Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

בידוד וכימות של טוקסין עצבי ממטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest

doi: 10.3791/51170 Published: March 3, 2014

Summary

מבחני זיהוי עצבי וטולינום BoTest מטריקס (ונט) במהירות לטהר ולכמת ונט מתוך מגוון רחב של מטריצות מדגם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיתור והכימות של ונט ממטריצות הן מוצקות ונוזליות ולהפגין assay עם בוטוקס, עגבניות, וחלב.

Abstract

איתור וכימות של עצבי טוקסין (בונט) מטריצות מורכבות מדויקים הנדרש עבור תרופות, סביבתיות, ובדיקת מדגם מזון. בדיקה המהירה בונט של מוצרי מזון נחוצה במהלך זיהוי פלילי פרוץ, אבחון מטופל, ובדיקות בטיחות מזון תוך נדרשת בדיקות עוצמה מדויקות לייצור מוצרים מבוססי תרופה בונט ובטיחות מטופל. מבדק העכבר בשימוש נרחב לבדיקת ונט הוא רגיש מאוד אך חסר הדיוק ותפוקה הנדרש לבדיקה בונט מהירה ושגרתית. יתר על כן, השימוש של המבדק של בעלי חיים הביא לשיחות על ידי הרשויות הרגולטוריות מוצר תרופה ותומכי זכויות בעלי החיים בארצות הברית ובעולם כדי להחליף את מבדק העכבר לבדיקה בונט. כמה מבחני חוץ גופיית החלפה פותחו שפועלים היטב עם ונט מטוהרת במאגרים פשוט, אבל רובם לא הוכחו כרלוונטי לבדיקה במטריצות מורכבות ביותר. כאן, פרוטוקול לזיהוי שלונט במטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest מוצגת. Assay מורכב משלושה חלקים: החלק הראשון כולל הכנת הדגימות לבדיקה, החלק השני הוא צעד immunoprecipitation באמצעות חרוזים פאראמגנטיים מצופה נוגדן אנטי ונט לטהר ונט מהמטריצה, ואת החלק השלישי מכמת מפרקי החלבונים של ונט המבודדת פעילות באמצעות כתב fluorogenic. הפרוטוקול כתוב לבדיקת תפוקה גבוהה בצלחות 96 היטב באמצעות מטריצות הן נוזליים ומוצקות ודורש כ 2 שעות של הכנה ידנית עם פעמים assay כוללת של 4-26 שעות, תלוי בסוג המדגם, עומס רעלן, ורגישות רצויה. הנתונים מוצגים עבור ונט בדיקות / עם פוספט שנאגרו מלוח, מוצר תרופה, supernatant התרבות, חלב 2%, ועגבניות טריות וכוללים דיון בפרמטרים קריטיים להצלחת assay.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

neurotoxins טוקסין (BoNTs) הם החומרים הקטלניים ידועים, עם מינונים קטלניים אנושיים תוך ורידי מוערכים ב 1-3 ננוגרם / ק"ג 1,2. שבעה קפסיד דומים מבחינה מבנית של ונט, שכותרתו דרך G, קיימים, כל אחת בהיקף של תחום שרשרת כבד אחראי על תא מחייב, ספיגה, וטרנסלוקציה לתוך cytosol ושרשרת אור שמקודד endopeptidase אבץ 3-5. הרעילות המעודנת של ונט נובעת מ, בין שאר, את כניסתה הספציפית מחייבת ולתוך הנוירונים מוטוריים בצומת neuromuscular 6. פעם בתוך תא העצב, endopeptidase שרשרת אור במיוחד דבק אחד או יותר של N-ethylmaleimide רגיש קולטן מסיס החלבון מצורף גורם (המוקשת) החלבונים דרושים לאיחוי שלפוחית, עיכוב שחרור הנוירוטרנסמיטר ומוביל לשיתוק רפה 7-14. ידוע בכינויו מחלת "בוטוליזם", שיתוק של שרירי סרעפת וצלעי בסופו של דבר התוצאות בונטכשל נשימתי ומוות, אלא אם כן אבחון וטיפול מוקדמים שקיבלו.

בוטוליזם במזון אדם מזוהה לרוב עם ונט קפסיד A, B, E ו-F (בונט /, ונט / B, וכו ') ובדרך כלל תוצאה של הבליעה של מזון מזוהם 15,16, אם כי, כמה מקרים של בוטוליזם פצע דווחו בקרב משתמשים בסמים תוך ורידי 17,18. בארצות הברית, בוטוליזם התינוק כתוצאה מהבליעה של נבגי Clostridium על ידי ילדים מתחת לגיל השנה הוא הצורה הנפוצה ביותר של בוטוליזם 19-21. עם זאת, התפרצויות ונט במזון כתוצאה משימורים הביתה פסולים ועיבוד מזון דווחו הן בארצות הברית והן בחו"ל. בין 2000-2009, לפחות 338 מקרים של בוטוליזם במזון דווחו ברחבי העולם ובם שישה הרוגים 22. היכולת במהירות וברגישות כדי לזהות התפרצויות של בוטוליזם במזון היא אינדיקציה קריטית שיכול לסייע לאבחון מוקדם 23,24. יתר על כן, שיטות זיהוי המאפשרות יעיל וחסכוני ובדיקת מזון שגרתית יובילו לביטחון תזונתי משופר.

הספציפיות עצביות של ונט ומחצית חיים ביולוגיים ארוכים גם עושה את זה טיפולי רב עוצמה. בארצות הברית, תרופות המבוססות על ונט אושרו על ידי מנהל המזון והתרופות אמריקניות לטיפול בבעיות קוסמטיות והפרעות הקשורות לתוקפת כולל קווי glabellar, דיסטוניה צוואר הרחם, מיגרנה, פעילות יתר של שלפוחית, ופזילה. יישומים "מותווים" רבים מתועדים, כוללים טיפולים במינון גבוה לתפקוד שרירים חמור 25-28. כימות הרעלן מדויקת היא קריטית למינון נכון, כמו underdosing עשויה להוביל לטיפול לא יעיל ואילו מינון היתר מעמיד אותם בסיכון לתופעות לוואי שעלול להזיק לחולים. למרבה הצער, אין פרוטוקול assay העוצמה סטנדרטי משותף בין יצרנים, וכתוצאה מכך אי שוויון הגדרת יחידה בין produ תרופה מבוססת ונטCTS 29-31.

הבדיקה סטנדרטית לונט היא מבדק העכבר שבי דגימות ונט המכילה מוזרקות intraperitoneally לעכברים ואת מספר מקרי המוות שנרשם על 1-7 ימים 16,32,33. מבדק העכבר רגיש מאוד עם מגבלות של זיהוי (לוד) של 5-10 pg ונט / 34, עם זאת, חששות אתיים על שימוש בבעלי חיים, את העלות הגבוהה של אנשי הדרכה ותחזוקה של מתקנים לבעלי חיים, פעמים assay ארוכות, וחוסר פרוטוקולים סטנדרטיים הביאו לשיחות לפיתוח, בדיקה סטנדרטית ללא בעלי חיים בונט ושיטות כימות 35-39. לאחרונה, במספר שיטות כימות ונט החלופית פותחו המציעים עכבר או רגישות מבדק ליד העכבר 40-49. שיטות אלו נפוצות שימוש בקרינה, ספקטרומטר מסה, או שיטות החיסוניות ומציעות פעמים assay קצרות משמעותי ממבדק העכבר ללא שימוש בבעלי חיים. ספקטרומטר מסת גישות בשילוב עם techniq החיסוניUES הוצג כדי לזהות ולכמת ונט הכלולות מזון ודגימות מורכבות אחרות, עם זאת, דרישות הכשרת כוח אדם ומגבלת ציוד מיוחד מבחני אלה 50-55. רוב מבחני חלופיים האחרים אינם בקלות החלים על בדיקת מדגם מורכבת או חוסר התפוקה הנדרשת לבדיקה שגרתית בונט. הטבע משתנה מאוד של צמיגות מדגם מזון, pH, תוכן מלח, ומרכיבים מטריצה ​​מציג אתגר קשה במיוחד כאשר מנסה לפתח שיטות assay במבחנה עם רגישות כדי להתאים את העוצמה הקיצונית של ונט. יתר על כן, אפילו מערכות חיץ פשוטות וסבירות יחסית, כגון אלה הנובעים מresuspension של מוצרים תרופתיים המבוססים על ונט, מכילות מלח, אלבומין, וסוכר מייצבים (כלומר חומרים בלתי פעיל) המשפיעים באופן משמעותי במבחנה ונט עוצמה 56. טיהור רעלן נדרש לבדיקת פעילות מדויקת של כל אבל הפשוט ביותר של דגימות 56-59.

BoTest מבחני מטריקס תוכננו לתפוקה גבוהה מהירה, וכימות עקבי של ונט מדגימות מורכבות ביותר באמצעות ציוד נמצאות בדרך כלל במעבדות מחקר 56,60. מבחני אלה משתמשים בחרוזי פאראמגנטיים קוולנטית קשורים לנוגדנים נגד ונט סרוטיפ ספציפי להיקשר ולעקל ונט מתוך מדגם ולאחר מכן להסיר מפריע תרכובות מטריצה ​​על ידי שטיפה. בעקבות שטיפה, פעילות פרוטאוליטי ונט מאוגדת אז לכמת במאגר תגובה מותאמת באמצעות כתב תואם נבדק סרוטיפ ונט. כתבים אלה הם חלבוני fluorogenic המורכב מחלבון ציאן N-מסוף ניאון מחצית (CFP) ונגזר בטרמינל C-צהובה ניאון חלבון מחצית (ונוס) מקושר על ידי מצע ונט, שאריות SNAP25 141-206 או שאריות synaptobrevin 33-94 מהווים / D / עיתונאים / E או B BoTest F / G, בהתאמה 45. מחשוף כתב ידי ונט מנוטר באמצעות העברת אנרגיית התהודה פורסטר (סריג). כאשר tהוא הכתב לא נפגע, עירור של CFP תוצאות בסריג לוונוס, מרווה פליטת CFP ופליטת ונוס מרגשת. מחשוף של הכתב ידי ונט מונע סריג, מה שמוביל לעלייה בפליטת CFP וירידה בפליטת ונוס. הפעילות בונט ואז ניתן למדידת כמותית באמצעות היחס בין פליטת CFP ונוגה. לוד להלן 3 pg אפשרית ממגוון רחב של מזונות באמצעות תבנית צלחת 96 היטב תפוקה גבוהה 56. ניתן להשיג רגישות מוגברת באמצעות כרכי מדגם גדולים יותר מאז assay מאפשר ריכוז של רעלן על פני השטח חרוז.

