Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Isolering og kvantificering af botulinumneurotoksin Fra komplekse matricer Brug af BoTest Matrix Analyser

Published: March 3, 2014 doi: 10.3791/51170
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1BioSentinel Inc., Madison, WI

Summary

Den BoTest Matrix botulinumneurotoksin (BoNT) påvisningsassays hurtigt rense og kvantificere BoNT fra en række prøvematrixer. Her præsenterer vi en protokol til påvisning og kvantificering af BoNT fra både faste og flydende matricer og demonstrere assay med Botox, tomater og mælk.

Abstract

Nøjagtig påvisning og kvantificering af botulinum neurotoksin (BoNT) i komplekse matricer er nødvendig for farmaceutiske, miljø og fødevarer stikprøvekontrol. Er behov for hurtige BoNT test af fødevarer i løbet af udbrud retsvidenskab, patient diagnose og fødevaresikkerhed test mens præcis potens test er påkrævet for BoNT-baserede drug produktfremstilling og patientsikkerhed. Den udbredte musebioassay til BoNT test er yderst følsom, men mangler præcision og gennemløb nødvendig for hurtig og rutine BoNT test. Desuden har den bioassay brug af dyr resulterede i opkald ved lægemiddelproduktbeholdere regulerende myndigheder og fortalere dyre-rettigheder i USA og i udlandet for at udskifte musebioassay for BoNT test. Adskillige in vitro udskiftning assays er blevet udviklet, som fungerer godt med renset BoNT i enkle buffere, men de fleste har ikke vist sig at være anvendelig til test i meget komplekse matricer. Her blev en protokol til påvisning afBoNT i komplekse matricer ved hjælp af BoTest Matrix-analyser præsenteres. Analysen består af tre dele: Den første del involverer forberedelsen af ​​prøverne til test, den anden del er et immunoudfældning trin ved hjælp af anti-Bont antistofovertrukne paramagnetiske perler til at rense BoNT fra matricen, og den tredje del kvantificerer isolerede BoNT s proteolytisk aktivitet under anvendelse af et fluorogent reporter. Protokollen er skrevet til high throughput test i 96-brønds plader ved anvendelse af både flydende og faste matricer og kræver omkring 2 timer for manuel forberedelse med samlede assay tidspunkter af 4-26 timer afhængigt af prøvetypen toksin belastning, og den ønskede følsomhed. Data er præsenteret for BoNT / A-test med phosphatbufret saltvand, et lægemiddel produkt, kultur supernatant, 2% mælk, og friske tomater og omfatter diskussion af de kritiske parametre for analysen succes.

Introduction

Botulinumneurotoksiner (BoNTs) er de dødeligste kendte stoffer, med intravenøs menneskelige dødelige doser anslået til 1-3 ng / kg 1,2. Syv strukturelt lignende serotyper af BoNT, mærket A til G, der findes, hver bestående af en tung kæde-domæne der er ansvarlig for cellebinding optagelse og translokation til cytosolen, og en let kæde, som koder for en zink-endopeptidase 3-5. Den udsøgte toksicitet BoNT skyldes dels dens specifikke binding og ibrugtagning motoriske neuroner ved den neuromuskulære junction 6. Inde i neuron, lyset kæde endopeptidasen specifikt spalter en eller flere af den opløselige N-ethylmaleinimid-følsomme faktor vedhæftet protein receptor (SNARE) proteiner, der er nødvendige for vesikelfusion, hæmmende neurotransmitter frigivelse og fører til lammelse 7-14. Almindeligvis kendt som sygdommen "botulisme", lammelse af mellemgulvet og mellemsiddende muskler ved BoNT sidste ende resulterer irespirationssvigt og død, medmindre tidlig diagnose og behandling modtages.

Menneskelig fødevarebåren botulisme er oftest forbundet med BoNT serotype A, B, E og F (BoNT / A, BoNT / B, etc.) og som regel skyldes indtagelse af forurenede fødevarer 15,16, selv om adskillige tilfælde af sårbotulisme blev rapporteret blandt intravenøse stofbrugere 17,18. I USA, spædbarn botulisme som følge af indtagelse af Clostridium sporer af børn under en alder af den ene er den mest almindelige form for botulisme 19-21. Imidlertid blev fødevarebårne Bont udbrud som følge af forkert hjemmet konservering og forarbejdning af fødevarer rapporteret i både USA og i udlandet. Mellem 2000-2009 blev der indberettet mindst 338 tilfælde af fødevarebårne botulisme på verdensplan, herunder seks dræbte 22. Evnen til hurtigt og nænsomt opdage fødevarebårne botulisme udbrud er en kritisk indikation, der kan støtte tidlig diagnose 23,24. Desuden vil påvisningsmetoder, der giver omkostningseffektive og rutineprøvning mad fører til bedre fødevaresikkerhed.

BoNT s neuronale specificitet og lang biologisk halveringstid gør det til et potent terapeutisk også. I USA er BoNT-baserede lægemidler er godkendt af Food and Drug Administration til behandling af kosmetiske betingelser og neuromuskulære lidelser, herunder glabellar linjer, cervikal dystoni, migræne hovedpine, overaktiv blære, og skelen. Talrige "off-label"-programmer er dokumenteret, herunder højdosis behandlinger for alvorlige muskel dysfunktion 25-28. Præcis toxin kvantificering er kritisk for korrekt dosering, som underdosering kan medføre ineffektiv behandling, mens overdosering sætter patienter med risiko for potentielt skadelige bivirkninger. Desværre er der ingen standardiseret potens assayprotokollen deles på tværs af producenter, hvilket resulterer i definition enhed uligheder mellem BoNT-baserede drug products 29-31.

Den standard test for BoNT er musebioassay hvor BoNT-holdige prøver injiceres intraperitonealt i mus og antallet af dødsfald registreret mere end 1-7 dage 16,32,33. Den musebioassay er meget følsom med detektionsgrænser (LOD) på 5-10 pg BoNT / A 34, men etiske bekymringer over brugen af dyr, den høje pris på uddannelse af personale og vedligeholdelse dyrefaciliteter, lange assay gange, og den manglende standardiserede protokoller resulterede i opfordringer til at udvikle standardiserede, dyre-fri BoNT test og kvantificering 35-39. For nylig blev flere alternative Bont kvantificering udviklet, der tilbyder mus eller nær-musebioassay følsomhed 40-49. Disse metoder almindeligt brug fluorescens, massespektrometri eller immunologiske metoder og tilbyde assay gange betydeligt kortere end den musebioassay uden brug af dyr. Massespektrometri tilgange kombineret med immunologisk Techniqdier blev vist til at detektere og kvantificere BoNT indeholdt i fødevarer og andre komplekse prøver, men krav personalets uddannelse og specialiseret udstyr grænse disse assays 50-55. De fleste andre alternative analyser er ikke umiddelbart anvendelig til komplekse test prøve eller mangler throughput kræves til rutinemæssig BoNT test. Den meget varierende karakter af mad prøve viskositet, pH, saltindhold, og matrixbestanddele præsenterer en særlig vanskelig udfordring, når de forsøger at udvikle in vitro assay metoder med følsomhed til at matche den ekstreme potens BoNT. Desuden selv simple og relativt godartede buffer-systemer, såsom dem, der skyldes ophvirvling af BoNT-baserede lægemidler, indeholder salt, albumin og sukker stabilisatorer (dvs. hjælpestoffer), der væsentligt påvirker in vitro BoNT potens 56.. Toxin rensning er nødvendig for afprøvning præcis aktivitet af alle, men den simpleste af prøverne 56-59.

DenBoTest Matrix assays er designet til hurtig, high-throughput, og konsekvent kvantificering af BoNT fra meget komplekse prøver ved anvendelse af udstyr, der almindeligvis findes i forskningslaboratorier 56,60. Disse analyser anvender paramagnetiske perler kovalent knyttet til serotype-specifikke anti-Bont antistoffer til at binde og udskille BoNT ud af en prøve, og derefter fjerne forstyrrende matrix forbindelser ved vask. Efter vask er bundet BoNT proteolytisk aktivitet derefter kvantificeret i en optimeret reaktion buffer ved hjælp af et reporter kompatibelt med BoNT serotype der testes. Disse reportere er fluorogene proteiner bestående af en N-terminal cyan fluorescerende protein (CFP) del og en C-terminal gult fluorescerende protein-derivat (Venus) bundet med et BoNT substrat SNAP25 resterne 141-206 eller synaptobrevin resterne 33-94, som udgør BoTest A / E eller B / D / F / G journalister, henholdsvis 45. Reporter spaltning med BoNT overvåges ved hjælp af Forster resonans energi overførsel (FRET). Når tHan Reporter er intakt, excitation af den fælles fiskeripolitik resulterer i FRET til Venus, afkølende FFP emission og spændende Venus emission. Spaltning af reporter ved BoNT forhindrer FRET, fører til en stigning i den fælles fiskeripolitik emission og fald i Venus emission. BoNT aktivitet kan derefter måles kvantitativt ved hjælp af forholdet mellem emissioner FFP og Venus. LOD under 3 pg er mulig ud fra et bredt udvalg af fødevarer under anvendelse af en high-throughput 96-brønds pladeformat 56. Forøget følsomhed kan opnås ved anvendelse af større prøvevolumener da assayet giver koncentrationen af ​​toksinet på perleoverfladen.

