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Neuroscience

隔离和肉毒杆菌神经毒素定量从复杂的基质使用BoTest矩阵测定

Published: March 3, 2014 doi: 10.3791/51170
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1BioSentinel Inc., Madison, WI

Summary

该BoTest矩阵A型肉毒毒素（肉毒毒素）检测方法快速净化，并从各种样品基质的量化肉毒毒素。在这里，我们提出了一个协议，用于肉毒毒素，从固体和液体基质的检测和定量，并证明有肉毒杆菌，番茄，牛奶的检测。

Abstract

准确的检测和肉毒杆菌神经毒素（肉毒毒素）对复杂基质中的量化是必需的药品，环境和食物样本测试。期间爆发取证，病人的诊断，食品安全检测是必要的食品快速检测肉毒毒素准确而有力测试是必需的肉毒毒素为基础的药物产品制造和病人安全。被广泛使用的小鼠生物法进行肉毒毒素测试是高度敏感，但缺乏必要的快速和常规检测肉毒毒素的精度和吞吐量。此外，生物测定的使用动物导致了药品监管部门和动物权利支持者在美国和国外的电话，以取代小鼠生物法进行肉毒毒素测试。几种体外测定法更换已开发工作以及与纯化的肉毒毒素在简单缓冲器，但大部分都没有被证明是适用于检测在高度复杂的矩阵。这里，一个协议，用于检测肉毒毒素在使用BoTest矩阵分析复杂基质中呈现。该测定由三部分组成：第一部分涉及制备样品进行测试的，第二部分是使用抗肉毒毒素抗体包被的顺磁珠从基质纯化肉毒毒素免疫沉淀步骤，和第三部分量化了孤立的BoNT的蛋白水解活动采用荧光记者。该协议是用于高通量试验在96孔板上使用液体和固体的矩阵写入，并且需要大约2个小时手工制备具有4-26小时的总的分析时间取决于样品的类型，毒素负载和所需的灵敏度。数据表示为用磷酸缓冲盐水中，药物产品，培养物上清液，2％牛奶，鲜番茄的BoNT / A的测试，并且包括用于检测成功的关键参数的讨论。

Introduction

肉毒杆菌神经毒素毒素（BoNTs）是已知的最致命的物质，估计在1-3纳克静注人致死剂量/公斤1,2。七结构相似的肉毒毒素血清型，至G标记为A，存在，每个由负责细胞结合，摄取和易位到细胞质和轻链编码一种锌内肽酶3-5的重链结构域。肉毒毒素的毒性精美的结果，在某种程度上，在神经肌肉接头6的特异性结合并进入运动神经元。神经元一旦进入，所述轻链肽酶特异性切割1的可溶性N-乙基马来酰亚胺-敏感因子附着蛋白受体（SNARE）所需的囊泡融合蛋白的一个或多个，抑制神经递质的释放，并导致弛缓性麻痹7-14。俗称疾病“肉毒杆菌”的膈肌和肋间肌由肉毒毒素麻痹，最终导致呼吸衰竭而死亡，除非早期诊断和治疗被接收。

人类食源性肉毒中毒是最常见的肉毒毒素血清型A，B，E关联，和F（肉毒毒素/ A，肉毒毒素/ B 等 ），通常从污染的食物15,16摄入导致，虽然，伤口肉毒中毒的几种情况据报道其中静脉吸毒者17,18。在美国，从梭状芽孢杆菌孢子的一岁以下儿童的摄入导致婴儿肉毒中毒是肉毒杆菌19-21的最常见形式。然而，不当家罐头和食品加工产生的食源性肉毒毒素暴发的报道同时在美国和海外。与2000-2009年至少 ​​有338例食源性肉毒中毒的报道世界各地，包括六人死亡22。快速和灵敏地检测食源性肉毒中毒爆发的能力是可能帮助早期诊断的重要指标23,24。此外，检测方法，使成本效益和常规食品检测将导致改善粮食安全。

肉毒毒素的神经元特异性和长的生物半衰期也使得它成为有效的治疗。在美国，肉毒毒素类药物被美国食品与药物管理局的化妆品条件和神经肌肉有关的疾病，包括眉间纹，颈部肌张力障碍，偏头痛，膀胱过度活动症，以及斜视治疗通过。众多的“关闭标签”的应用被记录，包括高剂量治疗重症肌功能不全25-28。准确的毒素定量是正确的剂量至关重要，因为剂量不足可能导致治疗无效，而超剂量将患者置于潜在的有害副作用的风险。不幸的是，没有标准的效价测定的协议不同制造商之间共享，从而导致肉毒毒素为基础的药物机生产线设备之间的不平等定义仙29-31。

标准测试肉毒毒素是小鼠生物法，其中含肉毒毒素样品腹腔注射到小鼠和死亡的人数录得超过1-7天16,32,33。小鼠生物检测与检测5-10皮克的BoNT / A 34限（LOD）非常敏感，但道德问题了动物的使用，培养人才的成本高，维护动物的设施，长期的分析时间，而且缺乏标准化的协议导致的呼叫建立标准化，无动物肉毒毒素检测和定量方法35-39。最近，一些替代肉毒毒素定量方法的发展，提供鼠标或近小鼠生物检测的灵敏度40-49。这些方法通常使用的荧光，质谱，或免疫学方法，并提供检测时间比不使用动物的小鼠生物法大大缩短。质谱办法结合免疫techniq的UE却显示出了检测和量化的BoNT包含在食品和其他复杂的样品，但是，人员的培训要求，专门的设备限制这些测定50-55。大多数其他替代分析是不容易适用于复杂样品测试或缺乏所需的日常肉毒毒素测试的吞吐量。试图开发在体外试验方法的敏感性，以配合肉毒毒素的极端效力时的食品样品的粘度，pH值，含盐量和基质成分的高度可变的性质提出了一个特别困难的挑战。此外，即使是简单和相对良性的缓冲系统，如那些从肉毒毒素为基础的药物产品的再悬浮产生的，含有盐，白蛋白，糖和稳定剂（ 即赋形剂），该显著影响的体外效力的BoNT 56。毒素净化所需的所有准确的活性测试，但最简单的样品56-59的。

该BoTest矩阵分析被设计用于快速，高通量，和肉毒毒素的使用设备在研究实验室56,60通常发现高度复杂样品一致的定量。这些测定中使用的顺磁珠共价连接到血清型特异性抗肉毒毒素的抗体结合和隔离的BoNT出样品，然后除去洗涤干扰矩阵的化合物。洗涤后，肉毒毒素结合蛋白水解活性，然后量化使用的肉毒毒素血清型进行测试兼容记者优化的反应缓冲液。这些记者是荧光蛋白质组成的N-末端青色荧光蛋白（CFP）部分和C-末端的黄色荧光蛋白衍生物（金星）部分由一个基底的BoNT，SNAP25残基141-206或残基突触33-94相连构成的BoTest A / E或B / D / F / G记者，分别为45。记者裂解肉毒毒素是用福斯特共振能量转移（FRET）进行监测。当t他记者是完整的，CFP的激发导致FRET金星，淬火CFP排放和令人兴奋的金星发射。记者通过肉毒毒素的裂解防止荧光共振能量转移，导致增加CFP排放和减少排放的金星。肉毒毒素活性可再使用CFP和金星排放量的比例来定量测定。 LOD低于3皮克有可能从广泛的使用高通量的96孔板格式56的食品。更高的灵敏度可以使用更大的样本量来获得，因为试验允许在磁珠表面毒素的浓度。

对于BoNTs A，B，E和F的BoTest矩阵分析被开发，并与食品，制药，环境样品56,60测试。在这里，我们描述了执行这些分析的肉毒毒素在低复杂度的检测（ 如制药，肉毒毒素在缓 ​​冲液）和高复杂性（ 如食物，环境）的样本程序。具体的处理方法几个样品类型，将在本协议并在这里没有描述的样品类型通常可以使用的呈现方法的组合调整。该协议的开发和测试了肉毒毒素/ A，但适应于其他血清型肉毒毒素使用各自的试验为证明别处56,60。

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Protocol

1。测定试剂的配制

  1. 解冻200X二硫苏糖醇（DTT），10倍的基质结合缓冲液（10×结合缓冲液下同），10倍的中和缓冲液（食物或pH失衡样品只），和15分钟的10倍BoTest反应缓冲液（10X反应缓冲下同），在室温（RT）或直到完全解冻。 见表1为在此协议中使用的缓冲液和试剂的列表。请参阅表2的本议定书所需的材料和设备清单。
  2. 旋涡解冻缓冲5秒混匀。 10X和缓冲液，200xDTT和10x反应缓冲液应显示清晰，同时10倍的结合缓冲液将有混浊的外观。暖10X反应缓冲液5分钟，在37°C和重复涡旋如果它融化之后会出现浑浊。
  3. 产生3.8毫升1X反应缓冲液。
    1. 标签15毫升锥形管“1X反应缓冲液”，并添加3.42毫升分子生物学级笏呃，380微升10X反应缓冲液和19微升200倍数码地面电视。颠倒混匀缓冲好。
    2. 切用干净的刀片季度单EDTA蛋白酶抑制剂药片和四分之一的平板电脑添加到1X反应缓冲液（剩余药片部分可以储存在4℃下以备后用）。NB蛋白酶抑制剂可能不若使用纯化的毒素和简单的缓冲器（ 例如药物样品）是必要的。
    3. 涡1X反应缓冲液，直到蛋白酶​​片完全溶解。
  4. 暖矩阵A珠（即IP-A珠下同）20分钟在室温。
  5. 解冻BoTest A / E记者（A / E以下简称记者）在室温避光。
  6. 标签15毫升锥形管“0.5微米的A / E记者”，并添加45微升的20微米的A / E记者股票至1.8毫升的1X反应缓冲液。吹打调匀，并储存在冰避光。

2。站ARD曲线生成示例

此处所述的标准曲线跨越10-30,000 MLD 50 /克食物或每毫升缓冲液中的半对数稀释（ 表3）。最终用户可以自由地使用替代浓度（如适用）。

  1. 扣球和温育该矩阵与参考材料。使用相同的矩阵的稀释剂为未知的，如果可能的话，以减少基体效应产生的标准曲线。使用明胶的磷酸盐缓冲液（GPB）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）作为稀释剂，如果附加，肉毒毒素负矩阵不可用（ 例如，字段或肉毒毒素爆发样品测试）。通过扣球肉毒毒素/ A到所选择的基质按照下面相应的协议生成标准曲线。
    1. 低复杂度的样品（ 如 PBS，GPB，或药物）
      1. 加入10 ml合适的缓冲液到15毫升锥形管中，备用。该样品将被用作稀释剂的STANDAR3D曲线和未知的稀释液（第4节）。
      2. 添加1.2毫升缓冲液到离心管中。
      3. 注意：此步骤使用肉毒毒素和处理和处置，在与毒素接触任何试剂和材料时，必须特别注意使用。使用个人防护装备和妥善处置所有材料必须按照劳动OSHA准则肉毒毒素（http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html）美国能源部执行。添加肉毒毒素/ A至1.2毫升样品，使终浓度为30,000 MLD 50 /毫升（36,000 MLD 50个）。
    2. 液体食物样本（或其他复杂的液体样品）注：初始建议进行试验以确定从上清液澄清的样品的颗粒物质（ 如纸浆）在液体基质中回收的数量会有所不同。这个协议假定至少1.2毫升澄清上清液将会从1.4毫升SAMP恢复乐。增加样本量，如果必要的。
      1. 加入10 ml液体食物到15毫升锥形管，并把它放在一边。该样品将被用作稀释剂的标准曲线和未知稀释物（第4项）。
      2. 称量一个空的1.5 ml离心管并记录其质量。
      3. 加1.4毫升的液体食品到称重的离心管中。
      4. 再次称重的离心管中，并通过减去空管的质量计算所添加的食品样品的质量。
      5. 注意：此步骤使用肉毒毒素和处理和处置，在与毒素接触任何试剂和材料时，必须特别注意使用。使用个人防护装备和妥善处置所有材料必须按照劳动OSHA准则肉毒毒素（http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html）美国能源部执行。添加肉毒毒素/ A至1.4 mL样品在30,000 MLD 50 /克食物的终浓度。
      6. 温浴忒稀释剂和掺入的样品在室温或4℃下进行2小时，得到的BoNT时间与食品基质相互作用，模仿天然污染。
    3. 固体食物样本（或其他固体样品）注：初始测试被推荐来确定上清液从均质化和澄清的样品后加入1ml GPB /克食物中回收的量。这个协议假定至少1.2毫升澄清的上清液会从2克样品回收。增加样本量，如果必要的。
      1. 称取满分克固体样品放入50ml锥形管中，备用。这将被用来作为稀释剂。
      2. 称出2克固体食物样品到第二50ml锥形管中。
      3. 注意：此步骤使用肉毒毒素和处理和处置，在与毒素接触任何试剂和材料时，必须特别注意使用。使用个人防护装备和妥善处置所有材料s必须根据劳动OSHA准则肉毒毒素（http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html）美国能源部执行。加的BoNT / A至2克样品的表面，以30,000 MLD 50 /克食物（60,000总MLD 50）的终浓度。
      4. 孵育所述稀释剂和加料样品在室温或4℃下进行2小时，得到的BoNT时间与食品基质相互作用，模仿天然污染。
  2. 样品均质和缓冲调整。过程中的加标标准曲线样品和稀释液，根据样品类型上面生成。
    1. 低复杂度的样品
      1. 没有进一步的样品处理是必要的。
    2. 液体食物样本（或其他复杂的液体样品）
      1. 没有样本的同质化是必要的。
      2. 加入140微升10X缓冲液中和到1.4毫升加标样品和1ml 10倍Neutralizat离子缓冲液中加入10毫升稀释样品。混合样品深受反转。
      3. 部分在6000 XG和4℃离心10分钟澄清两个样本立即取出上清液并转移到新管。
    3. 固体食物样本（或其他固体样品）
      1. 加入2ml GPB（1毫升GPB /克食物）的2克的BoNT / A-飙升固体食物样品和10ml GPB以各10 g稀释样品。
      2. 用杵直到充分混合使样品均质化。取决于样品的性质，可能有重大的小块，不能均匀，这是可以接受的。另外，也可以使用机械同质化的方法。 使用搅拌机的不推荐，因为它可能会失活以及雾化的毒素。
      3. 加入10倍和缓冲液体积的十分之一基于近似总量上的样品稀释液（ 如 2毫升，如果量为20毫升）。推断在肉毒毒素/ A-飙升样品的总量和新增的10倍和缓冲液体积的十分之一。混合样品深受反转。
      4. 部分在6000 XG和4℃离心10分钟澄清两个样本立即取出上清液并转移到新管。
  3. 制备标准曲线的连续稀释用于测试
    1. 使用的BoNT / A-掺入标准曲线样品作为D1和nonspiked样品作为稀释液，按表3产生在1.5ml微量离心管中剩余的标准曲线样品。

3。准备未知样本

这部分可以并行第2完成。

  1. 确定未知量的数目和稀释液。如果可能的未知测试，一式三份。
    1. 对于定性测定，比要求的要处理的样品作为记述的运行未知数没有任何进一步的稀释下面床。
    2. 对于定量测定，准备至少2 1:10稀释的样品，如下所述，以确保一个或多个样品落入测定响应的线性范围内。使用相同的矩阵的稀释剂为未知的，如果可能的话，如第3节中所述，以减少基体效应产生的稀释。否则，用PBS或GPB作为稀释剂。
  2. 生成并根据样品类型稀释未知样品。
    1. 低复杂度的未知数（ 如 PBS，GPB，或药物）
      1. 新增至少750微升未知的微量离心管中产生未知稀释1。
      2. 加入675微升稀释至标有未知稀释2和3两的微量离心管。稀释剂将用于标准曲线的生成相同的材料。
      3. 通过串行传输75微升稀释1到2稀释管和混合稀释稀释1。
      4. 连续dilutË稀释2转增75微升稀释2到3稀释管和混合。
    2. 液体食品未知数（或其他复杂的液体样品）注：初始建议进行试验以确定从上清液澄清的样品回收在第3节中讨论的音量。增加样本量，如果必要的。
      1. 添加≥875微升液体未知到微量离心管中。
      2. 加入10倍和缓冲液体积的十分之一到样品（ 如 87.5微升为875微升的样品）。
      3. 部分在6000 XG和4℃离心10分钟澄清样品立即将上清液转移到新管中。这是未知的稀释度。
      4. 添加675微升稀释到两个管子标记未知稀释2和3。稀释剂将用于标准曲线的生成相同的处理物 。
      5. 通过串行传输稀释稀释1环75微升稀释1到2稀释管和混合。
      6. 通过串行传输75微升稀释2到3稀释管和混合稀释稀释2。
    3. 固体食物未知数（或其它固体样品）注：初始测试被推荐来确定上清液澄清的样品回收作为在第3节中讨论的体积。增加样本量，如果必要的。
      1. 称出2克固体未知样品放入50ml锥形管中。
      2. 加入2ml GPB（1毫升GPB /克食物），以2克固体样品。
      3. 使样品均质化，如第3.2.3.2中所述。
      4. 加入10倍和缓冲液体积的十分之一基于近似总量的样品（ 如 0.4毫升，如果量为4毫升）。混合样品深受反转。
      5. 部分在6000 XG和4℃离心10分钟澄清样品立即出现Ÿ转移≥750微升上清到离心管中。这是未知的稀释度。
      6. 加675毫升稀释剂以两个管标记为未知稀释2和3。稀释剂将用于标准曲线的生成相同的处理物 。
      7. 通过串行传输75微升稀释1到2稀释管和混合稀释稀释1。
      8. 通过串行传输75微升稀释2到3稀释管和混合稀释稀释2。

4。最终样本澄清

如果检测液体或固体食物样品，离心所有样品5分钟，≥14,000 XG在微量充分澄清样品。立即取出上清液并转移到新管。

5。板安装和肉毒毒素/一个下拉

  1. 具体的板块布局是依赖于应用程序，但是，不要用外面的井，从而以避免边缘效应。每个未知样品和标准曲线样品D1-D8需要3口井，而样品D9需要6口井。一个建议的板布局如图1所示。
  2. 加入20微升10×结合缓冲液中向每个孔中使用。
  3. 加入200μl每个澄清稀释和未知的每个三口井（六口井的D9）为一式三份测试。混合板，持续10秒的微混合器。
  4. 添加IP-A珠。
    1. 旋涡的IP-A珠，持续10秒的最高速度。继续涡旋如果珠粒不充分悬浮并均匀。
    2. 移液管20微升的IP-A珠子每个样品孔。
    3. 混合盘30秒的微混合器。
  5. 使用旋转板孵化器2小时，在750转，25℃或室温孵育板。检测性能高度依赖于生成和在所有孵育步骤保持的IP-A珠悬浮液。总重悬珠子用microp在所有孵育步骤，使用轨道微孔板摇床造粒和维护停牌后后期混音。

6。板清洗和再悬浮珠

  1. 通过手或通过使用磁珠兼容自动洗板机洗板。配置为磁珠自动洗板机大大提高测定的吞吐量。
    1. 手动清洗
      1. 标记一个50ml锥形管中“1X洗涤缓冲液”和添加45毫升分子生物学级水和5ml 10倍矩阵洗涤缓冲液。颠倒混匀缓冲好。
      2. 从旋转板孵化器中取出钢板。
      3. 立即将板于96孔磁珠分离板5分钟。
      4. 同时使板在96孔磁珠分离板，轻轻取出并丢弃从使用单或多通道移液器样品孔的上清液。不吸珠 - 视觉监测吸气缓冲枪头意外珠去除。如果去除见证，轻轻向后添加提示内容到井，reseparate，并重复删除。
      5. 添加300μl的1X洗涤缓冲液到每个样品孔。
      6. 通过混合盘30秒的微混合器充分重悬珠。
      7. 将培养板在96孔磁珠分离板2分钟。
      8. 删除和丢弃之前从样品孔的上清液。
      9. 总共4次洗涤，重复步骤6.1.1.5-6.1.1.8三次以上。
      10. 与板的96孔磁珠分离板，目视检查井，以确认即使除去上清液;用移液器除去必要的过量残留的缓冲液。一些缓冲将留在孔中，必须小心以避免除去珠或珠干燥。
      11. 加50μl的1X反应缓冲液，以每个样品井和混合板30本身C对微孔板混合器充分重悬珠。如果需要，使用吸管，充分重悬珠。
    2. 自动洗板
      1. 设置和程序根据表4的垫圈。清洁和冲洗垫圈高品质（ 如毫微纯）水。
      2. 总理洗衣机通过运行程序“总理”。
      3. 从旋转板孵化器中取出钢板。
      4. 立即将板在96孔磁珠分离板对板垫圈。
      5. 运行链接程序“主洗”。程序的第一步是5分钟孵育步骤，其中洗衣机将是静止的。
      6. 下面的程序完成后，从洗衣机取出板，加50微升1×反应缓冲液到每个样品孔，并且混合的板进行30秒的微板混合器充分重悬珠。如果需要，使用吸管，充分重悬珠。

    7。试验启动和孵化

    1. 加入50微升0.5微米的A / E记者（见第1节），以每个样品孔中，混合30秒的微混合器充分重悬珠。
    2. 加入100微升水，每个未使用的以及在平板上，以防止边缘效应。
    3. 密封板与板密封胶带，并用旋转板孵化器在750转，25℃或室温孵育板。孵化期间由轻保护板。

    8。数据收集和分析

    注意：此法是一种可以直到获得所需的灵敏度被测量多次，实时测定中，也有不需要停止的试剂。推荐初始读取时间为2，4，并与孵育时间24小时培养时间与检测的灵敏度增加。

    1. 数据收集
      1. 在每个读出时间，从旋转板培养箱取出板，取下密封ING胶带，并立即放置在盘上的96孔磁珠分离板。允许珠来分离2分钟。
      2. 将板在酶标仪和测量排放〜470和〜434 nm的激发下〜526纳米。
      3. 如果需要额外的读取时间是理想的，重悬珠子，持续30秒的微混合器，重新密封板，并在板返回到旋转板孵化器。
    2. 数据分析
      1. 通过在470 nm处的RFU值除以相对荧光单位（RFU）的值在526 nm处计算各样品的发射率。
      2. 绘制排放比与日志[肉毒毒素/ A]进行标准曲线的数据点。根据测试的BoNT / A的效力范围，S形剂量 - 反应曲线，将获得（见代表性成果）。
      3. 适合与可变斜率剂量-反应曲线Y =底+（顶-底）/标准曲线数据（1 +10 ^（（logEC 50-X）*坡地）），其中X是浓度的对数，Y是反应，和Y在底部开始，去到上面用S形的形状。
      4. 确定检测限（LOD），定量限（LOQ）和半最大有效浓度（EC 50）的限制。检测限被定义为具有低于空白对照的发射率小于3个标准偏差（SDS）的样本（N = 6）。定量限被定义为具有一个样品的发射率小于10 SD中下面的空白对照组（n = 6）。 EC 50从S形的剂量-反应曲线拟合来确定。
      5. 插任何未知样品对S形剂量 - 响应标准曲线的效力。
        1. 对于定量的结果，未知样品应理想落在标准曲线的线性部分内。通过计算20-80％的总测定响应窗口接近标准曲线的线性部分（ 例如 ，如果标准曲线r的发射率安格斯从0.5-2.5，线性范围将是标准曲线，从0.9-2.1范围内的部分）。
        2. 对于定性结果，与之比较的标准曲线的LOD和LOQ未知样品。
        3. 不推断未知样品超出标准曲线的范围。

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Representative Results

的图表总结了在所描述的协议的步骤示于图2。 4-26小时之间的检测需要根据样品的类型和所需的检测灵敏度来完成，但只〜2小时的手工操作时间。该测定在96 - 孔板中进行，并根据所执行的测试的类型，允许多达20个样品，包括每盘标准的一式三份测试。

图3显示了使用肉毒毒素代表性的化验结果/ A全毒素飙升至PBS及与所描述的协议下2，4，和24小时培养与A / E的记者进行测试。纯化的BoNT / A全毒素被选作此实验，因为其定义的分子量的〜150 kDa的，相比于更广泛的定义700-900 kDa的对毒素复合物，和纯度允许非常精确的尖峰在精确的浓度。发射率，在526毫微米至470毫微米的发射率在434以下的激发纳米，在每个时间点绘制成的BoNT / A的浓度（MLD的50值是基于肉毒毒素/ A制造商的有力测试）。记者通过肉毒毒素的裂解是衡量的排放比例，这与我们的酶标仪之间约2.7范围内的完整记者以约0.7的完全酶切的报道减少。要注意的是，由于在RF美国各板读数器测量荧光，发射率的实际值将依赖于所使用的平板阅读器是很重要的。延长孵育时间与记者导致增加的记者裂解所看到的曲线向左偏移。数据点，一式三份测试，显示平均低SD和遵循的具有减少毒素负荷加大发射比预期的趋势。测定的不遵守此预期的趋势可能产生稀释或数据绘图时表示错误。不含肉毒毒素/ A控制的发射率也保持稳定超级碗克温育（ 图3，小图），这表明缺乏非特异性蛋白酶活性。

使用该协议来量化药物的BoNT / A的样品的一个例子示于图4。在PBS生成与纯化的肉毒毒素/ A全毒素标准曲线，并与药物产品从单一的100单位小瓶冻干再水化肉毒杆菌在0.9％生理盐水稀释产生的并行处理。 （理想的情况下，绘制标准曲线将被由参考大量肉毒杆菌，但这样的材料是不容易得到）。样品使用所描述的协议与该异常50μl的样品一式两份，无需使用10×结合缓冲液中测试了测试。标准曲线绘制成以下24小时培养与A / E的记者肉毒毒素/ A浓度的函数。每个未知样品的发射率，然后通过在标准曲线，其显示其交叉点可视化。在该试验中，线标准曲线（20-80％化验响应窗）的芳基部分的2.11-1.05的发射率介于并且由虚线方框中的数字表示。三个未知属于这个线性范围的浓度，然后从标准曲线（ 图4，小图）内插。本实施例证明，将用于检测或定量任何未知样品相对于标准曲线的一般方法。

新鲜的西红柿和2％的牛奶被选为示范协议的性能，同时使用固体（番茄）及液态食品（2％牛奶）矩阵的灵敏度。包括核心的全毒素和神经毒素相关蛋白（NAP）的的肉毒毒素/一个复杂的被选定为这些实验，因为这个准备过程中酷似天然梭状芽孢杆菌污染所产生的毒素。 如图5A，肉毒毒素/ A，按该A / E记者裂解回收，是用b观察超视距矩阵。增加孵育时间与记者会增加检测的灵敏度，但不会导致在无毒素对照（ 图5A，插图）减少排放比率，表示从的BoNT / A和所观察到的裂解结果不是非特异性的蛋白酶结转从食物中检测。与图3中，数据显示低变异性和如下的预期趋势下降记者裂解以降低毒素的浓度。

的肉毒毒素/ A的LOD，LOQ，和EC 50为在食品中所示的每个时间点归纳在表5中 。的LOD和LOQ被定义为低于三至十SD中的背景下，分别为（不含肉毒毒素/ A样本）的发射率的最低浓度样品。这些限制被限制为测试数据点，尽管插值到S形剂量 - 响应曲线可以用来计算下理论上的限制。一些矩阵对在LOD和LOQ基质变性预计，随着基质效应可能影响毒素的珠子和珠子洗涤过程中回收的约束力。虽然它会出现，有更多的毒素回收率为2％的牛奶比西红柿从图5A，从均质化番茄样品中GPB所需的额外稀释太多这种差异导致的数据。

除了 ​​作为固体食物基质中，西红柿是一个值得注意的样品类型，其中，pH和离子强度的调整，通过加入10倍的中和缓冲液来实现，是检测成功的关键。 图5B测试西红柿有或没有夹杂物的时候表示测定反应10倍的中和缓冲。若不加10倍和缓冲液导致肉毒毒素/ A以上的样品回收率较差，并且证明了在所有测试的肉毒毒素/ A浓度恒定的发射率。此外，10×缓冲液中和，虽然河esults在灵敏检测的毒素。

含有复杂基质中特异性蛋白酶可以导致误报，如果不处理，因为蛋白酶比肉毒毒素等可裂解A / E的记者。非特异性蛋白酶可能是内源性食物样本或使用nonpurified肉毒毒素制剂如梭状芽孢杆菌培养上清液时介绍。彻底洗涤珠将除去大部分的非特异性的蛋白酶，但是，除了蛋白酶抑制剂的反应缓冲液是临界图6展示了在梭菌的BoNT / A的培养上清液发现使用修改A / E记者，BoTest KO（KO记者非特异性蛋白酶活性。 ）。劫记者的是，肉毒毒素/ A裂解位点发生突变一样的A / E记者，除了这样，它是由肉毒毒素/ A不再切割因此，任何观察到的记者裂解导致的非特异性蛋白酶活性。高水平的KO记者CLEavage表明培养上清液中包含的蛋白酶活性的水平高，但活性可通过加入蛋白酶抑制剂有效地否定。

样本数据证明了协议的简单缓冲区和食品样品高通量的BoNT / A的检测工具。某些食物可能需要小法的调整，但所描述的协议应产生良好的效果与广大食品类型。

图1
图1。建议板布局。样品被限制在所述内孔60的板，以避免可能的边缘效应。可以添加或未知的标准曲线样品应有的作用。记者在孵化所有未使用的孔内均应加入100μl水。 CLI的在这里完蛋查看大图。

图2
图2中描述的方案的总体示意图。在协议中的每个主要步骤是由一个标记的框表示与旁边的估计检测时间轴（不按比例）对齐。非食品样品不要求来样加工等进入食品样品下游的协议。各地连续稀释代虚线框为未知数表示这是一个可选的，但建议，一步。 点击这里查看大图。

图3
图3。检测肉毒毒素/使用说明协议的PBS全毒素的。纯化的肉毒毒素/ A全毒素中掺入至PBS及使用说明协议与1纳米的上的BoNT / A的浓度进行测试。所有样品一式三份进行测试和误差棒代表平均值的标准偏差。报告的效力是根据制造商的小鼠生物毒素的检测。标准曲线的发射率（发射在526 nm处，以激发波长为434 nm的后470 nm处的比率）的测定以下的2个，4个和24小时培养与A / E的记者和绘制的BoNT / A浓度的函数。 点击此处查看大图。

图4
图4：利用定量的描述的协议BOTOX药物产品。单100单位小瓶肉毒杆菌冻干药品的是resuspe NDED在220微升0.9％盐水，连续稀释，并测试根据标准曲线用纯化的BoNT / A的全毒素的PBS中制成的未知数。样品按照不同的是50微升的样品中不重复的10×结合缓冲液中进行测试所描述的协议进行测试。标准曲线来计算拟合标准曲线样品的发射率到可变斜率S形剂量响应方程，并绘制成的BoNT / A的浓度的函数。每个未知样品显示它与标准曲线相交以下24小时培养与A / E的记者。未知样品落下的线性范围（虚线阴影框）内的浓度通过从标准曲线进行内插。标签为每个BOTOX是未知的单位存在，基于标记的效力与样品中的数量。误差棒代表平均值的标准偏差。T =“_blank”>点击这里查看大图。

图5
图5。恢复肉毒毒素/ A-飙升2％的牛奶和新鲜的西红柿测试使用上述协议。2％的牛奶和新鲜的西红柿样品中加入纯化的肉毒毒素/一个复杂和使用所描述的协议测试。所有样品一式三份测试，误差棒代表平均值的标准偏差。（一）2％的牛奶和新鲜的西红柿标准曲线的排放比下面2进行测定，4，和24小时培养与A / E记者和绘制为的BoNT / A效力的函数（B）未在番茄试验结果试验失败，以包括10倍的中和缓冲液中。新鲜番茄样品按照所描述的协议具有或不具有另外的10倍中性测试化缓冲区。显示数据是4小时的时间点。 点击这里查看大图。

图6
测试复杂的矩阵时，如图6所示。蛋白酶抑制剂是必需的。 梭菌的BoNT / A（菌株A馆）培养上清液系列稀释在PBS中，并使用所描述的协议有或没有蛋白酶抑制剂加入到反应缓冲液并同时与一个经过测试/ E和KO记者。发射率测量以下24小时培养既在A / E或KO记者和绘制的肉毒毒素/ A效力的函数。在KO记者显著裂解被认为不加蛋白酶抑制剂，但被否定了他们的包容。所有样品一式三份，并在错误B测试ARS代表平均值的标准偏差。 点击这里查看大图。

缓冲组成储存温度稳定性笔记
10X矩阵结合缓冲液 500毫摩尔HEPES-的NaOH，pH值7.1，250 mM氯化钠，1％Tween-20中，5％酪蛋白，0.05％NaN 3的 -20℃或-80℃ 稳定了至少五天，在4℃解冻后随附BoTest矩阵A型肉毒检测试剂盒
10X矩阵洗涤缓冲液 119 mM的磷酸盐，pH为7.4，1370 mM氯化钠，27 mM的氯化钾，1％Tween-20的 -20℃或-80℃ 稳定了至少五天，在4℃解冻后随附BoTest矩阵A型肉毒检测试剂盒
10倍中和缓冲液 1M的HEPES-的NaOH，pH值8.0，1M NaCl的 4℃ 稳定在4℃至六个月
10X BoTest反应缓冲液 500毫摩尔HEPES-的NaOH，pH值7.1，50 mM氯化钠，1％Tween-20中，100μM的ZnCl 2 -20℃或-80℃ 稳定了至少五天，在4℃解冻后随附BoTest矩阵A型肉毒检测试剂盒
BoTest A / E记者 20μM，在50mM HEPES-的NaOH，10 mM氯化钠，15％甘油 -80℃ 存放在小等份。稳定了至少五天，在4℃解冻后。 随附BoTest矩阵A型肉毒检测试剂盒
明胶磷酸盐缓冲液（GPB） 33.3毫的NaH 2 PO 4，pH值6.2，2克/升明胶 4℃ 稳定长达1个月，在4℃下
200X二硫苏糖醇（DTT）的 1 M DTT -20°C 稳定长达6个月，在-20℃下制作和贮存小（100微升）等分
1X PBS-T 11.9毫磷酸盐，pH为7.4，137 mM氯化钠，2.7 mM的氯化钾，0.1％Tween-20的 4℃ 稳定长达1个月，在4℃下可以用10倍的PBS从费舍尔（BP399-1）进行
矩阵A珠（即IP-A珠） 磁珠共价结合，以在PBS鸡抗肉毒毒素/ A抗体。 0.1％的Tween-20，0.05％叠氮化钠，0.25％酪蛋白和50％的甘油 -20°C 稳定了至少五天，在4℃在除去从-20℃。不要冻结在-80°C

表1。所需描述的协议缓冲器的 10倍中和缓冲器是只对高度复杂的（ 例如食品）的样品，并根据被分析的样品的性质，可以不需要。

材料/设备名称公司目录号评论/说明
BoTest矩阵A型肉毒毒素检测试剂盒 BioSentinel A1015 也可检测试剂盒的BoNT / B和F。
Varioskan闪光荧光酶标仪热尔科技 5250040 大多数单色器或过滤器为基础的单位，434 nm激发和470 nm和526 nm发射功能可以使用。
96孔磁珠分离板 V＆P科学 VP771H 其它磁性板也可以使用，但在板的设计应该分开的BEADS到井的侧面。
磁珠兼容洗板 BioTek的 ELx405 VSRM 可选的，只需要自动洗板。其他磁珠兼容板垫圈也可使用，但在使用前应进行测试。
离心各个 N / A 可选的，只需要样品需要离心。
MixMate板混合器 Eppendorf公司 22674200
轨道摇床各个 N / A 用于在室温或在25°C如果温度控制可
无EDTA蛋白酶抑制剂片剂罗氏 4693132001 只需要食物或环境测试。蛋白酶抑制剂必须是无EDTA。
肉毒毒素/ A Metabiologics N / A 可选的，只需要标准化和量化的目的
黑色，平底96孔板 NUNC 237105 板不应被视为
96孔板封口胶带 Thermo Scientific的 15036

表2材料和所需的所述协议的设备。某些材料和设备是可选的或者可以根据现有的设备上被取代。额外的适用性测试和优化，可能需要，如果使用备用设备。

</ TR>
样品名称体积毒素稀释剂体积 [肉毒毒素/ A]（MLD 50 /毫升）或MLD（50 /克食物） 日志[肉毒毒素/ A]（MLD 50 /毫升）或MLD（50 /克食物） D1 1,200微升股票 N / A 30,000 4.48
D2 300微升D1 600微升 10,000 4
D3 90微升D1 810微升 3,000 3.48
D4 90微升D2 810微升 1,000 3
D5 90微升D3 810微升 300 2.48
D6 90微升D4 810微升 100 2
D7 90微升D5 810微升 30 1.48
D8 90微升D6 810微升 10 1
D9 N / A 1,400微升 N / A N / A

表3：对于标准曲线样品稀释表此表生成的标准曲线在半对数稀释幅度超过3.5的订单。没有足够的肉毒毒素空白样品（D9）生成运行一个n = 6。如果需要额外的稀释液可以增加。

<TD> 0
节目名称变量值评论
总理试剂瓶一
黄金卷 400
总理流量 7
泡总理后？ Ñ
矩阵洗试剂瓶一如果残留的蛋白酶活性，观察可以增加洗涤次数。
方法
4
浸泡/摇 Ÿ
浸泡时间 180
摇前浸泡？ Ñ
总理浸泡后？ Ñ
DISP
分配体积 300
免除流量 5
点胶高度 130
贺。免除名次。 0
禁止吸？ Ÿ
底清洗第一？ Ñ
总理开始之前？ Ñ
Aspir
吸液高度 40
贺。吸名次。 0
抽吸率 5
抽吸延迟
横向吸？ Ñ
最后的要求呢？ Ÿ
最后吸气延迟 0
基质浸泡浸泡时间 300 增加浸泡时间可能会增加磁珠回收率为较粘稠的食物。
摇前浸泡？ Ñ
主洗基质浸泡这是一个'链接'程序运行矩阵浸泡和Matrix洗程序在一起。
矩阵洗

表4。磁珠兼容自动化洗板程序设置。以下程序假定洗板机配备了一个磁铁，拉珠孔的侧面和该缓冲器切换模块被设置成使得1X洗涤缓冲液（ PBS-t）被连接到阀门A.这些程序是特定于BioTek的ELx405。请参考仪器手册编程指令。其他磁珠兼容自动洗板机或真空歧管可被使用，但是，测试将被要求来定义的设置，最大限度地提高洗涤效率和洗涤过程中最小化珠损失。建议珠复苏下洗的初步测试，无论使用的具体洗板机。

<TD> LOD
食品矩阵公 2小时 4小时 24小时
MLD 50 /克食物 MLD 50 /孔 MLD 50 /克食物 MLD 50 /孔 MLD 50 /克食物 MLD 50 /孔
牛奶 300 58 100 19 30 6
定量限 1,000 193 300 58 100 19
欧共体50 2,404 464 590 114 92 18
新鲜西红柿 LOD 1,000 91 300 27 30 3
定量限 1,000 91 1,000 91 100 9
欧共体50 7,561 687 1,932 176 229 21

表5。检测限（LOD），定量限（LOQ），半米aximal有效浓度（EC 50）为2％的牛奶和新鲜番茄测试图2A中所示的EC 50从S形剂量-响应曲线拟合派生而LOD和LOQ被定义为落在最低浓度数据点3或10个标准差以下没有肉毒毒素，分别为对照组（6 N =）。数据以两个50 MLD / g的食品和总MLD 50秒每孔200微升的样品量测试中。

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Discussion

本协议描述的量化肉毒毒素/一个复杂的，全毒素，或梭状芽孢杆菌培养上清复杂基质中的程序。该协议是一样的，但是，与他们各自的矩阵分析56,60测试其他血清型肉毒毒素（ 如肉毒毒素/ B，E和F）时，虽然检测灵敏度将跨越血清型和分析有所不同。这个协议没有考虑所有类型的样品的可能和一些修改可以根据具体的样品组合物和期望的应用是必需的。矩阵可以包括食物样本（ 如食物激发试验）或药用赋形剂缓冲器（ 例如肉毒毒素为基础的药物产品测试）。复杂的非食用（ 例如动物组织或环境）的液体和固体样品应被 ​​视为食品样品。该协议使用200微升/孔样品量，但只有50微升/孔可以作出相应调整，以10倍结合蛋白的量进行测试克缓冲区。大于50微升小应与GPB或PBS稀释到测试前≥50微升。

食品的高度变化的性质代表了肉毒毒素检测和定量食品中以一种特别的挑战。样品的pH，粘度，离子强度和颗粒物的存在都可以潜在地影响毒素的活性的食物基质内和必要的毒素可以从食品中分离得到准确， 在体外定量。许多食物或毒素制剂还包含内源性蛋白酶，必须除去或使用基于蛋白质的记者时，以确保只有肉毒毒素特异性蛋白酶活性的测量是灭活。即使是简单的，定义良好的缓冲液基质，如药物赋形剂缓冲剂，可以包含与肉毒毒素的活性是必须量化35,56-59,61之前去除干扰化合物。免疫沉淀提供了一个快速，高血清型特异性纯化肉毒毒素fication的方法，但需要高亲和力的抗体来隔离在“现实世界”的食品，环境和药物样品发现低浓度的毒素。

使用涂有朝向的BoNT / A全毒素芯56的毒素重链受体结构域抗的BoNT / A抗体的顺磁性珠的描述协议净化毒素。 梭菌属 ，然而，天然产生的毒素复合物组成的相关联的核心全毒素的有午睡习惯62-64。国家行动方案保护毒素从胃肠道蛋白酶的攻击，被认为有利于毒素的运输在整个小肠上皮63,65。国家行动方案抑制的IP-A珠抗肉毒毒素/ A抗体的核心全毒素（数据未显示）的结合。这种抑制作用是通过增加样品的pH值，以上面〜6.25，引起的BoNT / A复合物解离为全毒素和行动方案，并允许有效的毒素解除绑定到IP-珠66。出于这个原因，调节样品的pH值到6.5以上是到测定（ 图5B）的成功至关重要。在协议中使用的10X结合缓冲液中含有缓冲剂，以帮助提高pH值到标准试验条件。然而，许多酸性食物可以压倒结合缓冲液的缓冲能力。附加的10倍和缓冲液大大提高了样品的缓冲能力，并应消除广大食品基质中。

用于测定的另一个重要参数是样品的离子强度。需要有效的珠子的洗涤和回收下列免疫沉淀通过离心分离样品的澄清。测试用新鲜的西红柿发现没有肉毒毒素/ A复苏看出，当样品被简单地处理并离心。我们推测，肉毒毒素/ A可能与番茄果肉关联使其在离心沉淀，成为从缺席测试上清液。我们发现，增加离子强度，或者更显著，中和肉毒毒素并从而提高了毒素恢复（ 图5B）的基体之间的pH值限定的相互作用。虽然不是必需的肉毒毒素恢复，因此预计，虽然没有表明，较高的盐浓度也会增加免疫沉淀的严格性以及导致更少的非特异性蛋白质回收率，特别是在低盐食品。

样品的pH值和离子强度调整在该协议通过加入10倍的中和缓冲液进行，并应具有宽范围的食品相容。而10倍的中和缓冲液具有高的缓冲能力，一些高酸性食品可能需要额外的pH调节。样品pH值的缓冲之后除了建议进行试验，如果试验性能不良和样本量允许。附加的pH调节可通过添加第实现1M的HEPES pH值为8商场卷，如果需要的话。通过10倍的缓冲液中和引入的额外的NaCl应该是可接受的，但所有的咸食品，但是，10倍的缓冲液中和可更换用1M HEPES pH为8，如果差的结果被认为与给定的食品。测试描述的协议在NaCl的浓度高达1.2M的PBS中，当无显著差异已观察。

而这个协议是适用于大多数样品中，在食品的pH值，离子强度和/或蛋白酶含量的极端可能不会产生与测定了良好的效果。一些食物也可以保持太粘在加入GPB的，导致差的焊道恢复。样品的预稀释用一个简单的缓冲液如PBS中可改善结果。增加洗涤次数或洗涤严格性（通过增加NaCl浓度）和增加的无EDTA蛋白酶抑制剂的浓度也可以改善的结果，如果是非特异性蛋白酶铅污染离子被观察到。仪器的清洁也很重要使用自动洗板时。管道和喷嘴与其他实验室检测蛋白酶（ 如胰蛋白酶）的污染可以在试验过程中导致无意引进蛋白酶。根据制造商的用户手册中的洗板的彻底的清洁运行试验之前的建议。

该BoTest矩阵分析是第一个商业化，以活动为基础的检测肉毒毒素用于检测和定量复杂基质中。相较于标准的小鼠生物法，该法具有快速，更便宜，并允许高吞吐量的测试，而不需要专门的设施或有关动物使用56伦理问题。其他体外肉毒毒素的检测方法进行了说明，但并没有被证明是与复杂样品基质相容的，需要专门的设备，或商业上不能连接状态乐35,42-44,46-55。该测定法还可以测量毒素内切蛋白酶活性，而传统的酶联免疫吸附测定（ELISA）技术，只报告毒素质量活性为基础的检测。基于活动的ELISA分析先前所述，但这些测定法没有表现出与食品基质的工作，不从样品基质41包含毒素的纯化。如果毒素不从样品纯化自基质化合物常与肉毒毒素活性35,56-59干扰可能会出现复杂样品的毒性的显著低估。

一旦协议被掌握，可以进行修改，以增加样本量，提高样本的灵敏度。例如，毒素结合于珠可以较大，散装样品（ 如 10毫升或更大）在收集之前通过离心进行的。这些珠子可以被添加到一个96孔板中，并测定以下的描述D协议。增加灵敏度大于1日志已被观察到与增加的样本量56。因此，所描述的协议可以与较大体积的样品用于检测，即使微量的BoNT中所含的样品，可能检测不到由小鼠生物量。

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Disclosures

调频邓宁，以旧换新广场，楼Zeytin，和厕所塔克是BioSentinel公司BioSentinel员工或业主目前生产并商业化了一些本报告中的试剂。

Acknowledgments

作者要感谢H.奥利瓦雷斯和D如歌的有价值的讨论和建议。这项研究是由美国国家科学基金会一SBIR计划奖（IIP-1127245至BioSentinel Inc。）和美国国防部的合同（W81XWH-07-2-0045到BioSentinel公司）的部分资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A Metabiologics Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Fisher Scientific 15036

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References

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Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).

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