מבחני מטריקס BoTest לBoNTs A, B, E, ו-F פותחו ונבדקו עם מזון, תרופות, ודגימות סביבתיות 56,60. כאן, אנו מתארים הליכים לביצוע מבחני אלה לצורך זיהוי של ונט במורכבות נמוכה (למשל תרופות, ונט בחיץ) ומורכבות גבוהה (לדוגמא: מזון, איכות סביבה) דגימות. שיטות עיבוד ספציפיותבמשך כמה סוגי מדגם מטופלים בפרוטוקול זה וסוגי המדגם אינו מתוארים כאן בדרך כלל ניתן להתאים באמצעות שילוב של השיטות שהוצגו. הפרוטוקול שפותח ונבדק בונט / אבל להתאמה זנים אל ונט אחרות באמצעות מבחני שלהם כפי שמודגם במקומות אחרים 56,60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת ריאגנטים Assay

  1. dithiothreitol 200x הפשרה (DTT), מאגר עקידת 10x מטריקס (10x להלן חיץ עקידה), חיץ 10x נטרול (דגימות לא מאוזנות מזון או pH בלבד), וחיץ 10x תגובת BoTest (להלן 10x תגובה חיץ) בטמפרטורת חדר (RT) ל15 דקות או עד מופשר לחלוטין. ראה לוח 1 לרשימה של מאגרים וחומרים כימיים המשמשים בפרוטוקול זה. ראה טבלה 2 לרשימת החומרים והציוד הדרוש לפרוטוקול זה.
  2. מערבולת במאגרים מופשרים במשך 5 שניות כדי לערבב. 10x נטרול חיץ, 200xDTT, וחיץ 10x תגובה אמור להופיע ברורים תוך חיץ עקידת 10x יהיה מראה מעונן. לחמם את חיץ תגובת 10x למשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס וחזור vortexing אם הוא מופיע מעונן הבא הפשרה.
  3. צור 3.8 מיליליטר של חיץ 1x תגובה.
    1. תווית "חיץ 1x תגובה" 15 מיליליטר חרוטי צינור ולהוסיף 3.42 מיליליטר ואט כיתה ביולוגיה מולקולריתאה, 380 μl חיץ 10x תגובה, ו19 μl 200x DTT. מערבבים חיץ היטב על ידי היפוך.
    2. מעכבים לחתוך לוח מעכבי פרוטאז בודד ללא EDTA ברבעונים באמצעות סכין גילוח נקי ולהוסיף רבע מהלוח למאגר 1x התגובה (חלק הלוח שנותר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר). פרוטאז נ.ב. אולי לא להיות נחוץ אם באמצעות רעל מטוהר ומאגרים פשוטים (למשל דגימות תרופות).
    3. מערבולת תגובת חיץ 1x עד לוח פרוטאז נמס לגמרי.
  4. לחמם את חרוזים מטריקס (חרוזים IP-להלן) עבור 20 דקות ב RT.
  5. להפשיר את כתב BoTest / E (להלן כתב / E) ב RT המוגן מפני אור.
  6. תווית צינור 15 מיליליטר חרוטי "כתב / E 0.5 מיקרומטר" ולהוסיף 45 μl של מניית הכתב / E 20 מיקרומטר ל1.8 מיליליטר 1x חיץ תגובה. מערבבים היטב על ידי pipetting ולאחסן על הקרח המוגן מפני אור.

2. לעמודדור דוגמא Curve ארד

עקומת הסטנדרט המתוארת כאן משתרעת 10-30,000 מזון 50 / g MLD או לחיץ מיליליטר בדילולים חצי יומן (לוח 3). משתמש הקצה הוא חופשי להשתמש בריכוזים חלופיים לפי העניין.

  1. יוצרות עלייה חדה ודוגר מטריצות עם חומר עזר. ליצור עקומת הסטנדרט באמצעות מדלל של אותו מטריקס כידוע, אם אפשר, כדי להפחית את השפעות מטריצה. השתמש חיץ ג'לטין פוספט (GPB) או שנאגרו מלוח פוספט (PBS) כמדלל אם מטריצה ​​נוספת, ונט שלילית אינה זמינה (למשל שדה או בדיקת מדגם פרוץ ונט). ליצור עקומת הסטנדרט ידי יוצרות עלייה חדה בונט / לתוך המטריצה ​​של הבחירה הבאה הפרוטוקול המתאים בהמשך.
    1. דגימות מורכבות נמוכה (למשל PBS, GPB, או תרופות)
      1. הוסף 10 מיליליטר של המאגר המתאים לצינור חרוטי 15 מ"ל ומניח בצד. מדגם זה ישמש כמדלל לstandarעקומת ד ודילולים לא ידועים (סעיף 4).
      2. הוספת 1.2 מיליליטר חיץ לצינור microcentrifuge.
      3. זהירות: בשלב זה משתמש בונט וזהירות קיצונית יש להשתמש בעת טיפול והסילוק של כל חומרים כימיים וחומרים שבאים במגע עם הרעל. שימוש בציוד מגן אישי וסילוק נאות של כל החומרים חייב להתבצע על פי הנחיות המחלקה לעבודת OSHA לונט (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) בארה"ב. הוספת ונט / ל1.2 מיליליטר המדגם כזה שהריכוז הסופי הוא 30,000 50 / מיליליטר MLD (36,000 בסך הכל MLD 50).
    2. הערה דגימות נוזלי מזון (או דגימות נוזל מורכבות אחרות): בדיקה ראשונית מומלץ לקבוע את עוצמת הקול של supernatant התאושש מדגימות הבהירו כחומר חלקיקים (. למשל עיסה) במטריצות נוזל תשתנה. פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה לפחות 1.2 מיליליטר של supernatant הבהיר יהיה התאושש מSAMP 1.4 מיליליטרle. להגדיל את גודל מדגם במידת צורך.
      1. הוסף 10 מיליליטר מזון נוזלי לצינור חרוטי 15 מיליליטר ולהגדיר אותו בצד. מדגם זה ישמש כמדלל לעקומה סטנדרטית ודילולים לא ידועים (סעיף 4).
      2. שוקל צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ריק ולהקליט את המסה שלו.
      3. הוספת 1.4 מיליליטר של המזון הנוזלי לצינור microcentrifuge שקל.
      4. Reweigh צינור microcentrifuge ולחשב את המסה של מדגם מזון המוסף על ידי הפחתת המסה של הצינור הריק.
      5. זהירות: בשלב זה משתמש בונט וזהירות קיצונית יש להשתמש בעת טיפול והסילוק של כל חומרים כימיים וחומרים שבאים במגע עם הרעל. שימוש בציוד מגן אישי וסילוק נאות של כל החומרים חייב להתבצע על פי הנחיות המחלקה לעבודת OSHA לונט (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) בארה"ב. הוספת ונט / מדגם 1.4 מיליליטר בריכוז סופי של 30,000 מזון 50 / g MLD.
      6. אינקובטוריםte diluent וזנק דגימות ב RT או 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי לתת זמן ונט לקיים אינטראקציה עם מטריקס המזון, מחקה זיהום טבעי.
    3. דגימות מוצקות אוכל (או דוגמאות מוצקות אחרות) הערה: בדיקה ראשונית מומלץ לקבוע את עוצמת הקול של supernatant התאושש מדגימות הומוגני והבהירו בעקבות התוספת של מיליליטר מזון GPB / 1 גרם. פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה שלפחות 1.2 מיליליטר הבהיר supernatant יהיה התאושש ממדגם 2 גרם. להגדיל את גודל מדגם במידת צורך.
      1. לשקול את דגימה מוצקה 10 גרם לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ומניח בצד. זה ישמש כמדלל.
      2. לשקול את 2 מדגם מזון מוצק גרם לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר שני.
      3. זהירות: בשלב זה משתמש בונט וזהירות קיצונית יש להשתמש בעת טיפול והסילוק של כל חומרים כימיים וחומרים שבאים במגע עם הרעל. שימוש בציוד מגן אישי וסילוק נאות של כל החומרים חייב להתבצע על פי הנחיות המחלקה לעבודת OSHA לונט (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) בארה"ב. הוספת ונט / אל פני השטח של מדגם 2 גרם לריכוז סופי של 30,000 מזון MLD 50 / g (60,000 50 MLD סך הכל).
      4. דגירה diluent ודגימות ממוסמר על RT או 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי לתת זמן ונט לקיים אינטראקציה עם מטריקס המזון, מחקה זיהום טבעי.
  2. התאמת המגון מדגם חיץ. תהליך המדגם זינק סטנדרטי עקום ומדלל שנוצר לעיל על פי טיב מדגם.
    1. דגימות מורכבות נמוכה
      1. אין עיבוד מדגם נוסף הוא הכרחי.
    2. דגימות מזון נוזלי (או דגימות נוזל מורכבות אחרות)
      1. לא המגון מדגם הוא הכרחי.
      2. מדגם הוסף חוצץ 10x נטרול 140 μl ל1.4 מיליליטר זינק ו1 מיליליטר 10x ניטרול חומציותיון חיץ מדגם diluent 10 מיליליטר. מערבבים דגימות היטב על ידי היפוך.
      3. חלקית להבהיר שני הדגימות על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב 6,000 XG ו4 ° C. מייד להסיר supernatants ולהעביר לצינורות חדשים.
    3. דגימות מוצקות אוכל (או דוגמאות מוצקות אחרות)
      1. הוסף 2 מיליליטר GPB (מיליליטר GPB / אוכל גרם 1) ל2 גרם ונט /-זינק מדגם מזון המוצק ו10 מיליליטר GPB למדגם diluent 10 גרם.
      2. Homogenize הדגימות באמצעות העלי עד מעורבב היטב. בהתאם לאופי של המדגם, ייתכן שיש גושים קטנים של חומר שלא יכול להיות הומוגני, שהוא מקובל. לחלופין, ניתן להשתמש בשיטות הומוגניזציה מכאניות. שימוש בבלנדר אינו מומלצים מכיוון שהוא עלול להשבית כמו גם תרסיס רעלן.
      3. הוספת 1/10th נפח של 10x חיץ נטרול מדגם diluent מבוסס על הנפח הכולל המשוער (למשל 2 מיליליטר אם הנפח הוא 20 מיליליטר). לחיץהנפח הכולל של / המדגם זינק ונט ולהוסיף 1/10th נפח של 10x חיץ נטרול. מערבבים דגימות היטב על ידי היפוך.
      4. חלקית להבהיר שני הדגימות על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב 6,000 XG ו4 ° C. מייד להסיר supernatants ולהעביר לצינורות חדשים.
  3. הכן דילולים סידוריים עקום סטנדרטיים לבדיקה
    1. שימוש בונט /-זינק מדגם סטנדרטי עקומה כD1 ומדגם nonspiked כמדלל, ליצור דגימות עקומת סטנדרט שנותרו בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge לפי טבלה 3.

3. הכן דוגמאות לא ידועות

סעיף זה יכול להסתיים במקביל לסעיף 2.

  1. לקבוע את המספר ודילולים של נעלמים. בדוק אלמונים בשלושה עותקים, אם אפשר.
    1. עבור מבחני איכותיים, הפעל את נעלמים ללא כל דילול נוסף מהנדרש כדי לעבד את המדגם כdescriמיטה למטה.
    2. למבחנים כמותיים, להכין לפחות שני 01:10 דגימות דילול, כמתואר להלן, כדי להבטיח כי דגימות אחד או יותר נמצאים בטווח ליניארי של תגובת assay. ליצור דילולים באמצעות מדלל של אותו מטריקס כידוע, אם אפשר, כדי להפחית את השפעות המטריצה ​​כמתואר בסעיף 3. אחרת, השתמש PBS או GPB כמדלל.
  2. יצירה ודילול דגימות ידועות בהתאם לסוג מדגם.
    1. אלמונים מורכבות נמוך (למשל PBS, GPB, או תרופות)
      1. הוסף לפחות 750 μl ידוע לצינור microcentrifuge ליצור דילול לא ידוע 1.
      2. הוספת 675 diluent μl לשני צינורות microcentrifuge שכותרתו דילול לא ידוע 2 ו -3. Diluent תהיה אותו החומר המשמש לייצור עקומה סטנדרטי.
      3. סדרתי לדלל דילול 1 על ידי העברת 75 μl דילול 1 לתוך צינור דילול 2 וערבוב.
      4. סדרתי dilutדואר דילול 2 על ידי העברת 75 μl דילול 2 לתוך צינור דילול 3 וערבוב.
    2. הערה אלמונים נוזל מזון (או דגימות נוזל מורכבות אחרות): בדיקה ראשונית מומלץ לקבוע את עוצמת הקול של supernatant התאושש מדגימות הבהירו כאמור בסעיף 3. להגדיל את גודל מדגם במידת צורך.
      1. הוספת ≥ 875 μl של הלא נודע הנוזל לצינור microcentrifuge.
      2. הוספת 1/10th נפח של 10x חיץ נטרול המדגם (למשל 87.5 μl למדגם μl 875).
      3. חלקית להבהיר את המדגם על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב 6,000 XG ו4 ° C. מייד להעביר את supernatant לצינור חדש. זהו דילול לא ידוע 1.
      4. הוספת 675 diluent μl לשני צינורות שכותרתו דילול לא ידוע 2 ו -3. Diluent תהיה זהה חומר מעובד משמש לייצור עקומה סטנדרטי.
      5. סדרתי לדלל דילול 1 על ידי העברהטבעת 75 μl דילול 1 לתוך צינור דילול 2 וערבוב.
      6. סדרתי לדלל דילול 2 על ידי העברת 75 μl דילול 2 לתוך צינור דילול 3 וערבוב.
    3. אלמונים מוצקים אוכל (או דוגמאות מוצקות אחרות) הערה: בדיקה ראשונית מומלץ לקבוע את עוצמת הקול של supernatant התאושש מדגימות הבהירו כאמור בסעיף 3. להגדיל את גודל מדגם במידת צורך.
      1. לשקול את מדגם לא ידוע מוצק 2 גרם לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר.
      2. הוסף 2 מיליליטר GPB (מזון GPB / g מיליליטר 1) למדגם המוצק 2 גרם.
      3. Homogenize הדגימות כפי שתואר בסעיף 3.2.3.2.
      4. הוספת 1/10th נפח של 10x חיץ נטרול המדגם המבוסס על הנפח הכולל המשוער (למשל 0.4 מיליליטר אם הנפח 4 מיליליטר). מערבבים דגימות היטב על ידי היפוך.
      5. חלקית להבהיר את המדגם על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב 6,000 XG ו4 ° C. Immediatel≥ העברת y supernatant 750 μl לצינור microcentrifuge. זהו דילול לא ידוע 1.
      6. הוספת 675 diluent מיליליטר לשני צינורות שכותרתו דילול לא ידוע 2 ו -3. Diluent תהיה זהה חומר מעובד משמש לייצור עקומה סטנדרטי.
      7. סדרתי לדלל דילול 1 על ידי העברת 75 μl דילול 1 לתוך צינור דילול 2 וערבוב.
      8. סדרתי לדלל דילול 2 על ידי העברת 75 μl דילול 2 לתוך צינור דילול 3 וערבוב.

4. הבהרת מדגם סופית

אם נוזל בדיקה או דגימות מזון מוצקות, צנטריפוגה כל הדגימות במשך 5 דקות ב≥ 14,000 XG בmicrocentrifuge להבהיר באופן מלא את הדגימות. מייד להסיר supernatants ולהעביר לצינורות חדשים.

5. התקנת הצלחת וונט / Pull Down

  1. פריסת הצלחת הספציפית היא יישום תלויה, עם זאת, אין להשתמש בבארות מחוץ כדיכדי להימנע מהשפעות קצה. כל מדגם לא ידוע ומדגם עקומת תקן D1-D8 דורש 3 בארות תוך D9 המדגם דורש 6 בארות. פריסת צלחת הציעה מוצגת באיור 1.
  2. הוסף 20 μl חיץ 10x עקידה היטב כל אחד לשימוש.
  3. הוסף 200 μl של דילול כל הובהר וידוע לכל אחד משלוש בארות (שש בארות לD9) לבדיקה בשלושה עותקים. מערבבים את הצלחת ל10 שניות במיקסר microplate.
  4. מוסיף את חרוזים IP-.
    1. ורטקס חרוזים IP-ל10 שניות במהירות הגבוהה ביותר. המשך vortexing אם חרוזים אינם מושעים והומוגנית באופן מלא.
    2. חרוזים פיפטה 20 μl IP-מדגם זה היטב.
    3. מערבבים את הצלחת ל30 שניות במיקסר microplate.
  5. דגירה את הצלחת באמצעות חממת צלחת מסתובבת לשעה 2 ב 750 סל"ד, 25 ° C או RT. ביצועי assay תלויים מאוד ביצירת ושמירה על ה-IP-ההשעיה חרוז במהלך כל שלבי הדגירה. חרוזים resuspend תמיד עם micropמאוחר מיקסר לאחר pelleting ולשמור על ההשעיה באמצעות ייקר צלחת microtiter מסלולית במהלך כל שלבי הדגירה.

6. כביסה צלחת וחרוז resuspension

  1. לשטוף את הצלחות ביד או על ידי שימוש במכונת כביסה צלחת אוטומטית חרוז תואם מגנטית. מכונת כביסה צלחת אוטומטית מוגדרת לחרוזים מגנטיים מגדילה מאוד את תפוקת assay.
    1. כביסה ידנית
      1. תווית צינור חרוטי 50 מיליליטר "1x הצפה לשטוף" ולהוסיף 45 מיליליטר מים כיתה ביולוגיה מולקולרית ו5 10x מיליליטר מטריקס הצפת לשטוף. מערבבים חיץ היטב על ידי היפוך.
      2. הסר את הצלחת מן חממת הצלחת המסתובבת.
      3. מייד מניח את הצלחת על 96 היטב צלחת הפרדת חרוז מגנטי למשך 5 דקות.
      4. תוך השמירה על הצלחת על צלחת הפרדת חרוז מגנטית 96 היטב, בעדינות להסיר ולסלק supernatants מהבארות המדגם באמצעות פיפטה יחיד או רב ערוצים. לא לשאובחרוזים חזותי לפקח חיץ aspirated בקצה פיפטה להסרת חרוז מקרי. אם ההסרה היא עדים, בעדינות להוסיף את תוכן הקצה חזרה ל, reseparate היטב, ולחזור על ההסרה.
      5. הוסף 300 חיץ 1x לשטוף μl לכל דגימה היטב.
      6. מלא resuspend את החרוזים על ידי ערבוב את הצלחת ל30 שניות במיקסר microplate.
      7. דגירה את הצלחת על צלחת הפרדת חרוז מגנטי 96 היטב במשך 2 דקות.
      8. להסיר ולסלק supernatants מהבארות המדגם כמו קודם.
      9. חזור על שלבים 6.1.1.5-6.1.1.8 פי שלושה עבור סכום כולל של 4 שוטף.
      10. עם הצלחת על צלחת הפרדת חרוז מגנטי 96 היטב, מבחינה ויזואלית לבדוק את הבארות כדי לאשר אפילו הסרת supernatant; להשתמש פיפטה להסיר את החיץ שיורית עודף במידת צורך. חיץ מסוים יישאר בבארות ויש להקפיד להימנע מהסרת חרוז או ייבוש חרוז.
      11. הוסף 50 חיץ תגובת μl 1x היטב כל מדגם ומערבבים את הצלחת ל30 seג במיקסר microplate לresuspend באופן מלא את החרוזים. במידת צורך, להשתמש פיפטה resuspend באופן מלא את החרוזים.
    2. כביסה אוטומטית פלייט
      1. התקנה ותכנית הכביסה בהתאם לטבלת 4. נקייה ולשטוף מכונת הכביסה עם מים באיכות גבוהה (למשל nanopure).
      2. ראש מכונת הכביסה על ידי הפעלת התכנית "ראש".
      3. הסר את הצלחת מן חממת הצלחת המסתובבת.
      4. מייד מניח את הצלחת על צלחת הפרדת חרוז מגנטי 96, גם במכונת הכביסה הצלחת.
      5. הפעל את קישור התכנית "מאסטר לשטוף". צעד התכנית הראשון הוא שלב דגירה 5 דקות שבו מכונת הכביסה תהיה נייחת.
      6. בעקבות השלמת תכנית, להסיר את הצלחת ממכונת הכביסה, להוסיף למאגר תגובת 1x 50 μl לכל דגימה היטב, ולערבב את הצלחת ל30 שניות במיקסר microplate לresuspend באופן מלא את החרוזים. במידת צורך, להשתמש פיפטה resuspend באופן מלא את החרוזים.

    7. Assay ייזום ודגירה

    1. הוסף 50 כתב μl / E 0.5 מיקרומטר (ראה סעיף 1) זה טוב מדגם ומערבבים ל30 שניות במיקסר microplate לresuspend באופן מלא את החרוזים.
    2. הוספת 100 מים μl היטב כל אחד שאינו בשימוש על הצלחת כדי למנוע השפעות קצה.
    3. חותם את הצלחת עם הקלטת איטום צלחת דגירה הצלחת באמצעות חממת צלחת מסתובבת ב750 סל"ד, 25 ° C או RT. הגן על הצלחת מן האור במהלך דגירה.

    8. איסוף נתונים וניתוח

    הערה: assay זה assay בזמן אמת שניתן למדוד מספר פעמים עד שהרגישות הרצויה מתקבלת, אין חומרים כימיים עצירה הנדרשת. פעמים קריאה ראשוניות מומלצות הן 2, 4, וזמן דגירה 24 שעות עם רגישות assay וגדל עם זמן דגירה.

    1. איסוף נתונים
      1. בכל פעם שקראה, להסיר את הצלחת מן חממת הצלחת המסתובבת, להסיר את החותםing קלטת, ומניח מייד את הצלחת על צלחת הפרדת חרוז מגנטי 96 היטב. לאפשר חרוזים להפריד למשך 2 דקות.
      2. מניחים את הצלחת בקורא microplate ולמדוד את הפליטות ב ~ 470 ו~ 526 ננומטר תחת עירור ב ~ 434 ננומטר.
      3. אם פעמים קריאה נוספות הן רצויים, resuspend את החרוזים ל30 שניות על מיקסר microplate, לאטום את הצלחת, ולהחזיר את הצלחת אל האינקובטור הצלחת המסתובבת.
    2. ניתוח נתונים
      1. לחשב את יחס הפליטה עבור כל דגימה על ידי חלוקת יחידת הקרינה היחסית ערך (RFU) ב526 ננומטר על ידי ערך RFU ב470 ננומטר.
      2. מגרש את יחס הפליטה לעומת [ונט /] יומן לנקודתי נתונים עקומה סטנדרטיות. בהתאם לטווח העוצמה ונט / נבדק, עקומת מנת תגובת sigmoidal תתקבל (ראה נציג תוצאות).
      3. להתאים את נתוני עקומת סטנדרט עם עקומת השיפוע משתנה מנת תגובת Y = + תחתון (Top-Bottom) / (1 ​​+10 ^ ((logEC 50 X-) * ​​Hillslope)) כאשר X הואלוגריתם של ריכוז, Y הוא התגובה, וY מתחיל בתחתית והולך למעלה עם צורת sigmoidal.
      4. לקבוע את הגבולות של זיהוי (לוד), גבולות כימות (LOQ), וריכוז חצי מקסימאלי אפקטיבי (50 EC). גבולות זיהוי מוגדרים כמדגם שיש יחס פליטה של ​​פחות מ 3 סטיות תקן (SDS) מתחת לפקדים ריקים (n = 6). גבולות כימות מוגדרים כמדגם שיש יחס פליטה פחות מ -10 סטיות תקן מתחת לפקדים ריקים (n = 6). 50 EC נקבע מכושר עקומת מנת תגובת sigmoidal.
      5. לשרבב את העוצמה של כל דגימות ידועות נגד עקומת סטנדרט מנת תגובת sigmoidal.
        1. לתוצאות כמותיות, המדגם לא ידוע אידיאלי צריך ליפול בתוך החלק ליניארי של העקומה סטנדרטית. משוער החלק ליניארי של העקומה סטנדרטית על ידי חישוב 20-80% בסך הכל חלון תגובת assay (למשל, אם יחס הפליטה של r עקומת הסטנדרטAnges .5-2.5, הטווח ליניארי יהיה החלק מעקומת הסטנדרט שנעה 0.9-2.1).
        2. לקבלת תוצאות איכותיות, השווה את המדגם לא ידוע נגד לוד וLOQ של העקומה סטנדרטית.
        3. אל להסיק דגימות ידועות מעבר לגבולות של העקומה סטנדרטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תרשים המסכם את השלבים בפרוטוקול המתואר מוצג באיור 2. Assay מחייב בין 4-26 שעות כדי להשלים בהתאם לסוג דגימה ורגישות assay רצוי, אבל ~ 2 שעות רק של ידיים על זמן. Assay מתבצע בצלחות 96 היטב ו, תלוי בסוג של מתבצעת בדיקה, מאפשרת בדיקה בשלושה עותקים של עד 20 דגימות לרבות תקנים לכל צלחת.

תרשים 3 מראה תוצאות assay נציג באמצעות ונט / holotoxin זינק לתוך PBS ונבדק עם הפרוטוקול המתואר הבא 2, 4, ו -24 דגירה שעה עם הכתב / E. ונט מטוהרת / holotoxin נבחר לניסוי זה בגלל המשקל שלה המוגדר המולקולרי של ~ 150 kDa, בהשוואה ל 700-900 kDa באופן רחב יותר שהוגדר למורכב רעלן, ובטהרה מאפשרת spiking מדויק מאוד בריכוזים מדויקים. יחס הפליטה, היחס של פליטה ב526 ננומטר לזה שב470 ננומטר הבא עירור ב 434ננומטר, בכל נקודת זמן הוא להתוות לעומת ונט / ריכוז (ערך MLD 50 מבוסס על בדיקות העוצמה ונט / היצרן). מחשוף של הכתב ידי ונט נמדד כקיטון בשיעור הפליטה, אשר עם קורא הצלחת שלנו נע בין כ 2.7 לכתב ללא פגע כ 0.7 לכתב ביקע באופן מלא. חשוב לציין כי, מאז כל הקרינה אמצעי צלחת קורא בRFUs, הערך האמיתי של יחס הפליטה יהיה תלוי בקורא הצלחת בשימוש. זמן דגירה ממושך עם תוצאות הכתב במחשוף כתב מוגבר כפי שניתן לראות על ידי השינוי שמאלה בעיקול. נקודות נתונים, נבדקו בשלושה עותקים, להציג SD הנמוך של הממוצע ובצעו את המגמה הצפויה של יחס פליטה מוגבר עם ירידה בעומס רעלים. כישלון של assay לעקוב מגמה צפויה זה עשוי להצביע על שגיאה במהלך דור דילול או ההתוויה נתונים. יחסי הפליטה של ​​הפקדים המכילים לא ונט / גם להישאר יציבים דוריןגרם הדגירה (איור 3, הבלעה), דבר המעיד על חוסר פעילות פרוטאז ספציפי.

דוגמא של שימוש בפרוטוקול זה כדי לכמת דגימות ונט / תרופות מוצגת באיור 4. עקומת סטנדרט נוצרה ב-PBS עם holotoxin ונט / מטוהרים ומעובד במקביל עם דילולים של מוצר תרופה המופקים מ100 בקבוקון של יחידה אחת של בוטוקס lyophilized rehydrated מלוחים 0.9%. (באופן אידיאלי, העקומה סטנדרטית תהיה מורכב מהמון התייחסות של בוטוקס אבל חומר כזה לא היה זמין.) דגימות נבדקו באמצעות הפרוטוקול המתואר למעט עובדת 50 דגימות μl נבדקו בשני עותקים ללא השימוש בחיץ 10x עקידה. עקומת הסטנדרט הייתה להתוות כפונקציה של ונט / הריכוז הבא דגירה שעה 24 עם הכתב / E. יחס הפליטה של ​​כל מדגם לא ידוע היה אז דמיינו ידי התוויית צומתה לאורך עקום הסטנדרטי. ב assay זה, הקוחלק ar של העקומה סטנדרטית (20-80% חלון תגובת assay) נופל בין יחס פליטה של ​​2.11-1.05 ומצוין באמצעות התיבה המקווקו באיור. הריכוזים של שלושת אלמונים שנופלים בתוך טווח ליניארי זה היו אז באינטרפולציה מהעקומה סטנדרטית (איור 4, הבלעה). דוגמא זו ממחישה את המתודולוגיה הכללית שהייתי לשמש כדי לזהות או לכמת את כל מדגם לא ידוע נגד עקומה סטנדרטית.