De BoTest Matrix assays for BoNTs A, B, E og F er udviklet og testet med fødevarer, farmaceutiske og miljøprøver 56,60. Her beskriver vi procedurerne for gennemførelsen af disse analyser til påvisning af BoNT i lav kompleksitet (f.eks farmaceutiske, BoNT i buffer) og høj kompleksitet (f.eks mad, miljømæssig) prøver. Specifikke forarbejdningsmetoderflere prøvetyper behandles i denne protokol og prøvetyper ikke er beskrevet her, kan normalt tilpasses ved hjælp af en kombination af de præsenterede metoder. Protokollen blev udviklet og testet med BoNT / A, men kan tilpasses til andre Bont serotyper ved hjælp af deres respektive analyser som påvist andetsteds 56,60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Fremstilling af analysereagenserne

  1. Tø 200x dithiothreitol (DTT), 10x Matrix Bindingsbuffer (10x Bindende herefter buffer), 10x Neutralisering buffer (fødevarer eller pH ubalancerede prøver kun) og 10x BoTest Reaktionsbuffer (10x Reaktionsbuffer herefter) ved stuetemperatur (RT) i 15 min eller indtil den er helt optøet. Se Tabel 1 for en liste over buffere og reagenser, der anvendes i denne protokol. Se tabel 2 for en liste over materialer og udstyr, der kræves for denne protokol.
  2. Vortex de optøede buffere til 5 sek for at blande. 10x Neutralisering buffer, 200xDTT og 10x Reaktionsbuffer skal være klar, mens 10x Binding buffer vil have et uklart udseende. Varm 10x Reaction buffer i 5 minutter ved 37 ° C og gentag hvirvelbehandling hvis uklar efter optøning.
  3. Generate 3.8 ml 1x Reaktionsbuffer.
    1. Mærk en 15 ml konisk rør "1x Reaktionsbuffer", og tilføj 3,42 ml molekylærbiologisk kvalitet watis, 380 pi 10x Reaction buffer, og 19 pi 200x DTT. Bland bufferen godt ved inversion.
    2. Skær en enkelt EDTA-fri proteaseinhibitor tablet fjerdedele hjælp af en ren barberblad og tilføje en fjerdedel af tabletten til 1x Reaction buffer (den resterende del tablet kan opbevares ved 4 ° C til senere brug). NB Proteaseinhibitorer kan ikke være nødvendigt, hvis anvendelse af oprenset toksin og enkle buffere (f.eks farmaceutiske prøver).
    3. Vortex 1x Reaktionsbuffer indtil protease tabletten er helt opløst.
  4. Varm matricen A perler (IP-A-perler nedenfor) i 20 minutter ved RT.
  5. Optø BoTest A / E reporter (A / E reporter nedenfor) ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
  6. Mærk en 15 ml konisk rør "0,5 uM A / E reporter", og tilføj 45 ul af 20 uM A / E reporter bestand til 1,8 ml 1x Reaktionsbuffer. Bland grundigt ved pipettering og gemme på is beskyttet mod lys.

2. Standard Curve Sample Generation

Standardkurven beskrevet her spænder 10-30,000 MLD 50 / g fødevarer eller per ml buffer i halv-log fortyndinger (Tabel 3). Slutbrugeren er gratis at bruge alternative koncentrationer så relevant.

  1. Spiking og inkubere matricer med referencemateriale. Generer standardkurven ved hjælp af et fortyndingsmiddel af samme matrix som det ukendte, hvis det er muligt, at reducere matrix effekter. Brug gelatine fosfatbuffer (GPB) eller phosphatpufret saltopløsning (PBS) som fortynder om ekstra, BoNT-negativ matrix ikke er tilgængelig (fx mark eller BoNT udbrud stikprøvekontrol). Generere standardkurven ved at tilsætte BoNT / A i matrixen af ​​valg efter den relevante protokol nedenfor.
    1. Lav kompleksitet prøver (fx PBS, GPB eller farmaceutiske)
      1. Tilsæt 10 ml af den passende buffer til en 15 ml konisk rør og afsat. Denne prøve vil blive brugt som fortyndingsmiddel til standard kurve og ukendte fortyndinger (afsnit 4).
      2. Tilsæt 1,2 ml puffer til et mikrocentrifugerør.
      3. ADVARSEL: Dette trin bruger BoNT og ekstrem forsigtighed skal udvises ved håndtering og bortskaffelse af eventuelle reagenser og materialer, der kommer i kontakt med toksin. Brug af personlige værnemidler og korrekt bortskaffelse af alle materialer skal udføres ifølge det amerikanske Department of Labor OSHA retningslinjer for BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Tilføj BoNT / A til 1,2 ml prøven, således at den endelige koncentration er 30.000 MLD 50 / ml (36.000 MLD 50 i alt).
    2. Mad prøver væske (eller andre komplekse flydende prøver) Bemærk: Det anbefales Initial test for at bestemme mængden af supernatanten genvundet fra afklarede prøver som partikler (. F.eks pulp) i flydende matricer vil variere. Denne protokol antager mindst 1,2 ml klarede supernatant vil blive inddrevet fra en 1,4 ml Sample. Øg stikprøve størrelse, hvis det er nødvendigt.
      1. Tilsæt 10 ml flydende mad til en 15 ml konisk rør og sæt den til side. Denne prøve vil blive brugt som fortyndingsmiddel til standardkurven og ukendte fortyndinger (afsnit 4).
      2. En tom 1,5 ml mikrocentrifugerør afvejes og registrere dens masse.
      3. Tilføj 1,4 ml af det flydende fødevarer til den vejede mikrocentrifugerør.
      4. Tilbagevejes mikrocentrifugerør og beregne massen af ​​tilsat madprøven ved at fratrække massen af ​​de tomme rør.
      5. ADVARSEL: Dette trin bruger BoNT og ekstrem forsigtighed skal udvises ved håndtering og bortskaffelse af eventuelle reagenser og materialer, der kommer i kontakt med toksin. Brug af personlige værnemidler og korrekt bortskaffelse af alle materialer skal udføres ifølge det amerikanske Department of Labor OSHA retningslinjer for BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Tilføj BoNT / A til 1,4 ml prøve ved en endelig koncentration på 30.000 MLD 50 / g fødevarer.
      6. Incubate fortyndingsmidlet og tilsat prøver ved stuetemperatur eller 4 ° C i 2 timer for at give BoNT tid til at interagere med fødevarer matrix efterligne en naturlig forurening.
    3. Solid mad prøver (eller andre faste prøver) Bemærk: Indledende test anbefales at bestemme mængden af supernatanten genvundet fra homogeniseret og afklaret prøver efter tilsætning af 1 ml GPB / g mad. Denne protokol antager, at mindst 1,2 ml klarede supernatant, vil blive inddrevet fra en 2 g prøve. Øg stikprøve størrelse, hvis det er nødvendigt.
      1. Afvejes 10 g fast prøve i et 50 ml konisk rør og afsat. Dette vil blive brugt som fortyndingsmiddel.
      2. 2 g fast føde prøve afvejes i et andet 50 ml konisk rør.
      3. ADVARSEL: Dette trin bruger BoNT og ekstrem forsigtighed skal udvises ved håndtering og bortskaffelse af eventuelle reagenser og materialer, der kommer i kontakt med toksin. Brug af personlige værnemidler og korrekt bortskaffelse af alt materiales skal udføres i overensstemmelse US Department of Labor OSHA retningslinjer for BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Tilføj BoNT / A til overfladen af 2 g prøve til en endelig koncentration på 30.000 MLD 50 / g fødevarer (60.000 samlede MLD 50).
      4. Inkubér fortyndingsmiddel og prøver med tilsætning ved stuetemperatur eller 4 ° C i 2 timer for at give BoNT tid til at interagere med fødevarer matrix efterligne en naturlig forurening.
  2. Prøve homogenisering og buffer justering. Den spidse standardkurve prøve og solvens genereret over efter prøvetype processen.
    1. Lav kompleksitet prøver
      1. Ingen yderligere prøve behandling er nødvendig.
    2. Flydende mad prøver (eller andre komplekse flydende prøver)
      1. Ingen prøve homogenisering er nødvendig.
      2. Tilføj 140 pi 10x Neutralisering buffer til de 1,4 ml prøve tilsat og 1 ml 10x Neutralization buffer til 10 ml fortynder prøve. Bland prøverne godt ved inversion.
      3. Delvist klarlægge begge prøver ved centrifugering i 10 min ved 6000 xg og 4. ° C. Fjern straks supernatanterne og overføre til nye rør.
    3. Solid mad prøver (eller andre faste prøver)
      1. Tilsæt 2 ml GPB (1 ml GPB / g mad) til 2 g BoNT / A-spiked fast føde prøve og 10 ml GPB til 10 g fortynder prøve.
      2. Homogeniseres prøverne ved hjælp af pistil indtil grundigt blandet. Afhængigt af arten af ​​prøven, kan der være små klumper af materiale, der ikke kan homogeniseres, hvilket er acceptabelt. Alternativt kan der anvendes mekaniske homogenise metoder. Anvendelse af en blender anbefales ikke, da det kan inaktivere samt aerosolisere toksin.
      3. Tilføj 1/10th volumen på 10x Neutralisering buffer til fortynderen stikprøve baseret på den omtrentlige totale volumen (f.eks 2 ml, hvis volumen er 20 ml). Ekstrapolereden samlede mængde af BoNT / A-prøve tilsat og tilføj 1/10th volumen 10x Neutralisering buffer. Bland prøverne godt ved inversion.
      4. Delvist klarlægge begge prøver ved centrifugering i 10 min ved 6000 xg og 4 ° C. Fjern straks supernatanterne og overføre til nye rør.
  3. Forbered Standardkurve seriefortyndinger til test
    1. Brug af BoNT / A-spiked standardkurve prøve som D1 og nonspiked prøve som fortyndingsmiddel, generere de resterende standardkurve prøver i 1,5 ml mikrocentrifugerør i henhold til tabel 3.

3. Forbered ukendte prøver

Dette afsnit kan være afsluttet i parallel til § 2..

  1. Bestem antallet og fortyndinger af ubekendte. Test ubekendte i tre eksemplarer, hvis muligt.
    1. For kvalitative analyser, køres ubekendte uden yderligere fortynding end påkrævet for at behandle prøven som beskrebed nedenfor.
    2. Ved kvantitative assays fremstilles mindst to 1:10 fortynding prøver, som beskrevet nedenfor, for at en eller flere prøver falder inden for det lineære område af assayet respons. Generer fortyndinger ved hjælp af et fortyndingsmiddel af samme matrix som det ukendte, hvis det er muligt, at reducere matrix effekter som beskrevet i afsnit 3. Ellers brug PBS eller GPB som fortyndingsmiddel.
  2. Generering og fortynde ukendte prøver efter prøvetype.
    1. Lav kompleksitet ubekendte (fx PBS, GPB eller farmaceutiske)
      1. Tilsæt mindst 750 pi ukendte til et mikrocentrifugerør at generere Ukendt fortynding 1.
      2. Tilføj 675 pi fortynder til to mikrocentrifugerør mærket Ukendt fortynding 2 og 3. Fortyndingsmidlet skal være det samme materiale, der anvendes til standardkurve generation.
      3. Serielt fortynde fortynding 1 ved at overføre 75 ul af fortynding 1 ind i fortynding 2 rør og blanding.
      4. Serielt fortynderene fortynding 2 ved at overføre 75 pi fortynding 2 ind i fortyndingen 3 rør og blanding.
    2. Flydende fødevarer ubekendte (eller andre komplekse flydende prøver) Bemærk: Det anbefales Initial test for at bestemme mængden af supernatanten genvundet fra afklarede prøver, som omtalt i afsnit 3. Øg stikprøve størrelse, hvis det er nødvendigt.
      1. Tilføj ≥ 875 ul af flydende ukendt for et mikrocentrifugerør.
      2. Tilføj 1/10th volumen 10x Neutralisering puffer til prøven (f.eks 87.5 pi for en 875 pi prøve).
      3. Nogen præcisere prøven ved centrifugering i 10 minutter ved 6.000 xg og 4 ° C. Umiddelbart overføre supernatanten til et nyt rør. Dette er ukendt fortynding 1.
      4. Tilføj 675 pi fortynder til to rør mærket Ukendt fortynding 2 og 3. Fortyndingsmidlet vil være den samme forarbejdet materiale anvendes til standardkurve generation.
      5. Serielt fortynde fortynding 1 ved overførselring 75 ul af fortynding 1 ind i fortynding 2 rør og blanding.
      6. Serielt fortynde fortynding 2 ved at overføre 75 pi fortynding 2 ind i fortyndingen 3 rør og blanding.
    3. Solid mad ubekendte (eller andre faste prøver) Bemærk: Indledende test anbefales at bestemme mængden af supernatanten genvundet fra afklarede prøver, som omtalt i afsnit 3. Øg stikprøve størrelse, hvis det er nødvendigt.
      1. Afvejes 2 g fast ukendt prøve i et 50 ml konisk rør.
      2. Tilsæt 2 ml GPB (1 ml GPB / g fødevarer) til 2 g fast prøve.
      3. Homogeniseres prøverne som beskrevet i afsnit 3.2.3.2.
      4. Tilføj 1/10th volumen på 10x Neutralisering buffer til prøven baseret på den omtrentlige samlede volumen (f.eks 0,4 ml, hvis den er 4 ml). Bland prøverne godt ved inversion.
      5. Nogen præcisere prøven ved centrifugering i 10 minutter ved 6.000 xg og 4 ° C. Immediately overførsel ≥ 750 pi supernatant til et mikrocentrifugerør. Dette er ukendt fortynding 1.
      6. Tilføj 675 ml fortynder til to rør mærket Ukendt fortynding 2 og 3. Fortyndingsmidlet vil være den samme forarbejdet materiale anvendes til standardkurve generation.
      7. Serielt fortynde fortynding 1 ved at overføre 75 ul af fortynding 1 ind i fortynding 2 rør og blanding.
      8. Serielt fortynde fortynding 2 ved at overføre 75 pi fortynding 2 ind i fortyndingen 3 rør og blanding.

4.. Slutproeve Afklaring

Hvis testning flydende eller fast føde prøver, centrifuge alle prøver i 5 minutter ved ≥ 14.000 xg i en mikrocentrifuge til fuldt ud at klarlægge prøverne. Fjern straks supernatanterne og overføre til nye rør.

5.. Opsætning Plate og BoNT / A Pull Down

  1. Den specifikke plade layout er ansøgning afhængig, men ikke bruger de udvendige brønde, såfor at undgå kantvirkninger. Hver ukendt prøve og standardkurve prøve D1-D8 kræver 3 brønde, mens prøve D9 kræver 6 brønde. En foreslået pladelayout er vist i figur 1.
  2. Der tilsættes 20 pi 10x bindingsbuffer til hver brønd, der skal anvendes.
  3. Tilsæt 200 pi af hver afklaret fortynding og ukendt for hver af tre brønde (seks brønde til D9) til tredobbelt test. Bland pladen i 10 sek på en mikroplade mixer.
  4. Tilsæt IP-A-perler.
    1. Vortex IP-A-perler til 10 sek på højeste hastighed. Fortsæt vortexing hvis perlerne ikke er fuldt resuspenderet og homogen.
    2. Pipette udtages 20 ul IP-A-perler til hver prøve godt.
    3. Bland pladen i 30 sek på en mikroplade mixer.
  5. Inkubér pladen ved hjælp af en roterende plade inkubator i 2 timer ved 750 rpm, 25 ° C eller stuetemperatur. Assay ydeevne er meget afhængig af skabe og opretholde IP-A perlesuspension i alle inkubationstrin. Altid resuspender perler med en microPsent mixer efter pelletering og opretholde suspensionen ved hjælp af en orbital mikrotiterpladeryster i alle inkubationstrin.

6.. Plate Vask og Bead Resuspension

  1. Pladerne skylles enten manuelt eller ved hjælp af en magnetisk perle-kompatibelt automatiseret pladevasker. En automatiseret pladevasker konfigureret til magnetiske perler øger assay gennemløb.
    1. Manuel vask
      1. Mærk en 50 ml konisk rør "1X vaskebuffer", og tilføj 45 ml molekylærbiologisk kvalitet vand og 5 ml 10x Matrix vaskebuffer. Bland bufferen godt ved inversion.
      2. Tag pladen ud den roterende plade rugemaskine.
      3. Straks pladen på en 96-brønds magnetisk perle skilleplade i 5 min.
      4. Mens du holder pladen på 96 brønde magnetisk perle separation plade fjernes forsigtigt og kassér supernatanterne fra prøven brønde med en enkelt eller multi-kanal pipette. Må ikke opsugesperler-visuelt overvåge aspirerede buffer i pipettespids til utilsigtet perle fjernelse. Hvis fjernelse er vidne, forsigtigt tilføje tippet indhold tilbage til brønden, reseparate og gentage fjernelse.
      5. Tilsæt 300 ul 1X vaskebuffer til hver prøve godt.
      6. Fuldt resuspendere perlerne ved at blande pladen i 30 sek på en mikroplade mixer.
      7. Inkubér pladen i 96-brønds magnetisk perle skilleplade i 2 min.
      8. Fjern og kassér supernatanterne fra prøvebrønde som før.
      9. Gentag trin 6.1.1.5-6.1.1.8 tre gange mere for i alt 4 gange.
      10. Med pladen på 96 brønde magnetisk perle separation plade, visuelt inspicere brøndene for at bekræfte selv supernatant fjernelse, brug en pipette til at fjerne overskydende resterende buffer som nødvendigt. Nogle buffer vil forblive i brøndene, og skal man være omhyggelig for at undgå perle fjernelse eller perle tørring.
      11. Tilsæt 50 ul 1x Reaktionsbuffer til hver prøve godt og bland pladen i 30 sec på en mikroplade mixer til fuldt resuspendere perlerne. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge en pipette til fuldt ud at genopslæmme perlerne.
    2. Automatiseret Plate Vask
      1. Opsætning og program i vaskemaskinen efter tabel 4. Rens og skyl i vaskemaskinen med vand af høj kvalitet (f.eks nanopure).
      2. Prime vaskemaskinen ved at køre programmet "Prime".
      3. Tag pladen ud den roterende plade rugemaskine.
      4. Straks pladen på 96-brønds separationsteknologi med magnetiske perler pladen på vaskemaskinen.
      5. Kør link program "Master Wash". Det første program trin er en 5 min inkubation trin, hvor skiven vil være stationær.
      6. Efter programmet er afsluttet, fjernes pladen fra vaskemaskinen, tilsættes 50 ul 1x Reaktionsbuffer til hver prøve godt, og bland pladen i 30 sek på en mikroplade mixer til fuldt ud at genopslæmme perlerne. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge en pipette til fuldt ud at genopslæmme perlerne.

