyse av de soppcellene. Soppmidler som direkte angriper patogenet kunne være mer vellykkede behandlinger, og mer arbeid som må gjøres for å teste lovende behandlingstilbud for BD-infeksjon.Itrakonazol behandling har vist seg å være effektive i subklinisk infiserte dyr, men behandling av klinisk chytridiomycosis har stort sett vært mislykket. Bare én studie for å date 20 har vellykket behandlet terminalt jeg ll amfibier, og behandlingen involvert en aggressiv kombinasjon av elektroterapi og kjemoterapi. Vellykket behandlingstilbud for terminalt syke dyr er nødvendig, spesielt for kritisk truede dyr i fangenskap kolonier der beskyttelse av hver enkelt er viktig for bevaring av arten.
Selv om å redusere dosen og behandlingstiden var vellykket for I. nebulifer, har behandlingen ikke blitt prøvd ut på andre arter eller dyr med kliniske infeksjoner. Noen arter og livsstadier er intolerante overfor itrakonazolbehandling, så før du påfører en storstilt behandling regime, bør fangenskap ledere prøvebehandling på en liten undergruppe av enkeltpersoner for å fastslå sikkerhet og effektivitet. Testing av de behandlede dyr i minst fire uker etter avslutning av behandling er nødvendig for å oppnå utryddelse av lavt nivå infeksjon 7, og bør gjennomføres etter hver behandlingsregime.
telt "> er avgjørende for å lykkes i naturvernarbeid og fangenskap kolonier Etablering trygge og effektive behandlingstilbud for BD-infeksjoner i fangenskap attestasjons kolonier område prioritert for amfibier bevaring innsats. Opprettholde Bd gratis kolonier kan være den eneste livline for arter på randen av utryddelse .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Jeg vil gjerne takke CL Richards-Zawacki om hjelp konseptualisere eksperimentell design og bistå med materialer, A. Pessier om hjelp å etablere et behandlingsregime og obduksjon analyser, MWH Chatfield, MJ Robak, K. Tasker og D. Lenger om hjelp i laboratorium og støtte og M. McFadden og P. Harlow på Taronga Zoo for bruk av deres plass under filmingen. Prosjektet ble delvis finansiert av Louisiana Department of Wildlife and Fisheries gjennom Louisiana Environmental Education Commission stipen til LA Brannelly og ved Life Technologies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox | Janssen Pharmaceutica Inc. | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-100 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sterile cotton swabs | Medical and Wire Equipment | MW113 | |
| 1.5 ml Microtubes | Sarstedt | 73.703.217 | |
| Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69581 | |
| 7500 Real-time PCR | Applied Biosystems | 4351104 | |
| VIC IPC | Applied Biosystems | 4308323 | |
| BSA | Applied Biosystems | AM2618 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| Tryptone | Invitrogen | Q10029 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS430589 |
References
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Wake, D. B., Vredenburg, V. T. Colloquium paper: are we in the midst of the sixth mass extinction? A view from the world of amphibians. PNAS. 105, 11466-11473 (2008).
- Voyles, J., et al. Electrolyte depletion and osmotic imbalance in amphibians with chytridiomycosis. Dis. Aquat. Org. 77 (2), 113-118 (2007).
- Ramsey, J. P. Amphibian immune defenses against Batrachochytrium dendrobatidis: A war between host and pathogen. , (2011).
- McMahon, T. A., et al. Chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis has nonamphibian hosts and releases chemicals that cause pathology in the absence of infection. PNAS. 110 (1), 210-215 (2013).
- Berger, L., Speare, R., Pessier, A., Voyles, J., Skerratt, L. F. Treatment of chytridiomycosis requires urgent clinical trials. Dis. Aquat. Org. 92, 165-174 (2010).
- Chatfield, M. W. H., Richards-Zawacki, C. L. Elevated temperature as a treatment for Batrachochytrium dendrobatidis infection in captive frogs. Dis. Aquat. Org. 94 (3), 235-238 (2011).
- Karbowski, M., et al. Free radical-induced megamitochondria formation and apoptosis. Free Rad. Biol. Med. 26 (98), 396-409 (1999).
- Bishop, P. J., et al. Elimination of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis by Archey's frog Leiopelma archeyi. Dis. Aquat. Org. 84 (1), 9-15 (2009).
- Pessier, A. P., Mendelson, J. A Manual For Control of Infectious Diseases in Amphibian Survival Assurance Colonies and Reintroduction Programs. , IUCN/SSC Conservation Breeding Specialist Group. Apple Valley, MN. (2009).
- Page, S. W. Chloramphenicol 1. Hazards of use and the current regulatory environment. Aus. Vet. J. 68 (1), 1-2 (1991).
- Yoon, H. -J., Seo, M. H., Kim, J. -K. Pharmaceutical formulations for itraconazole. , (2005).
- Garner, T. W. J., Garcia, G., Carroll, B., Fisher, M. C. Using itraconazole to clean Batrachochytrium dendrobatidis infection, and subsequent depigmentation of Alytes muletensis tadpoles. Dis. Aquat. Org. 83, 257-260 (2009).
- Brannelly, L. A., Richards-Zawacki, C. L., Pessier, A. P. Clinical trials with itraconazole as a treatment for chytrid fungal infections in amphibians. Dis. Aquat. Org. 101 (2), 95-104 (2012).
- Jones, M. E. B., Paddock, D., Bender, L., Allen, J. L., Schrenzel, M. S., Pessier, A. P. Treatment of chytridiomycosis with reduced-dose itraconazole. Dis. Aquat. Org. 99 (3), 243-249 (2012).
- Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Dis. Aquat. Org. 60 (2), 141-148 (2004).
- Martel, A., et al. Developing a safe antifungal treatment protocol to eliminate Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians. Med. Mycol. 49 (2), 143-149 (2011).
- Bowerman, J., Rombough, C., Weinstock, S. R., Padgett-Flohr, G. E. Terbinafine hydrochloride in ethanol effectively clears Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians. J. Herpetol. Med. Surg. 20 (1), 24-29 (2010).
- Young, S., Speare, R., Berger, L., Skerratt, L. F. Chloramphenicol with fluid and electrolyte therapy cures terminally ill green tree frogs (Litoria caerulea) with chytridiomycosis. J. Zoo Wildlife Med. 43 (2), 330-337 (2012).
