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Neuroscience

BoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化

Published: March 3, 2014 doi: 10.3791/51170
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1BioSentinel Inc., Madison, WI

Summary

BoTestマトリックスボツリヌス神経毒素（BoNT）検出アッセイは、急速にサンプルマトリックスの範囲からのBoNTを浄化し、定量化する。ここでは、固体と液体の両方の行列からのBoNTの検出および定量のためのプロトコルを提示し、BOTOX、トマト、ミルクを用いたアッセイを示す。

Abstract

複雑なマトリックス中のボツリヌス神経毒素（BoNT）の正確な検出および定量は、製薬、環境、食品サンプルのテストに必要とされる。正確な効力試験をするBoNTベースの薬剤製品の製造および患者の安全のために必要であるが、食品の急速なBoNT試験は流行フォレンジック、患者の診断、および食品の安全性試験の際に必要となります。のBoNTテストのための広く使用されているマウスのバイオアッセイは、高感度であるが、迅速かつ日常的なBoNTのテストに必要な精度とスループットを欠いている。さらに、動物のバイオアッセイの使用はのBoNTテストのためのマウスのバイオアッセイに代わる米国および海外での薬物製品の規制当局や動物の権利の支持者による通話をもたらしました。いくつかのインビトロ置換アッセイは、単純な緩衝液中で精製されたBoNTでうまく機能するよう開発されてきたが、ほとんどは、非常に複雑なマトリックス中の試験に適用可能であることが示されていない。ここで、検出のためのプロトコルBoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックス中のBoNTが提示されている。検定は3つの部分から構成されています。最初の部分はテストのためのサンプルの調製を含む、第二部は、マトリックスからのBoNTを精製する抗のBoNT抗体でコーティングされた常磁性ビーズを用いて免疫沈降ステップであり、3番目の部分は分離されたBoNTのタンパク質分解を定量化蛍光性レポーターを使用して、アクティビティ。プロトコルは、液体および固体の両方の行列を用いて96ウェルプレートでハイスループット試験のために書かれ4-26時間の合計アッセイ時間は、試料の種類、毒素負荷、および所望の感度に応じた手動製剤の約2時間を必要とする。データは、リン酸緩衝生理食塩水、医薬製品、培養上清を、2％ミルク、新鮮なトマトのBoNT / A試験のために提示され、アッセイの成功のための重要なパラメータの議論を含むている。

Introduction

ボツリヌス神経毒素（BoNTを）が知られている最も致命的な物質で、1〜3 NGと推定静脈人間の致死量に/ 1,2キロ。七つのBoNT血清型は構造的に類似し、Gを介して標識され、各々は、サイトゾルと亜鉛エンドペプチダーゼ3-5をコードする軽鎖への細胞結合、取り込み、および転座に関与する重鎖ドメインからなる、存在する。部分的には、その具体的な結合および神経筋接合部6での運動ニューロンへのエントリーからのBoNT結果の絶妙な毒性。一旦ニューロンの内部に、軽鎖エンドペプチダーゼを特異的に切断する可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質レセプター（SNARE）小胞融合に必要なタンパク質の1つ以上が、神経伝達物質放出を阻害し、弛緩性麻痺7-14をもたらす。一般的疾患」ボツリヌス中毒」のBoNTによる横隔膜や肋間筋の麻痺として知られ、最終的には、その結果早期診断と治療しない限り、呼吸不全や死を受けている。

人間の食品媒介性ボツリヌス症は、最も一般的なBoNT血清型A、B、Eに関連付けられており、通常は、F（BoNT / A型、のBoNT / B 等 ）とは汚染された食物15,16の摂取に起因される。たが、創傷ボツリヌス中毒のいくつかのケース静脈内薬物使用者の間で報告された17,18。米国では、1歳未満の子供によるクロストリジウム胞子の摂取による乳児ボツリヌス症は、ボツリヌス中毒19〜21の中で最も一般的な形式です。しかし、不適切な家庭缶詰食品加工に起因する食中毒のBoNTのアウトブレイクは、米国および海外の両方で報告された。 2000-2009の間、食品媒介性ボツリヌス症の少なくとも338例は6死亡例22を含め世界的に報告された。迅速かつ高感度に食中毒ボツリヌス中毒の発生を検出する能力は、早期診断を支援することができ、重要な指標である23,24。さらに、費用対効果の高い、日常食品検査できるように検出方法が改善された食料安全保障につながる。

のBoNTの神経細胞の特異性と生物学的半減期が長く、また、それ強力な治療になります。米国において、BoNT系薬剤は、化粧品の条件や眉間のしわ、頸部ジストニア、片頭痛、過活動膀胱、および斜視などの神経筋関連障害の治療のための食品医薬品局（FDA）によって承認されています。多数の「適応外」アプリケーションは、重度の筋機能不全のため25〜28高用量治療を含む、文書化されています。過剰投与が潜在的に有害な副作用のリスクがある患者を置くながら過少が無効治療につながる可能性がある正確な毒素定量化は、正しい投与のために重要である。残念ながら、標準化された効力アッセイプロトコルはなBoNTに基づく薬剤のprodu間の単位定義不平等で、その結果、製造業者間で共有されていないCTS 29〜31。

のBoNTのための標準的な試験は、のBoNT含有試料をマウスに腹腔内注射し、死亡者の数は1〜7日以上16,32,33が記録されたマウスのバイオアッセイである。マウスバイオアッセイは、5月10日PGのBoNT / A 34の検出限界（LOD）と非常に敏感であるが、動物使用上の倫理的な問題、高い人材育成のコストと動物施設、長いアッセイ時間、および欠如を維持標準化されたプロトコルは標準化された、アニマルフリーのBoNTテストおよび定量方法35-39を開発するために呼び出しされた。最近、いくつかの代替のBoNT定量法は、マウスまたはそれに近いマウスバイオアッセイ感度40-49を提供することが開発された。これらの方法には、一般的に、蛍光、質量分析、または免疫学的方法を使用し、動物を使用することなく、マウスのバイオアッセイよりもかなり短いアッセイ時間を提供します。免疫学的techniqと組み合わせた質量分析のアプローチUEは、食品やその他の複雑なサンプルに含まれているのBoNTを検出し、定量化することが示されたが、人材育成の必要条件と特殊な装置の制限これらのアッセイは、50〜55。他のほとんどの代替のアッセイは、複雑なサンプル試験に容易に適用できないか、日常的なBoNTのテストに必要なスループットを欠いている。のBoNTの極端な効力に一致するように感度のインビトロアッセイ法を開発しようとする食品サンプルの粘度、pH、塩分、およびマトリックス構成成分の高度に可変性は、特に困難な挑戦を提示する。さらに、このようなBoNT系医薬品の再懸濁に起因するものなどであっても、単純で、比較的良性の緩衝系は、有意にインビトロ効力のBoNT 56影響を及ぼす塩、アルブミン、および糖安定剤（ すなわち、賦形剤）を含有する。毒素精製は、サンプル56〜59の最も単純ますが、すべての正確な活性試験のために必要である。