עגבניות טריות וחלב 2% נבחרו כדי להדגים את הביצועים של הפרוטוקול ורגישות בשתי מוצקות (עגבניות) ומזון נוזלי (חלב 2%) מטריקס. ונט / מורכבת מורכב מholotoxin הליבה והחלבונים הקשורים לרעלן עצבי (תנומות) נבחר לניסויים אלה, כי תכשיר זה דומה לרעלן המיוצר בזיהום Clostridium טבעי. כפי שניתן לראות באיור 5 א ', התאוששות של ונט /, שנמדד כמחשוף של הכתב / E, הוא ציין עם במטריצות OTH. זמן דגירה גדל עם הכתב מגביר את רגישות assay, אך אינו תוצאה של יחסי פליטה ירדו לשום פקדי רעלן (איור 5 א, ריבועי), המציין את התוצאות שנצפו המחשוף מונט / ופרוטאז לא ספציפי לשאת מעל מהמזון ב assay. כמו באיור 3, ההשתנות הנמוכה מציג נתונים ועוקב אחר המגמה הצפויה של הירידה במחשוף כתב עם ירידה בריכוז הרעלן.

ונט / לוד, LOQ, ו-EC 50 עבור שני מזונות בכל נקודת זמן הראתה מסוכמות בטבלה 5. לוד וLOQ מוגדרות כמדגם הריכוז הנמוך ביותר עם יחס פליטה נמוך יותר משלושה ועשר סטיות תקן מתחת רקע (דגימות המכילות לא ונט /), בהתאמה. מגבלות אלה מוגבלות לנקודות נתונים שנבדקו, אם כי אינטרפולציה לעקומת מנת תגובת sigmoidal יכול לשמש כדי לחשב גבולות תיאורטי נמוכים יותר. כמה מטריצה ​​אלהשתנות מטריצה ​​בלוד וLOQ צפויות, כמו השפעות מטריצה ​​עשויות להשפיע על הכריכה של הרעלן לחרוזים וההתאוששות של חרוזים במהלך כביסה. למרות שזה נראה שיש יותר התאוששות רעלן מחלב 2% מעגבניות מהנתונים באיור 5A, חלק גדול מהבדל זה נובע מהדילול נוסף הנדרש לhomogenize דגימות עגבניות בGPB.

בנוסף להיותו מטריצת מזון מוצקה, עגבניות הן סוג מדגם ראוי לציון שבו pH וחוזק היוני התאמה, הושגה על ידי התוספת של חיץ 10x נטרול, היא קריטית להצלחה של assay. איור 5 מדגימות תגובות assay כאשר בודקים עגבניות עם או בלי הכללת חיץ נטרול 10x. כישלון להוסיף 10x תוצאות חיץ ניטרול בהחלמה לקויה של ונט / מדגימות ובאו לידי ביטוי ביחס פליטה קבוע בכל ריכוזי ונט / נבדקו. בנוסף למאגר נטרול 10x, אם כי, results בזיהוי רגיש של הרעלן.

פרוטאזות ספציפיות הכלולות במטריצות מורכבות יכולות להוביל לתוצאות חיוביות שגויות אם לא התייחסו מאז פרוטאזות אחרות מאשר ונט עשויות לדבוק הכתב / E. פרוטאזות ספציפיות עשויות להיות אנדוגני לדוגמא מזון או הציג בעת השימוש בתכשירי ונט nonpurified כגון supernatants תרבות Clostridium. שטיפה יסודית חרוז תסיר פרוטאזות ספציפיות ביותר, עם זאת, התוספת של מעכבי פרוטאז למאגר התגובה היא קריטית איור 6 מדגים פעילות פרוטאז ספציפי שנמצאה בונט / supernatants תרבות Clostridium באמצעות כתב שונה / E, BoTest KO (כתב KO. ). כתב KO זהה לכתב / E עם החריג שונט / אתר מחשוף כבר מוטציה כזאת, כי זה כבר לא ביקע ידי ונט / א ' לכן, כל מחשוף כתב שנצפה כתוצאה מפעילות פרוטאז ספציפי. הרמות גבוהות של CLE כתב KOAvage מציין את supernatant התרבות מכיל רמה גבוהה של פעילות פרוטאז, אבל הפעילות שהוא שלל באופן יעיל על ידי התוספת של מעכבי פרוטאז.

נתונים לדוגמה להדגים את התועלת של הפרוטוקול לתפוקה גבוהה בונט זיהוי / במאגרים פשוטים ומטריצות מזון. מזונות מסוימים עשויים לדרוש התאמות assay קטנות, אבל הפרוטוקול המתואר אמור להניב תוצאות טובות עם רוב סוגי מזון.

איור 1
פריסת צלחת איור 1. מומלץ. דוגמאות מוגבלות 60 הבארות הפנימיות של הצלחת, כדי למנוע השפעות קצה אפשריות. ניתן להוסיף דוגמאות עקומה ידועות או סטנדרטיות בהתאם לצורך. כל הבארות שאינן בשימוש צריכה להיות מלאות עם 100 מים μl במהלך הדגירה כתב. CLICK כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. סקירה סכמטי של הפרוטוקול המתואר. כל צעד מרכזי בפרוטוקול מצויינים על ידי תיבה שכותרתה ומיושרת לצד ציר זמן assay מוערך (לא בקנה מידה). דגימות Nonfood אינו דורשות עיבוד דגימה וכך להיכנס לפרוטוקול במורד הזרם של דגימות מזון. התיבה המקווקו סביב דור דילול סדרתי עבור הנעלמים מציינת זו היא אופציונלית, אך מומלץ, צעד. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
איור 3. איתור של ונט / holotoxin ב PBS באמצעות הפרוטוקול המתואר.ונט מטוהרת / holotoxin היה ממוסמר לPBS ונבדק באמצעות הפרוטוקול המתואר עם ריכוז ונט / עליון של 1 ננומטר. כל הדגימות נבדקו בשלושה עותקים וברי השגיאה מייצגים סטיית התקן של הממוצע. עוצמה מדווחות מבוססת על בדיקת מבדק העכבר של היצרן של הרעלן. יחס הפליטה (היחס בין הפליטה ב 526 ננומטר ל470 ננומטר על עירור ב434 ננומטר) של העקומה סטנדרטית נמדד הבא 2, 4, ו -24 דגירה שעה עם כתב / E וזמם כפונקציה של ונט / ריכוז . לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4
איור 4. כימות של מוצר תרופה בוטוקס באמצעות הפרוטוקול המתואר. 100 בקבוקון של יחידה אחת של מוצר תרופה בוטוקס lyophilized הייתה resuspe nded ב220 μl מלוח 0.9%, באופן סדרתי בדילול מלא, ונבדק כאלמונים נגד עקומת סטנדרט שנעשתה בPBS באמצעות holotoxin ונט / מטוהר. דגימות נבדקו על פי הפרוטוקול המתואר אלא ש50 דגימות μl נבדקו ללא חיץ 10x עקידה בשני עותקים. העקומה סטנדרטית חושבה על ידי התאמת יחס הפליטה של ​​הדגימות העקומה סטנדרטיות למשוואת מנת התגובה משתנה מדרון sigmoidal וזמם כפונקציה של ונט / ריכוז. כל מדגם לא ידוע מוצג בו מצטלב עם העקומה סטנדרטית הבאים דגירה שעה 24 עם הכתב / E. הריכוזים של הדגימות ידועות נופלות בתוך הטווח ליניארי (מקווקו תיבה מוצלת) היו אינטרפולציה מהעקומה סטנדרטית. התווית לכל ידוע בוטוקס היא את מספר היחידות הנוכחי במדגם המבוסס על עוצמה שכותרתו. ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן של הממוצע.t = "_blank"> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 5
איור 5. השחזור של ונט /-זינק חלב 2% ובדיקות עגבניות טריות באמצעות הפרוטוקול המתואר. דוגמאות של חלב 2% ועגבניות טריות היו מתובל בונט / מורכב מטוהר ונבדק באמצעות הפרוטוקול המתואר. כל הדגימות נבדקו בשלושה עותקים וברי השגיאה מייצגים סטיית התקן של הממוצע. (א) יחס הפליטה של חלב 2% ועגבניות טריות עקומות סטנדרטיות נמדדו הבא 2, 4, ו דגירה שעה 24 עם כתב / E וזמם כפונקציה של ונט / עוצמה. כישלון (ב ') כדי לכלול את חיץ 10x נטרול במהלך תוצאות בדיקות עגבניות בכישלון assay. דוגמאות של עגבניות טריות נבדקו על פי הפרוטוקול המתואר עם או בלי תוספת של 10x ניטרליחיץ נפל על קרקע פורה. הנתונים שמוצגים הוא לנקודת זמן 4 שעות. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 6
איור 6. מעכבי פרוטאז נדרשים כאשר בודקים מטריצות מורכבות. Clostridium ונט / (אולם מתח) supernatant התרבות היה בדילול סדרתי ב-PBS ונבדק באמצעות הפרוטוקול המתואר עם או בלי מעכבי פרוטאז נוספו למאגר התגובה ועם שניהם כתבים / E ו-KO. יחס הפליטה נמדד הבא דגירה שעה 24 עם שני / E או כתבי KO וזמם כפונקציה של ונט / עוצמה. מחשוף משמעותי של כתב KO נתפס ללא תוספת של מעכבי פרוטאז, אבל נשלל על ידי ההכללה שלהם. כל הדגימות נבדקו בשלושה עותקים והשגיאה בערס מייצג את סטיית התקן של הממוצע. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

חוצץ הרכב טמפרטורת אחסון יציבות הערות
10x מטריקס חיץ מחייב 500 HEPES מ"מ-NaOH, 7.1 pH, 250 mM NaCl, Tween-20 1%, 5% קזאין, 0.05% NaN 3 -20 או -80 ° C יציב למשך התקופה מינימאלית של חמישה ימים ב 4 ° C על הפשרה מסופק עם ערכת BoTest מטריקס טוקסין איתור
10x מטריקס הצפת לשטוף 119 פוספטים מ"מ, 7.4 pH, 1,370 מ"מ NaCl, 27 מ"מ KCl, 20-Tween 1% -20 או -80 ° C יציב למשך התקופה מינימאלית של חמישה ימים ב 4 ° C על הפשרה מסופק עם ערכת BoTest מטריקס טוקסין איתור
10x נטרול הצפת 1 M HEPES-NaOH, 8.0 pH, 1 M NaCl 4 מעלות צלזיוס יציב לתקופה של עד שישה חודשים על 4 מעלות צלזיוס
10x חיץ תגובת BoTest 500 HEPES מ"מ-NaOH, pH 7.1, 50 mM NaCl, 1% 20-Tween, 100 מיקרומטר ZnCl 2 -20 או -80 ° C יציב למשך התקופה מינימאלית של חמישה ימים ב 4 ° C על הפשרה מסופק עם ערכת BoTest מטריקס טוקסין איתור
כתב BoTest / E 20 מיקרומטר ב50 HEPES מ"מ-NaOH, 10 mM NaCl, גליצרול 15% -80 ° C אחסן בaliquots הקטנים. יציב למשך התקופה מינימאלית של חמישה ימים ב 4 ° C על הפשרה. מסופק עם ערכת BoTest מטריקס טוקסין איתור
ג'לטין פוספט חוצץ (GPB) 33.3 מ"מ אא 2 PO 4, pH 6.2, 2 גר '/ ג'לטין L 4 מעלות צלזיוס יציב לתקופה של עד חודש 1 על 4 מעלות צלזיוס
200x dithiothreitol (DTT) 1 M DTT -20 ° C יציב לתקופה של עד 6 חודשים ב-20 ° C הפוך ולאחסן aliquots הקטנים (100 μl)
1x PBS-t 11.9 פוספטים מ"מ, 7.4 pH, 137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 20-Tween 0.1% 4 מעלות צלזיוס יציב לתקופה של עד חודש 1 על 4 מעלות צלזיוס יכול להתבצע באמצעות 10x PBS מפישר (BP399-1)
חרוזים מטריקס (IP-חרוזים) חרוזים מגנטיים מצומדות קוולנטית לעוף אנטי ונט נוגדן / ב-PBS. Tween-20 0.1%, 0.05% נתרן יזיד, 0.25% קזאין, וגליצרול 50% -20 ° C יציב למשך התקופה מינימאלית של חמישה ימים על 4 מעלות צלזיוס עם ההסרה מ-20 ° C. לא להקפיא ב -80 ° C

טבלת 1. Buffers נדרש לפרוטוקול המתואר. נטרול 10xהחיץ הוא רק לדגימות מורכבות מאוד (למשל, מזון) ולא ייתכן שיידרש בהתאם לאופי של הדגימות להיות assayed.

שמו של חומר / ציוד חברה מס 'קטלוגי תגובות / תיאור
BoTest מטריקס טוקסין עצבי ערכת זיהוי BioSentinel A1015 ערכות זיהוי לונט / B ו-F הן גם זמינות.
קורא microplate הקרינה Varioskan פלאש תרמו פישר סיינטיפיק 5250040 רוב או את monochromator-יחידות המבוסס על מסנן עם 434 עירור ננומטר ו470 ננומטר ו526 יכולת פליטת ננומטר יכולות לשמש.
צלחת הפרדה 96 היטב חרוז מגנטי V & P מדעי VP771H ניתן להשתמש בלוחות מגנטיים אחרים, אבל את הצלחת צריכה להיות מתוכננת כדי להפריד בEADS לצד השני של הבאר.
מכונת כביסת פלייט חרוזים תואמות מגנטית BioTek ELx405 VSRM אופציונאלי, נדרש רק לשטיפת צלחת אוטומטית. עשויים לשמש גם מנקי צלחת אחרים מגנטיים חרוז תואם, אך יש לבדוק לפני השימוש.
Microcentrifuge שונים N / אופציונאלי, הנדרש רק עבור דגימות הזקוקים לצנטריפוגה.
מיקסר צלחת MixMate אפנדורף 22674200
Orbital אכר שונים N / שימוש ב RT או ב ° C25 אם בקרת הטמפרטורה נגיש
לוחות מעכבי פרוטאז ללא EDTA רוש 4693132001 נדרש רק למזון או בדיקות סביבתיות. מעכבי פרוטאז חייבים להיות ללא EDTA.
ונט / Metabiologics N / אופציונאלי, נדרש רק למטרות תקינה וכימות
לוחות שחורים, עם תחתית שטוחה 96 היטב NUNC 237,105 לא צריכים להתייחס צלחות
סרט איטום פלייט 96 היטב Thermo Scientific 15036

טבלה 2. חומרים וציוד דרושים לפרוטוקול המתואר. חומרים וציוד חלקם אופציונליים או ניתן להחליף בהתאם לציוד זמין. בדיקת התאמה נוספות ואופטימיזציה עשויה להידרש אם באמצעות ציוד חלופי.

</ Tr>
שם מדגם רעלן נפח ממס נפח [ונט /] (MLD 50 / מיליליטר) או (MLD 50 / מזון ז) להיכנס [ונט /] (MLD 50 / מיליליטר) או (מזון 50 / g MLD) D1 בורסת μl 1,200 N / 30,000 4.48
D2 300 μl D1 600 μl 10,000 4
D3 90 μl D1 810 μl 3,000 3.48
D4 90 μl D2 810 μl 1,000 3
D5 90 μl D3 810 μl 300 2.48
D6 90 μl D4 810 μl 100 2
D7 90 μl D5 810 μl 30 1.48
D8 90 μl D6 810 μl 10 1
D9 N / 1,400 μl N / N /

טבלה 3:. שולחן דילול עבור דגימות עקומת סטנדרט טבלה זו מייצרת עקומת סטנדרט בדילולים חצי לוג מעל 3.5 סדרי הגודל. מדגם מספיק לא ונט ריק (D9) שנוצר כדי להפעיל n = 6. ניתן להוסיף דילולים נוספים אם תרצה בכך.

<td> 0
שם תכנית משתנה ערך תגובות
ראשוני בקבוק מגיב
נפח ראש 400
ראש קצב זרימה 7
משרים אחרי שהראש? N
מטריקס שטפי בקבוק מגיב מספר שוטף יכול להיות מוגבר אם פעילות פרוטאז שיורי הוא ציין.
שיטה
4
משרים / Shake Y
משרים משך 180
לנער לפני משרים? N
ראש משרים לאחר? N
חד פעמי
לוותר על נפח 300
לוותר על קצב הזרימה 5
לוותר על גובה 130
הר. לוותר ממוצע. 0
להשבית לשאוב? Y
הכביסה הראשונה תחתונה? N
ראש לפני ההתחלה? N
Aspir
גובה שאיפה 40
הר. לשאוב ממוצע. 0
שאיפת מחיר 5
שאיפת עיכוב
רוחב לשאוב? N
סופי שאיפה? Y
סופי איפת עיכוב 0
מטריקס משרים משרים משך 300 עליית משך לספוג עלול להגביר התאוששות חרוז ממזונות צמיגות יותר.
לנער לפני משרים? N
מאסטר שטפי מטריקס משרים זוהי תכנית 'קישור' כדי להפעיל את מטריקס משרים ותוכניות מטריקס לשטוף ביחד.
מטריקס שטפי

הגדרות לוח 4. מגנטי חרוז תואם אוטומטיות מכונת כביסה צלחת תכנית. התוכניות הבאות יניחו שמכונת הכביסה הצלחת מצוידת במגנט שמושך את חרוזים לצד השני של הבארות ושחיץ מיתוג מודול מוגדר כך ש1x הצפת לשטוף ( PBS-t) מצורף לא סתום תוכניות אלה הן ספציפיות לELx405 BioTek. עיין במדריך לכלי להוראות תכנות. אחר מגנטי חרוז תואם מנקי צלחת אוטומטית או יריעות ואקום יכול לשמש, עם זאת, תהיה צורך בבדיקות לקביעת הגדרות שלמקסם את יעילות כביסה ולהקטין את איבוד חרוז במהלך כביסה. בדיקה ראשונית של התאוששות חרוז הבא כביסה מומלצת ללא קשר למכונת הכביסה הצלחת הספציפית בשימוש.

<td> לוד
מטריקס מזון מטרי 2 שעות 4 שעות 24 שעות
אוכל 50 / g MLD MLD 50 / טוב אוכל 50 / g MLD MLD 50 / טוב אוכל 50 / g MLD MLD 50 / טוב
חלב 300 58 100 19 30 6
LOQ 1,000 193 300 58 100 19
50 EC 2,404 464 590 114 92 18
עגבניות טריות לוד 1,000 91 300 27 30 3
LOQ 1,000 91 1,000 91 100 9
50 EC 7561 687 1,932 176 229 21

לוח 5. גבולות זיהוי (לוד), גבולות כימות (LOQ), וחצי מ 'ריכוז aximal היעיל (50 EC) לחלב 2% ובדיקות עגבניות טריות שמוצג באיור 2 א. 50 EC נגזר מכושר עקומת מנת תגובת sigmoidal תוך לוד וLOQ מוגדרות כנקודת נתונים הריכוז הנמוכה ביותר שנופלת או 3 או 10 סטיות תקן מתחת לא שולט בונט (n = 6), בהתאמה. הנתונים מוצגים בשני מזון MLD 50 / g וכולל MLD 50 של נבדק בכל טוב ב200 μl נפח הדגימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול זה מתאר הליכים לכימות ונט / holotoxin, או supernatant מורכבים, Clostridium תרבות מטריצות מורכבות. הפרוטוקול הוא זהה, עם זאת, כאשר בודקים קפסיד אחרים ונט (למשל ונט / B, E, ו-F) עם מבחני מטריקס 56,60, למרות רגישות assay תשתנה פני קפסיד ומבחנים. פרוטוקול זה אינו לוקח בחשבון כל סוג של מדגם אפשרי וכמה שינויים שיידרשו בהתאם להרכב מדגם המסוים ויישום רצוי. מטריצות יכולות לכלול דגימות מזון (למשל בדיקת אתגר מזון) או מאגרי חומר לא פעילי תרופות (בדיקת מוצר מבוססת תרופה בונט לדוגמא). נוזל nonfood המורכב (למשל רקמות בעלי חיים או איכות סביבה) ודגימות מוצקות יש להתייחס אליהם כדגימות מזון. פרוטוקול זה משתמש כרכי 200 μl / גם מדגם אבל קטן כמו 50 μl / גם ניתן לבדוק עם התאמה מקבילה להיקף של 10x Bindinחיץ גרם. דוגמאות קטנות מ50 μl צריכה להיות מדוללים בGPB או PBS ל≥ 50 μl לפני הבדיקה.

הטבע משתנה מאוד של מוצרי מזון מהווה אתגר מיוחד לגילוי ונט וכימות במזון. pH לדוגמא, צמיגות, חוזק היוני, ואת הנוכחות של חומר חלקיקים יכולים כל פוטנציאל להשפיע על הפעילות של הרעלן בתוך מטריצת המזון ומחייבים שרעלן להיות מבודד מהמזון לכימות מדויק, במבחנה. מזונות רבים או תכשירי רעל מכילים גם פרוטאזות אנדוגני שיש להסירו או מומת בעת שימוש בכתבים המבוססים על חלבונים כדי להבטיח שרק פעילות פרוטאז ונט הספציפית נמדדה. מטריצות אפילו פשוטות, מוגדרות היטב חיץ, כגון מאגרי חומר לא פעילי תרופות, יכולות להכיל תרכובות המפריעות לפעילות בונט שיש להסיר לפני הכימות 35,56-59,61. Immunoprecipitation מציע, מאוד סרוטיפ ספציפי ונט פורי מהירהשיטה אבל fication דורשת נוגדני זיקה גבוהים לבודד את ריכוזי רעלן נמוכים נמצאים במזון "בעולם האמיתי", סביבתי, ודגימות תרופות.

הפרוטוקול המתואר מטהר את הרעל באמצעות חרוזים פאראמגנטיים מצופים בנוגדנים נגד ונט / מכוונים תחום קולט שרשרת כבדה של רעלן בונט / holotoxin ליבת 56. מיני Clostridium, עם זאת, באופן טבעי לייצר מתחמי הרעלן מורכב מholotoxin הליבה בעמותה עם תנומות 62-64. התנומות להגן על רעלן מפני התקפת פרוטאז בדרכי העיכול והם האמינו כדי להקל על תחבורת רעלן על פני אפיתל מעי 63,65. התנומות מעכבות קשירה של הנוגדנים ה-IP-אנטי ונט / חרוז לholotoxin הליבה (מידע לא מוצג). עיכוב זה הוא הקלה על ידי הגדלת ה-pH המדגם לעיל ~ 6.25, גורם לונט / רעל אפקטיבי מורכב התפרק לholotoxin ותנומות ומאפשריםמחייב את ה-IP-חרוזי 66. מסיבה זו, כדי להתאים את ה-pH המדגם לעיל 6.5 הוא קריטי להצלחה של assay (איור 5). חיץ עקידת 10x המשמש בפרוטוקול מכיל סוכן חציצה כדי לסייע להעלות את רמת החומציות לתנאי assay סטנדרטיים. עם זאת, רבים מזונות חומציים יכולים להציף את יכולת החציצה של חיץ המחייב. חיץ נטרול נוסף 10x מגדיל מאוד את יכולת חציצת מדגם וצריך לנטרל את רוב מטריצות מזון.

פרמטר חשוב נוסף עבור assay הוא כוח היוני מדגם. הבהרה של הדגימות על ידי צנטריפוגה נדרש לשטיפה יעילה חרוז והתאוששות הבא immunoprecipitation. בדיקה עם עגבניות טריות גילתה כי אין בונט / התאוששות הייתה לראות כאשר הדגימות היו פשוט מעובד וcentrifuged. חוקרים שערנו כי בונט / עשוי לשייך עם בשר העגבניות גורמים לו לגלולה במהלך צנטריפוגה ולהיות נעדרו מןsupernatant נבדק. מצאנו כי הגדלת הכוח היוני או, באופן משמעותי יותר, נטרול האינטראקציות מוגבלות pH בין ונט ומטריקס וכתוצאה מכך התאוששות רעל משופרת (איור 5). אמנם לא נדרש להתאוששות בונט, הוא צפוי, אם כי לא הוכיח, כי ריכוז מלח גבוה יותר יהיה גם להגדיל את ההחמרה של immunoprecipitation ולגרום להתאוששות חלבון פחות ספציפי, במיוחד במזונות דלי מלח.

pH לדוגמא והתאמת כוח יונית בפרוטוקול מבוצע על ידי התוספת של חיץ 10x ניטרול וצריכים להיות תואם עם מגוון רחב של מזונות. בעוד חיץ נטרול 10x בעל קיבולת חציצה גבוהה, כמה מזונות חומציים ביותר עשויים לדרוש התאמת pH נוספת. בדיקה של ה-pH המדגם הבא בנוסף חיץ מומלץ אם ביצועי assay עניים הוא ציין ונפח דגימה מאפשר. התאמת ה-pH נוסף יכולה להיות מושגת באמצעות התוספת של יםכרכי קניון של 1 M HEPES pH 8, אם נדרש. NaCl נוסף הוצג על ידי חיץ נטרול 10x צריך להיות מקובל על כולם מלבד המזונות המלוחים ביותר, עם זאת, יכול להיות מוחלף על חיץ 10x נטרול עם 1 pH M HEPES 8 אם תוצאות עניות נתפסות עם מזון נתון. אין הבדלים משמעותיים נצפו בעת בדיקת הפרוטוקול המתואר בריכוזים NaCl עד 1.2 M ב-PBS.

בעוד פרוטוקול זה חל על רוב הדגימות, מזונות על הקצוות של ה-pH, כוח היוני, ו / או תוכן פרוטאז לא עשויים להניב תוצאות טובות עם assay. מזונות מסוימים עשויים גם להישאר צמיג מדי בעקבות התוספת של GPB, וכתוצאה מכך התאוששות חרוז גרועה. Predilution של דגימות עם חיץ פשוט כגון PBS עשוי לשפר את התוצאות. הגדלת מספר שוטף או לשטוף חומרה (על ידי ריכוז NaCl הגדלת) ולהגדיל את הריכוז של מעכבי פרוטאז ללא EDTA עשויה גם לשפר את התוצאות אם contaminat פרוטאז ספציפייון הוא ציין. ניקיון מכשיר הוא גם מאוד חשוב בעת שימוש בשטיפת צלחת אוטומטית. זיהום של חרירי צנרת והזרקה עם פרוטאזות (למשל טריפסין) ממבחני מעבדה אחרים יכול להוביל להקדמה לא מכוונת של פרוטאזות במהלך assay. ניקוי יסודי של מכונת הכביסה הצלחת על פי המדריך למשתמש של היצרן מומלץ לפני הפעלת assay.

מבחני מטריקס BoTest הם מבחני הראשונים ממוסחר, המבוסס על פעילות לאיתור ונט וכימות של מטריצות מורכבות. בהשוואה למבדק העכבר הסטנדרטי, assay הוא מהיר, פחות יקר, ומאפשר בדיקת תפוקה גבוהה ללא הצורך במתקנים מיוחדים או חששות אתיים בנוגע לשימוש בבעלי חיים 56. במבחנה ונט שיטות זיהוי אחרות תוארו אך לא הוכחו להיות תואם עם מטריצות מדגם מורכבות, דורשות ציוד מיוחד, או שלא באופן מסחרי available 35,42-44,46-55. מבחני הם גם מבחני מבוססי פעילות המודדים את פעילות endoprotease רעלן, ואילו טכניקות assay immunosorbant צמודת אנזים המסורתי (ELISA) רק לדווח המוניות הרעלן. מבחני ELISA המבוסס על פעילות שתוארו קודם לכן, אבל מבחני אלה לא היו הפגינו לעבוד עם מטריצות מזון ולא להקיף טיהור הרעלים ממטריצת מדגם 41. הערכה חסרה משמעותית של הרעילות של דגימות מורכבות עלולה להתרחש אם הרעל לא מטוהר מהמדגם מאז תרכובות מטריצה ​​לעתים קרובות מפריעות לפעילות בונט 35,56-59.

ברגע שהפרוטוקול הוא שולט, ניתן לבצע שינויים כדי להגדיל את כמויות מדגם ולהגביר את הרגישות לדוגמה. לדוגמא, קשירה של הרעלן לחרוזים יכולה להתבצע במדגמים גדולים יותר, בתפזורת (למשל 10 מיליליטר או יותר) לפני האיסוף על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן ניתן להוסיף חרוזים אלה לצלחת 96 היטב וassayed הבא לתארפרוטוקול ד. עלייה ברגישות רבה יותר מאשר יומן אחד כבר נצפתה עם גודל מדגם מוגבר 56. לפיכך, הפרוטוקול המתואר ניתן להשתמש בדגימות נפח גדולות יותר כדי לזהות אפילו כמויות זעירות של ונט הכלולות בדגימות שעשויות שלא להתגלות על ידי מבדק העכבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

FM דאנינג, TM פיאצה, פ Zeytin, ומקלחת טאקר הם עובדים או בעלי BioSentinel בע"מ BioSentinel כיום מייצר ויש ממוסחרים חלק מהחומרים הכימיים שהוצגו בדוח זה.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לח' Olivares וד 'רוגה לדיונים ועצות רבי ערך. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי הפרס NSF SBIR (IIP-1,127,245 לBioSentinel Inc) וחוזה של משרד ההגנה (W81XWH-07-2-0,045 לBioSentinel Inc).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A Metabiologics Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Fisher Scientific 15036

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
  2. Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
  3. Montal, M. Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu. Rev. Biochem. 79, 591-617 (2010).
  4. Lacy, D. B., Stevens, R. C. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins. J. Mol. Biol. 291, 1091-1104 (1999).
  5. Montecucco, C., Schiavo, G. Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins. Q. Rev. Biophys. 28, 423-472 (1995).
  6. Ahnert-Hilger, G., Munster-Wandowski, A., Holtje, M. Synaptic vesicle proteins: targets and routes for botulinum neurotoxins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 159-177 (2013).
  7. Yamasaki, S., et al. Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinal neurotoxins and tetanus toxin. J. Biol. Chem. 269, 12764-12772 (1994).
  8. Schiavo, G., et al. Identification of the nerve terminal targets of botulinum neurotoxin serotypes A, D, and E. J. Biol. Chem. 268, 23784-23787 (1993).
  9. Schiavo, G., et al. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature. 359, 832-835 (1992).
  10. Schiavo, G., et al. Botulinum G neurotoxin cleaves VAMP/synaptobrevin at a single Ala-Ala peptide bond. J. Biol. Chem. 269, 20213-20216 (1994).
  11. Rossetto, O., et al. SNARE motif and neurotoxins. Nature. 372, 415-416 (1994).
  12. Montecucco, C., Schiavo, G. Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Mol. Microbiol. 13, 1-8 (1994).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  14. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin C1 blocks neurotransmitter release by means of cleaving HPC-1/syntaxin. EMBO J. 12, 4821-4828 (1993).
  15. Cherington, M. Clinical spectrum of botulism. Muscle Nerve. 21, 701-710 (1998).
  16. Lindstrom, M., Korkeala, H. Laboratory diagnostics of botulism. Clin. Microbiol. Rev. 19, 298-314 (2006).
  17. Werner, S. B., Passaro, D., McGee, J., Schechter, R., Vugia, D. J. Wound botulism in California, 1951-1998: recent epidemic in heroin injectors. Clin. Infect. Dis. 31, 1018-1024 (2000).
  18. Passaro, D. J., Werner, S. B., McGee, J., MacKenzie, W. R., Vugia, D. J. Wound botulism associated with black tar heroin among injecting drug users. J. Am. Med. Assoc. 279, 859-863 (1998).
  19. Brook, I. Infant botulism. J. Perinatol. 27, 175-180 (2007).
  20. Arnon, S. S. Honey, infant botulism and the sudden infant death syndrome. West J. Med. 132, 58-59 (1980).
  21. Arnon, S. S. Infant botulism. Annu. Rev. Med. 31, 541-560 (1980).
  22. Peck, M. W., Stringer, S. C., Carter, A. T. Clostridium botulinum in the post-genomic era. Food Microbiol. 28, 183-191 (2011).
  23. Sharma, S. K., Whiting, R. C. Methods for detection of Clostridium botulinum toxin in foods. J. Food Prot. 68, 1256-1263 (2005).
  24. Sobel, J. Botulism. Clin. Infect. Dis. 41, 1167-1173 (2005).
  25. Chen, S. Clinical uses of botulinum neurotoxins: current indications, limitations and future developments. Toxins. 4, 913-939 (2012).
  26. Sinha, D., Karri, K., Arunkalaivanan, A. S. Applications of Botulinum toxin in urogynaecology. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 133, 4-11 (2007).
  27. Dmochowski, R., Sand, P. K. Botulinum toxin A in the overactive bladder: current status and future directions. BJU Int. 99, 247-262 (2007).
  28. Benecke, R., Dressler, D. Botulinum toxin treatment of axial and cervical dystonia. Disabil. Rehabil. 29, 1769-1777 (2007).
  29. Hunt, T., Clarke, K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin. Neuropharmacol. 32, 28-31 (2009).
  30. Marchetti, A., et al. Retrospective evaluation of the dose of Dysport and BOTOX in the management of cervical dystonia and blepharospasm the REAL DOSE study. Mov. Disord. 20, 937-944 (2005).
  31. Wohlfarth, K., Sycha, T., Ranoux, D., Naver, H., Caird, D. Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment. 25, 1573-1584 (2009).
  32. AOAC International, Clostridium botulinum and its toxins in foods (method 977.26 section 17.7.01). (2001).
  33. Schantz, E. J., Kautter, D. A. Microbiological methods: standardized assay for Clostridium botulinum toxins. J. AOAC. 61, 96-99 (1978).
  34. Ferreira, J. L. Comparison of amplified ELISA and mouse bioassay procedures for determination of botulinal toxins A, B, E, and F. J. AOAC. Int. 84, 85-88 (2001).
  35. Directive 2003/15/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Union. (2003).
  36. Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM Scientific Workshop on Alternative Methods to Refine, Reduce or Replace the Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing. Report No. 08-6416, NIH. (2008).
  37. Bitz, S. The botulinum neurotoxin LD50 test - problems and solutions. ALTEX. 27, 114-116 (2010).
  38. Balls, M. Replacing the animal testing of botulinum toxin: time to smooth out the wrinkles. Altern. Lab. Anim. 38, 1-2 (2010).
  39. Balls, M. Botulinum toxin testing in animals: the questions remain unanswered. Altern. Lab. Anim. 31, 611-615 (2003).
  40. Singh, A. K., Stanker, L. H., Sharma, S. K. Botulinum neurotoxin: where are we with detection technologies. Crit. Rev. Microbiol. 39, 43-56 (2013).
  41. Liu, Y. Y., Rigsby, P., Sesardic, D., Marks, J. D., Jones, R. G. A functional dual-coated (FDC) microtiter plate method to replace the botulinum toxin LD50 test. Anal. Biochem. 425, 28-35 (2012).
  42. Ouimet, T., Duquesnoy, S., Poras, H., Fournie-Zaluski, M. C., Roques, B. P. Comparison of Fluorigenic Peptide Substrates PL50, SNAPtide, and BoTest A/E for BoNT/A Detection and Quantification: Exosite Binding Confers High-Assay Sensitivity. J. Biomol. Screen. (2013).
  43. Scotcher, M. C., Cheng, L. W., Stanker, L. H. Detection of botulinum neurotoxin serotype B at sub mouse LD(50) levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk. PLoS One. 5, (2010).
  44. Mason, J. T., Xu, L., Sheng, Z. M., O'Leary, T. J. A liposome-PCR assay for the ultrasensitive detection of biological toxins. Nat. Biotechnol. 24, 555-557 (2006).
  45. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Anal. Biochem. 411, 200-209 (2011).
  46. Hines, H. B., et al. Use of a recombinant fluorescent substrate with cleavage sites for all botulinum neurotoxins in high-throughput screening of natural product extracts for inhibitors of serotypes A, B, and E. Appl. Environ. Microbiol. 74, 653-659 (2008).
  47. Gilmore, M. A., et al. Depolarization after resonance energy transfer (DARET): a sensitive fluorescence-based assay for botulinum neurotoxin protease activity. Anal. Biochem. 413, 36-42 (2011).
  48. Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
  49. Bagramyan, K., Barash, J. R., Arnon, S. S., Kalkum, M. Attomolar detection of botulinum toxin type A in complex biological matrices. PLoS One. 3, (2008).
  50. Wang, D., Baudys, J., Kalb, S. R., Barr, J. R. Improved detection of botulinum neurotoxin type A in stool by mass spectrometry. Anal. Biochem. 412, 67-73 (2011).
  51. Parks, B. A., et al. Quantification of botulinum neurotoxin serotypes A and B from serum using mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 9047-9053 (2011).
  52. Kalb, S. R., Goodnough, M. C., Malizio, C. J., Pirkle, J. L., Barr, J. R. Detection of botulinum neurotoxin A in a spiked milk sample with subtype identification through toxin proteomics. Anal. Chem. 77, 6140-6146 (2005).
  53. Kalb, S. R., et al. The use of Endopep-MS for the detection of botulinum toxins A, B, E, and F in serum and stool samples. Anal. Biochem. 351, 84-92 (2006).
  54. Boyer, A. E., et al. From the mouse to the mass spectrometer: detection and differentiation of the endoproteinase activities of botulinum neurotoxins A-G by mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 3916-3924 (2005).
  55. Barr, J. R., et al. Botulinum neurotoxin detection and differentiation by mass spectrometry. Emerg. Infect. Dis. 11, 1578-1583 (2005).
  56. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7687-7697 (2012).
  57. Jones, R. G., Ochiai, M., Liu, Y., Ekong, T., Sesardic, D. Development of improved SNAP25 endopeptidase immuno-assays for botulinum type A and E toxins. J. Immunol. Methods. 329, 92-101 (2008).
  58. Ekong, T. A., Feavers, I. M., Sesardic, D. Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology. 143 (pt 10), 3337-3347 (1997).
  59. Shone, C. C., Roberts, A. K. Peptide substrate specificity and properties of the zinc-endopeptidase activity of botulinum type B neurotoxin. Eur. J. Biochem. 225, 263-270 (1994).
  60. Piazza, T. M., et al. In vitro detection and quantification of botulinum neurotoxin type e activity in avian blood. Appl. Environ. Microbiol. 77, 7815-7822 (2011).
  61. Mizanur, R. M., Gorbet, J., Swaminathan, S., Ahmed, S. A. Inhibition of catalytic activities of botulinum neurotoxin light chains of serotypes A, B and E by acetate, sulfate and calcium. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 3, 313-321 (2012).
  62. Sugii, S., Sakaguchi, G. Molecular construction of Clostridium botulinum type A toxins. Infect. Immun. 12, 1262-1270 (1975).
  63. Sharma, S. K., Ramzan, M. A., Singh, B. R. Separation of the components of type A botulinum neurotoxin complex by electrophoresis. Toxicon. 41, 321-331 (2003).
  64. Bryant, A. M., Davis, J., Cai, S., Singh, B. R. Molecular composition and extinction coefficient of native botulinum neurotoxin complex produced by Clostridium botulinum hall A strain. Protein. J. 32, 106-117 (2013).
  65. Kukreja, R. V., Singh, B. R. Comparative role of neurotoxin-associated proteins in the structural stability and endopeptidase activity of botulinum neurotoxin complex types A and E. 46, 14316-14324 (2007).
  66. Eisele, K. H., Fink, K., Vey, M., Taylor, H. V. Studies on the dissociation of botulinum neurotoxin type A complexes. Toxicon. 57, 555-565 (2011).
בידוד וכימות של טוקסין עצבי ממטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).More

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter