Summary
Total RNA av høy kvalitet er fremstilt fra cellelegemer av musens ryggmargsmotor-nevroner ved laserfangstmikrodisseksjon etter farging av ryggmargsseksjoner med Azure B i 70 % etanol. Tilstrekkelig RNA (~40-60 ng) gjenvinnes fra 3000-4000 motoriske nevroner for å tillate nedstrøms RNA-analyse av RNA-seq og qRT-PCR.
Abstract
Utarbeidelse av høykvalitets RNA fra celler av interesse er avgjørende for presis og meningsfull analyse av transkripsjonelle forskjeller mellom celletyper eller mellom samme celletype i helse og sykdom eller etter farmakologiske behandlinger. I ryggmargen er slike forberedelser fra motoriske nevroner, målet for interesse for mange nevrologiske og nevrodegenerative sykdommer, komplisert av det faktum at motoriske nevroner representerer <10% av den totale cellepopulasjonen. Laserfangstmikrodisseksjon (LMD) er utviklet for å løse dette problemet. Her beskriver vi en protokoll for raskt å gjenopprette, fryse og seksjonsmus ryggmargen for å unngå RNA-skade ved endogene og eksogene RNases, etterfulgt av farging med Azure B i 70% etanol for å identifisere motornevronene mens du holder endogen RNase hemmet. LMD brukes deretter til å fange de fargede nevronene direkte inn i guanidintiocyanat lysis buffer, opprettholde RNA integritet. Standardteknikker brukes til å gjenopprette den totale RNA og måle integriteten. Dette materialet kan deretter brukes til nedstrømsanalyse av transkripsjonene av RNA-seq og qRT-PCR.
Introduction
I pattedyrvev som består av flere forskjellige celletyper, har fremkomsten av laserfangst mikrodeseksjon (LMD) instrumentering gitt muligheten til å velge en bestemt celletype for analyse på RNA- eller proteinnivå. For tiden muliggjør forsterkning og neste generasjons sekvenseringsteknikker bruk av et utvalg av total RNA fra noen få tusen celler for å oppnå en relativt grundig oversikt over transkripsjonen, inkludert vurdering av relative nivåer av RNAer og identifisering av ulike skjøtede former. Til dags dato vil proteomikkanalyser av noen få tusen celler nå ned gjennom bare mer tallrike arter. For eksempel har vi identifisert < 1000 av de mest tallrike proteinene fra 3000-4000 motoriske nevroncellelegemer (ikke vist), og Zhu og kolleger har nylig rapportert å identifisere 2665 proteiner fra ~ 15.000 tumorceller1. Med videre utvikling av massespektrometri er det imidlertid sannsynlig at slike analyser vil strekke seg til langt større dybde.
Her presenterer vi en spesifikk protokoll som brukes til LMD av motoriske nevroncellelegemer fra ryggmargen av mus, etterfulgt av forberedelse av RNA. Denne protokollen ble brukt i sammenheng med å sammenligne RNAer fra motoriske nevroner av presymptomatisk transgen mutant superoksid dismutase (SOD)1 amyotrofisk lateral sklerose (ALS) mus med RNAer fremstilt fra en villtype SOD1 transgen stamme av både RNA-seq og qRT-PCR validering2. Spesielt består motornevroner, i det fremre hornet av det grå stoffet i ryggmargen, <10% av den totale cellepopulasjonen, omgitt av et hav av astrocytter, og som sådan kan deres transkripsjonsprofil ikke lett dekonvoluteres fra studier av hele ledningen. En laserfangsttilnærming er dermed ideell for å analysere RNA-uttrykk i disse cellene, med fysiologi bevart ved raskt å utskille og fryse ledningen etter kort intrakariac saltvannsperfusjon. Motor neuron somata er stor og er dermed lett å påvise, her ved hjelp av et fargestoff som har sterk affinitet for nevroner3. I tillegg, med en slik størrelse, gir disse cellene en relativt stor mengde RNA per celle fanget. Prosedyren som brukes, som beskrevet nedenfor, kan enkelt justeres for å oppnå andre nevroncelletyper, samt potensielt andre celletyper, spesielt identifisert enten ved fargestofffargingsteknikker eller ved antistofffarging.
Protocol
Prosedyrene beskrevet her for anestesi, eutanasi og hjerteperfusjon av mus ble utført under en protokoll godkjent av Yale University Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Utarbeidelse av RNase-frie instrumenter og løsninger
- RNase er en vanlig forurensning av alle laboratorieoverflater, inkludert benkeplater, mikropipetter og undersøkeren.
- Skift hansker ofte eller tørk regelmessig med en RNAse dekontamineringsløsning.
- Disseksjonsverktøy i rustfritt stål og glass kan gjøres RNase-fri ved oppvarming ved >200 °C i 1 time eller mer. Merk: Dampsterilisering ødelegger ikke RNase. Alternativt kan du tørke med en RNase dekontamineringsløsning, deretter med RNase-fri 70% etanol og lufttørk.
- Tørk av benkeplater, andre laboratorieflater og mikropipetter med RNase dekontamineringsløsning, deretter med RNase-fri 70% etanol. Angi en bestemt labbenk eller et bestemt arbeidsområde for RNA-gjenoppretting og -analyse. Merk: Fjern tipputkastere før du tørker av saftene på pipettene og la dem være av hvis mulig.
- Bruk rør, mikrosenterrør, pipetter og mikropipettespisser som er sertifisert av produsenten til å være RNase-frie. Bruk av svært lave bindingstips og mikrorør anbefales. Hvis det er mulig, bruk nyåpnede bokser eller poser med disse komponentene og hold dem atskilt fra den generelle laboratorieforsyningen.
- Få RNase-frie løsninger [Dulbeccos kalsium- og magnesiumfrie PBS (PBS), etanol, RNase-fri 70% etanol] fra kommersielle kilder. Bruk nyåpnede flasker for hvert eksperiment.
- Kilden til Azure B-fargestoffet er avgjørende for vellykket gjenoppretting av intakt RNA. Test hver gruppe fargestoff før du begår dyrebare prøver til farging og innsamling. Samle noen tusen nevroner fra et ikke-piksperimentalt dyr, forbered RNA, og bestem RNA-integriteten som beskrevet nedenfor for å finne en som konsekvent produserer RIN-tall over 8,5.
- Løs opp Azure B-fargestoff (1 %, wt/vol) i RNase-fritt 70 % etanol, vanligvis 0,3 g i 30 ml etanol i et sentrifugerør på 50 ml. Bland godt på en rocker på RT over natten eller til alle partiklene er oppløst. Ett rør av denne løsningen kan brukes til å flekke flere lysbilder uten å påvirke fargingsintensiteten.
- Som en forholdsregel, bruk et annet rør av flekk for hver biologiske replikering.
- Bruk cryomolds og O.C.T. for å legge inn ledningsseksjoner uten videre behandling.
- Oppretthold kryostaten ved -20 til -24 °C. Etter seksjonering plasserer du lysbildene i en -80 °C fryser til et tilstrekkelig antall er klargjort. Start RNA-forberedelsen så snart som mulig etter at lysbildene er laget. For langvarig lagring, hold uforsette eller delvis seksjonerte OCT blokker, i stedet for lysbilder, ved 80 °C.
- Lag guanidintiocyanatbufferen for RNA-forberedelse fra dissekerte motornevronene ved hjelp av løsningene fra produsenten av RNA-forberedelsessettet i henhold til instruksjonene.
2. Fremstilling av ryggmargsseksjoner fra mus (figur 1A)
- Rengjør alle disseksjonsverktøyene, glasssklier, barberblader og disseksjonsplattformen ved å bake eller tørke med RNase dekontamineringsløsning, etterfulgt av RNase-fri 70% etanol. La tørke i 2 min. Hold alt støvfritt ved å dekke med laboratorieservietter.
- Dyrehåndteringsprosedyrer, inkludert anestesi, hjerteperfusjon og eutanasi, bør utføres i henhold til kravene i den lokale institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteen (IACUC), med mål om raskt å bringe dyret til punktet av ryggmargs disseksjon.
- Bedøv musen ved intraperitoneal (ip) injeksjon av en dødelig dose Ketamin (450 mg/kg).
- Når et dypt nivå av anestesi er oppnådd og bekreftet av mangel på tåklemmerespons, plasser musen ventral side opp på en disseksjonsplattform (for eksempel et Styrofoam-brett), åpne brysthulen for å eksponere hjertet, og sett inn 27 G sommerfuglnålen til en infusjon satt inn i venstre ventrikel (som er på undersøkerens høyre). Nick riktig atrium med skarpe tang, og parfyme med PBS med en hastighet på 5-7 ml / min i ca 2 min ved hjelp av en peristaltisk pumpe. Væsken som strømmer fra atriet, bør i stor grad være fri for blod på dette tidspunktet.
- Fjern perfusjonsnålen, halshugge musen og snu den på disseksjonsbrettet. Åpne huden for å eksponere ryggsøylen, bruk små saks og tang for å fjerne ryggvirvlene, og løft ut ryggmargen mens du kutter nerverøttene med skarpe tang. Hastighet og praksis er avgjørende for å bevege seg fra starten av perfusjonen til fjerning av ledningen; Dette bør ikke ta mer enn 7 min.
- Skyll ledningen i 10 sek i RNase-fritt vann for å vaske av eventuelt gjenværende blod. Legg ryggmargen på en RNase-fri glasssklie med buede tang veldig forsiktig, men raskt. Del ryggmargen tverrgående med et rent barberblad i 9-10 stykker.
- Legg brikkene i en kryofyll fylt med O.C.T. med de samme tangene, og juster dem vertikalt ved hjelp av en ren nål. Legg formen i et grunt brett som inneholder 2-metylbutan forkjølet med flytende nitrogen, og legg deretter brettet i et flytende nitrogenbad for å fryse ryggmargsstykkene raskt for å unngå RNA-nedbrytning.
- Oppbevar den OKT-innebygde blokken ved -80 °C i opptil 6 måneder før seksjonering. Prosessen fra gjenfinning av ledningen gjennom frysing bør gjøres innen 5 min for å opprettholde RNA-integritet.
- Kryoseksjon O.C.T.-innebygd blokk ved -20 °C med en kryostat for å produsere 20 μm skiver, som hver inneholder 9-10 ryggmargs tverrsnitt, på RNase-fri PEN-membran 2 μm lysbilder holdt i utgangspunktet ved romtemperatur for å sikre at seksjonene holder seg til lysbildet. Refreeze seksjonen på en -20 °C overflate inne i kryostaten. Hold lysbildene ved -80 °C til de er i bruk.
3. Farging av ryggmargsseksjoner (figur 1A)
- På et rent stativ, ordne seks 50 ml koniske rør. Fyll dem alle med 25-30 ml RNase-fri 70% etanol, slik at dybden er tilstrekkelig til å dekke alle seksjonene på et lysbilde når lysbildet er nedsenket. Lag 30-35 ml 1% Azure B-løsning som beskrevet tidligere, og hold den på samme rack for å minimere tiden mellom å bytte løsning under vask eller farging. Hold tre eller fire laboratorieservietter foran stativet for å tømme ekstra løsning raskt.
- Ta skliene ut av -80 °C fryseren på tørris. Tin ett lysbilde ved å plassere det på en håndflate med hansker. Fjern det meste av fuktigheten og kondensen på lysbildet ved å tørke det av med en laboratorieserviett, vær forsiktig så du ikke berører seksjonene. Sett lysbildet på fersk silikageltørker i en Petri-tallerken i 30-40 sek for å tørke helt. Hvis laboratoriefuktigheten er høy, kan kort behandling i en vakuumdessicator brukes til å tørke lysbildet raskere.
- Vasking og farging.
- Dypp den tørkede sklien inn i det første røret med RNase-fri 70% etanol. Bløtlegg lysbildet i 30 sek, og vask deretter lysbildet for å fjerne TILPASNING VED Å dyppe det opp og ned i 45-60 sek . Ta skredet ut av løsningen og tøm overflødig væske på laboratorieservietter. Gjenta den samme prosessen ved å dyppe lysbildet i det andre røret på 70% etanol. Hvis OCT rundt ryggmargsdelene ikke er helt borte, gjenta vasken i det tredje røret.
- Etter å ha tømt overflødig væske, senk lysbildet i 1% Azure B-løsning i 70% RNase-fri etanol i 30-45 sek. Tøm overflødig Azure B på en laboratorieserviett; På dette tidspunktet vil hele lysbildet være blått.
- Senk sklien ned i neste rør med 70% etanol, og dypp raskt opp og ned 3-4x for å fjerne overflødig fargestoff og for å gjøre den spesifikke motoriske nevronfargingen synlig. Hvis seksjonene ser veldig mørkt farget ut, gjentar du destaining trinnet i et friskt rør på 70% etanol. Hvis fargingen virker for lett, returnerer du lysbildet til Azure B-løsningen i ytterligere 30 sekunder og gjentar destaining. Tørk av overflødig etanol og lufttørk sklien i ~ 40 sek til all væsken er borte. Det grå stoffet vil være lyseblått, mens motornevronene blir farget dypt blå, noe som er lett synlig. Start disseksjonen umiddelbart.
4. Mikrodeseksjon for laserfangst (LMD) (figur 1B)
- Slå på mikroskopet og fjern rørholderen for å feste hetten på et 0,6 ml mikrofunksjonsrør for prøveoppsamling. Sett 30 μl guanidin tiocyanat lysis buffer i hetten på et 0,6 ml mikrofugerør. Dekk overflaten av hetten med væske ved å spre løsningen ved hjelp av en pipettespiss. På denne måten vil alle de innsamlede nevronene bli oppløst i solubiliserende løsning når de dissekeres. Juster hetten etter hullet og målet med mikroskopprogramvaren. Hold hetten i dekket posisjon til du starter laserfangst.
- Plasser den lufttørkede sklien på scenen til LMD-mikroskopet opp ned, slik at membranen på PEN-lysbildet vender ned. Membranen med seksjoner skal vende mot hullet, under hvilken er oppsamlingsrøret.
- Slå på laseren 10 min før du starter klargjøringen av lysbildet. Fokuser på en ryggmargsseksjon med 5X-målet. Gå over til 20X-målet for disseksjon.
- Merk en "dummy" region med lyspennen og la laseren kutte den ut uten å samle den. Dette slapper av PEN membranen og gjør det mulig å markere og kutte flere regioner suksessivt.
- Fokuser på nytt og identifiser motoriske nevroner i ventralhornområdet. Disse nevronene er gjenkjennelige av deres plassering, deres pyramidale morfologi, deres store størrelse og deres mørkeblå farging med Azure B (figur 2).
- Bruk lyspennen til å velge tegneverktøyet og merk langs kanten av motornevronene, og lag et komplett omriss. Prøv å gjøre omrisset så nært som mulig til motornevronen for å unngå forurensning fra andre celler enn motornevronen. (Test noen seksjoner på forhånd for å se hvor bred laserkuttlinjen er, og juster klaringen etter behov.) Merk flere celler før kutting. programvaren vil huske posisjonene.
- Før hetten under skjæreposisjonen ved å klikke på hetteposisjonen. Klikk på startknappen for å starte motorisk nevron disseksjon med laseren. Samle alle motornevronene fra alle seksjonene på ett gli inn i hetten på ett mikrofunksjonsrør.
- Når oppsamlingen er fullført, tar du mikrofugerøret ut av holderen ved å losse brettet og forsiktig løsne røret. Løs motornevronene helt opp i bufferen ved å pipette løsningen opp og ned. Flytt oppløsningen inn i rørets kropp ved sentrifugering ved 14.000 x g i 2 min ved 4 °C. Frys prøven umiddelbart i tørris og oppbevar den ved -80 °C. Denne prosessen, fra glidefarging gjennom motorisk nevronsamling, bør gjøres innen 30 minutter for ett lysbilde for å minimere RNA-nedbrytning.
5. RNA-forberedelse fra motoriske nevroner
Tine alle de innsamlede nevronene fra ett dyr og samle dem sammen for å trekke ut RNA. Prøver kan se lyseblå ut, avhengig av antall motoriske nevroner (farget med Azure B) i dem. Trekk ut RNA ved hjelp av et passende sett i henhold til protokollen som er gitt for LMD-vev, og eluting i det minste mulige volumet. Ta 1 μl for å sjekke mengden og integriteten til prøven. Frys den gjenværende RNA raskt på tørris og oppbevar den ved -80 °C.
6. Bestemmelse av RNA kvalitet og kvantitet
Bestem RNA-kvaliteten med 1 μl-prøven på en kapillær elektroforesemikrofluidikkbrikke i henhold til produsentens protokoll. Totalt RNA-preparater med et RNA-integritetsnummer (RIN) over 8,5 kan brukes til RNA-seq og qRT-PCR. Datautgangen inkluderer også vanligvis den omtrentlige konsentrasjonen av prøven.
Representative Results
Protokollen som er skissert ovenfor og i figur 1, skal produsere 50 ng eller mer av total RNA med en RIN på >8,5 fra 3000-4000 ryggmargsmotoriske nevroncellelegemer dissekert fra 9-10 20 μm skiver på ca 20 PEN lysbilder. Fordi dette antallet lysbilder representerer mindre enn 10% av en O.C.T.-innebygd blokk av en mus ryggmarg, er det mulig å gå tilbake til blokken, som har blitt lagret ved -80 °C, og kutte flere skiver for å gå gjennom en annen runde med RNA-forberedelse. Hvis større mengder RNA er nødvendig for en analyse, er det bedre å lage bare antall lysbilder(f.eks. 20) på en gang som kan behandles gjennom disseksjon og RNA-forberedelse om noen dager, deretter lage flere lysbilder for en andre runde og kombinere produktene. Pass på å sjekke RIN for hvert preparat først for å unngå å kombinere en god en med en dårlig. RNA-seq-metoder blir mer følsomme og nye PCR-teknologier lover høyere følsomhet enn dagens. Dermed vil det være nødvendig med mindre RNA fra færre nevroncellelegemer, noe som gir større sekvenseringsdybde og mer omfattende validering av interessante treff. På den annen side kan full overholdelse av MIQE-anbefalingene for qRT-PCR-analyse og validering4 kreve større beløp for å muliggjøre de nødvendige kontrollreaksjonene for lav-overflod RNAer.
Figur 2 viser en typisk serie bilder av en del av en ryggmargs ventralhornseksjon etter Azure B-farging og disseksjon. I panel A er de store, mørkt fargede cellelegemene motoriske nevroner, bekreftet av anti-Chat antistofffarging2, og er lett differensiert fra mindre nærliggende celler. Panel B viser samme region med individuelle cellelegemer skissert med lyspennen og nummerert av mikroskopprogramvaren. Konturene følger nøye margene på cellelegemene, med en liten kvote for laserens skjærebredde. Denne avstanden må bestemmes for hver lasereffektinnstilling for å minimere inkluderingen av fremmed materiale samtidig som du unngår tap av motorisk nevroncytosol. Panelene C og D viser seksjonen etter at laseren har kuttet og de enkelte cellelegemene har falt ned i oppsamlingshetten. Legg merke til at skjæremargen ikke akkurat følger lyspennomrisset i panel C, men holder seg i stor grad utenfor. Denne uregelmessigheten er tydelig i panel D, og det samme er det mørke området rundt hvert kutt, noe som gjenspeiler varmeskaden på vevet forårsaket av laseren. På grunn av dette, hvis to cellelegemer er svært nær hverandre, er det bedre å skissere dem for et enkelt kutt, i stedet for å prøve å kutte dem separat og miste litt RNA for å varme skade i deres region med nærkontakt.
Figur 3 viser typiske resultater av en elektroforetisk analyse av RNA-integriteten til en prøve av RNA fremstilt fra ~4000 musemotoriske nevroncellelegemer samlet inn av LMD. Det øvre panelet er elektropherogrammet produsert av 1 μl av den totale RNA; innsettet til høyre er et bilde av gelen. I begge, legg merke til de fremtredende ribosomale RNA-toppene. Det nedre panelet er elektropherogram av banen som inneholder RNA størrelse standarder. Analyseprogramvaren beregnet en RIN på 9,8 for denne prøven, med en konsentrasjon på 4,9 ng/μl. Totalt 13 μl av denne løsningen var tilgjengelig etter analysen, og ga 64 ng RNA for nedstrøms qRT-PCR-validering av transkripsjonsbeløp. For en typisk qRT-PCR-analyse av moderat rikelig transkripsjoner, 0,15-0,20 ng av total RNA er tilstrekkelig til å produsere nøyaktig kvantasjon2, så mengden RNA tilgjengelig fra dette preparatet er tilstrekkelig til å validere en rekke transkripsjoner med flere primersett, som anbefalt4. Selvfølgelig kan større mengder inngang RNA brukes til å tillate validering av sjeldne transkripsjoner. Dette beløpet er også mer enn tilstrekkelig til å tillate bibliotekforberedelse og neste generasjons RNA-seq.
Figur 1. Oversikt over produksjon av ryggmargsskiver og laserfangstmikrodisseksjon av nevroncellelegemer i ryggmargen. A) Viktige trinn i stykkeproduksjon og farging. B) Tegneserievisning av ryggmargsseksjon og laser disseksjon. Klikk her for å vise større bilde.
Figur 2. Før-og-etter-bilder av en laser disseksjon av Azure B fargede motoriske nevroncellelegemer. A) En del av ventralhornet i en farget seksjon. Legg merke til de fire store, mørkt fargede cellene. Det er også noen få lett fargede og noe mindre celler, som ikke er motoriske nevroner (bekreftet av anti-Chat antistofffarging; ikke vist, men se Bandyopadhyay2) og som ikke vil bli valgt for disseksjon. De mange små, mørke flekkene er sannsynligvis nevronale prosesser (dendritter og axoner), men dette er ikke bekreftet. B) De fire cellelegemene som er omrisset av lyspennen. Legg merke til at konturene følger cellemargene tett, med en minimumsavstand mellom dem. Denne avstanden bør etableres empirisk for hvert mikroskop og laser. Programvaren nummererer de enkelte nevronene, noe som forenkler å holde oversikt over hvor mange som er samlet inn. C og D) Etter at laseren er kuttet og bitene som inneholder cellelegemene har falt ned i oppsamlingshetten. Vær oppmerksom på at hullet som er igjen er noe større enn omrisset og er uregelmessig. Dette gjenspeiler bredden på laserstrålen og dens litt variable skjæreeffektivitet avhengig av vevets lokale sammensetning. Også tydelig er kanten av mørkt vev rundt hvert hull på grunn av lokal oppvarming skade forårsaket av laseren.
Klikk her for å vise større bilde.
Figur 3. Elektroforetisk analyse av integriteten til RNA fremstilt fra LMD-prøver. A) En 1 μl aliquot av RNA fremstilt fra ~ 4000 motoriske nevroncellelegemer ved ovennevnte protokoll ble analysert av mikrokapillær elektroforese på en mikrofluidikkbrikke. Elektropherogrammet er vist, med fremtredende ribosomale RNA-topper. Til høyre er et bilde av selve gelen. B) Elektropherogrammet til størrelsesstandardene vises, med tilsvarende gelfelt til høyre. Instrumentprogramvaren beregnet en RIN på 9,8 for denne prøven og en konsentrasjon på 4,9 ng/μl. Klikk her for å se større bilde.
Discussion
Det viktigste målet på suksess av denne protokollen for å produsere total RNA ved lasermikrodisseksjon av ryggmargsskiver er RIN-verdien5. For RNA-prøver fra høyere eukaryoter gir verdier over 8,5 regelmessig sekvensering av høy kvalitet og qRT-PCR-data. Hvis utbyttet er lavt, men kvaliteten er høy, gjenta preparatet. Hvis integriteten er lavere (til og med 7,5-8), er det imidlertid bedre å finne kilden til problemet og prøve igjen. Det er mange trinn der noe kan gå galt, men egentlig bare to kilder til problemet - endogen RNase forurensning eller eksogen RNase forurensning. Den første kan adresseres av praksis, slik at tiden fra å ofre musen til å fryse O.C.T-innebygd ledning minimeres. Det andre punktet i protokollen der endogen RNase kan bidra til et dårlig resultat er under utarbeidelsen av skivene. Hver skive skal holde seg til en romtemperatur PEN glir raskt, men den vil smelte (O.C.T blir klar). Jo raskere stykket kan bli refrozen jo bedre. Kryostaten vi bruker har flate overflater inne i kammeret som er ved -20 °C, som vi bruker til raskt å fryse skiven på nytt. Finn et lignende sted i kryostaten som brukes, og sørg for at stykket blir ugjennomsiktig igjen raskt.
Det kan være vanskelig å spore opp kilder til eksogen RNase, fordi det er så mange muligheter. De eneste reagensene som brukes som ikke er uttrykkelig RNase-frie, er O.C.T. og Azure B. Hvis Azure B har prestert tilfredsstillende før, kan du prøve en ny flaske O.C.T., selv om dette reagenset aldri har vært et problem. RNase-frie reagenser kan også byttes ut, selv fra en annen leverandør. En mye mer sannsynlig kilde er etterforskeren. I tillegg til en grundig opprydding av arbeidsområdet, er det ofte nyttig å få et annet labmedlem til å følge med og observere alle trinnene i prosedyren. Selv om dette er noen som ikke rutinemessig utfører denne prosedyren, kan et nytt sett med øyne plukke opp en ellers ubemerket forurensningskilde.
Å utvide denne protokollen til å gjenopprette RNA fra andre ryggmargsceller, fra ryggmargsceller fra andre arter, eller fra bestemte celletyper i andre organer, vil kreve modifikasjoner på flere områder rettet mot å oppnå klar identifisering av cellene av interesse mens du obviating, eller i det minste minimere, virkningen av endogen RNase. I protokollen her tillot rask fjerning og frysing av ledningen, kombinert med Azure B-farging i 70% etanol, både minimering av RNA-nedbrytning og enkel identifisering av motoriske nevroncellelegemer. Azure B er en veletablert histokjemisk flekk for nevroner som ser ut til å binde seg til RNA3 og har blitt brukt til å evaluere RNA-innhold av nevroner i obduksjonsprøver av hjernevev fra pasienter med nevrodegenerativ sykdom6. Spesielt påvirket ikke Azure B-farging verken integriteten til den rensede RNA eller dens evne til å bli omvendt transkribert og analysert. Andre fargestoffer, som cresylfiolett7 og toluidinblå8, har blitt brukt i lignende LMD-protokoller. Å samle cellelegemene direkte inn i guanidintiocyanatløsningen da de ble dissekert, ga det siste trinnet som resulterte i rutinemessig gjenoppretting av intakt RNA.
Lignende tilnærminger kan ses for seg for andre celler og organer, og erkjenner at det å identifisere cellene av interesse mens du minimerer eller helst forhindrer RNA-nedbrytning av endogene RNases er det kritiske kravet for vellykket analyse. I vev som har høye nivåer av RNase, som bukspyttkjertelen, har rask håndtering og lav temperatur blitt kombinert for å tillate utvinning av RNA fra β celler, og dra nytte av deres naturlige autofluorescence for visualisering9. Prosedyrer som bruker antistofffarging for identifisering er også rapportert10, men har ikke vært fullt vellykket i våre hender. Til slutt er mange musemodeller tilgjengelige som uttrykker fluorescerende fusjonsproteiner (dvs. GFP, YFP, RFP) i celler av interesse, som kan brukes til å identifisere dem i vevsseksjoner på LMD-mikroskopet. Faktisk uttrykker musestammene vi har analysert med denne protokollen et fusjonsprotein mellom SOD1 og YFP11, og deres ryggmargsmotoriske nevroner er svært fluorescerende. Vi var imidlertid ikke i stand til å finne et sett med etanolvasker og / eller dehydreringsforhold som samtidig ville fjerne O.C.T., hemme RNase-aktivitet og konsekvent opprettholde tilstrekkelig YFP-fluorescens for å tillate visualisering av motornevronene og deres gjenoppretting av LMD. Kanskje et nytt fluorescerende protein eller en variant av de tilgjengelige som opprettholder fluorescens i organiske løsningsmidler, kan bli funnet for å overvinne denne begrensningen.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke George Farr og medlemmer av Horwich lab for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
| Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
| Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
| LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
| RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
| RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
| Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
| Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
| PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
| RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
| 2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
| Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
| Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |
References
- Zhu, J., Nie, S., Wu, J., Lubman, D. M. Target proteomic profiling of frozen pancreatic CD24+ adenocarcinoma tissues by immuno-laser capture microdissection and nano-LC-MS/MS. J. Proteome. Res. , (2013).
- Bandyopadhyay, U., et al. RNA-Seq profiling of spinal cord motor neurons from a presymptomatic SOD1 ALS mouse. PLoS ONE. 8 (1), 10-1371 (2013).
- Shea, J. R. A method for in situ cytophotometric estimation of absolute amount of ribonucleic acid using azure B1. J. Histochem. Cytochem. 18 (2), 143-152 (1970).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol. Biol. 7, (2006).
- Doebler, J. A., Rhoads, R. E., Anthony, A. Neuronal RNA in Pick's and Alzheimer's diseases. Comparison of disease-susceptible and disease-resistant cortical areas. Arch. Neurol. 46 (2), 134-137 (1989).
- Lobsiger, C. S., Boillée, S., Cleveland, D. W. Toxicity from different SOD1 mutants dysregulates the complement system and the neuronal regenerative response in ALS motor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), (2007).
- Ferraiuolo, L., et al. Microarray analysis of the cellular pathways involved in the adaptation to and progression of motor neuron injury in the SOD1 G93A mouse model of familial ALS. J. Neurosci. 27 (34), 9201-9219 (2007).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. J. Vis. Exp. 6 (71), (2013).
- Burbach, G. J., Dehn, D., Nagel, B., Del Turco, D., Deller, T. Laser microdissection of immunolabeled astrocytes allows quantification of astrocytic gene expression. J. Neurosci. Methods. 138 (1-2), 141-148 (2004).
- Wang, J., et al. Progressive aggregation despite chaperone associations of a mutant SOD1-YFP in transgenic mice that develop ALS. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (5), 1392-1397 (2009).