    7.. Assay Indledning og inkubation

    1. Tilføj 50 gl 0,5 uM A / E reporter (se afsnit 1) til hver prøve og bland i 30 sekunder på en mikroplade mixer til fuldt ud at genopslæmme perlerne.
    2. Tilsæt 100 pi vand til hvert ubrugt godt på pladen for at undgå kantvirkninger.
    3. Forsegle pladen med pladen forseglingstape og inkuber pladen ved hjælp af en roterende plade inkubator ved 750 omdrejninger i minuttet, 25 ° C eller stuetemperatur. Beskyt pladen mod lys under inkubation.

    8.. Dataindsamling og analyse

    Bemærk: Denne analyse er et real-time analyse, der kan måles flere gange, indtil den ønskede følsomhed er opnået, er der ingen stop-reagenser påkrævet. Anbefalet initial læste tider er 2, 4 og 24 timers inkubationstid med analysesensitivitet stigende med inkubationstid.

    1. Dataindsamling
      1. På hver læse tid, fjernes pladen fra den roterende plade kuvøse, fjerne forseglingenning bånd, og umiddelbart placere pladen på 96-brønds separationsteknologi med magnetiske perler plade. Give perlerne skilles ad til 2 min.
      2. Pladen anbringes i mikropladelæseren og måle emissioner ved ~ 470 og ~ 526 nm under excitation ved ~ 434 nm.
      3. Hvis der ønskes yderligere læsetider, resuspendere perlerne i 30 sek på mikropladen mixer, forsegl pladen, og returnere pladen til den roterende plade inkubator.
    2. Dataanalyse
      1. Beregn forholdet emission for hver prøve ved at dividere den relative fluorescens enhed (RFU) værdi på 526 nm ved RFU værdi på 470 nm.
      2. Plot emissionsforhold versus log [BoNT / A] for standardkurven datapunkter. Afhængigt af BoNT / A potens testede vil en sigmoidal dosisresponskurve opnås (se Repræsentative resultater).
      3. Monter standardkurven data med variabel hældning dosisresponskurven Y = Bund + (top-bund) / (1 ​​+10 ^ ((logEC 50-X) * Hillslope)), hvor X er denlogaritmen til koncentrationen, Y er svaret, og Y starter ved bunden og går til toppen med en S-formet form.
      4. Bestem detektionsgrænserne (LOD), grænser for kvantificering (LOQ), og halvmaksimal effektiv koncentration (EF 50). Detektionsgrænser er defineret som en prøve med en emission forhold mindre end 3 standardafvigelser (SD) under de tomme kontroller (n = 6). Grænser for kvantificering defineres som en prøve med en emission forholdet mindre end 10 SD under de tomme kontroller (n = 6). EC50 bestemmes af sigmoidal dosisresponskurve pasform.
      5. Interpolere styrken af ​​ukendte prøver mod sigmoidal dosis-respons standardkurve.
        1. Ved kvantitative resultater bør den ukendte prøve ideelt falder inden for den lineære del af standardkurven. Tilnærme den lineære del af standardkurven ved beregningen af den samlede analysesvar vinduet 20-80% (f.eks hvis emissionen forholdet standardkurven ranges 0,5-2,5 ville det lineære område er den del af standardkurven, der spænder fra 0,9 til 2,1).
        2. For kvalitative resultater, sammenligne den ukendte prøve mod LOD og LOQ af standardkurven.
        3. Må ikke ekstrapolere ukendte prøver ud over grænserne for standardkurven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et diagram, der sammenfatter trinene, i den beskrevne protokol er vist i figur 2. Analysen kræver mellem 4-26 timer til at fuldføre, afhængigt af prøvetype og ønsket målefølsomhed, men kun ~ 2 timer af hands-on tid. Assayet udføres i 96-brønds plader, og afhængigt af den type test, der skal udføres, tillader tredobbelt test af op til 20 prøver, herunder standarder per plade.

Figur 3 viser repræsentative analyseresultater ved hjælp af BoNT / A holotoxin tilsat til PBS og testet med den beskrevne protokol efter 2, 4 og 24 timers inkubation med A / E reporter. Renset BoNT / A holotoxin blev valgt til dette eksperiment, fordi den definerede molekylvægt på ~ 150 kDa, i forhold til de mere bredt defineret 700-900 kDa for toksinet kompleks og renhed tillader meget nøjagtig spiking i præcise koncentrationer. Emission ratio forholdet mellem emission på 526 nm til, at der på 470 nm efter excitation ved 434nm, ved hvert tidspunkt afsættes mod BoNT / A-koncentration (MLD 50 værdi er baseret på BoNT / A fabrikantens potens test). Spaltning af reporteren fra BoNT måles som en reduktion i udledningen forhold, som med vores pladelæser i området mellem omkring 2,7 til intakte reporter til omkring 0,7 for den fuldt spaltede reporter. Det er vigtigt at bemærke, at da hver plade læser foranstaltninger fluorescens i RFU'er, vil den faktiske værdi af emissionen forholdet være afhængig af pladelæseren anvendes. Langvarig inkubationstid med reporter resulterer i øget reporter spaltning som set af venstregående forskydning i kurven. Datapunkterne, testet i tre eksemplarer, vise lav SD af middelværdien og følge den forventede tendens til øget emission forhold med nedsat toksin belastning. Svigt i analysen at følge denne forventede udvikling kan indikere en fejl under fortynding generation eller data plotte. Emissionsfaktorerne nøgletal for de kontroller, der ikke indeholder BoNT / A også forblive stabil During inkubation (fig. 3, indsat), hvilket indikerer mangel på specifik proteaseaktivitet.

Et eksempel på anvendelse af denne protokol til at kvantificere farmaceutiske BoNT / A prøver er vist i figur 4. En standardkurve blev genereret i PBS med oprenset BoNT / A-holotoxin og behandles parallelt med fortyndinger af lægemidlet genereret fra en enkelt 100 U hætteglas med frysetørret BOTOX rehydreret i 0,9% saltvand. (Ideelt standardkurven vil bestå af reference masser af BOTOX men et sådant materiale ikke var let tilgængelig.) Prøverne blev testet under anvendelse af den beskrevne protokol med den undtagelse, at prøverne 50 pi blev testet i duplikat uden anvendelse af 10x bindingsbuffer. Standardkurven blev afbildet som en funktion af BoNT / A koncentrationen efter 24 timers inkubation med A / E reporter. Forholdet mellem hver ukendt prøve emissionen blev derefter visualiseret ved at afsætte skæringspunktet tværs standardkurven. I dette assay linjenar del af standardkurven (analysesvar vinduet 20-80%) falder mellem en emission forholdet 2,11-1,05 og er angivet ved den punkterede kasse i figuren. Koncentrationerne af de tre ubekendte, der falder inden for dette lineære område blev derefter interpoleret fra standardkurven (figur 4, indsat). Dette eksempel viser den generelle metode, der ville blive brugt til at opdage eller kvantificere nogen ukendte prøve mod en standardkurve.

Friske tomater og 2% mælk blev udvalgt til at demonstrere protokollen ydeevne og følsomhed ved hjælp af både en fast (tomat) og flydende fødevarer (2% mælk) matrix. BoNT / A kompleks bestående af kernen holotoxin og nervegift-associerede proteiner (NAP) blev valgt til disse eksperimenter, fordi dette præparat ligner toksin produceret under en naturlig Clostridium forurening. Som vist i figur 5A, genopretning af BoNT / A, målt som spaltning af A / E reporter iagttages med both matricer. Øget inkubationstid med journalisten øger målefølsomhed, ikke resulterer i nedsat emission nøgletal for de ingen toksin kontroller (figur 5A, mellemværker), med angivelse af de observerede spaltning resulterer fra BoNT / A og ikke-specifik protease fremførsel fra maden i assay. Som med figur 3 data displays lav variabilitet og følger den forventede udvikling af nedsat reporter spaltning med nedsat toksin koncentration.

Den BoNT / A LOD, LOQ, og EC 50 for begge fødevarer på hvert tidspunkt vist er opsummeret i tabel 5.. LOD og LOQ er defineret som den laveste koncentration prøve med en emission forholdet lavere end tre og ti SD under Baggrund (prøver indeholdende ikke BoNT / A), hhv. Disse grænser er begrænset til de data testede punkter, selvom interpolation til sigmoidal dosis-respons-kurve kan anvendes til at beregne lavere teoretiske grænser. Nogle matrix-til-forventes matrix variabilitet i LOD og LOQ, som matrix effekter kan påvirke binding af toksin til perlerne og tilbagebetaling af perler under vask. Selv om det ser ud til, at der var mere toksin nyttiggørelse fra 2% mælk end tomater fra data i figur 5A, meget af denne forskel skyldes den ekstra fortynding kræves for at homogenisere tomat prøver i GPB.

Ud over at være en fødevare i fast matrix, tomater er en bemærkelsesværdig prøvetype hvor pH og ionstyrke justering opnås ved tilsætning af 10x Neutralisering buffer, er afgørende for analysen succes. 5B illustrerer assay reaktioner ved prøvning af tomater med eller uden inddragelse af 10x Neutralisering buffer. Manglende tilføje 10x Neutraliseringsmetoder buffer resulterer i dårlig inddrivelse af BoNT / A fra prøver og demonstreres ved en konstant emission forhold på tværs af alle testede BoNT / A koncentrationer. Tilsætning af 10x Neutralisering buffer, selvom rESULTATERNE i følsom påvisning af toksinet.

Uspecifikke proteaser indeholdt i komplekse matricer kan føre til falske positiver hvis den ikke behandles, da andre end BoNT proteaser kan spaltes A / E reporter. Uspecifikke proteaser kan være endogene for madprøven eller indføres ved brug af ikke-oprensede Bont præparater såsom Clostridium dyrkningssupernatanter. Grundig perle vask vil fjerne de fleste ikke-specifikke proteaser, men tilsætningen af proteaseinhibitorer til Reaktionsbufferen er kritisk Figur 6 viser specifik proteaseaktivitet findes i Clostridium Bont / A kultursupernatanter under anvendelse af en modificeret A / E reporter, BoTest KO (KO reporter. ). KO-reporter er den samme som A / E reporter med den undtagelse, at BoNT / A spaltningssted er blevet muteret, således at det ikke længere spaltes af BoNT / A. Derfor vil enhver observerede reporter spaltning skyldes uspecifik proteaseaktivitet. De høje niveauer af KO reporter cleAvage angiver kultursupernatanten indeholder et højt niveau af proteaseaktivitet, men aktivitet er effektivt negeret ved tilsætning af proteasehæmmere.

Dataene prøve demonstrere nytten af ​​protokollen til high throughput BoNT / A opdagelse i enkle buffere og fødevarematricer. Visse fødevarer kan kræve små assay justeringer, men den beskrevne protokol skulle give gode resultater med de fleste typer fødevarer.

Figur 1
Fig. 1. Foreslåede pladelayout. Prøver er begrænset til de indre 60 brønde af pladen for at undgå mulige randeffekter. Kan tilsættes ukendt eller standard kurve prøver som ønsket. Alle ubrugte brønde skal fyldes med 100 ul vand under reporter inkubation. Click her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2.. Skematisk oversigt over den beskrevne protokol. Hvert større skridt i protokollen angives med et navngivet felt og tilpasset siden til en anslået assay tidslinjen (ikke at skalere). Spiselige prøver kræver ikke prøve forarbejdning og så indtaste protokollen nedstrøms for smagsprøver. Den stiplede boks rundt seriel fortynding generation for de ubekendte indikerer dette er et valgfrit, men anbefales, trin. Klik her for at se større billede.

Figur 3
Fig. 3. Påvisning af BoNT / A holotoxin i PBS ved hjælp af den beskrevne protokol.Renset BoNT / A holotoxin blev tilsat til PBS og testet under anvendelse af den beskrevne protokol med en øvre BoNT / A koncentration på 1 nM. Alle prøver blev testet i tre eksemplarer og fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen af ​​middelværdien. Rapporteret potens er baseret på producentens muse bioassay test af toksin. Emission ratio (forholdet mellem emission på 526 nm til 470 nm ved excitation ved 434 nm) af standardkurven blev målt efter 2, 4 og 24 timers inkubation med A / E reporter og plottet som en funktion af BoNT / En koncentration . Klik her for at se større billede.

Figur 4
Figur 4.. Kvantificering af BOTOX lægemidlet ved hjælp af den beskrevne protokol. En enkelt 100 E hætteglas med frysetørret BOTOX lægemidlet var resuspe nded i 220 pi 0,9% saltvand, seriefortyndes, og testet som ukendte mod en standardkurve fremstillet i PBS ved hjælp af renset BoNT / A holotoxin. Prøver blev testet i henhold til den beskrevne protokol, bortset fra at prøverne 50 pi blev testet uden 10x bindingsbuffer i to eksemplarer. Standardkurven blev beregnet ved at anbringe emissionsforhold af standardkurven prøverne til variabel slope sigmoidal dosis-respons-ligning, og afbildes som en funktion af BoNT / A koncentration. Hver ukendt prøve er vist, hvor den skærer med standardkurven efter en 24 timers inkubation med A / E reporter. Koncentrationerne af de ukendte prøver, der falder inden for det lineære interval (stiplet skraveret kasse) blev interpoleret ud fra standardkurven. Etiketten for hver BOTOX ukendte er antallet af enheder til stede i prøven baseret på mærket potens. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af ​​middelværdien.t = "_blank"> Klik her for at se større billede.

Figur 5
Figur 5.. Inddrivelse af BoNT / A-tilsat 2% mælk og friske tomater test vha. den beskrevne protokol. Prøver af 2% mælk og friske tomater blev tilsat oprenset BoNT / Et komplekst og testet ved hjælp af den beskrevne protokol. Alle prøver blev testet i tre eksemplarer og fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien. (A) forholdet mellem mælk på 2% og friske tomater standardkurver Emissionen blev målt efter 2, 4 og 24 timers inkubation med A / E reporter og plottet som en funktion af BoNT / A potens. (B) Undladelse af at medtage 10x Neutralisering buffer under tomat prøveresultater i assay fiasko. Prøver af frisk tomat blev testet i henhold til den beskrevne protokol enten med eller uden tilsætning af 10x Neutralordning buffer. Der vises data for 4 timer tidspunkt. Klik her for at se større billede.

Figur 6
Figur 6. Proteaseinhibitorer er påkrævet, når afprøvning komplekse matricer. Clostridium BoNT / A (stamme Hall A) kultursupernatant blev seriefortyndet i PBS og testet under anvendelse af den beskrevne protokol, enten med eller uden proteasehæmmere tilsættes til reaktionsbuffer og både A / E og KO journalister. Emissionsforhold blev målt efter 24 timers inkubation med både A / E eller KO reportere og plottet som en funktion af BoNT / A potens. Betydelig spaltning af KO reporter blev set uden tilsætning af proteasehæmmere, men blev ophævet ved deres optagelse. Alle prøver blev testet i tre eksemplarer og fejlen bars repræsenterer standardafvigelsen for middelværdien. Klik her for at se større billede.

Buffer Sammensætning Opbevaringstemperatur Stabilitet Noter
10x Matrix Binding Buffer 500 mM HEPES-NaOH, pH 7,1, 250 mM NaCI, 1% Tween-20, 5% Casein, 0,05% NaN3 -20 Eller -80 ° C Stabil i mindst fem dage ved 4 ° C ved optøning Leveres med Kit BoTest Matrix A Botulinum Detection
10x Matrix vaskebuffer 119 mM phosphater, pH 7,4, 1370 mM NaCl, 27 mM KCI, 1% Tween-20 -20 Eller -80 ° C Stabil i mindst fem dage ved 4 ° C ved optøning Leveres med Kit BoTest Matrix A Botulinum Detection
10x Neutralisering Buffer 1 M HEPES-NaOH, pH 8,0, 1 M NaCl 4 ° C Stabil i op til seks måneder ved 4 ° C
10x BoTest Reaction Buffer 500 mM HEPES-NaOH, pH 7,1, 50 mM NaCl, 1% Tween-20, 100 uM ZnCl2 -20 Eller -80 ° C Stabil i mindst fem dage ved 4 ° C ved optøning Leveres med Kit BoTest Matrix A Botulinum Detection
BoTest A / E Reporter 20 pM i 50 mM HEPES-NaOH, 10 mM NaCl, 15% glycerol -80 ° C Opbevar i små portioner. Stabil i mindst fem dage ved 4 ° C ved optøning. Leveres med Kit BoTest Matrix A Botulinum Detection
Gelatine fosfatbuffer (GPB) 33,3 mM NaH 2 PO 4, pH 6,2, 2 g / L gelatine 4 ° C Stabil i op til 1 måned ved 4 ° C
200x dithiothreitol (DTT) 1 M DTT -20 ° C Stabil i op til 6 måneder ved -20 ° C Foretag og gemme lille (100 ul) portioner
1x PBS-t 11.9 mM phosphater, pH 7,4, 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 0,1% Tween-20 4 ° C Stabil i op til 1 måned ved 4 ° C Kan gøres ved hjælp 10x PBS fra Fisher (BP399-1)
Matrix A Beads (IP-A-perler) Magnetiske kugler konjugeres kovalent til kylling anti-BoNT / A-antistof i PBS. 0,1% Tween-20, 0,05% natriumazid, 0,25% casein og 50% glycerol -20 ° C Stabil i mindst fem dage ved 4 ° C efter fjernelse fra -20 ° C. IKKE nedfryses til -80 ° C

Tabel 1. Puffere er nødvendige for den beskrevne protokol. 10x NeutraliseringBuffer er kun for meget komplekse (fx fødevarer) prøver og kan ikke kræves, afhængigt af arten af de prøver, der analyseres.

Navn på Material / Udstyr Firma Catalog Number Kommentarer / Beskrivelse
BoTest Matrix A botulinumneurotoksin Detection Kit BioSentinel A1015 Kits Detection for BoNT / B og F er også tilgængelige.
Varioskan Flash fluorescens mikropladelæser Thermo-Fisher Scientific 5250040 De fleste monochromator-eller filtrer-baserede enheder med 434 nm excitation og 470 nm og 526 nm emission kapacitet kan anvendes.
96-brønds Magnetic Bead Separation Plate V & P Scientific VP771H Andre magnetiske plader, kan anvendes, men pladen skal være konstrueret til at adskille beads til siden af ​​brønden.
Magnetisk Perle-Kompatibel pladevasker BioTek ELx405 VSRM Valgfri, kun påkrævet for automatiseret plade vask. Andre magnetiske perle-kompatible pladevaskere kan også anvendes, men bør testes, før brug.
Mikrocentrifuge Forskellige N / A Valgfri, kun påkrævet for prøver behov centrifugering.
MixMate pladeblander Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Forskellige N / A Anvendes ved stuetemperatur eller ved 25 ° C, hvis temperaturen er tilgænge
EDTA-fri proteasehæmmer Tablets Roche 4693132001 Kun nødvendig til fødevarer eller miljøtest. Proteaseinhibitorer skal EDTA-fri.
BoNT / A Metabiologics N / A Valgfri, kun påkrævet med henblik standardisering og kvantificering
Sorte fladbundede 96-brønds plader NUNC 237.105 Plader bør ikke behandles
96 brønde tætningsbånd Thermo Scientific 15036

Tabel 2.. Materialer og udstyr, der kræves for den beskrevne protokol. Nogle materialer og udstyr, er valgfrie eller kan erstattes, afhængigt af udstyr til rådighed. Det kan være nødvendigt, hvis du bruger alternativ udstyr Ekstra egnethed test og optimering.

</ Tr>
Sample Name Volume Toxin Volume Diluent [BoNT / A] (MLD 50 / ml) eller (MLD 50 / g fødevarer) log [BoNT / A] (MLD 50 / ml) eller (MLD 50 / g fødevarer) D1 1.200 ul Stock N / A 30.000 4.48
D2 300 pi D1 600 pi 10.000 4.
D3 90 pi D1 810 pi 3.000 3,48
D4 90 pi D2 810 pi 1.000 3
D5 90 pi D3 810 pi 300 2,48
D6 90 pi D4 810 pi 100 2
D7 90 pi D5 810 pi 30 1,48
D8 90 pi D6 810 pi 10 1
D9 N / A 1.400 pi N / A N / A

Tabel 3:. Fortynding bord til standardkurve prøver Denne tabel genererer en standardkurve i halv-log fortyndinger over 3,5 størrelsesordener. Nok Ingen BoNT blindprøve (D9) genereres til at køre en n = 6. Kan tilføjes yderligere udvanding, hvis det ønskes.

<td> 0
Program Name Variabel Value Kommentarer
Prime Reagensflasken A
Prime Volume 400
Prime Flow Rate 7
Soak Efter Prime? N
Matrix Wash Reagensflasken A Antallet af skylninger kan øges, hvis der observeres residual protease aktivitet.
Metode
4.
Soak / Shake Y
Soak Varighed 180
Omrystes før Soak? N
Prime Efter Soak? N
Disp
Dispenseringsvolumen 300
Dispensere Flow Rate 5.
Doser Højde 130
Hor. Doser Pos. 0
Deaktiver Aspirer? Y
Bottom Wash First? N
Prime før start? N
Aspir
Aspiration Højde 40
Hor. Aspirer Pos. 0
Aspiration Rate 5.
Aspiration Delay
På tværs Aspirer? N
Sidste aspiration? Y
Sidste aspiration Delay 0
Matrix Soak Soak Varighed 300 Øget iblødsætningstid kan øge perle opsving fra mere tyktflydende fødevarer.
Omrystes før Soak? N
Master Wash Matrix Soak Dette er en 'Link' program til at køre Matrix Soak og Matrix Vaskeprogrammer sammen.
Matrix Wash

Tabel 4. Magnetisk perle-kompatible automatiseret pladevasker programmets indstillinger. Følgende programmer antage, at pladevasker er udstyret med en magnet, der trækker perler på siden af brøndene, og at bufferen skifte modulet er sat op således, at 1x vaskebuffer ( PBS-t) er fastgjort til ventilen A. Disse programmer er specifikke for BioTek ELx405. Henvises til instrumentets manual for programmeringsinstruktioner. Andre magnetisk perle-kompatible automatisk pladevaskere eller vakuumgrenrør kan bruges, men vil teste være forpligtet til at definere indstillinger, der maksimerer vaskeeffektivitet og minimere tab af perler under vask. Det anbefales første afprøvning af perle genopretning efter vask, uanset det specifikke pladevasker anvendes.

<td> LOD
Food Matrix Metric 2 timer 4 timer 24 hr
MLD 50 / g mad MLD 50 / brønd MLD 50 / g mad MLD 50 / brønd MLD 50 / g mad MLD 50 / brønd
Mælk 300 58 100 19 30 6
LOQ 1.000 193 300 58 100 19
EC 50 2.404 464 590 114 92 18
Friske tomater LOD 1.000 91 300 27 30 3
LOQ 1.000 91 1.000 91 100 9
EC 50 7.561 687 1.932 176 229 21

Tabel 5. Detektionsgrænser (LOD), grænser for (LOQ), og halv-maximal effektiv koncentration (EC50) for mælk, 2% og frisk tomat test er vist i figur 2A. EC50 er afledt af sigmoidale dosis-respons-kurve i form, mens detektionsgrænsen og LOQ er defineret som den laveste koncentration datapunkt, der falder enten 3 eller 10 standardafvigelser under ingen Bont kontroller (n = 6), hhv. Dataene præsenteres i både MLD 50 / g mad og de ​​samlede MLD 50 testede brønd i målevoluminet 200 ul sek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver procedurer for kvantificering BoNT / A komplekse, holotoksin eller Clostridium dyrkningssupernatant i komplekse matricer. Protokollen er den samme, men når afprøvning andre BoNT serotyper (f.eks BoNT / B, E og F) med deres respektive Matrix analyser 56,60, selvom målefølsomhed vil variere på tværs af serotyper og analyser. Denne protokol tager ikke højde for hver type prøve muligt, og nogle ændringer kan være påkrævet afhængigt af den specifikke prøve sammensætning og ønskede program. Matricer kan omfatte mad prøver (f.eks provokationsprøvning mad) eller farmaceutisk hjælpestof buffere (f.eks BoNT-baserede lægemidlet afprøvning). Bør behandles kompleks spiselige (fx animalsk væv eller miljømæssige) flydende og faste prøver som fødevarer prøver. Denne protokol bruger 200 ul / brønd prøvevolumener men så lidt som 50 ul / brønd kan testes med en tilsvarende regulering i mængden af ​​10x binding eng puffer. Prøver mindre end 50 pi skal fortyndes med GPB eller PBS til ≥ 50 ul før afprøvning.

Den meget varierende karakter af fødevarer udgør en særlig udfordring for BoNT påvisning og kvantificering i fødevarer. Sample pH, viskositet, ionstyrke og tilstedeværelsen af partikler kan alle potentielt påvirke aktiviteten af toksinet inden maden matrix og nødvendiggøre, at toksin isoleres fra mad til præcise, in vitro-kvantificering. Mange fødevarer eller toksin præparater indeholder også endogene proteaser, som skal fjernes eller inaktiveres ved anvendelse af protein-baserede reportere til at sikre, at kun BoNT-specifik protease aktivitet måles. Selv simple, veldefinerede buffer matricer, såsom farmaceutiske excipiens buffere kan indeholde forbindelser, der interfererer med BoNT aktivitet, der skal fjernes før kvantificering 35,56-59,61. Immunfældning tilbyder en hurtig, meget serotype-specifikke BoNT purifikation metode, men kræver højaffinitetsantistoffer at isolere de lave toksin fundne koncentrationer i "den virkelige verden" fødevarer, miljø og farmaceutiske prøver.

Den beskrevne protokol renser toksin ved hjælp af paramagnetiske perler overtrukket med anti-BoNT / A-antistoffer rettet mod toksin-tung kæde-receptor domæne af BoNT / A core holotoxin 56. Arter af Clostridium imidlertid naturligt producerer toksin-komplekser, der består af kernen holotoxin i forbindelse med nationale handlingsplaner 62-64. De NAP beskytte toksinet fra protease angreb i mave-tarmkanalen og menes at lette toksin transport over tarmen epitel 63,65. De nationale handlingsplaner hæmmer binding af IP-A perle anti-BoNT / A antistoffer til kernen holotoksin (data ikke vist). Denne hæmning er lettet ved at øge prøven pH til over ~ 6.25, forårsager BoNT / Et komplekst til at dissociere i holotoxin og nationale handlingsplaner, og at sikre en effektiv toksinbinding til IP-A perler 66. Af denne grund, justere prøvens pH til over 6,5 er kritisk for succesen af assayet (figur 5B). 10x bindingsbuffer anvendt i protokollen indeholder et buffermiddel for at hæve pH til standard assaybetingelser. Dog kan mange sure fødevarer overvælde bufferkapacitet bindingsbuffer. Den yderligere 10x Neutralisering buffer øger prøven bufferkapacitet og bør neutralisere de fleste af fødevarematricer.

En anden vigtig parameter for assayet er prøven ionstyrke. Præcisering af prøver ved centrifugering er nødvendig for effektiv perle vask og genvinding efter immunopræcipitering. Test med friske tomater vist, at ingen BoNT / A recovery blev set, da prøverne blev simpelthen behandlet og centrifugeres. Vi antager, at BoNT / A kan associere med tomat kødet får det til at bundfælde under centrifugering og bliver fraværende fratestet supernatant. Vi fandt, at forøge ionstyrken, eller mere væsentligt, at neutralisere pH begrænsede interaktioner mellem BoNT og matrixen resulterer i forbedret toksin gendannelse (figur 5B). Selvom det ikke er påkrævet for BoNT opsving, forventes det, men ikke påvist, at højere saltkoncentrationer også vil øge stringensen af ​​immunfældning og resultere i mindre specifikt protein recovery, især i lave salt fødevarer.

Prøve pH og ionstyrke justering i protokollen udføres ved tilsætning af 10x Neutralisering puffer og bør være kompatibel med en lang række fødevarer. Mens 10x Neutralisering buffer har en høj bufferkapacitet, kan nogle meget sure fødevarer kræver yderligere justering af pH. Anbefales Test af prøven pH efter buffer tilføjelse, hvis der observeres dårlig assay ydeevne og prøvevolumen tillader. Yderligere justering af pH kan opnås ved tilsætning af rmall mængder af 1 M HEPES pH 8, hvis det kræves. Den ekstra NaCl blev indført med 10x Neutralisering buffer bør være acceptabelt for alle, men saltiest fødevarer, men kan 10x Neutralisering buffer blive erstattet med 1 M HEPES pH 8, hvis dårlige resultater er set med en given fødevare. Ingen signifikante forskelle er blevet observeret, når du tester den beskrevne protokol ved NaCl-koncentrationer op til 1,2 M i PBS.

Mens denne protokol er gældende for størstedelen af ​​prøverne, må fødevarer ved de ekstreme pH, ionstyrke og / eller protease-indhold ikke give gode resultater med analysen. Nogle fødevarer kan også være for tyktflydende efter tilsætning af GPB, hvilket resulterer i dårlig perle opsving. Forfortynding af prøver med en simpel buffer, såsom PBS kan forbedre resultaterne. Forøgelse af antallet af vaske eller vaske stringens (ved at øge NaCl koncentration) og øge koncentrationen af ​​EDTA-fri proteasehæmmere kan også forbedre resultater, hvis uspecifik protease forurenedeion overholdes. Instrument renlighed er også meget vigtigt, når du bruger den automatiske plade vask. Forurening af VVS og indsprøjtningsdyserne med proteaser (fx trypsin) fra andre laboratorieanalyser kan føre til utilsigtet tilførsel af proteaser under assayet. Grundig rengøring af pladevasker henhold til producentens brugervejledning anbefales, før du kører testen.

De BoTest Matrix assays er de første kommercialiseret, aktivitets-baserede assays til BoNT påvisning og kvantificering i komplekse matricer. Sammenlignet med standard musebioassay, analysen er hurtig, billigere, og giver high-throughput test uden behov for specialiserede faciliteter eller etiske betænkeligheder vedrørende brug af dyr 56. Er blevet beskrevet andre in vitro Bont påvisningsmetoder, men har ikke vist sig at være kompatible med komplekse prøvematricer kræver specialudstyr, eller ikke er kommercielt tilgængle 35,42-44,46-55. Analyserne er også aktivitets-baserede assays, der måler toksin endoprotease aktivitet, hvorimod den traditionelle enzym-linked immunosorbant assay (ELISA) teknikker kun rapportere toksin masse. Aktivitet-baserede ELISA-assays blev tidligere beskrevet, men disse analyser blev ikke påvist at arbejde med fødevarematricer og omfatter ikke rensning af toksin fra prøvematrixen 41. Betydelig undervurdering af toksiciteten af komplekse prøver kan forekomme, hvis toksin ikke renses fra prøven, da matrix-forbindelser ofte forstyrre BoNT aktivitet 35,56-59.

Når protokollen er styr på den, kan der foretages ændringer for at øge prøvevolumener og øge prøve følsomhed. For eksempel kan bindingen af toksinet til perlerne udføres i større, bulk prøver (fx 10 ml eller mere), før indsamling ved centrifugering. Disse perler kan derefter tilsættes til en plade med 96 brønde og analyseres efter beskrived protokol. Stigninger i følsomhed større end en log er blevet observeret med øget prøve str. 56. Således kan den beskrevne protokol anvendes med større volumen prøver for at påvise endog spormængder af BoNT indeholdt i prøver, som kan blive opdaget ved musebioassay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin og toilet Tucker er ansatte eller ejere af BioSentinel Inc. BioSentinel øjeblikket fremstiller og har kommercialiseret nogle af de reagenser, der præsenteres i denne rapport.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke H. Olivares og D. Ruge for værdifulde diskussioner og rådgivning. Denne forskning blev støttet delvist af en NSF SBIR Award (IIP-1.127.245 til BioSentinel Inc.) og en Department of Defense kontrakt (W81XWH-07-2-0045 til BioSentinel Inc.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A Metabiologics Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Fisher Scientific 15036

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
  2. Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
  3. Montal, M. Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu. Rev. Biochem. 79, 591-617 (2010).
  4. Lacy, D. B., Stevens, R. C. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins. J. Mol. Biol. 291, 1091-1104 (1999).
  5. Montecucco, C., Schiavo, G. Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins. Q. Rev. Biophys. 28, 423-472 (1995).
  6. Ahnert-Hilger, G., Munster-Wandowski, A., Holtje, M. Synaptic vesicle proteins: targets and routes for botulinum neurotoxins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 159-177 (2013).
  7. Yamasaki, S., et al. Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinal neurotoxins and tetanus toxin. J. Biol. Chem. 269, 12764-12772 (1994).
  8. Schiavo, G., et al. Identification of the nerve terminal targets of botulinum neurotoxin serotypes A, D, and E. J. Biol. Chem. 268, 23784-23787 (1993).
  9. Schiavo, G., et al. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature. 359, 832-835 (1992).
  10. Schiavo, G., et al. Botulinum G neurotoxin cleaves VAMP/synaptobrevin at a single Ala-Ala peptide bond. J. Biol. Chem. 269, 20213-20216 (1994).
  11. Rossetto, O., et al. SNARE motif and neurotoxins. Nature. 372, 415-416 (1994).
  12. Montecucco, C., Schiavo, G. Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Mol. Microbiol. 13, 1-8 (1994).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  14. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin C1 blocks neurotransmitter release by means of cleaving HPC-1/syntaxin. EMBO J. 12, 4821-4828 (1993).
  15. Cherington, M. Clinical spectrum of botulism. Muscle Nerve. 21, 701-710 (1998).
  16. Lindstrom, M., Korkeala, H. Laboratory diagnostics of botulism. Clin. Microbiol. Rev. 19, 298-314 (2006).
  17. Werner, S. B., Passaro, D., McGee, J., Schechter, R., Vugia, D. J. Wound botulism in California, 1951-1998: recent epidemic in heroin injectors. Clin. Infect. Dis. 31, 1018-1024 (2000).
  18. Passaro, D. J., Werner, S. B., McGee, J., MacKenzie, W. R., Vugia, D. J. Wound botulism associated with black tar heroin among injecting drug users. J. Am. Med. Assoc. 279, 859-863 (1998).
  19. Brook, I. Infant botulism. J. Perinatol. 27, 175-180 (2007).
  20. Arnon, S. S. Honey, infant botulism and the sudden infant death syndrome. West J. Med. 132, 58-59 (1980).
  21. Arnon, S. S. Infant botulism. Annu. Rev. Med. 31, 541-560 (1980).
  22. Peck, M. W., Stringer, S. C., Carter, A. T. Clostridium botulinum in the post-genomic era. Food Microbiol. 28, 183-191 (2011).
  23. Sharma, S. K., Whiting, R. C. Methods for detection of Clostridium botulinum toxin in foods. J. Food Prot. 68, 1256-1263 (2005).
  24. Sobel, J. Botulism. Clin. Infect. Dis. 41, 1167-1173 (2005).
  25. Chen, S. Clinical uses of botulinum neurotoxins: current indications, limitations and future developments. Toxins. 4, 913-939 (2012).
  26. Sinha, D., Karri, K., Arunkalaivanan, A. S. Applications of Botulinum toxin in urogynaecology. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 133, 4-11 (2007).
  27. Dmochowski, R., Sand, P. K. Botulinum toxin A in the overactive bladder: current status and future directions. BJU Int. 99, 247-262 (2007).
  28. Benecke, R., Dressler, D. Botulinum toxin treatment of axial and cervical dystonia. Disabil. Rehabil. 29, 1769-1777 (2007).
  29. Hunt, T., Clarke, K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin. Neuropharmacol. 32, 28-31 (2009).
  30. Marchetti, A., et al. Retrospective evaluation of the dose of Dysport and BOTOX in the management of cervical dystonia and blepharospasm the REAL DOSE study. Mov. Disord. 20, 937-944 (2005).
  31. Wohlfarth, K., Sycha, T., Ranoux, D., Naver, H., Caird, D. Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment. 25, 1573-1584 (2009).
  32. AOAC International, Clostridium botulinum and its toxins in foods (method 977.26 section 17.7.01). , (2001).
  33. Schantz, E. J., Kautter, D. A. Microbiological methods: standardized assay for Clostridium botulinum toxins. J. AOAC. 61, 96-99 (1978).
  34. Ferreira, J. L. Comparison of amplified ELISA and mouse bioassay procedures for determination of botulinal toxins A, B, E, and F. J. AOAC. Int. 84, 85-88 (2001).
  35. Directive 2003/15/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Union. , (2003).
  36. Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM Scientific Workshop on Alternative Methods to Refine, Reduce or Replace the Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing. Report No. 08-6416, NIH. , (2008).
  37. Bitz, S. The botulinum neurotoxin LD50 test - problems and solutions. ALTEX. 27, 114-116 (2010).
  38. Balls, M. Replacing the animal testing of botulinum toxin: time to smooth out the wrinkles. Altern. Lab. Anim. 38, 1-2 (2010).
  39. Balls, M. Botulinum toxin testing in animals: the questions remain unanswered. Altern. Lab. Anim. 31, 611-615 (2003).
  40. Singh, A. K., Stanker, L. H., Sharma, S. K. Botulinum neurotoxin: where are we with detection technologies. Crit. Rev. Microbiol. 39, 43-56 (2013).
  41. Liu, Y. Y., Rigsby, P., Sesardic, D., Marks, J. D., Jones, R. G. A functional dual-coated (FDC) microtiter plate method to replace the botulinum toxin LD50 test. Anal. Biochem. 425, 28-35 (2012).
  42. Ouimet, T., Duquesnoy, S., Poras, H., Fournie-Zaluski, M. C., Roques, B. P. Comparison of Fluorigenic Peptide Substrates PL50, SNAPtide, and BoTest A/E for BoNT/A Detection and Quantification: Exosite Binding Confers High-Assay Sensitivity. J. Biomol. Screen. , (2013).
  43. Scotcher, M. C., Cheng, L. W., Stanker, L. H. Detection of botulinum neurotoxin serotype B at sub mouse LD(50) levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk. PLoS One. 5, (2010).
  44. Mason, J. T., Xu, L., Sheng, Z. M., O'Leary, T. J. A liposome-PCR assay for the ultrasensitive detection of biological toxins. Nat. Biotechnol. 24, 555-557 (2006).
  45. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Anal. Biochem. 411, 200-209 (2011).
  46. Hines, H. B., et al. Use of a recombinant fluorescent substrate with cleavage sites for all botulinum neurotoxins in high-throughput screening of natural product extracts for inhibitors of serotypes A, B, and E. Appl. Environ. Microbiol. 74, 653-659 (2008).
  47. Gilmore, M. A., et al. Depolarization after resonance energy transfer (DARET): a sensitive fluorescence-based assay for botulinum neurotoxin protease activity. Anal. Biochem. 413, 36-42 (2011).
  48. Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
  49. Bagramyan, K., Barash, J. R., Arnon, S. S., Kalkum, M. Attomolar detection of botulinum toxin type A in complex biological matrices. PLoS One. 3, (2008).
  50. Wang, D., Baudys, J., Kalb, S. R., Barr, J. R. Improved detection of botulinum neurotoxin type A in stool by mass spectrometry. Anal. Biochem. 412, 67-73 (2011).
  51. Parks, B. A., et al. Quantification of botulinum neurotoxin serotypes A and B from serum using mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 9047-9053 (2011).
  52. Kalb, S. R., Goodnough, M. C., Malizio, C. J., Pirkle, J. L., Barr, J. R. Detection of botulinum neurotoxin A in a spiked milk sample with subtype identification through toxin proteomics. Anal. Chem. 77, 6140-6146 (2005).
  53. Kalb, S. R., et al. The use of Endopep-MS for the detection of botulinum toxins A, B, E, and F in serum and stool samples. Anal. Biochem. 351, 84-92 (2006).
  54. Boyer, A. E., et al. From the mouse to the mass spectrometer: detection and differentiation of the endoproteinase activities of botulinum neurotoxins A-G by mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 3916-3924 (2005).
  55. Barr, J. R., et al. Botulinum neurotoxin detection and differentiation by mass spectrometry. Emerg. Infect. Dis. 11, 1578-1583 (2005).
  56. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7687-7697 (2012).
  57. Jones, R. G., Ochiai, M., Liu, Y., Ekong, T., Sesardic, D. Development of improved SNAP25 endopeptidase immuno-assays for botulinum type A and E toxins. J. Immunol. Methods. 329, 92-101 (2008).
  58. Ekong, T. A., Feavers, I. M., Sesardic, D. Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology. 143 (pt 10), 3337-3347 (1997).
  59. Shone, C. C., Roberts, A. K. Peptide substrate specificity and properties of the zinc-endopeptidase activity of botulinum type B neurotoxin. Eur. J. Biochem. 225, 263-270 (1994).
  60. Piazza, T. M., et al. In vitro detection and quantification of botulinum neurotoxin type e activity in avian blood. Appl. Environ. Microbiol. 77, 7815-7822 (2011).
  61. Mizanur, R. M., Gorbet, J., Swaminathan, S., Ahmed, S. A. Inhibition of catalytic activities of botulinum neurotoxin light chains of serotypes A, B and E by acetate, sulfate and calcium. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 3, 313-321 (2012).
  62. Sugii, S., Sakaguchi, G. Molecular construction of Clostridium botulinum type A toxins. Infect. Immun. 12, 1262-1270 (1975).
  63. Sharma, S. K., Ramzan, M. A., Singh, B. R. Separation of the components of type A botulinum neurotoxin complex by electrophoresis. Toxicon. 41, 321-331 (2003).
  64. Bryant, A. M., Davis, J., Cai, S., Singh, B. R. Molecular composition and extinction coefficient of native botulinum neurotoxin complex produced by Clostridium botulinum hall A strain. Protein. J. 32, 106-117 (2013).
  65. Kukreja, R. V., Singh, B. R. Comparative role of neurotoxin-associated proteins in the structural stability and endopeptidase activity of botulinum neurotoxin complex types A and E. 46, 14316-14324 (2007).
  66. Eisele, K. H., Fink, K., Vey, M., Taylor, H. V. Studies on the dissociation of botulinum neurotoxin type A complexes. Toxicon. 57, 555-565 (2011).

Tags

Neurovidenskab botulinum mad testning afsløring kvantificering komplekse matricer BoTest Matrix Clostridium potens test
Isolering og kvantificering af botulinumneurotoksin Fra komplekse matricer Brug af BoTest Matrix Analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunning, F. M., Piazza, T. M.,… More

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter