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Neuroscience

El aislamiento y la cuantificación de la neurotoxina botulínica A partir de matrices complejas utilizando el BoTest Matrix Ensayos

Published: March 3, 2014 doi: 10.3791/51170
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1BioSentinel Inc., Madison, WI

Summary

La neurotoxina botulínica Matriz BoTest (BoNT) ensayos de detección de purificar y cuantificar rápidamente BoNT a partir de una variedad de matrices de muestras. Aquí, se presenta un protocolo para la detección y cuantificación de BoNT a partir de matrices tanto sólidos como líquidos y demostrar el ensayo con BOTOX ®, los tomates y la leche.

Abstract

Se requiere la detección y cuantificación de la neurotoxina botulínica (NTBo) en matrices complejas precisa para la industria farmacéutica, medioambiental, y las pruebas de muestra de alimento. Se necesita prueba rápida BoNT de los productos alimenticios durante el forense del brote, el diagnóstico del paciente, y las pruebas de seguridad de los alimentos mientras que se requiere la prueba de potencia precisa para la fabricación de productos de fármacos basado en la NTBo y la seguridad del paciente. El bioensayo en ratón ampliamente utilizado para la prueba de BoNT es altamente sensible, pero carece de la precisión y el rendimiento necesario para la prueba rápida y rutinaria de BoNT. Además, el uso del bioensayo de los animales ha dado lugar a los llamados de las autoridades reguladoras de medicamentos y productos proponentes derechos de los animales en los EE.UU. y en el extranjero para sustituir el bioensayo en ratones para probar la NTBo. Varios ensayos in vitro de recambio en se han desarrollado que funciona bien con purificada de BoNT en tampones simples, pero la mayoría no han demostrado ser aplicable a prueba en matrices muy complejas. Aquí, un protocolo para la detección deNTBo en matrices complejas utilizando la matriz de ensayos BoTest se presenta. El ensayo consta de tres partes: La primera parte implica la preparación de las muestras para las pruebas, la segunda parte es un paso inmunoprecipitación usando anti-BoNT recubiertas de anticuerpos perlas paramagnéticas para purificar la NTBo de la matriz, y la tercera parte cuantifica proteolítica de la BoNT aislado actividad utilizando un reportero fluorogenic. El protocolo está escrito para las pruebas de alto rendimiento en placas de 96 pocillos utilizando matrices de ambos líquidos y sólidos y requiere alrededor de 2 h de preparación manual con tiempos de ensayo total de 4-26 horas dependiendo del tipo de muestra, la carga de la toxina, y la sensibilidad deseada. Los datos se presentan para las pruebas de BoNT / A con solución salina tamponada con fosfato, un producto farmacéutico, el sobrenadante del cultivo, 2% de leche, y tomates frescos e incluye la discusión de los parámetros críticos para el éxito del ensayo.

Introduction

Neurotoxinas botulínicas (BoNT) son las sustancias más letales conocidos, con dosis letales intravenosas humanos estiman en 3.1 ng / kg 1,2. Siete serotipos de BoNT estructuralmente similares, etiquetadas A a la G, de existir, consistiendo cada uno en un dominio de cadena pesada responsable de la unión celular, la absorción, y la translocación en el citosol y una cadena ligera que codifica una endopeptidasa de zinc 3-5. La exquisita toxicidad de BoNT resulta de, en parte, de su entrada obligatoria y específica en las neuronas motoras en la unión neuromuscular 6. Una vez dentro de la neurona, la endopeptidasa de la cadena ligera escinde específicamente uno o más de la N-etilmaleimida-sensible receptor soluble de proteína de fijación del factor (SNARE) proteínas necesarias para la fusión de vesículas, la inhibición de la liberación de neurotransmisores y que conduce a parálisis flácida 7-14. Comúnmente conocida como la enfermedad "botulismo" parálisis del diafragma y los músculos intercostales por BoNT en última instancia se traduce ense reciben insuficiencia respiratoria y la muerte a menos que el diagnóstico y tratamiento tempranos.

Botulismo alimentario humano es más comúnmente asociado con BoNT serotipos A, B, E y F (BoNT / D, BoNT / B, etc) y por lo general resulta de la ingestión de alimentos contaminados 15,16, aunque, varios casos de botulismo por heridas fueron reportados entre los usuarios de drogas por vía intravenosa 17,18. En los Estados Unidos, el botulismo infantil como resultado de la ingestión de esporas de Clostridium por los niños menores de uno es la forma más común de botulismo 19-21. Sin embargo, se reportaron brotes de origen alimentario BoNT resultantes de conservas caseras impropio y el procesamiento de alimentos, tanto en Estados Unidos como en el extranjero. Entre 2000-2009, se reportaron al menos 338 casos de botulismo transmitido por alimentos en todo el mundo incluyendo a seis víctimas mortales 22. La capacidad de detectar rápidamente y con sensibilidad brotes de botulismo de origen alimentario es un indicador crítico que podría ayudar al diagnóstico precoz 23,24. Por otra parte, los métodos de detección que permiten rentable y las pruebas de rutina de alimentos dará lugar a una mejora de la seguridad alimentaria.

Especificidad neuronal de BoNT y larga vida media biológica también lo convierte en un potente terapéutico. En los Estados Unidos, los medicamentos basados ​​en la NTBo están aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos para el tratamiento de afecciones cosméticas y trastornos relacionados neuromusculares incluidas las líneas del entrecejo, distonía cervical, dolores de cabeza por migraña, la vejiga hiperactiva, y estrabismo. Numerosas aplicaciones "off-label" están documentados, incluyendo los tratamientos de dosis alta para la disfunción muscular severa 25-28. Cuantificación de toxinas precisa es fundamental para la dosificación correcta, ya que una dosis insuficiente puede dar lugar a un tratamiento ineficaz, mientras que una sobredosis pone a los pacientes en riesgo de efectos secundarios potencialmente dañinos. Desafortunadamente, no existe un protocolo ensayo de potencia normalizada se comparte entre los fabricantes, lo que resulta en desigualdades de definición de unidad entre productores de medicamentos a base de BoNT29-31 cts.

La prueba estándar para la NTBo es el bioensayo en ratones en los que las muestras que contienen NTBo se inyectan por vía intraperitoneal en ratones, y el número de muertes registradas más de 1-7 días 16,32,33. El bioensayo en ratones es muy sensible a los límites de detección (LOD) de 5-10 pg de BoNT / A 34, sin embargo, las preocupaciones éticas sobre el uso de animales, el alto costo de la capacitación del personal y el mantenimiento de instalaciones de los animales, los tiempos de ensayo de largo, y la falta de protocolos estandarizados resultaron en llamadas a desarrollar, las pruebas estandarizadas BoNT libre de productos animales y métodos de cuantificación 35-39. Recientemente, varios métodos alternativos de cuantificación BoNT fueron desarrollados que ofrecen ratón o casi ratón sensibilidad bioensayo 40-49. Estos métodos suelen utilizar la fluorescencia, la espectrometría de masa, o métodos inmunológicos y ofrecen tiempos de ensayo considerablemente más corto que el bioensayo en ratones sin el uso de animales. Mass-espectrometría de enfoques combinados con techniq inmunológicaues, se mostró a detectar y cuantificar BoNT contenida en los alimentos y otras muestras complejas, sin embargo, los requisitos de capacitación de personal y equipo especializado límite de estos ensayos de 50-55. La mayoría de los otros ensayos alternativos no son fácilmente aplicables a la prueba de la muestra compleja o carecen del rendimiento necesarios para las pruebas de rutina BoNT. La naturaleza altamente variable de la viscosidad de la muestra de alimentos, pH, contenido de sal, y constituyentes de la matriz presenta un desafío especialmente difícil cuando se trata de desarrollar métodos de ensayo in vitro con sensibilidad para que coincida con la potencia extrema de la NTBo. Por otra parte, incluso los sistemas de amortiguación simples y relativamente benignas, como las que resultan de la resuspensión de los productos farmacéuticos a base de BoNT, contienen sal, albúmina, azúcar y estabilizantes (por ejemplo, excipientes) que impactan significativamente in vitro BoNT potencia 56. Se requiere la purificación de toxinas de las pruebas de actividad precisa de todos pero la más sencilla de las muestras 56-59.

LaBoTest ensayos de Matrix fue diseñada para una rápida y de alto rendimiento, y la cuantificación consistente de BoNT a partir de muestras de alta complejidad utilizando equipos que se encuentran comúnmente en los laboratorios de investigación 56,60. Estos ensayos utilizan perlas paramagnéticas unidas covalentemente a los anticuerpos anti-BoNT específicos de serotipo de atar y secuestrar BoNT de una muestra y luego eliminar la interferencia de compuestos de matriz mediante lavado. Después del lavado, atado actividad proteolítica BoNT se cuantifica entonces en un tampón de reacción optimizado utilizando un reportero compatible con el serotipo BoNT está probando. Estos reporteros son proteínas fluorogénicos que consisten en una proteína fluorescente cian N-terminal (PPC) y un resto derivado de la proteína fluorescente amarilla C-terminal de resto (Venus) unidos por un sustrato de BoNT, residuos de SNAP25 141 a 206 o los residuos de sinaptobrevina 33-94 que constituye la BoTest A / E o B / D / reporteros F / G, respectivamente 45. Reportero escisión por BoNT se vigila por medio de Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET). Cuando tque el reportero está intacta, la excitación de CFP se traduce en FRET a Venus, apagando emisión PPC y emocionante emisión Venus. La escisión del reportero por BoNT impide FRET, lo que lleva a un aumento en la emisión de PPC y disminución en la emisión de Venus. La actividad de BoNT se puede medir cuantitativamente utilizando la relación de las emisiones de la PPC y Venus. LOD por debajo de 3 pg son posibles a partir de una amplia gama de alimentos utilizando un formato de placa de 96 pocillos de alto rendimiento 56. Aumento de la sensibilidad se puede conseguir utilizando volúmenes de muestra más grandes ya que el ensayo permite la concentración de la toxina en la superficie de la perla.

Los ensayos de Matrix BoTest para BoNTs A, B, E y F se desarrollaron y probaron con alimentos, productos farmacéuticos, y las muestras ambientales 56,60. Aquí se describe los procedimientos para la ejecución de estos ensayos para la detección de la NTBo en baja complejidad (por ejemplo, productos farmacéuticos, la NTBo en la memoria intermedia) y alta complejidad (por ejemplo, alimentos, medio ambiente) muestras. Métodos de procesamiento específicospara se abordan varios tipos de muestras en este protocolo y tipos de muestras que no se describen aquí por lo general se pueden adaptar usando una combinación de los métodos presentados. El protocolo fue desarrollado y probado con BoNT / A, pero se puede adaptar a otros serotipos de NTBo utilizando sus respectivos ensayos como se ha demostrado en otras partes 56,60.

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Protocol

1. Preparación de Reactivos de ensayo

  1. Ditiotreitol 200x Deshielo (TDT), 10x Matrix tampón de unión (10 veces de aquí en adelante tampón de unión), 10x tampón de neutralización (alimentos o muestras de pH desequilibrados solamente), y 10 veces más BoTest tampón de reacción (10x Reacción adelante buffer) a temperatura ambiente (TA) durante 15 minutos o hasta que esté completamente descongelado. Véase la Tabla 1 para obtener una lista de los tampones y reactivos utilizados en este protocolo. Consulte la Tabla 2 para una lista de materiales y equipos necesarios para este protocolo.
  2. Agite los buffers descongelados durante 5 segundos para mezclar. 10x tampón de neutralización, 200xDTT y 10x tampón de reacción debe ser transparente, mientras que el tampón de unión 10x tendrá un aspecto turbio. Caliente el tampón de reacción 10x durante 5 min a 37 ° C y repita vórtex si su aspecto es turbio tras la descongelación.
  3. Generar 3,8 ml de tampón de reacción 1x.
    1. Etiquete un tubo de "tampón de reacción 1x" cónico de 15 ml y añadir 3,42 ml wat grado biología molecularer, 380 l de 10x tampón de reacción, y 19 l 200x TDT. Mezclar bien por inversión búfer.
    2. Inhibidores de cortar una sola tableta de inhibidor de proteasa libre de EDTA en los trimestres utilizando una hoja de afeitar limpia y añadir un cuarto de la tableta para el tampón de reacción 1x (la porción restante de la tableta se puede almacenar a 4 ° C para su uso posterior). NB de la proteasa no puede ser necesario si el uso de la toxina purificada y tampones simples (por ejemplo, muestras farmacéuticas).
    3. Vortex El tampón de reacción 1x hasta que la tableta de la proteasa se haya disuelto completamente.
  4. Caliente las cuentas de la matriz A (perlas IP-A en adelante) durante 20 minutos a temperatura ambiente.
  5. Descongele el reportero BoTest A / E (A / E reportero de aquí en adelante) a temperatura ambiente protegido de la luz.
  6. Etiquete un tubo cónico de 15 ml "0.5 M A / E reportero" y añadir 45 l de la 20 M reportero A / E de stock a 1,8 ml 1x tampón de reacción. Mezcle bien con la pipeta y almacenar en hielo protegido de la luz.

2. Estar de pieard Generación de la curva de la muestra

La curva estándar descrito aquí abarca 10-30,000 MLD 50 / g de alimento o por ml de tampón en diluciones semi-log (Tabla 3). El usuario final es libre de utilizar concentraciones alternativas según sea aplicable.

  1. Adición y la incubación de las matrices con material de referencia. Generar la curva estándar utilizando un diluyente de la misma matriz que el desconocido, si es posible, para reducir los efectos de matriz. Utilizar una solución tampón de fosfato de gelatina (GPB) o solución salina tamponada con fosfato (PBS) como diluyente, si la matriz adicional, BoNT-negativo no está disponible (por ejemplo, el campo o BoNT brote de prueba de la muestra). Generar la curva estándar por spiking de BoNT / A en la matriz de elección siguiendo el protocolo apropiado a continuación.
    1. Muestras de baja complejidad (por ejemplo, PBS, GPB, o farmacéutico)
      1. Añadir 10 ml del tampón apropiado a un tubo cónico de 15 ml y reservar. Esta muestra se utiliza como diluyente para el standarcurva d y diluciones desconocidos (Sección 4).
      2. Añadir 1,2 ml de tampón a un tubo de microcentrífuga.
      3. ATENCIÓN: Este paso se utiliza la NTBo y la precaución extrema se debe utilizar para la manipulación y eliminación de cualquier reactivos y materiales que entran en contacto con la toxina. El uso de equipo de protección personal y la disposición adecuada de todos los materiales debe realizarse de acuerdo con el Departamento de Trabajo de las directrices de la OSHA para la NTBo (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) EE.UU.. Añadir de BoNT / A a la muestra 1,2 ml de tal manera que la concentración final es 30 000 50 MLD / ml (36000 MLD 50 en total).
    2. Muestras de alimentos líquidos (u otras muestras líquidas complejas) Nota: se recomienda realizar pruebas iniciales para determinar el volumen de sobrenadante recuperado de muestras clarificadas como el material particulado (por ej. Pulpa) en matrices líquidas variará. Este protocolo supone, al menos, 1,2 ml de sobrenadante clarificado se recuperaron de una samp 1.4 mlle. Aumentar el tamaño de la muestra si es necesario.
      1. Añadir 10 ml de líquido de los alimentos a un tubo cónico de 15 ml y déjela a un lado. Esta muestra se utiliza como diluyente para la curva patrón y las diluciones desconocidos (Sección 4).
      2. Pese un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml vacío y registre su masa.
      3. Añadir 1,4 ml de la comida de líquido al tubo de microcentrífuga pesados.
      4. Volver a pesar el tubo de microcentrífuga y calcular la masa de la muestra de alimento añadido restando la masa del tubo de vacío.
      5. ATENCIÓN: Este paso se utiliza la NTBo y la precaución extrema se debe utilizar para la manipulación y eliminación de cualquier reactivos y materiales que entran en contacto con la toxina. El uso de equipo de protección personal y la disposición adecuada de todos los materiales debe realizarse de acuerdo con el Departamento de Trabajo de las directrices de la OSHA para la NTBo (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) EE.UU.. Añadir de BoNT / A a la muestra 1,4 ml a una concentración final de 30.000 MLD 50 / g de alimento.
      6. Incubaciónte El diluyente y pinchos muestras a temperatura ambiente o 4 º C durante 2 horas para dar tiempo a la NTBo para interactuar con la matriz alimentaria, imitando una contaminación natural.
    3. Las muestras sólidas de alimentos (u otras muestras sólidas) Nota: Se recomienda la prueba inicial para determinar el volumen de sobrenadante recuperado de muestras homogeneizadas y aclaradas tras la adición de 1 ml GPB / g de alimento. Este protocolo asume que al menos 1,2 ml aclararon sobrenadante se recuperó de un 2 g de muestra. Aumentar el tamaño de la muestra si es necesario.
      1. Pesar 10 g de muestra sólido en un tubo cónico de 50 ml y reservar. Esto se utiliza como diluyente.
      2. Pesar 2 g de muestra de alimento sólido en un segundo tubo cónico de 50 ml.
      3. ATENCIÓN: Este paso se utiliza la NTBo y la precaución extrema se debe utilizar para la manipulación y eliminación de cualquier reactivos y materiales que entran en contacto con la toxina. El uso de equipo de protección personal y la disposición adecuada de todos los materialess se deben realizar de acuerdo con el Departamento de Trabajo de las directrices de la OSHA para la NTBo (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) EE.UU.. Añadir de BoNT / A a la superficie de la 2 g de muestra a una concentración final de 30.000 MLD 50 / g de alimento (60000 MLD total de 50).
      4. Incubar el diluyente y muestras adicionadas a temperatura ambiente o 4 º C durante 2 horas para dar tiempo a la NTBo para interactuar con la matriz alimentaria, imitando una contaminación natural.
  2. Homogeneización de la muestra y el tampón de ajuste. Procesar la muestra de curva estándar de pinchos y diluyente generada anteriormente de acuerdo con el tipo de muestra.
    1. Muestras de baja complejidad
      1. No se muestra la transformación adicional es necesario.
    2. Muestras de alimentos líquidos (u otras muestras líquidas complejas)
      1. No se muestra la homogeneización es necesario.
      2. Añadir 140 l de tampón 10x La neutralización de los 1,4 ml de pinchos de muestra y 1 ml de 10x Neutralizationes tampón para la muestra de 10 ml de diluyente. Mezcle las muestras por inversión.
      3. Parcialmente aclarar ambas muestras por centrifugación durante 10 min a 6000 x g y 4 º C. Quitarse de inmediato los sobrenadantes y traslado a nuevos tubos.
    3. Muestras de alimentos sólidos (u otras muestras sólidas)
      1. Añadir 2 ml de GPB (1 ml GPB / g de alimento) a la 2 g de BoNT / A-clavó la muestra de alimento sólido y 10 ml GPB a la 10 g de diluyente de la muestra.
      2. Homogeneizar las muestras usando un mortero hasta que se mezcle bien. Dependiendo de la naturaleza de la muestra, puede haber pequeños trozos de material que no se puede homogeneizar, lo cual es aceptable. Alternativamente, se pueden usar métodos de homogeneización mecánicas. El uso de un mezclador no se recomienda ya que puede inactivar así como aerosolizar la toxina.
      3. Añadir un volumen 1/10th de 10x tampón de neutralización a la muestra de diluyente basado en el volumen total aproximada (por ejemplo, 2 ml, si el volumen es de 20 ml). Extrapolarel volumen total de la muestra global / NTBo-enriquecida y agregar volumen 1/10th de 10x tampón de neutralización. Mezcle las muestras por inversión.
      4. Parcialmente aclarar ambas muestras por centrifugación durante 10 min a 6000 x g y 4 º C. Quitarse de inmediato los sobrenadantes y traslado a nuevos tubos.
  3. Preparar diluciones seriadas de la curva estándar para la prueba
    1. Uso de la / A-muestra marcada de la curva estándar de BoNT como D1 y la muestra nonspiked como diluyente, generar las muestras de la curva estándar restantes en 1,5 ml de tubos de microcentrífuga de acuerdo con la Tabla 3.

3. Preparar Muestras desconocidas

En esta sección se puede completar de forma paralela a la sección 2.

  1. Determinar el número y las diluciones de incógnitas. Pruebe incógnitas por triplicado si es posible.
    1. Para los ensayos cualitativos, ejecute las incógnitas sin dilución adicional que requiere para procesar la muestra como se descricama abajo.
    2. Para los ensayos cuantitativos, preparar al menos dos muestras de 01:10 de dilución, como se describe a continuación, para garantizar que una o más muestras están comprendidas en el intervalo lineal de la respuesta del ensayo. Generar diluciones utilizando un diluyente de la misma matriz que lo desconocido, si es posible, para reducir los efectos de matriz como se describe en la Sección 3. De lo contrario, utilizar PBS o GPB como el diluyente.
  2. Generar y diluyendo muestras desconocidas según el tipo de muestra.
    1. Incógnitas de baja complejidad (por ejemplo, PBS, GPB, o farmacéutico)
      1. Agregue por lo menos 750 l desconocidos a un tubo de microcentrífuga para generar Desconocido dilución 1.
      2. Añadir 675 l de diluyente a dos tubos de microcentrífuga etiquetados Desconocido dilución 2 y 3. El diluyente será el mismo material utilizado para la generación de la curva estándar.
      3. En serie diluir dilución 1 mediante la transferencia de 75 l de dilución 1 en el tubo de dilución 2 y mezclar.
      4. En serie DILUTe dilución 2 mediante la transferencia de 75 l de dilución 2 en el tubo de dilución y mezcla 3.
    2. Incógnitas alimenticios líquidos (u otras muestras líquidas complejas) Nota: se recomienda realizar pruebas iniciales para determinar el volumen de sobrenadante recuperado de muestras clarificadas como se discutió en la Sección 3. Aumentar el tamaño de la muestra si es necesario.
      1. Añadir ≥ 875 l de lo desconocido líquido a un tubo de microcentrífuga.
      2. Añadir un volumen 1/10th de 10x tampón de neutralización de la muestra (por ejemplo, 87,5 l de una muestra de 875 l).
      3. Parcialmente aclarar la muestra por centrifugación durante 10 min a 6000 x g y 4 º C. Inmediatamente transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Esto es desconocido dilución 1.
      4. Añadir 675 l de diluyente a dos tubos etiquetados Desconocido dilución 2 y 3. El diluyente será el mismo material procesado utilizado para la generación de la curva estándar.
      5. En serie diluir dilución 1 por transferenciaanillo de 75 l de dilución 1 en el tubo de dilución 2 y la mezcla.
      6. En serie diluir dilución 2 mediante la transferencia de 75 l de dilución 2 en el tubo de dilución 3 y mezcla.
    3. Incógnitas alimento sólido (u otras muestras sólidas) Nota: Se recomienda la prueba inicial para determinar el volumen de sobrenadante recuperado de muestras clarificadas como se discutió en la Sección 3. Aumentar el tamaño de la muestra si es necesario.
      1. Pesar 2 g de muestra desconocido sólido en un tubo cónico de 50 ml.
      2. Añadir 2 ml GPB (1 ml GPB / g de alimento) a la 2 g de la muestra sólida.
      3. Homogeneizar las muestras como se describe en la Sección 3.2.3.2.
      4. Añadir un volumen 1/10th de 10x tampón de neutralización a la muestra basada en el volumen total aproximada (por ejemplo, 0,4 ml, si el volumen es 4 ml). Mezcle las muestras por inversión.
      5. Parcialmente aclarar la muestra por centrifugación durante 10 min a 6000 x g y 4 º C. INMEDIATAMtransferencia y ≥ 750 l sobrenadante a un tubo de microcentrífuga. Esto es desconocido dilución 1.
      6. Añadir 675 ml de diluyente a dos tubos etiquetados Desconocido dilución 2 y 3. El diluyente será el mismo material procesado utilizado para la generación de la curva estándar.
      7. En serie diluir dilución 1 mediante la transferencia de 75 l de dilución 1 en el tubo de dilución 2 y mezclar.
      8. En serie diluir dilución 2 mediante la transferencia de 75 l de dilución 2 en el tubo de dilución 3 y mezcla.

4. Aclaración de la muestra final

Si el líquido de las pruebas o muestras de alimentos sólidos, centrífuga de todas las muestras durante 5 minutos a 14.000 xg ≥ en una microcentrífuga para aclarar plenamente las muestras. Quitarse de inmediato los sobrenadantes y traslado a nuevos tubos.

5. Configuración de placa y BoNT / A Tire hacia abajo

  1. El diseño de la placa específica depende de la aplicación, sin embargo, no use los pozos externos con el fin depara evitar los efectos de borde. Cada muestra desconocida y muestra patrón curva D1-D8 requiere 3 pozos mientras que la muestra D9 requiere 6 pozos. Un diseño de la placa sugerido se muestra en la Figura 1.
  2. Añadir 20 l de 10x tampón de unión a cada pocillo para ser usado.
  3. Añadir 200 l de cada dilución aclarado y desconocido para cada uno de los tres pozos (seis pozos para D9) para las pruebas por triplicado. Mezcle la placa durante 10 segundos en una mezcladora de microplaca.
  4. Agregue las cuentas de IP-A.
    1. Vortex las cuentas IP-A durante 10 segundos a la velocidad más alta. Continuar agitación vorticial si los granos no están completamente resuspendieron y homogénea.
    2. Pipeta 20 l IP-A cuentas a cada pocillo de muestra.
    3. Mezcle la placa durante 30 segundos en una mezcladora de microplaca.
  5. Incubar la placa utilizando una placa de incubadora giratoria durante 2 horas a 750 rpm, 25 ° C o temperatura ambiente. El rendimiento del ensayo es altamente dependiente de la generación y el mantenimiento de la IP-Una suspensión de microesferas durante todas las etapas de incubación. Perlas siempre resuspender con un Micrófono dmezclador de tarde después de la granulación y mantener la suspensión usando una placa de microtitulación orbital agitador durante todas las etapas de incubación.

6. Lavado de la Plata y Abalorio Resuspensión

  1. Lavar las placas ya sea a mano o mediante el uso de un grano compatible con lavador de placas automatizado magnética. Un lavador de placas automático configurado para los granos magnéticos aumenta en gran medida el rendimiento del ensayo.
    1. Lavado Manual
      1. Etiquete un tubo cónico de 50 ml "tampón de lavado 1X" y añadir 45 ml de agua de grado biología molecular y 5 ml de tampón de lavado 10x Matrix. Mezclar bien por inversión búfer.
      2. Retirar la placa de la placa de la incubadora rotativa.
      3. Colocar inmediatamente la placa en una placa de separación 96 pocillos perla magnética durante 5 min.
      4. Mientras se mantiene la placa en la placa de 96 pocillos de separación de cuentas magnéticas, retire con cuidado y deseche los sobrenadantes de los pocillos de la muestra utilizando una pipeta multicanal de una o. No aspirarcuentas-visualmente supervisar el búfer aspirado en la punta de la pipeta para la eliminación de cuentas accidental. Si es testigo de la eliminación, añadir con cuidado los Contenidos de recomendaciones de vuelta al pozo, reseparate, y repetir la extracción.
      5. Añadir 300 l de tampón de lavado 1X a cada pocillo de muestra.
      6. Resuspender completamente las perlas mezclando la placa durante 30 segundos en una mezcladora de microplaca.
      7. Incubar la placa en la placa de separación de 96 pocillos perla magnética durante 2 min.
      8. Retire y deseche los sobrenadantes de los pocillos de muestras como antes.
      9. Repita los pasos 6.1.1.5-6.1.1.8 tres veces más para un total de 4 lavados.
      10. Con la placa en la placa de separación de 96 pocillos perla magnética, una inspección visual de los pozos para confirmar incluso eliminación de sobrenadante, el uso de una pipeta para eliminar el exceso de tampón residual como sea necesario. Algunos búfer se mantendrá en los pozos y se debe tener cuidado para evitar la eliminación de cuentas o el secado del grano.
      11. Añadir 50 l de tampón de reacción 1X a cada pocillo de la muestra y mezclar la placa durante 30 síc en un mezclador de microplacas para resuspender completamente las perlas. Si es necesario, use una pipeta para volver a suspender totalmente las cuentas.
    2. Lavado automatizado Plate
      1. Configuración y programa de la lavadora de acuerdo con la Tabla 4. Limpie y enjuague la lavadora con alta calidad (por ejemplo nanopura) de agua.
      2. Prepare la lavadora mediante la ejecución del programa "Prime".
      3. Retirar la placa de la placa de la incubadora rotativa.
      4. Inmediatamente colocar la placa en la placa de separación de 96 pocillos de cuentas magnéticas en el lavador de placas.
      5. Ejecute el programa de enlace "Maestro Wash". El primer paso del programa es un paso de incubación de 5 min, donde la lavadora se encuentre estacionado.
      6. Tras la finalización del programa, retire la placa de la lavadora, añadir 50 l de tampón de reacción 1X a cada pocillo de muestra, y mezclar la placa durante 30 segundos en un mezclador de microplacas para volver a suspender totalmente las cuentas. Si es necesario, use una pipeta para volver a suspender totalmente las cuentas.

    7. Ensayo Iniciación e Incubación

    1. Añadir 50 reportero l 0,5 M de A / E (véase la Sección 1) a cada pocillo de muestra y se mezcla durante 30 seg en un mezclador de microplacas para resuspender completamente las perlas.
    2. Añadir 100 ml de agua a cada pozo sin usar en la placa para evitar los efectos de borde.
    3. Sellar la placa con cinta de sellado de la placa y se incuba la placa utilizando una placa de incubadora que gira a 750 rpm, 25 ° C o temperatura ambiente. Proteja la placa de la luz durante la incubación.

    8. Recopilación y análisis de datos

    Nota: Este ensayo es un ensayo en tiempo real que se puede medir varias veces hasta que se obtiene la sensibilidad deseada, no hay reactivos de parada necesarios. Los tiempos de lectura iniciales recomendados son 2, 4, y 24 horas de tiempo de incubación con la sensibilidad del ensayo aumentando con el tiempo de incubación.

    1. La recolección de datos
      1. En cada tiempo de leer, retirar la placa de la placa de la incubadora rotativa, retire el selloción de cintas, e inmediatamente colocar la placa en la placa de separación de 96 pocillos con perlas magnéticas. Permita que los granos se separen durante 2 min.
      2. Colocar la placa en el lector de microplacas y medir las emisiones a ~ 470 y ~ 526 nm bajo excitación a ~ 434 nm.
      3. Si se desean tiempos de lectura adicionales, resuspender las perlas durante 30 segundos en el mezclador de microplacas, cerrar de nuevo la placa, y devolver la placa a la placa de la incubadora rotativa.
    2. Análisis de los datos
      1. Calcular la relación de emisión para cada muestra dividiendo la unidad de fluorescencia relativa (RFU) valor a 526 nm por el valor de RFU a 470 nm.
      2. Representar la relación de emisión frente al log [BoNT / A] para los puntos de datos de la curva estándar. Dependiendo de la BoNT / A Gama de potencia probado, se obtendrá una curva dosis-respuesta sigmoidal (ver resultados representativos).
      3. Coloque los datos de la curva estándar con el pendiente variable curva dosis-respuesta Y = + Bottom (superior-inferior) / (1 ​​+10 ^ ((LogEc 50-X) * Hillslope)) donde X es ellogaritmo de la concentración, Y es la respuesta, e Y comienza en la parte inferior y va a la parte superior con una forma sigmoidal.
      4. Determinar los límites de detección (LOD), límites de cuantificación (LC), y la concentración efectiva media máxima (EC50). Los límites de detección se definen como una muestra que tiene una relación de emisión a menos de 3 desviaciones estándar (DE) por debajo de los controles en blanco (n = 6). Límites de cuantificación se definen como una muestra que tiene una relación de emisión de menos de 10 desviaciones estándar por debajo de los controles en blanco (n = 6). CE 50 se determina a partir de la curva de ajuste de dosis-respuesta sigmoidal.
      5. Interpolar la potencia de las muestras desconocidas contra la curva estándar de dosis-respuesta sigmoidal.
        1. Para resultados cuantitativos, la muestra desconocida idealmente debe caer dentro de la porción lineal de la curva estándar. Aproximado de la porción lineal de la curva estándar mediante el cálculo de la ventana de respuesta de ensayo total de 20-80% (por ejemplo, si la relación de emisión de la curva estándar ranges 0,5 a 2,5, el intervalo lineal sería la porción de la curva estándar que varía desde 0,9 hasta 2,1).
        2. Para resultados cualitativos, comparar la muestra desconocida contra la LOD y LOQ de la curva estándar.
        3. No extrapolar muestras desconocidas más allá de los límites de la curva estándar.

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Representative Results

Un diagrama que resume los pasos en el protocolo descrito se muestra en la Figura 2. El ensayo requiere entre 4-26 horas en completarse, dependiendo del tipo de muestra y la sensibilidad del ensayo deseado, pero sólo ~ 2 horas de tiempo de práctica. El ensayo se realiza en placas de 96 pocillos y, dependiendo del tipo de prueba que se lleva a cabo, permite realizar pruebas por triplicado de hasta 20 muestras incluidas las normas por placa.

La Figura 3 muestra los resultados del ensayo representativos usando BoNT / A holotoxina claveteado en PBS y se ensayó con el protocolo descrito siguiente 2, 4, y 24 horas de incubación con el reportero A / E. Purificada de BoNT / A holotoxina fue elegido para este experimento debido a su peso molecular definida de ~ 150 kDa, en comparación con el definido más ampliamente 700-900 kDa para el complejo de toxina, y la pureza permite Rematar muy precisa a concentraciones precisas. La relación de emisión, la relación de emisión a 526 nm a que a 470 nm después de excitación a 434nm, en cada punto de tiempo se representa gráficamente frente a BoNT / A de concentración (el valor MLD 50 se basa en las pruebas de potencia a los Atléticos fabricante / BoNT). La escisión del reportero por BoNT se mide como una reducción en la relación de emisión, que con nuestro lector de placas oscila entre aproximadamente 2,7 para el reportero intacta a aproximadamente 0,7 para el reportero totalmente escindido. Es importante tener en cuenta que, ya que cada lector de placas de fluorescencia medidas en RFUs, el valor real de la relación de emisión será dependiente de el lector de placas utilizado. Prolongado tiempo de incubación con los resultados de reportero en mayor división reportero como se ve por el giro a la izquierda en la curva. Los puntos de datos, probados por triplicado, muestran bajo SD de la media y siguen la tendencia esperada de una mayor proporción de emisiones con una menor carga de toxinas. El fracaso del ensayo de seguir esta tendencia esperada puede indicar un error durante la generación de la dilución o el trazado de datos. Las tasas de emisión de los testigos que no contienen BoNT / A también se mantienen estables During de la incubación (Figura 3, recuadro), lo que indica la falta de actividad de la proteasa no específica.

Un ejemplo del uso de este protocolo para cuantificar las muestras farmacéuticas BoNT / A se muestra en la Figura 4. Una curva estándar fue generada en PBS con purificada de BoNT / A holotoxina y se procesa en paralelo con diluciones de producto de fármaco generadas a partir de un único vial de 100 U de BOTOX ® liofilizada rehidratada en 0,9% de solución salina. (Idealmente, la curva estándar se compone de lotes de referencia de BOTOX pero ese material no estaba fácilmente disponible.) Las muestras se ensayaron usando el protocolo descrito con la excepción de que 50 l muestras se ensayaron por duplicado sin el uso de 10x tampón de unión. La curva estándar se representó como una función de la BoNT / concentración Un siguiente 24 h de incubación con el reportero A / E. A continuación, la relación de emisión de cada muestra desconocida se visualizó mediante el trazado de su intersección a través de la curva estándar. En este ensayo, la líneaAR porción de la curva estándar (la ventana de respuesta de ensayo de 20-80%) cae entre una relación de emisión de 2.11 a 1.5 y se indica por el cuadro de líneas discontinuas en la figura. Las concentraciones de los tres incógnitas que caen dentro de este rango lineal se interpolan a partir de la curva estándar (figura 4, recuadro). Este ejemplo demuestra la metodología general que se utiliza para detectar o cuantificar cualquier muestra desconocida contra una curva estándar.

Tomates frescos y 2% de leche fueron elegidos para demostrar el rendimiento y la sensibilidad utilizando tanto un sólido (tomate) y alimentos líquidos (leche al 2%) de la matriz del protocolo. BoNT / A complejo compuesto por la holotoxina núcleo y las proteínas neurotoxina asociada (PAN) fue seleccionado para estos experimentos porque esta preparación se asemeja a la toxina producida durante una contaminación de Clostridium natural. Como se muestra en la Figura 5A, la recuperación de la BoNT / A, medido como la escisión del reportero A / E, se observa con bmatrices OTR. Aumento del tiempo de incubación con el reportero aumenta la sensibilidad del ensayo, pero no se traduce en tasas de emisión incluso disminuidos de los controles no toxinas (Figura 5A, inserciones), con indicación de los resultados observados de escisión de BoNT / A y proteasa no específica la transferencia desde la comida en el ensayo. Al igual que con la Figura 3, la muestra de datos de baja variabilidad y sigue la tendencia esperada de la disminución de la escisión reportero con disminución de la concentración de toxina.

La BoNT / A LOD, LOQ, y EC 50 para ambos alimentos en cada punto de tiempo que se muestra se resumen en la Tabla 5. El LOD y LOQ se definen como la muestra más bajo de concentración con una relación de emisión inferior a tres y diez desviaciones estándar por debajo del fondo (muestras que no contenían BoNT / A), respectivamente. Estos límites están restringidas a los puntos de datos probados, aunque la interpolación de la curva de dosis-respuesta sigmoidal se puede utilizar para calcular límites teóricos inferiores. Algunos matriz-a-Se espera que la variabilidad de la matriz en LOD y LOQ, como efectos de matriz pueden influir en la unión de la toxina a las perlas y la recuperación de los granos durante el lavado. Si bien parece que había más de recuperación toxina del 2% de leche que los tomates de los datos en la Figura 5A, gran parte de esta diferencia resulta de la dilución adicional necesaria para homogeneizar muestras de tomate en GPB.

Además de ser una matriz de alimentos sólidos, los tomates son un tipo de muestra digno de mención que el pH y la fuerza iónica de ajuste, logrado por la adición de 10x tampón de neutralización, es crítico para el éxito del ensayo. Figura 5B ilustra las respuestas de ensayo al probar los tomates con o sin inclusión de el tampón de neutralización 10x. La no agregación de los resultados de 10x tampón de neutralización en la mala recuperación de BoNT / A partir de las muestras y se demuestra por una relación de emisión constante a través de todas las concentraciones de BoNT / A. La adición del tampón de neutralización 10 veces, sin embargo, Resultados en la detección sensible de la toxina.

Proteasas no específicas contenidas en matrices complejas pueden llevar a falsos positivos si no se aborda desde proteasas distintas de NTBo pueden escindir el reportero de A / E. Proteasas no específicas pueden ser endógena a la muestra de alimento o introducida cuando se utiliza preparaciones no purificadas de BoNT tales como sobrenadantes de cultivo de Clostridium. Lavado de esferas a fondo será eliminar proteasas más inespecíficos, sin embargo, la adición de inhibidores de la proteasa para el tampón de reacción es crítico La Figura 6 demuestra la actividad de la proteasa no específica que se encuentra en Clostridium BoNT / A de cultivo sobrenadantes usando un reportero A / E modificado, BoTest KO (reportero KO. ). El reportero KO es el mismo que el reportero A / E con la excepción de que la de BoNT / A sitio de escisión se ha mutado de tal manera que ya no se escinde por BoNT / A. Por lo tanto, cualquier escisión reportero observaron resultados de la actividad de la proteasa no específica. Los altos niveles de KO reportero cleAvage indica el sobrenadante del cultivo contiene un alto nivel de actividad de la proteasa, pero que la actividad es negado efectivamente por la adición de inhibidores de la proteasa.

Los datos de la muestra demuestran la utilidad del protocolo de alto rendimiento de BoNT / D de detección en tampones simples y matrices de alimentos. Ciertos alimentos pueden requerir ajustes de ensayo pequeños, pero el protocolo descrito deben dar buenos resultados con la mayoría de tipos de alimentos.

Figura 1
Figura 1. Sugerido disposición de la placa. Las muestras se limitan a los 60 pocillos internos de la placa para evitar posibles efectos de borde. Muestras de la curva estándar Desconocida o se pueden añadir si lo desea. Todos los pocillos no utilizados deben ser llenados con 100 l de agua durante la incubación reportera. Click aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2
Figura 2. Visión general esquemática del protocolo descrito. Cada paso importante en el protocolo se indica mediante una caja etiquetada y se alinea junto a una línea de tiempo de ensayo estimado (no a escala). Muestras no alimenticios no requieren procesamiento de la muestra y así entrar en el protocolo de aguas abajo de las muestras de alimentos. El cuadro de líneas discontinuas alrededor de la generación de dilución en serie para las incógnitas indica que es opcional, pero se recomienda, paso. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3
Figura 3. Detección de BoNT / A holotoxina en PBS utilizando el protocolo descrito.Purificada de BoNT / A holotoxina, se añadieron en PBS y se ensayó usando el protocolo descrito con una concentración superior de BoNT / A de 1 nM. Todas las muestras se ensayaron por triplicado y las barras de error representan la desviación estándar de la media. Reportado potencia se basa en pruebas de bioensayo de ratón del fabricante de la toxina. La relación de emisión (la relación de emisión a 526 nm a 470 nm tras excitación a 434 nm) de la curva estándar se midió después de 2, 4, y 24 horas de incubación con el reportero de A / E y representará gráficamente como una función de la BoNT / D concentración . Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4
Figura 4. Cuantificación de producto de BOTOX de drogas utilizando el protocolo descrito. Un único vial de 100 U de BOTOX producto farmacéutico liofilizado se resuspe nded en 220 l 0,9% de solución salina, se diluyeron en serie, y probado como incógnitas contra una curva estándar hecha en PBS usando purificada de BoNT / A holotoxina. Las muestras se ensayaron de acuerdo con el protocolo descrito excepto que 50 l muestras se ensayaron sin 10x tampón de unión en duplicado. La curva estándar se calculó mediante el ajuste de la relación de emisión de las muestras de la curva estándar a la pendiente ecuación dosis-respuesta sigmoidal variable y se representa gráficamente como una función de la concentración de BoNT / A. Cada muestra desconocida se muestra donde se cruza con la curva estándar después de una incubación de 24 horas con el reportero de A / E. Las concentraciones de las muestras desconocidas que caen dentro del intervalo lineal (caja sombreada de trazos) se interpolan a partir de la curva estándar. La etiqueta para cada desconocido de BOTOX es el número de unidades presentes en la muestra en base a la potencia marcada. Las barras de error representan la desviación estándar de la media.t = "_blank"> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

La figura 5
Figura 5. Recuperación de BoNT / A-enriquecida 2% de leche y ensayo de tomates frescos utilizando el protocolo descrito. Las muestras de 2% de leche y tomates frescos fueron sobrecargadas con purificada complejo de BoNT / A y probado usando el protocolo descrito. Todas las muestras se ensayaron por triplicado y las barras de error representan la desviación estándar de la media. (A) La relación de emisión de la leche 2% y tomates frescos curvas estándar se midieron después de 2, 4, y 24 horas de incubación con el reportero de A / E y se representa como una función de la BoNT / A de potencia. (B) Si no se incluye el tampón 10x neutralización durante resultados de las pruebas de tomate en la insuficiencia ensayo. Las muestras de tomate fresco se ensayaron de acuerdo con el protocolo descrito ya sea con o sin adición de 10 veces Neutrobúfer zación. Los datos que se muestran son para el punto de tiempo de 4 horas. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

La figura 6
Se requieren inhibidores de la proteasa Figura 6. Cuando se prueba matrices complejas. Clostridium de BoNT / A (cepa Hall A) sobrenadante de cultivo se diluyó en serie en PBS y se ensayó usando el protocolo descrito ya sea con o sin inhibidores de la proteasa añadido el tampón de reacción y tanto con la Un / E y KO a los periodistas. La relación de emisión se midió después de 24 h de incubación tanto con el A / E o reporteros KO y se representó gráficamente como una función de la BoNT / A de potencia. Escisión significativa del reportero KO fue visto sin adición de inhibidores de la proteasa, pero fue negado por su inclusión. Todas las muestras se analizaron por triplicado y el error bars representan la desviación estándar de la media. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Buffer Composición Temperatura de almacenamiento Estabilidad Notas
Matriz de 10x tampón de unión MM de HEPES-NaOH 500, pH 7,1, NaCl 250 mM, 1% de Tween-20, 5% de caseína, 0,05% NaN 3 -20 O -80 ° C Estable durante un mínimo de cinco días a 4 ° C después de la descongelación Se suministra con Kit de Matrix BoTest A Detección botulínica
10x Matrix tampón de lavado Fosfatos mM 119, pH 7,4, NaCl 1370 mM, 27 mM de KCl, 1% de Tween-20 -20 O -80 ° C Estable durante un mínimo de cinco días a 4 ° C después de la descongelación Se suministra con Kit de Matrix BoTest A Detección botulínica
10x tampón de neutralización 1 M de HEPES-NaOH, pH 8,0, NaCl 1 M 4 ° C Estable durante un máximo de seis meses a 4 ° C
10x BoTest Reaction Buffer MM de HEPES-NaOH 500, pH 7,1, NaCl 50 mM, 1% de Tween-20, 100 mM ZnCl2 -20 O -80 ° C Estable durante un mínimo de cinco días a 4 ° C después de la descongelación Se suministra con Kit de Matrix BoTest A Detección botulínica
BoTest A / E Reportero 20 mM en 50 mM de HEPES-NaOH, NaCl 10 mM, 15% de glicerol -80 ° C Almacenar en alícuotas pequeñas. Estable durante un mínimo de cinco días a 4 ° C después de la descongelación. Se suministra con Kit de Matrix BoTest A Detección botulínica
Gelatina de tampón fosfato (GPB) 33,3 mM de NaH 2 PO 4, pH 6,2, 2 g / l de gelatina 4 ° C Estable durante un máximo de 1 mes a 4 ° C
200x ditiotreitol (DTT) 1 M DTT -20 ° C Estable durante un máximo de 6 meses a -20 ° C Marca y almacenar pequeñas (100 l) alícuotas
1x PBS-T Fosfatos mM 11,9, pH 7,4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 0,1% de Tween-20 4 ° C Estable durante un máximo de 1 mes a 4 ° C Puede ser hecho usando 10x de PBS de Fisher (BP399-1)
Perlas de una matriz (IP-A Beads) Las perlas magnéticas conjugadas covalentemente a anti-pollo de BoNT Un anticuerpo / en PBS. 0,1% de Tween-20, 0,05% de azida de sodio, 0,25% de caseína, y 50% de glicerol -20 ° C Estable durante un mínimo de cinco días a 4 ° C después de la retirada de -20 ° C. NO CONGELAR a -80 ° C

Tabla 1. Los tampones necesarios para el protocolo descrito. La neutralización 10xTampón es sólo para muy complejas (por ejemplo, alimentos) muestras y puede no ser necesaria dependiendo de la naturaleza de las muestras que se está ensayando.

Nombre del Material / Equipo Empresa Número de catálogo Comentarios / Descripción
BoTest Matrix Una neurotoxina botulínica Kit de detección BioSentinel A1015 Kits de detección de la BoNT / B y F también están disponibles.
Varioskan flash lector de microplacas de fluorescencia Thermo-Fisher Scientific 5250040 La mayoría de los monocromador o unidades basados ​​en filtros con 434 nm de excitación y 470 nm y 526 nm de emisión capacidad se pueden utilizar.
96 pocillos bolas magnéticas Separación Plate V & P Scientific VP771H Otras placas magnéticas se pueden usar, pero la placa deben ser diseñados para separar el BEADS a el lado del pozo.
Magnética Placa de Apoyo-Bead Compatible BioTek ELx405 VSRM Opcional, sólo se requiere para el lavado automático de placas. Otros lavadores de placas compatible con perlas magnéticas también pueden ser utilizados, pero deben ser probados antes de su uso.
Microcentrífuga Vario N / A Opcional, sólo se requiere para las muestras que requieren centrifugación.
Mezclador de placas MixMate Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Vario N / A Usado a TA o a 25 ° C Si el control de temperatura está disponible
EDTA libre de inhibidor de la proteasa Tablets Roche 4693132001 Sólo se requiere para alimentos o pruebas ambientales. Los inhibidores de proteasa deben estar libre de EDTA.
BoNT / A Metabiologics N / A Opcional, sólo se requiere para propósitos de estandarización y cuantificación
, Placas de 96 pocillos de fondo plano negro NUNC 237105 Las placas no deben ser tratados
96 pozos de cinta de sellado de la Plata Thermo Scientific 15036

Tabla 2. Materiales y equipo requerido para el protocolo descrito. Algunos materiales y equipos son opcionales o pueden estar sustituidos dependiendo del equipo disponible. Pruebas de idoneidad y optimización adicional puede ser necesaria si se utiliza el equipo alternativo.

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Nombre de la muestra Toxina Volumen Diluyente Volumen [BoNT / A] (50 MLD / ml) o (MLD 50 / g de alimento) log [BoNT / A] (50 MLD / ml) o (MLD 50 / g de alimento) D1 L 1200 Stock N / A 30000 4.48
D2 300 l D1 600 l 10000 4
D3 90 l D1 810 l 3000 3.48
D4 90 l D2 810 l 1000 3
D5 90 l D3 810 l 300 2.48
D6 90 l D4 810 l 100 2
D7 90 l D5 810 l 30 1.48
D8 90 l D6 810 l 10 1
D9 N / A 1400 l N / A N / A

Tabla 3:. Tabla de dilución para muestras de la curva estándar Esta tabla genera una curva estándar en diluciones semilogarítmicas más de 3,5 órdenes de magnitud. Suficiente muestra en blanco No BoNT (D9) se genera al ejecutar una n = 6. Diluciones adicionales se pueden agregar si se desea.

<td> 0
Nombre del programa Variable Valor Comentarios
Principal Botella reactiva La
Primer volumen 400
Primer Caudal 7
Remoje Después Prime? N
Matrix Wash Botella reactiva La El número de lavados puede aumentarse si se observa actividad de proteasa residual.
Método
4
Remoje / Shake Y
Remoje Duración 180
Agitar Antes Remoje? N
Prima Después Soak? N
Disp
Prescindir de volumen 300
Dispense Caudal 5
Dispense Altura 130
Hor. Dispense Pos. 0
Desactivar Aspirar? Y
Bottom Wash Primero? N
Primer Antes Start? N
Aspir
La aspiración Altura 40
Hor. Aspirar Pos. 0
Aspiración Cambio 5
Aspiración Delay
Transversal Aspirar? N
Final de aspiración? Y
La aspiración final Delay 0
Matrix Soak Remoje Duración 300 Mayor tiempo de remojo puede aumentar la recuperación de cuentas de los alimentos más viscosos.
Agitar Antes Remoje? N
Maestro Wash Matrix Soak Este es un programa 'Enlace' para ejecutar el Matrix Soak y programas de Matrix Lave juntos.
Matrix Wash

Tabla 4. Magnética automatizados configuración del programa lavador de placas compatible con cordón. Los siguientes programas asumen que el lavador de placas está equipado con un imán que tira de perlas a un lado de los pozos y que la memoria intermedia de módulo de conmutación está configurado de tal manera que 1x tampón de lavado ( PBS-t) está unido a la válvula A. Estos programas son específicos a la BioTek ELx405. Consulte el manual del instrumento para instrucciones de programación. Otros lavadores de placas automático o colectores de vacío se puede utilizar compatible con perla magnética, sin embargo, será necesario realizar una prueba para definir los ajustes que maximizan la eficiencia de lavado y reducir al mínimo la pérdida de lecho durante el lavado. Las pruebas iniciales de la recuperación del grano después del lavado es recomendable, independientemente del lavador de placas específico usado.

<td> LOD
Matriz de Alimentos Métrico 2 hr 4 hr 24 hr
MLD 50 / g de alimento MLD 50 / pocillo MLD 50 / g de alimento MLD 50 / pocillo MLD 50 / g de alimento MLD 50 / pocillo
Leche 300 58 100 19 30 6
LOQ 1000 193 300 58 100 19
CE 50 2404 464 590 114 92 18
Tomates Frescos LOD 1000 91 300 27 30 3
LOQ 1000 91 1000 91 100 9
CE 50 7561 687 1932 176 229 21

Tabla 5. Los límites de detección (LOD), límites de cuantificación (LOQ) y medio-mconcentración efectiva aximal (CE 50) para la leche 2% y las pruebas de tomate fresco se muestra en la Figura 2A. La CE 50 se deriva de la curva de ajuste de dosis-respuesta sigmoidal mientras que el límite de detección y límite de cuantificación se definen como el punto de datos concentración más baja que cae ya sea 3 ó 10 desviaciones estándar por debajo de los controles no NTBo (n = 6), respectivamente. Los datos se presentan en tanto MLD 50 / g de alimento y el total de MLD 50 s a prueba por pocillo en el volumen de muestra 200 l.

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Discussion

Este protocolo describe los procedimientos para la cuantificación de BoNT / A complejo holotoxina o Clostridium sobrenadante de cultivo en matrices complejas. El protocolo es el mismo, sin embargo, al probar otra serotipos de BoNT (por ejemplo BoNT / B, E y F) con sus respectivos ensayos Matrix 56,60, aunque la sensibilidad del ensayo variará según los serotipos y ensayos. Este protocolo no tiene en cuenta para cada tipo de muestra posible y algunas modificaciones puede ser necesaria dependiendo de la composición de la muestra específica y la aplicación deseada. Las matrices pueden incluir muestras de alimentos (por ejemplo, pruebas de provocación) o tampones excipiente farmacéutica (prueba de productos de fármacos basado NTBo por ejemplo). Complejo no alimentarios (por ejemplo, tejido animal o ambiental) líquidos y muestras sólidas deben ser tratados como muestras de alimentos. Este protocolo utiliza los volúmenes de 200 l / pocillo de muestra, pero tan sólo 50 l / pocillo se puede probar con el correspondiente ajuste en el volumen de 10x binding tampón. Las muestras más pequeñas de 50 l se deben diluir con GPB o PBS a ≥ 50 l antes de la prueba.

La naturaleza altamente variable de los productos alimenticios representa un desafío particular para la detección y cuantificación de BoNT en los alimentos. PH de la muestra, la viscosidad, la fuerza iónica, y la presencia de materia particulada pueden todos potencialmente afectar a la actividad de la toxina dentro de la matriz del alimento y requerir que la toxina puede aislar de la comida para, la cuantificación exacta in vitro. Muchos de los alimentos o preparaciones de la toxina también contienen proteasas endógenas que deben ser eliminados o inactivados cuando se utiliza a la prensa a base de proteínas para asegurar que sólo se mide la actividad de BoNT-específica de la proteasa. Incluso las matrices de amortiguamiento simples, bien definidas, tales como tampones excipiente farmacéutico, pueden contener compuestos que interfieren con la actividad de BoNT que debe ser eliminado antes de la cuantificación 35,56-59,61. La inmunoprecipitación ofrece una forma rápida, altamente específica de serotipo BoNT purimétodo ficación pero requiere anticuerpos de alta afinidad para aislar las bajas concentraciones de toxinas presentes en los alimentos "del mundo real", del medio ambiente, y las muestras farmacéuticas.

El protocolo descrito purifica la toxina usando perlas paramagnéticas recubiertas con anticuerpos anti-BoNT / A dirigidos hacia el dominio del receptor de la cadena pesada de la toxina de la BoNT / A holotoxina núcleo 56. Especies de Clostridium, sin embargo, producen naturalmente complejos de toxina que consisten de la holotoxina núcleo en asociación con PAN 62-64. Los PNA de proteger la toxina del ataque de la proteasa en el tracto gastro-intestinal y se cree que para facilitar el transporte de la toxina a través del epitelio del intestino 63,65. Los PNA de inhibir la unión de los anticuerpos de IP-Un cordón anti-BoNT / A de la holotoxina núcleo (datos no mostrados). Esta inhibición se alivia con el aumento del pH de la muestra a por encima de ~ 6,25, causando la BoNT / A complejo a disociarse en holotoxina y PNA y permitiendo que la toxina efectivaunión a la IP-A de perlas 66. Por esta razón, ajustando el pH de la muestra a por encima de 6,5 es crítico para el éxito del ensayo (Figura 5B). El 10x tampón de unión usado en el protocolo contiene un agente tampón para ayudar a elevar el pH a condiciones de ensayo estándar. Sin embargo, muchos alimentos ácidos pueden desbordar la capacidad de amortiguación del tampón de unión. El tampón 10x neutralización adicional aumenta en gran medida la capacidad de almacenamiento en búfer de muestra y debe neutralizar la mayoría de las matrices de alimentos.

Otro parámetro importante para el ensayo es la fuerza iónica de la muestra. Se requiere aclarar las muestras por centrifugación para el lavado del grano eficaz y la recuperación después de la inmunoprecipitación. Prueba con tomates frescos, resulta que ninguno Una recuperación / BoNT se observó cuando las muestras fueron simplemente procesan y se centrifuga. La hipótesis de que la BoNT / A puede asociarse con la carne del tomate haciendo que se sedimenten durante la centrifugación y convertirse ausente delsobrenadante probado. Se encontró que el aumento de la fuerza iónica o, más significativamente, la neutralización de las interacciones limitadas de pH entre BoNT y la matriz resulta en una mayor recuperación de la toxina (Figura 5B). Aunque no es necesario para la recuperación de BoNT, se espera, aunque no demostró, que las concentraciones más altas de sal también aumentará la rigurosidad de la inmunoprecipitación y el resultado en la recuperación de proteína menos no específica, especialmente en alimentos bajos en sal.

PH de la muestra y ajuste de la fuerza iónica en el protocolo se lleva a cabo mediante la adición de 10x tampón de neutralización y deben ser compatibles con una amplia gama de alimentos. Mientras que el tampón 10x La neutralización tiene una alta capacidad de tamponamiento, algunos alimentos muy ácidos pueden requerir un ajuste de pH adicional. Se recomienda comprobar el pH de la muestra después de la adición de tampón, si se observa un rendimiento deficiente del ensayo y el volumen de la muestra lo permita. Ajuste adicional del pH se puede lograr a través de la adición de svolúmenes del centro comercial de 1 M HEPES pH 8, si es necesario. El NaCl adicional introducida por el tampón de neutralización 10x debería ser aceptable para todos, pero los alimentos más saladas, sin embargo, 10x tampón de neutralización puede ser sustituido con 1 M de HEPES, pH 8 si los resultados pobres se ven con un determinado producto alimenticio. No se han observado diferencias significativas cuando se prueba el protocolo descrito a concentraciones de NaCl hasta 1,2 M en PBS.

Mientras que este protocolo es aplicable a la mayoría de las muestras, los alimentos en los extremos de pH, fuerza iónica, y / o el contenido de la proteasa no pueden dar buenos resultados con el ensayo. Algunos alimentos también pueden permanecer demasiado viscosa después de la adición de GPB, resultando en la recuperación de talón pobres. Predilución de muestras, con un buffer simple tal como PBS puede mejorar los resultados. El aumento del número de lavados o lavado en condiciones restrictivas (por aumento de la concentración de NaCl) y el aumento de la concentración de inhibidores de proteasa libre de EDTA puede también mejorar los resultados si contami proteasa no específicase observa de iones. La limpieza del instrumento también es muy importante cuando se utiliza el lavado automático de placas. La contaminación de las toberas de inyección de fontanería y con proteasas (por ejemplo, tripsina) de otros ensayos de laboratorio puede conducir a la introducción involuntaria de proteasas durante el ensayo. Se recomienda la limpieza minuciosa del lavador de placas de acuerdo con el manual del usuario del fabricante antes de realizar el ensayo.

Los ensayos de Matrix BoTest son los primeros comercializados, ensayos basados ​​en la actividad para la detección y cuantificación de BoNT en matrices complejas. En comparación con el bioensayo en ratón estándar, el ensayo es rápido, menos costoso, y permite realizar pruebas de alto rendimiento sin necesidad de instalaciones especializadas o preocupaciones éticas relacionadas con el uso de animales 56. Otros métodos de detección in vitro de BoNT en se han descrito, pero no se han demostrado ser compatibles con matrices de muestras complejas, requieren equipo especializado, o no son comercialmente disponle 35,42-44,46-55. Los ensayos son también ensayos basados ​​en la actividad que miden la actividad endoproteasa la toxina, mientras que el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas tradicional (ELISA) técnicas sólo informan de masa toxina. Ensayos ELISA basados ​​en la actividad se describieron anteriormente, pero estos ensayos no se demostraron para trabajar con matrices de alimentos y no abarcan la purificación de la toxina de la matriz de la muestra 41. Subestimación significativa de la toxicidad de muestras complejas se puede producir si la toxina no se purifica a partir de la muestra ya que los compuestos de matriz a menudo interfieren con la actividad de BoNT 35,56-59.

Una vez que el protocolo se domina, se pueden hacer modificaciones para aumentar los volúmenes de muestra y aumentar la sensibilidad de la muestra. Por ejemplo, la unión de la toxina a las perlas se puede realizar en muestras a granel, más grandes (por ejemplo 10 ml o más) antes de la recogida por centrifugación. Estas perlas se pueden añadir a una placa de 96 pocillos y se ensayaron siguiendo el describird protocolo. El aumento de la sensibilidad mayor de un registro se han observado con el aumento de tamaño de la muestra 56. Por lo tanto, el protocolo descrito se puede utilizar con muestras de mayor volumen para detectar incluso pequeñas cantidades de BoNT contenidas en las muestras que pueden pasar sin ser detectados por el bioensayo en ratón.

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Disclosures

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin y WC Tucker son empleados o propietarios de BioSentinel Inc. BioSentinel actualmente fabrica y ha comercializado algunos de los reactivos que se presentan en este informe.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a H. Olivares y D. Ruge para las discusiones y consejos valiosos. Esta investigación fue financiada en parte por un premio NSF SBIR (IIP-1.127.245 a BioSentinel Inc.) y un Departamento de Defensa contrato (W81XWH-07-2-0045 a BioSentinel Inc.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A Metabiologics Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Fisher Scientific 15036

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El aislamiento y la cuantificación de la neurotoxina botulínica A partir de matrices complejas utilizando el BoTest Matrix Ensayos
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Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).

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