Summary
Infecção Batrachochytrium dendrobatidis em anfíbios pode ser eliminado usando uma concentração reduzida (0,0025%) e duração mais curta (banhos de cinco minutos, durante seis dias) de itraconazol do que é geralmente usado. Menos de mortalidade e menos efeitos secundários negativos foram observadas utilizando este protocolo de tratamento modificado.
Abstract
Anfíbios estão experimentando o maior declínio de qualquer classe de vertebrados e uma das principais causas desses declínios é um fungo, Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), que faz com que a quitridiomicose doença. Colônias de garantia de cativeiro são importantes em todo o mundo para as espécies de anfíbios ameaçadas e pode ser a única tábua de salvação para aqueles em perigo crítico de extinção. A manutenção de colônias livres de doença é uma prioridade dos gestores de cativeiro, ainda tratamentos seguros e eficazes para todas as espécies e entre as fases da vida ainda não foram identificados. O tratamento quimioterapêutico mais amplamente utilizado é o itraconazol, embora a dose utilizada pode ser prejudicial para alguns indivíduos e espécies. Foi realizado um ensaio tratamento clínico para avaliar se uma dose mais baixa e mais seguro, mas eficaz, de itraconazol poderia ser encontrado para curar infecções bd. Observou-se que, reduzindo a concentração de tratamento ,01-,0025% e reduzindo o tempo de tratamento de 11-6 Dias de banhos 5 min, rãs poderia ser curado de infecção Bd com menos efeitos secundários e menos mortalidade associada ao tratamento.
Introduction
Anfíbios estão experimentando atualmente o maior declínio da biodiversidade de todos os táxons de vertebrados 1. Quitridiomicose, uma doença de pele causada pelos dendrobatidis patógeno Batrachochytrium fúngicas chytrid (bd), é uma das principais causas desses declínios dramáticos 2 Bd é o pior já registrado patógeno para causar a perda de biodiversidade:. Que infecta mais de 600 espécies de anfíbios e tem causado declínios em mais de 300 espécies, das quais cerca de 200 espécies tornaram-se criticamente ameaçadas ou extintas 2,3. O fungo anfíbio não é hospedar específico e não está claro quais são as qualidades do hospedeiro permitem infecção Bd progredir causando doença grave. Chytridiomycosis causa morte por perturbar canais iônicos na pele, resultando na perda de eletrólitos e insuficiência cardíaca 4. Além disso, Bd sobrenadante (que não contém zoósporos Bd) provoca uma resposta imune em girinos 5 leading pesquisadores a acreditar Bd produz um subproduto tóxico 6.
Porque muitas espécies estão diminuindo rapidamente, colônias de garantia de cativos e programas de melhoramento são importantes medidas de conservação, e pode ser a única tábua de salvação para algumas espécies. Estabelecer e manter colônias livres de doenças é um desafio para as instalações de gestão de anfíbios. Os atuais métodos quimioterápicos para o tratamento de infecções Bd, embora eficazes, podem ser prejudiciais para os animais que estão sendo tratados, e nenhum método de tratamento único tem sido bem sucedida entre as espécies e classes de idade de anfíbios 7.
Poucos estudos clínicos de tratamentos para a infecção Bd foram realizados 7. Os três métodos mais utilizados de tratamento são a terapia do calor, cloranfenicol e itraconazol. Terapia de calor é uma opção de tratamento nonchemotherapeutic que parece ter poucos efeitos secundários, pode ser utilizada em vários estágios da vida, e é Generaliado eficaz. Num ensaio de tratamento, Chatfield e Richards-Zawacki 8 constatou que 96% dos animais tratados tinha desaparecido infecções depois de ser alojados a 30 ° C durante 10 dias. Embora este estudo não foi 100% bem sucedida, ele fornece uma linha de base para os outros para avaliar a terapia de calor para sua própria espécie. Terapia de calor, embora eficaz para muitas espécies, é impraticável para muitas espécies alpine que não pode permanecer a temperaturas elevadas por um longo período de tempo. Cloranfenicol, um agente antibacteriano, foi utilizada com sucesso para tratar Bd em muitas espécies, e inibe o crescimento de fungos in vitro. Como um agente antibacteriano, o cloranfenicol não ataca o fungo especificamente mas tem sido conhecido por causar a apoptose em células eucarióticas 9. Especulou-se que a terapia de cloranfenicol provoca a apoptose na pele, matando esporângios intracelular, embora o mecanismo exacto de acção é desconhecido. Embora nenhum estudo clínico foi realizado e, portanto,a dose e tempo de tratamento não ter sido avaliado, protocolos de tratamento correntes requerem tipicamente a submersão de duas a quatro semanas 10,11, tornando impraticável o tratamento de anfíbios terrestres. Cloranfenicol foi também restrito em alguns países para uso veterinário porque a exposição humana tem sido associada com uma forma rara de anemia aplástica 12.
