Summary
Total RNA af høj kvalitet er fremstillet af cellekroppe af mus rygmarvsmotor neuroner ved laserfangst microdissection efter farvning rygmarv sektioner med Azure B i 70% ethanol. Tilstrækkelig RNA (~ 40-60 ng) er genvundet fra 3.000-4.000 motoriske neuroner til at tillade downstream RNA-analyse af RNA-seq og qRT-PCR.
Abstract
Forberedelse af højkvalitets RNA fra celler af interesse er afgørende for præcis og meningsfuld analyse af transskriptionelle forskelle mellem celletyper eller mellem den samme celletype i sundhed og sygdom eller efter farmakologiske behandlinger. I rygmarven kompliceres et sådant præparat fra motoriske neuroner, målet for interesse for mange neurologiske og neurodegenerative sygdomme, af det faktum, at motoriske neuroner udgør < 10% af den samlede cellepopulation. Laserfangstmikreksinfektion (LMD) er udviklet til at løse dette problem. Her beskriver vi en protokol til hurtigt at komme sig, fryse og sektionsmuse rygmarv for at undgå RNA-skader ved endogene og eksogene RNases, efterfulgt af farvning med Azure B i 70% ethanol for at identificere motorneuronerne, mens de holder endogene RNase hæmmet. LMD bruges derefter til at fange de farvede neuroner direkte ind i guanidin thiocyanat lysis buffer, opretholde RNA integritet. Standardteknikker bruges til at gendanne det samlede RNA og måle dets integritet. Dette materiale kan derefter bruges til downstream-analyse af udskrifterne af RNA-seq og qRT-PCR.
Introduction
I pattedyr væv bestående af flere forskellige celletyper, fremkomsten af laser fange microdissection (LMD) instrumentering har givet mulighed for at vælge en bestemt celletype til analyse på RNA eller protein niveau. På nuværende tidspunkt gør forstærknings- og næste generations sekventeringsteknikker det muligt at anvende en pulje af det samlede RNA fra nogle få tusinde celler for at opnå en relativt grundig opgørelse over transskriptionen, herunder vurdering af relative niveauer af RNA'er og identifikation af forskellige splejsede former. Til dato vil proteomics analyser af et par tusinde celler nå ned gennem kun mere rigelige arter. For eksempel har vi identificeret < 1.000 af de mest rigelige proteiner fra 3.000-4.000 motoriske neuroncellelegemer (ikke vist), og Zhu og kolleger har for nylig rapporteret at identificere 2.665 proteiner fra ~ 15.000 tumorceller1. Med den videre udvikling af massespektrometri er det imidlertid sandsynligt, at sådanne analyser vil strække sig langt mere dybtgående.
Her præsenterer vi en specifik protokol, der bruges til LMD af motoriske neuroncellelegemer fra muss rygmarv efterfulgt af forberedelse af RNA. Denne protokol blev anvendt i forbindelse med sammenligning af RNA'er fra motoriske neuroner af presymptomatiske transgene mutante superoxid dismutase (SOD)1 amyotrofisk lateral sklerose (ALS) mus med RNA'er fremstillet af en transgen stamme af vildtypen SOD1 af både RNA-seq- og qRT-PCR-validering2. Især motor neuroner, i den forreste horn af det grå stof i rygmarven, omfatter < 10% af den samlede cellepopulation, omgivet af et hav af astrocytter, og som sådan, deres transskriptionelle profil kan ikke let dekonvoluteres fra undersøgelser af hele ledningen. En laseroptagelsesmetode er således ideel til analyse af RNA-ekspression i disse celler, hvor fysiologi bevares ved hurtigt at udskille og fryse ledningen efter kort intrakardi saltvandsperfusion. Motor neuron somata er store og er således let påviselige, her ved hjælp af et farvestof, der har stærk affinitet for neuroner3. Derudover giver disse celler med en sådan størrelse en relativt stor mængde RNA pr. indfanget celle. Den anvendte procedure, som beskrevet nedenfor, kunne let justeres for at opnå andre neuronale celletyper, samt potentielt andre celletyper, der specifikt identificeres enten ved farvepletfarvningsteknikker eller ved antistoffarvning.
Protocol
De her beskrevne procedurer for anæstesi, aktiv dødshjælp og hjertetransfusion af mus blev udført under en protokol godkendt af Yale University Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Forberedelse af RNase-fri instrumenter og løsninger
- RNase er et almindeligt forurenende stof af alle laboratorieoverflader, herunder bænktoppe, mikropipetter og investigator.
- Skift handsker ofte eller regelmæssigt tørre med en RNAse dekontaminering løsning.
- Dissektionsværktøjer i rustfrit stål og glas kan gøres RNase-fri ved opvarmning ved >200 °C i 1 time eller mere. Bemærk: Dampsterilisering ødelægger ikke RNase. Alternativt kan du tørre med en RNase dekontaminerende opløsning og derefter med RNase-fri 70% ethanol og lufttørring.
- Tør bænk toppe, andre lab overflader og micropipettors med RNase dekontaminering løsning, derefter med RNase-fri 70% ethanol. Udpeg en specifik laboratoriebænk eller arbejdsområde til RNA-genopretning og -analyse. Bemærk: Fjern tipudstødere, før du tørrer pipetorernes aksler af og lader dem være slukket, hvis det er muligt.
- Brug rør, mikrocentrifugerør, pipetter og micropipettespidser, der er certificeret af deres producent til at være RNase-fri. Brug af meget lave bindingstips og mikrorør anbefales. Hvis det er muligt, skal du bruge friskåbne kasser eller poser af disse komponenter og holde dem adskilt fra den generelle laboratorieforsyning.
- Få RNase-fri løsninger [Dulbecco's calcium og magnesium-fri PBS (PBS), ethanol, RNase-fri 70% ethanol] fra kommercielle kilder. Brug nyåbnede flasker til hvert eksperiment.
- Kilden til Azure B-farvestoffet er afgørende for en vellykket gendannelse af intakt RNA. Test hvert parti farvestof, før der begås dyrebare prøver til farvning og indsamling. Saml et par tusinde neuroner fra et ikke-oplevelsesdyr, forbered RNA, og bestem RNA-integriteten som beskrevet nedenfor for at finde en, der konsekvent producerer RIN-numre over 8,5.
- Azure B-farvestof (1 %, wt/vol) opløses i RNase-fri 70 % ethanol, typisk 0,3 g i 30 ml ethanol i et 50 ml centrifugerør. Bland godt på en rocker på RT natten over, eller indtil alle partiklerne er opløst. Et rør af denne opløsning kan bruges til at plette flere dias uden at påvirke farvningsintensiteten.
- Som en sikkerhedsforanstaltning skal du bruge et andet rør af plet for hver biologisk replikat.
- Brug cryomolds og O.C.T. til indlejring af ledningssektioner uden yderligere behandling.
- Kryostaten skal fastholdes ved -20 til -24 °C. Efter sektionsopderinger anbringes rutsjebanerne i en fryser på -80 °C, indtil der er forberedt et tilstrækkeligt antal. Start RNA-forberedelsen så hurtigt som muligt, når rutsjebanerne er lavet. Til langtidsopbevaring skal olt-blokke, der ikke er sektioneret eller delvist, holdes i stedet for dias ved 80 °C.
- Lav guanidin thiocyanatbufferen til RNA-forberedelse fra de dissekerede motorneurner ved hjælp af de løsninger, der leveres af RNA-forberedelsessætproducenten i henhold til dens retninger.
2. Forberedelse af rygmarvssektioner fra mus (figur 1A)
- Rengør alle dissektionsværktøjer, glasrutsjebaner, barberblade og dissektionsplatform ved at bage eller tørre med RNase dekontamineringsopløsning efterfulgt af RNase-fri 70% ethanol. Lad tørre i 2 min. Hold alt støvfrit ved at dække med laboratorieservietter.
- Dyrehåndteringsprocedurer, herunder anæstesi, hjertetransfusion og aktiv dødshjælp, bør udføres i overensstemmelse med kravene i den lokale institutionelle dyrepleje- og brugskomité (IACUC) med det formål hurtigt at bringe dyret til det punkt, hvor rygmarvsdesektionen er.
- Bedøve musen ved intraperitoneal (ip) injektion af en dødelig dosis ketamin (450 mg/kg).
- Når et dybt niveau af anæstesi er opnået og bekræftet af mangel på en tå-knivspids respons, placere musen ventral side op på en dissektion platform (en Styrofoam bord, for eksempel), åbne brysthulen for at eksponere hjertet, og indsætte 27 G sommerfugl nål af en infusion sat i venstre ventrikel (som er på investigator højre). Nick højre atrium med en skarp pincet, og perfuse med PBS med en hastighed på 5-7 ml / min i ca 2 min ved hjælp af en peristaltisk pumpe. Væsken, der strømmer fra atriet, skal stort set være fri for blod på dette tidspunkt.
- Fjern perfusionsnålen, halshugge musen og vende den om på dissektionsbrættet. Åbn huden for at udsætte rygsøjlen, brug en lille saks og pincet til at fjerne ryghvirvlerne, og løft rygmarven, mens du skærer nerverødderne med skarpe pincet. Hastighed og praksis er afgørende for at flytte fra starten af perfusionen til fjernelse af ledningen; dette bør ikke tage mere end 7 min.
- Skyl ledningen i 10 sek i RNase-fri vand for at vaske eventuelt resterende blod af. Læg rygmarven på en RNase-fri glasrutsjebane med en buet pincet meget forsigtigt, men hurtigt. Del rygmarven tværgående ved hjælp af et rent barberblad i 9-10 stykker.
- Placer stykkerne i en cryomold fyldt med O.C.T. ved hjælp af de samme pincet, og juster dem lodret ved hjælp af en ren nål. Placer formen i en lavvandet bakke, der indeholder 2-methylbutan forkølet med flydende nitrogen, og sæt derefter bakken i et flydende nitrogenbad for hurtigt at fryse rygmarvsstykkerne for at undgå RNA-nedbrydning.
- Den OLT-indlejrede blok opbevares ved -80 °C i op til 6 måneder før sektionsopbygning. Processen fra udtagning af ledningen gennem frysning skal ske inden for 5 minutter for at opretholde RNA-integritet.
- Kryosection O.C.T.-indlejret blok ved -20 °C med en kryostat til at producere 20 μm skiver, hver indeholder 9-10 rygmarv tværsnit, på RNase-fri PEN-membran 2 μm dias holdes i første omgang ved stuetemperatur for at sikre, at sektionerne klæber til diaset. Afsnittet genfryses straks på en overflade på -20 °C inde i kryostaten. Hold rutsjebanerne ved -80 °C, indtil de bruges.
3. Farvning af rygmarvssektioner (figur 1A)
- På et rent stativ skal du arrangere seks 50 ml koniske rør. Fyld dem alle med 25-30 ml RNase-fri 70% ethanol, så dybden er tilstrækkelig til at dække alle sektioner på et dias, når diaset er nedsænket. Lav 30-35 ml 1 % Azure B-løsning som beskrevet tidligere, og opbevar den på det samme rack for at minimere tiden mellem skiftende løsninger under vask eller farvning. Hold tre eller fire laboratorieservietter foran stativet for hurtigt at dræne ekstra løsning.
- Tag rutsjebanerne ud af fryseren -80 °C på tøris. Tø et dias ved at placere det på en behandsket håndflade. Fjern det meste af fugten og kondensen på rutsjebanen ved at tørre den af med en laboratorieservietter, og pas på ikke at røre sektionerne. Sæt rutsjebanen på frisk silica gel desiccant i en petriskål i 30-40 sek. for at tørre helt. Hvis laboratoriets luftfugtighed er høj, kan kort behandling i en vakuumdesicator bruges til at tørre rutsjebanen hurtigere.
- Vask og farvning.
- Dyp den tørrede glide ind i det første rør af RNase-fri 70% ethanol. Blødgør rutsjebanen i 30 sek., vask derefter diaset for at fjerne OLT ved at dyppe det op og ned i 45-60 sek. Tag rutsjebanen ud af opløsningen og dræn den overskydende væske på laboratorieservietter. Gentag den samme proces ved at dyppe diaset i det andet rør på 70% ethanol. Hvis OLT omkring rygmarvssektionerne ikke er helt væk, skal vaskes i det tredje rør.
- Når du har drænet den overskydende væske, skal du nedsænke diaset i 1 % Azure B-opløsning i 70 % RNase-fri ethanol i 30-45 sek. Tøm den overskydende Azure B på en laboratorieservietter. på dette tidspunkt vil hele diaset være blåt.
- Nedsænk rutsjebanen i det næste rør på 70% ethanol, og dyp hurtigt op og ned 3-4x for at fjerne overskydende farvestof og for at gøre den specifikke motorneuronfarvning synlig. Hvis sektionerne ser meget mørkt farvede ud, skal du gentage destaining-trinnet i et frisk rør på 70% ethanol. Hvis farvningen virker for let, skal du returnere diaset til Azure B-løsningen i yderligere 30 sekunder og gentage pletten. Tør den overskydende ethanol og luft tørre diaset i ~ 40 sek, indtil al væsken er væk. Det grå stof vil være lyseblåt, mens motorneuronerne vil blive farvet dybblå, hvilket er let synligt. Start dissektionen med det samme.
4. Mikrodissection til laseroptagelse (LMD) (figur 1B)
- Tænd mikroskopet, og aflæss slangeholderen for at fastgøre hætten på et 0,6 ml mikrofugerør til prøveopsamling. Der hældes 30 μl guanidin thiocyanat lysis buffer i hætten på et 0,6 ml mikrofugerør. Dæk overfladen af hætten med væske ved at sprede opløsningen ved hjælp af en pipettespids. På denne måde opløses alle de indsamlede neuroner i opløselig opløsning, da de dissekeres. Juster hætten med hullet og målet med mikroskopsoftwaren. Hold hætten i den overdækkede position, indtil laseroptagelsen startes.
- Placer den lufttørrede rutsjebane på LMD-mikroskopets scene på hovedet, så pen-diasets membran vender nedad. Membranen med sektioner skal vende mod hullet, under hvilket opsamlingsrøret er.
- Tænd for laseren 10 min før du starter slide forberedelse. Fokuser på en rygmarvssektion med 5X-målet. Gå videre til 20X-målet for dissektion.
- Marker et "dummy"-område med lyspennen, og lad laseren skære den ud uden at samle den. Dette lemper PEN-membranen og gør det muligt at markere og skære flere regioner successivt.
- Refokuser og identificer motoriske neuroner i ventralhornregionen. Disse neuroner kan genkendes på deres placering, deres pyramidemorfologi, deres store størrelse og deres mørkeblå farvning med Azure B (Figur 2).
- Brug lyspennen til at vælge tegneværktøjet og markere langs kanten af motorneuronerne, hvilket giver en komplet kontur. Prøv at gøre omridset så tæt som muligt på motoren neuron for at undgå forurening fra andre celler end motor neuron. (Test nogle sektioner på forhånd for at se, hvor bred laserskæringen er, og juster frigangen efter behov). Marker flere celler, før de klippes. softwaren vil huske positionerne.
- Placer hætten under skærepositionen ved at klikke på hættepositionen. Klik på startknappen for at starte motor neuron dissektion med laseren. Saml alle motoriske neuroner fra alle sektioner på en glide ind i hætten af en mikrofuge rør.
- Når opsamlingen er færdig, skal du tage mikrofugerøret ud af holderen ved at aflæsse bakken og forsigtigt løsne røret. Opløs motorneuronerne fuldstændigt i bufferen ved at pipettere opløsningen op og ned. Opløsningen flyttes ind i rørets krop ved centrifugering ved 14.000 x g i 2 minutter ved 4 °C. Prøven fryses straks i tøris og opbevares ved -80 °C. Denne proces, fra dias farvning gennem motor neuron indsamling, bør ske inden for 30 minutter for en dias for at minimere RNA nedbrydning.
5. RNA-forberedelse fra motorneuroner
Tø alle de indsamlede neuroner fra et dyr og pool dem sammen for at udtrække RNA. Eksemplerne kan se lyseblå ud, afhængigt af antallet af motoriske neuroner (plettet med Azure B) i dem. Ekstrakt RNA ved hjælp af et passende sæt i henhold til protokollen for LMD-væv, eluting i det mindst mulige volumen. Tag 1 μl for at kontrollere prøvens mængde og integritet. Fastfrys det resterende RNA på tøris og opbevar ved -80 °C.
6. Bestemmelse af RNA-kvalitet og -mængde
RNA-kvaliteten bestemmes med 1 μl-prøven på en kapillær elektroforesemikrobiærchip i henhold til producentens protokol. I alt RNA-præparater med et RNA-integritetsnummer (RIN) over 8,5 kan bruges til RNA-seq og qRT-PCR. Dataoutputtet omfatter også typisk den omtrentlige koncentration af stikprøven.
Representative Results
Den protokol, der er skitseret ovenfor og i figur 1, bør producere 50 ng eller mere af det samlede RNA med et RIN på >8,5 fra 3.000-4.000 rygmarvsmotor neuroncellelegemer dissekeret fra 9-10 20 μm skiver på ca. 20 PEN-dias. Da dette antal lysbilleder udgør mindre end 10 % af en O.C.T.-indlejret blok af en muses rygmarv, er det muligt at vende tilbage til blokken, som er blevet opbevaret ved -80 °C, og skære flere skiver for at gennemgå en anden runde RNA-forberedelse. Hvis der er behov for større mængder RNA til en analyse, er det bedre kun at lave antallet af lysbilleder(f.eks. 20) på én gang, der kan behandles gennem dissektion og RNA-forberedelse om et par dage, så lav flere dias til en anden runde og kombiner produkterne. Sørg for at kontrollere RIN for hvert præparat først for at undgå at kombinere en god en med en dårlig. RNA-seq-metoder bliver mere følsomme, og nye PCR-teknologier lover højere følsomhed end de nuværende. Således vil mindre RNA fra færre neuron celle organer være påkrævet, så større sekventering dybde og mere omfattende validering af interessante hits. På den anden side kan fuld overholdelse af MIQE's anbefalinger til qRT-PCR-analyse ogvalidering 4 kræve større mængder for at give mulighed for de nødvendige kontrolreaktioner for RNA'er med lav overflod.
Figur 2 viser en typisk række billeder af en del af en afsnit af rygmarvsventilalhorn efter Azure B-farvning og dissektion. I panel A er de store, mørkt farvede cellelegemer motoriske neuroner, bekræftet af anti-Chat antistoffarvning2, og er let differentieret fra mindre naboceller. Panel B viser det samme område med individuelle cellelegemer skitseret med lyspennen og nummereret af mikroskopsoftwaren. Konturerne følger nøje margenerne i cellekroppene med en lille godtgørelse for laserens skærebredde. Denne afstand skal bestemmes for hver lasereffektindstilling for at minimere optagelsen af fremmed materiale og samtidig undgå tab af motorisk neuroncytosol. Panel C og D viser afsnittet, efter at laseren er skåret over, og de enkelte cellelegemer er faldet ned i indsamlingshætten. Bemærk, at skæremargenen ikke nøjagtigt følger lyspennskonturen i panel C, men stort set forbliver uden for den. Denne uregelmæssighed er tydelig i panel D, ligesom det mørke område omkring hvert snit, som afspejler varmeskaderne på vævet forårsaget af laseren. På grund af dette, hvis to cellelegemer er meget tæt på hinanden, er det bedre at skitsere dem for et enkelt snit, snarere end at forsøge at skære dem separat og miste nogle RNA til at varme skader på deres region af nær-kontakt.
Figur 3 viser typiske resultater af en elektrofobtisk analyse af RNA-integriteten af en prøve af RNA fremstillet af ~ 4.000 mus motoriske neuron celle organer indsamlet af LMD. Det øverste panel er elektroferogram produceret af 1 μl af det samlede RNA; indsat til højre er et billede af gelen. I begge bemærker den fremtrædende ribosomale RNA toppe. Det nederste panel er elektrofemogram af banen, der indeholder RNA-størrelsesstandarder. Analysesoftwaren beregnede etrin på 9,8 for denne prøve med en koncentration på 4,9 ng/μl. Der foreå i alt 13 μl af denne løsning efter analysen, hvilket gav 64 ng RNA til downstream qRT-PCR-validering af transskriptionsmængder. For en typisk qRT-PCR-analyse af moderat rigelige udskrifter er 0,15-0,20 ng af det samlede RNA tilstrækkeligt til at producere nøjagtig kvantantitation2, så mængden af RNA, der er tilgængelig fra dette præparat, er tilstrækkelig til at validere et antal udskrifter med flere primersæt, som anbefalet4. Selvfølgelig kan større mængder input RNA bruges til at tillade validering af sjældne udskrifter. Dette beløb er også mere end tilstrækkeligt til at muliggøre biblioteksforberedelse og næste generations RNA-seq.
Figur 1. Oversigt over rygmarvsskive produktion og laser fange microdissection af rygmarv motor neuron celle organer. A)Større skridt i skiveproduktion og farvning. B) Tegneserievisning af rygmarvssektion og laserdissektion. Klik her for at se større billede.
Figur 2. Før-og-efter-billeder af en laserdissektion af Azure B farvede motoriske neuroncellekroppe. A)En del af det ventrale horn i en farvet sektion. Bemærk de fire store, mørkt farvede celler. Der er også et par let farvede og noget mindre celler, som ikke er motoriske neuroner (bekræftet af anti-Chat antistoffarvning; ikke vist, men se Bandyopadhyay2), og som ikke vil blive udvalgt til dissektion. De mange små, mørke pletter er sandsynligvis neuronale processer (dendritter og axoner), men dette er ikke blevet bekræftet. B)De fire cellelegemer, der er skitseret med lyspennen. Bemærk, at konturerne nøje følger cellernes margener med en minimumsafstand mellem dem. Denne afstand bør etableres empirisk for hvert mikroskop og laser. Softwaren nummererer de enkelte neuroner, hvilket forenkler at holde styr på, hvor mange der er blevet indsamlet. C og D) Når laseren er skåret over, og stykkerne med cellekroppene er faldet ned i opsamlingshætten. Bemærk, at det efterladte hul er noget større end konturen og er uregelmæssigt. Dette afspejler bredden af laserstrålen og dens lidt variable skæreeffektivitet afhængigt af vævets lokale sammensætning. Også tilsyneladende er kanten af formørket væv omkring hvert hul på grund af lokale varmeskader forårsaget af laseren.
Klik her for at se større billede.
Figur 3. Elektrofobtisk analyse af integriteten af RNA fremstillet af LMD-prøver. A)En 1 μl aliquot af RNA fremstillet af ~ 4.000 motoriske neuron celle organer ved ovennævnte protokol blev analyseret ved mikrocapillary elektroforese på en mikrofluidics chip. Elektrofemogrammet er vist med fremtrædende ribosomale RNA-toppe. Til højre er et billede af selve gelen. B)Elektrofemogrammet af størrelsesstandarderne er vist med den tilsvarende gelbane til højre. Instrumentsoftwaren beregnede en RIN på 9,8 for denne prøve og en koncentration på 4,9 ng/μl. Klik her for at se større billede.
Discussion
Det vigtigste mål for denne protokols succes med at producere total RNA ved lasermikrobiation af rygmarvsskiver er RIN-værdien5. For RNA-prøver fra højere eukaryoter giver værdier over 8,5 regelmæssigt rækkefølge af høj kvalitet og qRT-PCR-data. Hvis udbyttet er lavt, men kvaliteten er høj, skal du gentage præparatet. Hvis integriteten er lavere (selv 7,5-8), er det dog bedre at finde kilden til problemet og prøve igen. Der er mange trin, hvor noget kan gå galt, men egentlig kun to kilder til problemet - endogen RNase forurening eller udefrakommende RNase forurening. Den første kan løses ved praksis, således at tiden fra ofring af musen til frysning sin O.C.T-indlejrede ledning er minimeret. Det andet punkt i protokollen, hvor endogene RNase kan bidrage til et dårligt resultat, er under forberedelsen af skiverne. Hver skive skal holde sig til en stuetemperatur PEN dias hurtigt, men det vil smelte (O.C.T bliver klar). Jo hurtigere skiven kan genfrosses, jo bedre. Den kryostat, vi bruger, har flade overflader inde i kammeret, der er ved -20 °C, som vi bruger til hurtigt at genfryse skiven. Find et lignende sted i den anvendte kryostat, og sørg for, at skiven hurtigt bliver uigennemsigtig igen.
Det kan være svært at opspore kilder til eksogen RNase, fordi der er så mange muligheder. De eneste reagenser, der ikke udtrykkeligt bruges RNase-fri, er O.C.T. og Azure B. Hvis Azure B tidligere har fungeret tilfredsstillende, kan du prøve en frisk flaske O.C.T., selvom dette reagens aldrig har været et problem. RNase-fri reagenser kan også udskiftes, selv fra en anden leverandør. En meget mere sandsynlig kilde er efterforskeren. Ud over en grundig oprydning af arbejdsområdet er det ofte nyttigt at have et andet laboratoriemedlem til at følge med og observere alle trinene i proceduren. Selv om dette er en person, der ikke rutinemæssigt udfører denne procedure, kan et nyt sæt øjne afhente en ellers ubemærket kilde til forurening.
En udvidelse af denne protokol til at genvinde RNA fra andre rygmarvsceller, fra rygmarvsceller fra andre arter eller fra specifikke celletyper i andre organer vil kræve ændringer på flere områder, der har til formål at opnå klar identifikation af de celler, der er af interesse, samtidig med at virkningen af endogene RNase undgås eller i det mindste minimeres. I protokollen her tillod hurtig fjernelse og frysning af ledningen kombineret med Azure B-farvning i 70% ethanol både minimering af RNA-nedbrydning og nem identifikation af motorneuronscellelegemer. Azure B er en veletableret histokemisk plet for neuroner, der ser ud til at binde sig til RNA3 og er blevet brugt til at evaluere RNA-indhold af neuroner i obduktionsprøver af hjernevæv fra patienter med neurodegenerativ sygdom6. Azure B-farvning påvirkede hverken integriteten af det rensede RNA eller dets evne til at blive omvendt transskriberet og analyseret. Andre farvestoffer, såsom cresyl violet7 og toluidinblå8, er blevet anvendt i lignende LMD-protokoller. Indsamling af celle organer direkte i guanidin thiocyanat løsning, da de blev dissekeret forudsat det sidste skridt, der resulterede i den rutinemæssige inddrivelse af intakt RNA.
Lignende tilgange kan forestilles for andre celler og organer, idet det erkendes, at identifikation af celler af interesse og samtidig minimere eller helst forhindre RNA nedbrydning af endogene RNases er det afgørende krav for en vellykket analyse. I væv, der har høje niveauer af RNase, såsom bugspytkirtel, hurtig håndtering og lav temperatur er blevet kombineret for at tillade inddrivelse af RNA fra β-celler, drage fordel af deres naturlige autofluorescens for visualisering9. Procedurer ved hjælp af antistof farvning til identifikation er også blevet rapporteret10, men har ikke været fuldt ud vellykket i vores hænder. Endelig er der mange musemodeller til rådighed, der udtrykker fluorescerende fusionsproteiner(dvs. GFP, YFP, RFP) i celler af interesse, som kan bruges til at identificere dem i vævsafsnit på LMD-mikroskopet. Faktisk udtrykker de musestammer, vi har analyseret med denne protokol, et fusionsprotein mellem SOD1 og YFP11, og deres rygmarvsmotorneuroner er meget fluorescerende. Vi var dog ikke i stand til at finde et sæt ethanolvask og / eller dehydreringsforhold, der samtidig ville fjerne O.C.T., hæmme RNase-aktivitet og konsekvent opretholde tilstrækkelig YFP-fluorescens til at tillade visualisering af motorneuronerne og deres genopretning af LMD. Måske kan et nyt fluorescerende protein eller en variant af de tilgængelige, der opretholder fluorescens i organiske opløsningsmidler, findes for at overvinde denne begrænsning.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke George Farr og medlemmer af Horwich lab for nyttige diskussioner. Dette arbejde blev støttet af Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
| Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
| Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
| LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
| RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
| RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
| Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
| Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
| PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
| RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
| 2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
| Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
| Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |
References
- Zhu, J., Nie, S., Wu, J., Lubman, D. M. Target proteomic profiling of frozen pancreatic CD24+ adenocarcinoma tissues by immuno-laser capture microdissection and nano-LC-MS/MS. J. Proteome. Res. , (2013).
- Bandyopadhyay, U., et al. RNA-Seq profiling of spinal cord motor neurons from a presymptomatic SOD1 ALS mouse. PLoS ONE. 8 (1), 10-1371 (2013).
- Shea, J. R. A method for in situ cytophotometric estimation of absolute amount of ribonucleic acid using azure B1. J. Histochem. Cytochem. 18 (2), 143-152 (1970).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol. Biol. 7, (2006).
- Doebler, J. A., Rhoads, R. E., Anthony, A. Neuronal RNA in Pick's and Alzheimer's diseases. Comparison of disease-susceptible and disease-resistant cortical areas. Arch. Neurol. 46 (2), 134-137 (1989).
- Lobsiger, C. S., Boillée, S., Cleveland, D. W. Toxicity from different SOD1 mutants dysregulates the complement system and the neuronal regenerative response in ALS motor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), (2007).
- Ferraiuolo, L., et al. Microarray analysis of the cellular pathways involved in the adaptation to and progression of motor neuron injury in the SOD1 G93A mouse model of familial ALS. J. Neurosci. 27 (34), 9201-9219 (2007).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. J. Vis. Exp. 6 (71), (2013).
- Burbach, G. J., Dehn, D., Nagel, B., Del Turco, D., Deller, T. Laser microdissection of immunolabeled astrocytes allows quantification of astrocytic gene expression. J. Neurosci. Methods. 138 (1-2), 141-148 (2004).
- Wang, J., et al. Progressive aggregation despite chaperone associations of a mutant SOD1-YFP in transgenic mice that develop ALS. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (5), 1392-1397 (2009).