Itraconazol, um antifúngico azóis, é o mais amplamente utilizado para o tratamento da infecção por Bd em anfíbios em cativeiro. O protocolo mais utilizado é animais de banho em uma solução de 0,01% itraconazol por cinco minutos por dia durante 11 dias consecutivos. Este protocolo foi derivado de padrões utilizados para a administração de mamíferos, e, ao mesmo tempo eficaz para anfíbios, que não se baseia em estudos clínicos em anfíbios 11,13. Este protocolo pode provocar efeitos colaterais negativos em certas espécies, especialmente no género Rana e em girinos e metamorphs últimos 11.Girino tratamento foi bem sucedido com uma concentração muito mais baixa (0,0005%) do itraconazole, mas foi associado a despigmentação 14. Esta mesma concentração foi julgado em metamorphs recentes e encontrou a ser vencida no tratamento da infecção 15. Porque não existe risco de efeitos colaterais negativos com o tratamento itraconazol, alguns profissionais têm utilizado a metade da concentração usual (0,005%) por 11 dias consecutivos e encontrei este para ser bem sucedido na cura de infecções Bd 16.
O presente estudo é um resumo de um estudo tratamento clínico utilizando itraconazol para tratar a infecção Bd 15. O protocolo descreve uma tentativa para encontrar a menor dose e tempo de tratamento, que é seguro e eficaz para o tratamento de animais infectados com Bd itraconazol. Animais utilizados neste estudo foram metamorphs recentes de sapos costa do golfo, Incilius nebulifer.
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Protocol
Aprovação de Ética: Este estudo e seus métodos foram aprovadas pelo Uso de Animais e Cuidados Comitê da Universidade de Tulane (protocolo n º 0407.).
1. Testes para Bd Infecção
- Limpando para Bd
- Animais Swab com um cotonete estéril cinco vezes no ventrum, cinco vezes em cada coxa, de cada lado, e cada um dos membros de um total de 45 cursos. Limpando é um método não invasivo de amostragem para Bd na pele de anfíbios.
- Rodar suavemente o cotonete durante e entre os cursos para garantir a maior quantidade de DNA é recolhida no cotonete.
- Armazene cotonetes em microtubos de 1,5 ml a -20 ° C.
- Extração de DNA e ensaio qPCR
- Extrair ADN genómico a partir dos cotonetes usando um kit de isolamento de ADN comercialmente disponíveis, em conformidade com as instruções de tecido animal.
- Analisar o ADN extraído utilizando PCR quantitativo em tempo real (qPCR) seguinte Boyle
- Diluir as amostras de extração de DNA de 1:10 com água deionizada dupla.
- Adicionar 0,7 mL de albumina de soro bovino (BSA) para impedir a inibição da PCR.
- Incluir um controlo positivo interno em cada amostra para garantir a inibição PCR não estava afetando os resultados.
- Amostras de correr com um controle positivo e negativo e uma série de padrões de diluição para estimar zoospore (infecção) de carga.
2. Inoculação
- Cultura Bd
- Prepare o caldo de triptona, adicionando 10 g de triptona e 1 L de osmose inversa ou de água desionizada, autoclavada (121 ° C durante 40 minutos) e deixa-se arrefecer. Uma vez arrefecida a 23 ° C, adicionar 1 ml de penicilina-estreptomicina.
- Grow Bd tensão (a partir de J. JEL411 Longcore, isolado a partir de Guabal, Panamá de um Phyllomedusa lemon) num caldo de triptona durante sete dias a 23 ° C.
- Transfira a bRoth cultura de triptona e placas de agar.
- Para fazer placas, adicionam-se 10 g de triptona e 10 g de ágar e 1 L de osmose inversa ou de água deionizada e de autoclave (121 ° C durante 40 min).
- Uma vez que a mistura autoclavada é fria o suficiente para tocar, mas antes que ele congela, despeje em placas de Petri, 1/4-1/3 íntegra, em uma capela de fluxo laminar.
- Quando agar tem congelado e resfriado por completo, adicionar 0,5 ml de caldo de Bd para cada prato e espalhe uniformemente em volta do prato. Deixe secar.
- Uma vez que as placas são inoculados com zoósporos bd, placas de vedação com Parafilm.
- Permitir que as placas a incubar a 23 ° C durante cinco a sete dias. Verifique zoospore movimento para assegurar a viabilidade antes da inoculação.
- Placas inundação para solução inoculação zoospore
- Após os cinco a sete dias de incubação Bd e crescimento, inundar cada placa com 5 ml de água da torneira e envelhecido permitir zoósporos de introduzir os meios de comunicação durante 10 min.
- Despeje a suspe zoosporension para um recipiente portátil.
- Estimar concentração zoospore com um hemocitômetro.
- Dilui-se a mistura uma concentração de 1 x 10 6 por 3 ml com água da torneira envelhecido.
- Inocular animais
- Em cada 50 ml recipientes, inocular cada animal por vazamento 3 ml mistura de inóculo sobre a sua ventrum. Permitir inoculo extra para escorrer para a base do recipiente de inoculação.
- Cada animal irá permanecer no recipiente de inoculação durante 24 h para assegurar a infecção.
- Após 24 horas da inoculação, o retorno animais para terrários desinfectados individuais.
- Permitir infecção construir por duas semanas. Confirme infecção com cotonete e os resultados de qPCR, e começar o tratamento.
- Para controles Bd-negativos, inundação Bd-livre placas de ágar com 5 ml com idades água da torneira, e inocular os animais simulada usando os mesmos métodos acima.
3. Regime de Tratamento
- Prepare banho de tratamento
- Adicionar 2,50 ml itraconazol aquosa (1% Sporanox solução oral) para uma solução de L Anfíbio Ringer (0,0025% itraconazol - a menor concentração tratamento eficaz).
- Solução receita do Anfíbio Ringer: 1 L de osmose reversa ou água deionizada, cloreto de 6,6 g de sódio, 0,15 g de cloreto de potássio, 0,15 g de cloreto de cálcio e 0,2 g de bicarbonato de sódio. Solução de autoclave (121 ° C durante 40 minutos) e deixa-se arrefecer até à temperatura ambiente.
- Para 0,01% de concentração de tratamento itraconazol, adicionar 10,00 ml itraconazol aquosa (1% Sporanox solução oral) para solução de 1 L Anfíbio Ringer
- Para 0.005% de concentração tratamento itraconazol, adicionar 5,00 ml itraconazol aquosa (1% Sporanox solução oral) para solução de 1 L Anfíbio Ringer.
- Para controles Bd-positivas e Bd-negativos, banhar animais em Solução de Ringer Anfíbio sem itraconazol.
- Adicionar 2,50 ml itraconazol aquosa (1% Sporanox solução oral) para uma solução de L Anfíbio Ringer (0,0025% itraconazol - a menor concentração tratamento eficaz).
- Tratamento <ol>
- Coloque anfíbios individuais em 50 ml desinfectados recipientes com 35 ml da solução de tratamento.
- Assegurar animais são totalmente cobertos por cinco minutos rodando suavemente o recipiente.
- Retornar animais para terrários desinfectados. Repita durante seis dias.
- Os animais de teste para a infecção Bd sobre o tratamento dia começa.
- Os animais de teste para a infecção Bd uma semana após terminar o tratamento, e uma vez por semana durante quatro semanas para garantir a infecção foi eliminada.
4. Bd como Biohazard
- Desinfetar semanal terrários individual.
- Banhe os recipientes Terraria e tratamento em um alvejante banho solução a 10%.
- Lavar cada recipiente branqueada duas vezes com água corrente.
- Permitir recipientes para secar por 24 horas antes de sua reutilização.
- Usar luvas de borracha nitrílica limpas ao manusear animais para evitar a contaminação cruzadade Bd patógeno. Mudar de luvas entre tratamento de cada animal.
- Desinfectar todos os resíduos de líquido antes do descarte por levando a solução a 10% de lixívia.
- Autoclave todos os resíduos sólidos que está potencialmente exposto a Bd antes do descarte.
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Representative Results
Itraconazol tratamento foi considerado bem sucedido se todos os animais foram Bd-negativos, quatro semanas após o fim do tratamento. Antes do tratamento iniciado duas semanas após a inoculação, todos os animais foram inoculados Bd-infectadas, com uma carga média de zoosporos de 1.121,7 (± 17,34), enquanto que quatro semanas após o fim do tratamento, os animais de controlo Bd-positivos tinham uma média de zoosporos de carga 16,765.12 ( ± 14643,08).
Tratamento de Incilius nebulifer (n = 15) foi bem sucedido usando banhos em 0,0025% de concentração de itraconazol por cinco minutos por dia, durante seis dias. Esta dosagem de concentração baixa de tratamento itraconazole não diferiram significativamente em mortalidade, quando comparados com os controlos positivos (Bd-regressão de Cox: χ 2,1 = 2,17, exp (b) = 20,500, p = 0,339) (Figura 1B), muitos dos quem sobreviveu até o final do julgamento com infecção Bd.
Banhos de 0,0025% itraconazole durante 11 dias, e tanto a 0,005% e 0,0025% de itraconazole durante seis dias, foram descobertos como sendo opções de tratamento seguro e eficaz (Figuras 1A e 1B). A concentração de tratamento recomendado e metade a concentração de um tempo de tratamento de 11 dias aumentou significativamente mortalidade quando comparados com os controles Bd-positivos (regressão Cox: 0,01% itraconazol χ 2,1 = 35,68, exp (b) = 307,54, p <0,01; 0,005% itraconazol χ 2,1 = 16,17, exp (B) = 9,40 , p <0,01) (Figura 1A). O tratamento 0,01% itraconazol por 11 dias causou 100% de mortalidade em I. nebulifer, e metade a concentração (0,005% de itraconazole durante 11 dias) provocou a mortalidade de 60% (Figura 1A). Necropsia e histopatologia para um pequeno subconjunto de animais que morreram durante o tratamento foram realizados. Nenhum animal neste estudo morreu de quitridiomicose.
Figura 1. Diferenças na sobrevivência em todos os tratamentos de itraconazol 15 (A) Incilius nebulifer: 11. Tratamento d (n = 15 para cada concentração de itraconazol de 0,01, 0,005 e 0,0025%, n = 17 para o grupo de controlo positivo Bd-e n = 9 para o grupo controle Bd-negativo). (B) I. nebulifer: 6 d tratamento (n = 15 para cada concentração de itraconazol de 0,01, 0,005 e 0,0025%, n = 17 para o grupo de controlo positivo Bd-e n = 9 para o grupo de controlo Bd-negativo). Setas negras indicam o último dia de tratamento. As linhas contínuas indicam a sobrevivência de grupos de controle (preto = Bd-positivo, cinza = Bd-negativo). Linhas quebradas indicam a sobrevivência de grupos de tratamento itraconazol (pontos cinza-luz = 0,01%, Pontos cinzentos médio = 0,005%, pontos pretos = 0,0025% itraconazol). (Esta figura foi modificada de 15 Brannelly et al., Figura 1B e 1C). Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
Usando este protocolo, fomos capazes de forma segura e eficaz reduzir a dose de tratamento e tempo de tratamento itraconazol por Bd em anfíbios. A menor dose do tratamento e do tempo (0,0025% por seis dias) era um tratamento bem sucedido para I. subclinically infectados nebulifer. A eficácia de ambos uma dose mais baixa e tempo de tratamento demonstram a necessidade de ensaios clínicos para tratamento de infecção tratamentos bd, como atualmente não há tratamentos seguros e eficazes a serem utilizados para todas as espécies e classes de idade de anfíbios.
A causa da morte resultante do tratamento itraconazol é desconhecido até o momento 11. Necropsia e histopatologia foram conduzidos em um pequeno subconjunto dos indivíduos que morreram durante ou logo após o período de tratamento no estudo Brannelly et al. 15. Os resultados destas análises foram inconclusivos quanto à causa da morte, embora seja claro que nenhum animal morreude quitridiomicose. Autólise Moderado ocorrido entre a morte ea preservação da amostra, o que pode ter afetado a nossa capacidade de detectar diferenças sutis entre os grupos de tratamento.
Embora este protocolo suporta a existência de um seguro e eficaz regime de tratamento, mais estudos como este precisa estar em curso. Um segundo tratamento de azol, voriconazol, tem sido demonstrado ser eficaz em, pelo menos, uma espécie de 18. O voriconazol é mais estável numa solução aquosa de itraconazol e demonstrou ser seguro para uso girino 18. Embora uma dose de tratamento único de itraconazol e voriconazol são semelhantes em preço, o voriconazol é muito mais caro para a compra de itraconazol, levando os pesquisadores e gestores de cativos para escolher itraconazol com mais regularidade. Neste momento, apenas um estudo publicado tenha demonstrado a eficácia de voriconazol 18. Para demonstrar a eficácia, mais espécies precisam ser testadas.
<antifúngicos p class = "jove_content"> azólicos representam um tipo de quimioterapia antifúngico que inibe o crescimento de fungos 13. Existem outros métodos de tratamento que visam a matar o fungo patogênico ao invés de apenas reduzir o crescimento. Bd é morto em vitro em temperaturas acima de 28 ° C e terapia de calor tem como objetivo matar Bd na epiderme. Cloridrato de terbinafina, um antifúngico alternativa que tem sido bem sucedido no tratamento da infecção do Bd em algumas espécies 19, funciona fazendo com que a lise das células fúngicas. Antifúngicos que atacam diretamente o patógeno pode ser tratamentos mais bem-sucedidos, e mais trabalho precisa ser feito para testar as opções de tratamento para a infecção pelo Bd promissores.Tratamento itraconazole tem sido mostrado para ser eficaz em animais infectadas subclinicamente, mas o tratamento de quitridiomicose clínica tem sido largamente mal sucedidas. Apenas um estudo até à data de 20 foi tratado com sucesso terminal i anfíbios ll, e o tratamento envolveu uma combinação de terapia agressiva electrólito e quimioterapia. Opções de tratamento bem sucedido para animais com doenças terminais são necessários, especialmente para animais criticamente em perigo de extinção em colónias em cativeiro onde a proteção de cada indivíduo é essencial para a conservação da espécie.
Apesar de reduzir a dose e tempo de tratamento foi bem sucedido para I. nebulifer, o tratamento não tem sido testadas em outras espécies de animais ou com infecções clínicas. Algumas espécies e fases da vida são intolerantes com tratamento itraconazol, por isso, antes de aplicar um regime de tratamento em larga escala, os gestores devem cativos tratamento experimental em um pequeno subconjunto de indivíduos para determinar a segurança e eficácia. Testando os animais tratados durante pelo menos quatro semanas após o término do tratamento é necessário para assegurar a erradicação da infecção de baixo nível 7, e deve ser executado depois de cada regime de tratamento.
tenda "> Estabelecer opções de tratamento seguras e eficazes para infecções Bd em prioridade cativo área colônias de garantia para os esforços de conservação de anfíbios. Manter Bd colônias livres é essencial para o sucesso dos esforços de conservação e colónias em cativeiro pode ser a única tábua de salvação para as espécies à beira da extinção .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
O autor declara não interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Eu gostaria de agradecer a CL Richards-Zawacki ajuda conceituar o projeto experimental e auxiliando com materiais, A. Pessier ajuda estabelecer um regime de tratamento e necropsia análises, MWH Chatfield, MJ Robak, K. Tasker e D. Lenger ajuda na laboratório e apoio e M. McFadden e P. Harlow no Zoológico Taronga para o uso de seu espaço durante as filmagens. O projeto foi parcialmente financiado pela Louisiana Departamento de Vida Selvagem e Pesca através da concessão Louisiana Comissão de Educação Ambiental atribuído a LA Brannelly e pela Life Technologies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox | Janssen Pharmaceutica Inc. | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-100 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sterile cotton swabs | Medical and Wire Equipment | MW113 | |
| 1.5 ml Microtubes | Sarstedt | 73.703.217 | |
| Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69581 | |
| 7500 Real-time PCR | Applied Biosystems | 4351104 | |
| VIC IPC | Applied Biosystems | 4308323 | |
| BSA | Applied Biosystems | AM2618 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| Tryptone | Invitrogen | Q10029 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS430589 |
References
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