ザ·BoTestマトリックスアッセイは迅速で高スループットのために設計されており、一般的に研究室56,60で見つかった機器を使用して、高度に複雑なサンプルからのBoNTの一貫した定量化された。これらのアッセイは、共有結合的に結合して、サンプルからのBoNTを封鎖した後、洗浄することによってマトリックス化合物を干渉除去して血清型特異的抗のBoNT抗体に連結常磁性ビーズを使用しています。洗浄後、結合したBoNTタンパク質分解活性は、その後のBoNT血清型は、試験されると互換性のレポーターを用いて最適化反応バッファー中で定量化される。これらのレポーターは、N末端シアン蛍光タンパク質（CFP）部分とを構成するBoNT基板、SNAP25残基141から206またはシナプトブレビン残基33から94で連結されたC末端黄色蛍光タンパク質誘導体（ヴィーナス）部分からなる蛍光性タンパク質であるBoTest A / EまたはB / D / F / Gの記者、それぞれ45。のBoNTによるレポーター切断は、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて監視される。ときはT彼記者は、CFPの励起はCFP発光と刺激的な金星発光が消光、金星にFRETの結果、無傷である。のBoNTによるレポーターの切断は、CFP発光と金星排出量の減少の増加につながる、FRETを防ぐことができます。活性のBoNT次いで定量的にCFPと金星の発光の比率を用いて測定することができる。 3視聴以下LODは、ハイスループットの96ウェルプレートフォーマットを使用して、食品56の広い範囲から可能である。アッセイは、ビーズ表面上の毒素の濃度を可能にするので、感度の増加は、より大きな試料体積を用いて得ることができる。

のBoNT A、B、E、およびFのためのBoTestマトリックスアッセイは、食品、製薬、環境試料56,60を使用して開発し、試験した。ここでは、（ 例えば 、食品、環境）のサンプル低複雑でのBoNTの検出のためのこれらのアッセイを実行するための手順（ 例えば医薬品、バッファ内のBoNT）と高い複雑性を説明しています。具体的な処理方法いくつかのサンプルタイプについて、このプロトコルで扱われており、ここでは説明しない試料の種類は、通常、提示される方法の組み合わせを使用して適合させることができる。プロトコルが開発され、テストのBoNT / Aであるが他の場所で56,60実証されたように、それぞれのアッセイを使用して他のBoNT血清型に適用可能であるした。

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Protocol

1。アッセイ試薬の調製

  1. 15分間室温（RT）で200倍ジチオスレイトール（DTT）、10×マトリックス結合緩衝液（10×結合緩衝以下）、10倍の中和緩衝液（のみ食品またはpH不均衡サンプル）、および10×BoTest反応緩衝液（10×反応緩衝以後）を解凍または完全に解凍されるまで。このプロトコルで使用されるバッファーおよび試薬のリストについては、表1を参照してください。このプロトコルに必要な資機材のリストについては、表2を参照してください。
  2. ミックスする5秒解凍したバッファをボルテックスする。 10倍の結合バッファーは曇りの外観を持つことになりますしながら、10倍の中和バッファー、200xDTT、および10X反応バッファーが明確に表示されます。 37℃で5分間■10X反応バッファーを温め、それを解凍し、次の曇り表示された場合は、ボルテ​​ックスを繰り返します。
  3. 1X反応緩衝液3.8ミリリットルを生成します。
    1. 15ミリリットルコニカルチューブ」1X反応バッファーを "ラベルと3.42ミリリットルの分子生物学グレードのワットを追加ER、380μlの10倍反応緩衝液、および19μlの200倍のDTT。反転によりバッファよく混ぜる。
    2. 清潔なカミソリの刃を使用して、四半期にシングルEDTAフリープロテアーゼ阻害剤タブレットをカットし、1×反応バッファーへの錠剤の四分の一を追加します（残りの錠剤部分は、後で使用するために4℃で保存することができます）。NBプロテアーゼ阻害剤がない場合があります精製された毒素でシンプルな緩衝液（ 例えば医薬品のサンプル）を使用している場合必要になる。
    3. 渦プロテアーゼ錠剤が完全に溶解するまで1X反応バッファー。
  4. RTで20分間行列Aビーズ（以下、IP-Aビーズ）を温める。
  5. 遮光して室温でBoTest A / Eレポーター（A / Eレポーター以下）を解凍する。
  6. 15ミリリットルコニカルチューブ」0.5μMのA / Eレポーターを "ラベルと1.8ミリリットル1X反応バッファーに20μMのA / Eレポーター株式の45μlを加える。ピペッティングで完全に混合し、光から保護氷上で保存する。

2。スタンドARDカーブのサンプルの生成

ここで説明した標準曲線は、半対数希釈（ 表3）に10-30,000 MLD 50 /グラム食物やミリリットルあたりのバッファにまたがる。エンドユーザーは、適用可能な代替濃度を自由に使用することです。

  1. スパイクと基準物質とマトリックスをインキュベートする。可能であれば、マトリックス効果を低減するために、未知のものと同じマトリックスの希釈剤を用いて標準曲線を生成する。付加的なBoNT陰性マトリックス（ 例えば 、フィールドまたはBoNT流行試料検査）が利用できない場合は、ゼラチンリン酸緩衝液（GPB）またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を希釈剤として使用する。下記の適切なプロトコルは以下の選択肢のマトリックスにBoNT / Aに加えることによって、標準曲線を生成します。
    1. 低複雑性のサンプル（ 例えば 、PBS、GPB、または医薬品）
      1. 15ミリリットルコニカルチューブに適切な緩衝液10mlを加え、脇に置きます。このサンプルでは、​​standarの希釈剤として使用されるD曲線と未知の希釈液（セクション4）。
      2. マイクロチューブに1.2ミリリットルのバッファを追加します。
      3. 注意：この手順では、BoNTを使用し、取り扱いおよび毒素に接触任意の試薬 ​​および物質を廃棄する場合は細心の注意を使用する必要があります。個人用保護具とすべての材料の適切な処分を使用することはなBoNTのための労働安全衛生ガイドライン（http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html）の米国商務省に従って行われなければならない。最終濃度30,000 MLD 50 /ミリリットル（36,000 MLD 50の合計）となるように1.2ミリリットルの試料にBoNT / Aに追加します。
    2. 液状食品サンプル（または他の複雑な液体サンプル）注：初期テストは、液体マトリックス中の粒子状物質（。 例えばパルプ）として明らかにしたサンプルから回収された上清の量を決定することをお勧めしますが異なります。このプロトコルは、明らかにした上清の少なくとも1.2ミリリットルを1.4ミリリットルSAMPから回収することを想定していル。必要に応じてサンプルサイズを大きくします。
      1. 15ミリリットルコニカルチューブに10ミリリットルの液体食品を追加し、脇に置きます。このサンプルは、標準曲線と未知の希釈液（第4）の希釈剤として使用されます。
      2. 空の1.5 mlのマイクロ遠心チューブを秤量し、その質量を記録する。
      3. 秤量したマイクロ遠心チューブに液体食品の1.4ミリリットルを追加します。
      4. マイクロチューブを再秤量し、空のチューブの質量を差し引くことにより追加された食品サンプルの質量を計算します。
      5. 注意：この手順では、BoNTを使用し、取り扱いおよび毒素に接触任意の試薬 ​​および物質を廃棄する場合は細心の注意を使用する必要があります。個人用保護具とすべての材料の適切な処分を使用することはなBoNTのための労働安全衛生ガイドライン（http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html）の米国商務省に従って行われなければならない。 3万MLD 50 / Gフードの最終濃度で1.4ミリリットルのサンプルにBoNT / Aに追加します。
      6. 、インキュベーター希釈剤teの汚染や自然を模倣する、食品マトリックスと相互作用するのBoNT時間を与えるために2時間、RTまたは4℃でサンプルをスパイクした。
    3. 固体食品サンプル（または他の固体サンプル）注：初期の試験は1ミリリットルGPB / G食品の添加後、均質化、明確化のサンプルから回収された上清の量を決定することをお勧めします。このプロトコルは、上澄みを明らかにし、少なくとも1.2ミリリットルを2グラムのサンプルから回収されることを前提としています。必要に応じてサンプルサイズを大きくします。
      1. 50ミリリットルコニカルチューブに10グラムの固体試料を計量し、脇に置きます。これは、希釈剤として使用される。
      2. 第50ミリリットルコニカルチューブに2グラムの固形食品サンプルを量る。
      3. 注意：この手順では、BoNTを使用し、取り扱いおよび毒素に接触任意の試薬 ​​および物質を廃棄する場合は細心の注意を使用する必要があります。個人用保護具とすべての物質の適正処理の使用Sは（http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html）のBoNTのための労働安全衛生ガイドラインの米国商務省に従って行われなければならない。 3万MLD 50 / Gフード（60,000総MLD 50）の最終濃度に2グラムの試料の表面にBoNT / Aに追加します。
      4. 自然汚染を模倣、食品マトリックスと対話するためのBoNT時間を与えるために2時間RTまたは4℃で希釈剤および添加サンプルをインキュベートする。
  2. サンプルの均質化およびバッファの調整。サンプルタイプに応じて上記で生成されたスパイク標準曲線サンプルおよび希釈剤を処理します。
    1. 低複雑サンプル
      1. さらなるサンプル処理は不要である。
    2. 液状食品サンプル（または他の複雑な液体サンプル）
      1. いいえサンプルの均質化は必要ありません。
      2. 1.4ミリリットルを140μlの10倍の中和バッファーを追加スパイクサンプル1ミリリットル10倍Neutralizat10ミリリットル希釈試料にイオンバッファー。反転によりよくサンプルを混ぜる。
      3. 部分的に6000×gで4℃で10分間遠心分離することにより、両方のサンプルを明確にするすぐに上清を除去し、新しいチューブに移す。
    3. 固体食品サンプル（または他の固体サンプル）
      1. 10グラムの希釈液を試料に2グラムのBoNT / A-スパイク固体食品サンプルと10ミリリットルGPBに2ミリリットルGPB（1ミリリットルGPB / gの食品）を追加します。
      2. 十分にブレンドされるまで乳棒を使用してサンプルを均質化する。試料の性質に応じて、許容可能で均質化することができない材料の小さな塊があってもよい。あるいは、機械的な均質化法を用いることができる。 それが不活性化、ならびに毒素をエアロゾル化することができるように、ブレンダーの使用は推奨されない。
      3. （体積を20mlであれば、例えば 2ml）に近似総容量に基づいて、希釈試料に10倍の中和緩衝液の10分の1容量を加える。外挿するのBoNT / A-スパイク試料の全体積と10倍の中和バッファーの10分の1のボリュームを追加。反転によりよくサンプルを混ぜる。
      4. 部分的に6000×gで4℃で10分間遠心分離することにより、両方のサンプルを明確にするすぐに上清を除去し、新しいチューブに移す。
  3. テストのための標準曲線希釈系列を用意する
    1. 希釈剤としてD1とnonspikedサンプルとしてのBoNT / A-スパイク標準曲線サンプルを用いて、 表3によると1.5ミリリットルマイクロチューブ内の残りの標準曲線サンプルを生成。

3。未知のサンプルを準備します

このセクションは、セクション2に平行で完了することができる。

  1. 未知数の数と希釈液を決定します。可能な場合は三重で未知数をテストします。
    1. 定性アッセイでは、descriの試料を処理するのに必要とされるよりも、さらなる希釈なしの未知数を実行する下のベッド。
    2. 後述するように、定量的アッセイのために、一つ以上のサンプルはアッセイ反応の直線範囲内に入ることを保証するために、少なくとも二つの1:10希釈試料を調製。可能であれば、セクション3で説明したようにマトリックス効果を低減するために、未知のものと同じマトリックスの希​​釈剤を用いて希釈を生成する。それ以外の場合は、希釈剤としてPBSまたはGPBを使用しています。
  2. 生成およびサンプルタイプに応じて、未知のサンプルを希釈する。
    1. 低複雑性の未知数（ 例えば 、PBS、GPB、または医薬）
      1. 不明な希釈1を生成するために、マイクロチューブに未知の少なくとも750μlを添加する。
      2. 未知の希釈2と3というラベルの付いた2つのマイクロチューブに675μlの希釈剤を追加します。希釈剤は、検量線の作成に使用されるのと同じ材料であろう。
      3. シリアルに希釈2チューブに希釈175μlのを転送し、混合して希釈1を希釈。
      4. シリアルにdilut希釈3チューブに希釈2の75μLを転送して混合することにより、E希釈2。
    2. 液体食品の未知数（ま ​​たは他の複雑な液体サンプル）注：初期テストは、3章で述べたように明らかにしたサンプルから回収した上清の体積を決定することをお勧めします。必要に応じてサンプルサイズを大きくします。
      1. マイクロ遠心チューブに液体の未知の≥875を添加する。
      2. サンプル（875μlのサンプル用など 87.5μL）に10倍の中和バッファーの10分の1のボリュームを追加します。
      3. 部分的に6000×gで4℃で10分間遠心することにより、試料を明確にすぐに新しいチューブに上清を移す。これは未知の希釈1です。
      4. 未知の希釈2と3というラベルの付いた2つのチューブに675μlの希釈剤を追加します。希釈剤は、検量線の作成 ​​に使用したのと同じ処理された材料であろう。
      5. シリアルに転送による希釈1を希釈リング75の希釈2チューブと混合への希釈1μlの。
      6. シリアルに希釈3チューブに希釈2の75μLを転送し、混合して希釈2を希釈。
    3. 固形食物未知数（ま ​​たは他の固体サンプル）注：初期の試験は、3章で述べたように明らかにしたサンプルから回収された上清の量を決定することをお勧めします。必要に応じてサンプルサイズを大きくします。
      1. 50ミリリットルコニカルチューブに2グラムの固形未知の試料を秤量する。
      2. 2グラムの固体試料に2ミリリットルGPB（1ミリリットルGPB / gの食品）を追加します。
      3. セクション3.2.3.2で説明したように、サンプルを均質化する。
      4. （ボリュームは4ミリリットルの場合は例えば 0.4ミリリットル）おおよその全体積を基準にして、試料に10倍の中和バッファーの10分の1のボリュームを追加します。反転によりよくサンプルを混ぜる。
      5. 部分的に6000×gで4℃で10分間遠心することにより、試料を明確にImmediatelマイクロ遠心チューブにY転送≥750μlの上清。これは未知の希釈1です。
      6. 未知の希釈2と3というラベルの付いた2つのチューブに675ミリリットルの希釈剤を追加します。希釈剤は、検量線の作成 ​​に使用したのと同じ処理された材料であろう。
      7. シリアルに希釈2チューブに希釈175μlのを転送し、混合して希釈1を希釈。
      8. シリアルに希釈3チューブに希釈2の75μLを転送し、混合して希釈2を希釈。

4。最終サンプルの明確化

テスト液体または固体食品サンプル、微量での≥14,000×gで5分間遠心すべてのサンプルは、完全にサンプルを明確にする場合。すぐに上清を除去し、新しいチューブに移す。

5。プレートのセットアップおよびBoNT / Aは、プルダウン

  1. 具体的なプレートレイアウトはアプリケーションに依存しますが、外の井戸を使用していないようにエッジ効果を回避する。サンプルD9は6つのウェルを必要としながら、それぞれの未知試料と標準曲線サンプルD1〜D8は3ウェルを必要とします。示唆プレートレイアウトを図1に示す。
  2. 使用する各ウェルに20μlの10倍の結合バッファーを追加します。
  3. 三重テストのため、各明確に希釈し、3ウェル（D9用6ウエル）の各々への未知の200を添加する。マイクロプレートミキサーで10秒間プレートを混ぜる。
  4. IP-Aビーズを追加します。
    1. 最高速度で10秒間ボルテックスIP-Aビーズ。ビーズを完全に再懸濁させ、均質されていない場合は、ボルテ​​ックスを続ける。
    2. 各サンプルピペット20μL、IP-Aビーズ良く。
    3. マイクロプレートミキサーで30秒間プレートを混ぜる。
  5. 750回転、25℃以上、室温で2時間回転板インキュベーターを用いてプレートをインキュベートする。アッセイ性能を生成し、全てのインキュベーション工程の間にIP-ビーズ懸濁液を維持することに大きく依存する。 micropで常に再懸濁ビーズ全てのインキュベーション工程の間に軌道をマイクロタイタープレートシェーカーを用いて懸濁液をペレット化し、維持した後後期ミキサ。

6。プレート洗浄とビーズ再懸濁

  1. 手または磁気ビーズ互換の自動プレート洗浄機を使用してどちらかのプレートを洗ってください。磁気ビーズ用に設定され、自動プレート洗浄機を大幅アッセイのスループットを向上させます。
    1. マニュアル洗浄
      1. 「1X洗浄バッファー」50ミリリットルコニカルチューブにラベルを付け、45ミリリットルの分子生物学グレードの水と5ミリリットル10Xマトリックス洗浄バッファーを追加します。反転によりバッファよく混ぜる。
      2. 回転板のインキュベーターからプレートを取り外します。
      3. すぐに5分間、96ウェル、磁気ビーズ分離板にプレートを配置します。
      4. 96ウェル磁気ビーズ分離板にプレートを保ちながら、穏やかに除去し、単一またはマルチチャンネルピペットを使用して、サンプルウェルからの上清を捨てる。吸引しないでくださいビーズは、視覚的、偶発的ビーズを除去するためのピペットチップに吸引さのバッファを監視します。除去が目撃されている場合は、ゆっくりよく、reseparateに戻って、先端の内容を追加し、削除を繰り返します。
      5. 各サンプルウェルに300μlの1X洗浄バッファーを追加します。
      6. 完全にマイクロプレートミキサーで30秒間、プレートを混合することにより、ビーズを懸濁します。
      7. 2分間、96ウェル磁気ビーズ分離板にプレートをインキュベート。
      8. 削除して、以前のようにサンプルウェルからの上清を捨てる。
      9. 繰り返します4回の洗浄、合計6.1.1.5-6.1.1.8 3回繰り返します。
      10. 96ウェル、磁気ビーズ分離板にプレートを使用すると、視覚的にさえ上澄み削除を確認する井戸を点検し、必要に応じて過剰残った液を除去するために、ピペットを使用しています。いくつかのバッファがウェル内に残るお手入れビーズ除去やビーズの乾燥を避けるように注意する必要があります。
      11. 各サンプルウェルに50μlの1×反応緩衝液を加え、30 SEのプレートをミックスCマイクロプレートミキサーで完全にビーズを再懸濁します。必要であれば、完全にビーズを再懸濁し、ピペットを使用しています。
    2. 自動プレート洗浄
      1. 表4に従ってセットアップし、プログラムワッシャー。クリーンで高品質な（ 例えばナノ純）水で洗濯機をフラッシュします。
      2. 素数プログラム「プライム」を実行して、ワッシャー。
      3. 回転板のインキュベーターからプレートを取り外します。
      4. すぐにプレート洗浄機で96ウェルの磁気ビーズ分離板にプレートを配置します。
      5. リンクプログラム「マスターウォッシュ」を実行します。最初のプログラムステップは、ワッシャが静止になる5分のインキュベーションステップである。
      6. プログラム完了後、洗濯機からプレートを取り外し各サンプルウェルに50μlの1×反応バッファーを追加し、完全にビーズを再懸濁し、マイクロプレートミキサーで30秒間プレートをミックス。必要であれば、完全にビーズを再懸濁し、ピペットを使用しています。

    7。アッセイ開始およびインキュベーション

    1. 各サンプルウェルに50μlの0.5μMのA / Eレポーター（第1参照）を追加し、完全にビーズを再懸濁し、マイクロプレートミキサーで30秒間混ぜる。
    2. エッジ効果を防ぐために、プレート上の各未使用のウェルに100μlの水を加える。
    3. プレートシールテープでプレートをシールし、25℃以下、RT、750 rpmで回転板インキュベーターを使用して静置します。インキュベーション中の光からプレートを保護します。

    8。データ収集と分析

    注：このアッセイは、所望の感度が得られるまで複数回測定することができるリアルタイム·アッセイで、不要停止試薬がありません。推奨される初期読み出し時間は、インキュベーション時間と共に増加アッセイ感度で2,4、および24時間のインキュベーション時間である。

    1. データ収集
      1. 各読む時には、回転板のインキュベーターからプレートを取り外し、シールを削除テープをING、すぐに96ウェルの磁気ビーズ分離板にプレートを配置します。ビーズは2分間分離することができます。
      2. マイクロプレートリーダーにプレートを置き、〜470で排出量を測定し、〜434 nmでの励起下〜526 nmの。
      3. 追加の読み取り時間が必要な場合は、マイクロプレートミキサーで30秒間ビーズを再懸濁し、プレートを再密封し、回転板のインキュベーターにプレートを返します。
    2. データ解析
      1. 470 nmでのRFU値で526 nmでの相対蛍光単位（RFU）の値で除して、各サンプルの放射率を算出。
      2. 標準曲線のデータポイントのログ[のBoNT / A]対発光比率をプロットします。テストされたBoNT / Aの効力範囲に応じて、シグモイド用量反応曲線は、（代表的な結果を参照）が得られるでしょう。
      3. 可変勾配の用量反応曲線Y =ボトム+を標準曲線データをフィット（トップ下）/（1 +10 ^（（logEC 50-X）*勾配））Xが濃度の対数であり、Yは応答であり、Yはボトムから始まり、シグモイド形状でトップに移行する。
      4. 検出限界（LOD）、定量限界（LOQ）と、半最大有効濃度（EC 50）を決定します。検出限界は、ブランク対照を下回る3未満の標準偏差（SDの）放射率を有する（n = 6）を試料として定義される。定量化の限界は、10未満のSDブランク対照下方に発光比を有する（n = 6）を試料として定義される。 EC 50を、シグモイド用量応答曲線適合から決定される。
      5. シグモイド用量反応標準曲線に対して未知の試料の効力を補間。
        1. 定量的な結果を得るためには、未知のサンプルは、理想的には、標準曲線の直線部分に入る必要があります。 （20〜80％全アッセイ応答ウィンドウを計算することにより、標準曲線の直線部分に近似する場合、例えば標準曲線rの放出比0.5から2.5アンジェ、直線範囲）が0.9から2.1の範囲で標準曲線の一部であろう。
        2. 定性的な結果を得るためには、標準曲線のLODおよびLOQに対して未知のサンプルを比較します。
        3. 標準曲線の限界を超えて未知のサンプルを推定しないでください。

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Representative Results

記載されたプロトコルにおけるステップを要約した図を図2に示されている。検定は、サンプルの種類と必要なアッセイ感度に応じて、完了するために4月26日時間の間が必要ですが、実践的な時間しか〜2時間。アッセイは、96ウェルプレート中で実施し、実行されるテストのタイプに依存している、プレート当たりの基準を含む最大20個のサンプルの三連の試験を可能にする。

図3は、BoNTを使用して代表的なアッセイの結果を示しています/ホロ毒素をPBSにスパイクおよびA / Eの記者と2、4、および24時間のインキュベーション後に記述されたプロトコルを使用してテスト。精製されたBoNT /ホロ毒素を〜150 kDaで、その定義された分子量は、毒素複合体のためのより広範に定義された700〜900 kDaのに比べので、この実験のために選択され、純度は、正確な濃度で非常に正確なスパイクを許可した。発光比、434での励起後470nmの場合と526 nmでの発光の比率以下、各時点でのBoNT /濃度（MLD 50値のBoNT / Aメーカーの効力のテストに基づいています）に対してプロットされている。のBoNTによるレポーターの切断は、当社のプレートリーダーを用いて約0.7に完全に切断された記者のために約2.7そのままReporterの間の範囲で発光比、の減少として測定される。これは、RFUは、各プレートリーダーで蛍光を測定するので、蛍光強度比の実際の値が使用されるプレートリーダーに依存するであろうことに留意することが重要である。曲線の左シフトによって見られるように、増加したレポーターの開裂におけるレポーター結果とインキュベーション時間を延長した。回試験のデータ点は、平均値の低いSDを表示し、減少した毒素負荷の増加発光比の予想される傾向に従う。この予想される傾向に従わアッセイの失敗は、希釈生成やデータ描画中にエラーがある可能性があります。何のBoNT / Aを含まないコントロールの放出比もドゥリン堅調に推移非特異的プロテアーゼ活性の欠如を示すグラムインキュベーション（ 図3、挿入図）。

医薬のBoNT / Aのサンプルを定量するためにこのプロトコルを使用した例が図4に示されている。標準曲線は、精製されたBoNT / Aホロ毒素を含むPBS中で生成され、0.9％生理食塩水で再水和凍結乾燥BOTOXの単100 Uバイアルから生成された薬物製品の希釈液と平行して処理した。 （理想的には、標準曲線は、BOTOXの基準ロットから構成されることになるが、このような材料は、容易に利用可能ではなかった。）試料を50μlの試料を10×結合緩衝液を使用せずに、二連で試験したことを除いて、記載したプロトコルを用いて試験した。標準曲線のBoNT / A / Eのレポーターで24時間のインキュベーション後の濃度の関数としてプロットした。各未知試料の発光比率を、標準曲線を横切って、その交点をプロットすることにより視覚化した。このアッセイでは、行標準曲線（20〜80％アッセイ応答ウィンドウ）のアル部分は2.11から1.05の放射率との間に落下し、図中の破線のボックスで示されている。この線形範囲内に3未知数の濃度を、標準曲線（ 図4、挿入図）から補間された。この例では、標準曲線に対して任意の未知のサンプルを検出または定量化するために使用される一般的な方法論を示しています。

新鮮なトマトおよび2％のミルクを固体（トマト）と液体食品（2％ミルク）マトリックスの両方を使用して、プロトコルの性能および感度を実証するために選択した。この準備は、自然クロストリジウム汚染の間に産生された毒素に似ていることから、コアホロ毒素と神経毒関連タンパク質（NAPを）構成のBoNT / A複合体は、これらの実験のために選択した。 図5Aに示すように、A / Eレポーターの切断として測定されたBoNT / Aの回収において、a、bを用いて観察されOTH行列。記者と増加し、インキュベーション時間は、アッセイ感度が向上しますが、食品からのキャリーオーバーのBoNT / Aから観測され、切断の結果や非特異的ではないプロテアーゼを示し、無毒素コントロール（ 図5A、インセット）のために減少した排出量比にはならないアッセイ。 図3の場合と同様に、データが低い変動を表示し、減少したレポーターを有する切断の傾向が予想される毒素濃度の減少に従う。

のBoNT / A LOD、LOQ、およびEC 50に示す各時点で両方の食品の表5にまとめる。 LODおよびLOQは、それぞれ、3よりも低く、10のSD背景（何のBoNT / Aを含まないサンプル）を下回る放射比の最低濃度サンプルとして定義されています。シグモイド用量反応曲線の補間が低い理論的限界を計算するために使用することができるが、これらの制限は、試験されたデータ点に制限される。いくつかのマトリックスへのマトリクス効果は、ビーズおよびビーズの洗浄時に回収毒素の結合に影響を及ぼし得るようにLODおよびLOQマトリックス変動が予想される。それは、図5（a）のデータから、トマトは2％のミルクからより多くの毒素の回収があったように思われるが、この差の大部分は、GPBでトマトのサンプルを均質化するために必要な追加の希釈に起因する。

固体食品マトリックスであることに加えて、トマトは10倍の中和緩衝液の添加によって達成pHおよびイオン強度調整は、アッセイの成功にとって重要で注目すべきサンプルタイプである。の包含を伴うまたは伴わないトマトをテストする際に、図5Bは、アッセイ応答を示す10倍の中和バッファー。サンプルからのBoNT / Aの貧弱な回復に10倍の中和バッファーの結果を追加し、すべてのテストされたBoNT / A濃度にわたって一定放出比によって実証されている障害。 10倍の中和緩衝液の添加、しかし、rは毒素の高感度検出にesults。

のBoNT以外のプロテアーゼは、A / Eのレポーターを切断する可能性があるので対処しなければ複雑なマトリックスに含まれる非特異的プロテアーゼは、偽陽性につながることができます。非特異的なプロテアーゼは、食品サンプルに対して内因性又はクロストリジウム培養上清として未精製の​​BoNT製剤を使用する際に導入されてもよい。徹底したビーズの洗浄は、ほとんどの非特異的プロテアーゼを除去するが、反応緩衝液にプロテアーゼ阻害剤の添加が不可欠である6が修飾A / Eレポーター、BoTest KO（KOレポーターを用いて、クロストリジウムのBoNT / Aの培養上清中に見出され、非特異的なプロテアーゼ活性を示す図 。 ）。 KOの記者がBoNT / A型切断部位は、それはもはやのBoNT / Aによって切断されるように変異していないことを除いて、A / Eの記者と同じですしたがって、任意の観測されたレポーターの切断は、非特異的プロテアーゼ活性に起因する。 KOレポーターCLE高レベルのavageは、培養上清をプロテアーゼ活性の高いレベルを含有することを示したが、その活性が効果的にプロテアーゼ阻害剤の添加によって打ち消される。

サンプルデータは、高スループットのBoNT /シンプルなバッファや食品マトリクスでの検出のためのプロトコルの有用性を実証している。特定の食品は、小さなアッセイの調整が必要な場合がありますが、説明されたプロトコルは、食品の種類の大部分で良好な結果が得られるはずです。

図1
図1プレートレイアウトを示唆した。サンプルは可能なエッジ効果を回避するために、プレートの内側の60ウェルに制限される。所望に応じて、未知のまたは標準曲線の試料を添加することができる。すべての未使用のウェルは、リポーターインキュベーション中に100μlの水で満たされなければならない。 CLI拡大画像を表示するには、ここをクリックCK。

図2
図2。説明されたプロトコルの概略図。プロトコルの各主要ステップはラベルの付いたボックスで示され、次の推定検定のタイムライン（正確な縮尺ではない）に揃えられます。非食品サンプルは、サンプル処理を必要とするので、食品サンプルの下流のプロトコルを入力しないでください。未知数のための連続希釈世代の周りの破線のボックスは、これはオプションであることを示しますが、ステップをお勧めします。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図3
図3。のBoNTの検出/記述されたプロトコルを使用してPBS中にホロ。精製されたBoNT /ホロ毒素をPBSにスパイクと上部のBoNT / 1 nMの濃度の記載したプロトコルを用いて試験した。全てのサンプルを三重で試験し、誤差バーは平均の標準偏差を表す。報告された効力は、毒素のメーカーのマウスバイオアッセイテストに基づいています。標準曲線の発光比率（434 nmでの励起時に470nmでの526 nmでの発光の比）がA / Eレポーターを有する2,4、および24時間のインキュベーション後に測定およびBoNT /濃度の関数としてプロットした。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図4
図4に記載のプロトコルを使用してBOTOX薬物製品の定量。凍結乾燥BOTOX薬物製品の単一の100 Uバイアルはresuspeあっ nded 220μlの0.9％生理食塩水で、連続的に希釈し、そして精製のBoNT / Aホロ毒素を用いてPBSで行われた標準曲線に対して未知数としてテスト。試料は、その50μlのサンプルを二連の10倍の結合緩衝液なしで試験した以外は、記載されたプロトコールに従って試験した。標準曲線を可変勾配シグモイド用量反応式に標準曲線の試料の発光比率をフィッティングおよびBoNT / A濃度の関数としてプロットすることにより算出した。それはA / Eの記者との24時間のインキュベーション後の標準曲線と交わる各未知のサンプルが表示されます。直線範囲（点線網掛けのボックス）内に入る未知試料の濃度を標準曲線から補間した。各ボトックス未知のラベルは、ラベルされた効力に基づいて、試料中に存在するユニットの数である。エラーバーは平均の標準偏差を表す。Tは= "_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図5
図5。のBoNT / A-スパイク2％の牛乳と新鮮なトマトのテストの回収が記載されているプロトコルを使用して2％の牛乳と新鮮なトマトの試料を精製したBoNT / A複合体とスパイクし、記述されたプロトコルを用いて試験した。全てのサンプルを三重で試験し、誤差バーは平均の標準偏差を表す。（A）2％ミルク、新鮮なトマト標準曲線の発光比率が2以下4を測定し、A / Eレポーターで24時間インキュベーションしたおよびBoNT / Aの効力の関数としてプロットした。アッセイ心不全におけるトマトの試験結果の間に10倍の中和バッファーを含むように（B）障害。新鮮なトマトのサンプルを用いて10倍または中立の添加なしのいずれか記載のプロトコールに従って試験したブリダイゼーションバッファー。示されたデータは、4時間の時点です。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図6
複雑なマトリクスをテストするときに図6プロテアーゼ阻害剤が必要とされる。 クロストリジウムのBoNT / A（株ホールA）培養上清をPBS中に連続希釈し、又はプロテアーゼ阻害することなく、反応緩衝液に添加し、Aの両方のいずれかに記載のプロトコルを用いて試験した/ EとKO記者。発光比は、A / EまたはKO記者の両方で24時間のインキュベーション後に測定されたBoNT / Aの効力の関数としてプロットした。 KOレポーターの有意な切断は、プロテアーゼ阻害剤を添加することなく見られたが、それらの包含によって打ち消された。全てのサンプルを三重し、エラー（b）に試験したARSは、平均値の標準偏差を表す。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

バッファ合成保存温度安定性注釈
結合バッファー10Xマトリックス 500mMのHEPES-NaOHを、pHが7.1、250mMのNaCl、1％のTween-20、5％カゼイン、0.05％のNaN 3 -20または-80℃〜 解凍時4℃で5日間以上は安定 BoTest行列Aボツリヌス検出キットに付属
10Xマトリックス洗浄バッファー 119 mMのリン酸塩、pH7.4で、1370のNaCl、27mMのKClを、1％Tween-20を -20または-80℃〜 解凍時4℃で5日間以上は安定 BoTest行列Aボツリヌス検出キットに付属
10倍の中和バッファー 1MのHEPES-NaOHを、pHが8.0、1MのNaCl 4℃ 4℃で最長6ヶ月間安定
10X BoTest反応バッファー 500mMのHEPES-NaOHを、pHが7.1、50mMのNaCl、1％Tween-20を、100μMのZnCl 2 -20または-80℃〜 解凍時4℃で5日間以上は安定 BoTest行列Aボツリヌス検出キットに付属
BoTest A / Eレポーター 50mMのHEPES-NaOHを、10mMのNaCl、15％グリセロールで20μM -80℃〜 少量ずつ保管してください。解凍時4℃で5日以上は安定。 BoTest行列Aボツリヌス検出キットに付属
ゼラチンリン酸緩衝液（GPB） 33.3のNaH 2 PO 4、pHが6.2、2g / Lのゼラチン 4℃ 4℃で1ヶ月までは安定
200xのジチオスレイトール（DTT） 1 M DTT -20℃〜 -20℃で最長6ヶ月間安定 （100μL）ずつを作り、小さな店
1×PBS-トン 11.9 mMのリン酸塩、pH7.4で、137mMのNaCl、2.7mMのKCl、0.1％Tween-20を 4℃ 4℃で1ヶ月までは安定フィッシャー（BP399-1）からの10倍のPBSを用いて製造することができる
行列Aビーズ（IP-Aビーズ） 共有結合ニワトリ抗のBoNT / PBS中の抗体に結合させた磁気ビーズ。 0.1％のTween-20、0.05％アジ化ナトリウム、0.25％カゼイン、50％グリセロール -20℃〜 -20℃から除去する際、4℃で5日間以上は安定-80℃での冷凍はしないでください

表1。説明されたプロトコルのために必要なバッファ。10倍の中和バッファは、非常に複雑な（ 例えば 、食品）のサンプルのためであり、アッセイされるサンプルの性質に応じて必要とされない場合があります。

素材/機器の名前会社カタログ番号コメント/説明
BoTest行列Aボツリヌス神経毒素検出キット BioSentinel A1015 のBoNT / BとFのための検出キットもご用意しています。
Varioskanフラッシュ蛍光マイクロプレートリーダーサーモフィッシャーサイエンティフィック 5250040 434 nmの励起および470 nmおよび526 nmの発光能力を有するほとんどのモノクロメーター又はフィルターベースユニットを使用することができる。
96ウェル磁気ビーズ分離プレート V＆Pサイエンティフィック VP771H その他の磁性板を用いてもよいが、プレートは、bは分離するように設計されるべきであるウェルの側にEADS。
磁気ビーズ互換プレートウォッシャーバイオテック ELX405 VSRM オプションの、唯一の自動プレート洗浄に必要。他の磁気ビーズと互換性のプレートウォッシャーを使用することもできるが、使用前にテストされるべきである。
マイクロ遠心さまざまな N / A オプションの、唯一の遠心分離を必要とするサンプルのために必要。
MixMateプレートミキサーエッペンドルフ 22674200
オービタルシェーカーさまざまな N / A 温度制御が利用可能な場合は、室温で、または25℃で使用
EDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠ロッシュ 4693132001 唯一の食べ物や環境試験のために必要。プロテアーゼ阻害剤はEDTAフリーでなければなりません。
のBoNT / A Metabiologics N / A オプションの、唯一の標準化および定量の目的のために必要な
黒、平底96ウェルプレート NUNC 237105 プレートは、扱われるべきではない
96ウェルプレートシーリングテープサーモサイエンティフィック 15036

表2。材料と記載されているプロトコルに必要な機器。一部の資機材は任意ですか、利用可能な機器に応じて置換することができる。代替機器を使用する場合は、追加の適合性のテストと最適化が必要になることがあります。

</ TR>
サンプル名ボリューム毒素ボリューム希釈 [のBoNT / A]（MLD 50 / ml）または（MLD 50 / Gフード） ログイン[のBoNT / A]（MLD 50 / ml）または（MLD 50 / Gフード） D1 1200μL証券 N / A 3万 4.48
D2 300μlのD1 600μL 万 4
D3 90μL、D1 810μL 3000 3.48
D4 90μLD2 810μL 千 3
D5は 90μLD3 810μL 300 2.48
D6は 90μLD4 810μL 100 2
D7〜 90μL、D5 810μL 30 1.48
D8 90μLのD6 810μL 10 1
D9 N / A 1400μL N / A N / A

表3：標準曲線サンプルの希釈テーブルこのテーブルには、大きさの3.5桁以上の半対数希釈での標準曲線を生成します。十分なノーのBoNTブランク試料（D9）は= 6のnを実行するために生成されます。必要に応じて追加の希釈液を追加することができます。

<TD> 0
プログラム名変数値注釈
プライム試薬瓶 A
首相ボリューム 400
首相流量 7
総理の後浸る？ N
行列ウォッシュ試薬瓶 A 残存プロテアーゼ活性が観察される場合、洗浄回数を増やすことができる。
方法
4
浸る/シェイク Y
時間ソーク 180
浸す前に振る？ N
首相は後ソーク？ N
DISP
ボリュームを分配 300
流量を分配 5
高さを分配 130
HOR。順位を分注する。 0
吸引除去を無効にする？ Y
おしり洗浄ファースト？ N
スタート前首相？ N
Aspir
吸引高さ 40
HOR。吸引除去順位。 0
吸引レート 5
誤嚥遅延
横を吸引？ N
最終的な吸引？ Y
最終的な吸引遅延 0
行列はソーク時間ソーク 300 増加浸し期間は、より粘性の食品から、ビーズの回収を増大させることができる。
浸す前に振る？ N
マスターウォッシュ行列はソークこのマトリックスはソーク実行する」リンク」のプログラムであり、一緒にマトリックス洗濯プログラム。
行列ウォッシュ

表4。磁気ビーズ互換の自動プレート洗浄機プログラムの設定。次のプログラムは、プレートウォッシャーをウェル側へとバッファスイッチングモジュールは、このような1X洗浄バッファー（という設定されていることをビーズを引くマグネットが装備されていることを前提としていPBS-t）は、これらのプログラムは、BioTekのELX405に固有の弁A.に取り付けられている。プログラミング命令のための機器のマニュアルを参照してください。他の磁気ビーズ互換自動プレート洗浄または真空マニホールドを使用することができるが、テストは、洗浄中に洗浄効率を最大化し、ビーズの損失を最小限に抑える設定を定義する必要があります。洗浄後のビーズ回復の初期テストに関係なく使用される特定のプレートウォッシャーのをお勧めします。

<TD> LOD
食品マトリックスメトリック 2時間 4時間 24時間
MLD 50 / Gフード MLD 50 /ウェル MLD 50 / Gフード MLD 50 /ウェル MLD 50 / Gフード MLD 50 /ウェル
ミルク 300 58 100 19 30 6
LOQ 千 193 300 58 100 19
EC 50 2404 464 590 114 92 18
新鮮なトマト LOD 千 91 300 27 30 3
LOQ 千 91 千 91 100 9
EC 50 7561 687 1932 176 229 21

表5。検出限界（LOD）、定量限界（LOQ）、およびハーフMLODおよびLOQを下回る最低濃度データポイントであると定義されている間、図2Aに示される2％のミルク、新鮮なトマトの試験のためaximal有効濃度（EC 50）。EC 50は、シグモイド用量応答曲線適合から誘導されるノーのBoNT対照（n = 6）は、それぞれ下記の3又は10のいずれかの標準偏差。データは、MLD 50 /グラム食物と200μlのサンプル量でウェルごとにテストの合計MLD 50の両方に示されている。

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Discussion

このプロトコルは、複雑なマトリックス中のBoNT / A複雑、ホロ毒素、またはクロストリジウム培養上清を定量化するための手順について説明します。アッセイ感度は血清型およびアッセイ間で変化するが、56,60それぞれのマトリクスアッセイと他のBoNT血清型（ 例えばのBoNT / B、E、およびF）をテストする際のプロトコルは、しかし、同じです。このプロトコルは、可能な試料の種類毎に考慮していない、いくつかの改変は、特定のサンプル組成物および所望の用途に応じて必要とされ得る。マトリックスは、食品試料（ 例えば 、食品負荷試験）又は医薬賦形剤の緩衝液（ 例えばなBoNTベースの薬剤製品試験）を含むことができる。複雑な食料品以外（ 例えば動物の組織または環境的）液体と固体のサンプルは、食品サンプルとして扱う必要があります。このプロトコルは、200μl/ウェルのサンプルのボリュームを使用していますが、50μL/ウェル10倍バインディンの容量に対応する調整をテストすることができるように、わずかGバッファ。 50μLより小さいサンプルは、試験前≥50μlにGPBまたはPBSで希釈してください。

食品の非常に可変的性質は、食品中のBoNTの検出および定量化のための特定の課題を表しています。試料のpH、粘度、イオン強度、および粒子状物質の存在は、すべての潜在的食品マトリックス内毒素の活性に影響を与え、毒素が正確、 インビトロ定量のために、食品から単離することを必要とすることができる。多くの食品又は毒素製剤はまた、唯一のBoNT特異的プロテアーゼ活性を測定することを保証するためにタンパク質ベースのレポーターを使用するときに除去又は不活性化されなければならない内因性プロテアーゼを含有する。そのような医薬賦形バッファとして単純な、明確に定義されたバッファ·マトリックスは、定量35,56-59,61前に除去しなければならないのBoNT活性を妨害する化合物を含有することができる。免疫沈降は、高速での高い血清型特異的なBoNTプリを提供していますfication方法が、 "現実世界"食料、環境、製薬サンプルで見つかった低毒素濃度を分離するために、高親和性抗体を必要とします。

記載されたプロトコルは、BoNT /コアホロトキシン56の毒素重鎖受容体ドメインに向けられたアンチたBoNT / A抗体でコーティングした常磁性ビーズを使用して毒素を浄化する。 クロストリジウム種は、しかしながら、天然に関連して、コアホロ毒素からなる毒素複合体を生成するNAPを62〜64に。 NAPには、胃腸管中のプロテアーゼの攻撃から毒素を保護し、腸上皮を横切っ63,65毒素輸送を促進すると考えられている。 NAPは、コアホロトキシン（データは図示せず）にIP-ビーズ、抗たBoNT / A抗体の結合を阻害する。この阻害はなBoNT /ホロ毒素とのNAPに解離が複雑でできるように効果的な毒素を引き起こし、6.25〜上記のサンプルのpHを上げることにより緩和されるIP-Aビーズ66に結合する。このため、6.5より上にサンプルのpHを調整するアッセイ（ 図5B）の成功に不可欠です。プロトコルで使用される10倍の結合バッファーは、標準的なアッセイ条件にpHを上げるのを助けるように緩衝剤が含まれています。しかし、多くの酸性食品はBinding緩衝液の緩衝能力を圧倒することができる。追加の10倍の中和バッファーを大幅試料緩衝能力を増大させ、食品マトリックスの大部分を中和する必要がある。

アッセイのための別の重要なパラメータは、試料のイオン強度である。遠心分離によるサンプルの明確化は、免疫沈降、次の効果的なビーズ洗浄と回復のために必要です。新鮮なトマトとのテストでは、サンプルは、単純に処理し、遠心分離したときにのBoNT /回復が見られなかったことを明らかにした。私たちは、BoNT / Aには、それが遠心分離中にペレット化する原因とトマトの果肉と会合を欠席になる可能性があると仮定上清をテストしました。私たちは、のBoNTおよび改善毒素の回収（ 図5B）で、結果の行列の間のpH限定された相互作用を中和する、より重要なのは、イオン強度を高めたりすることを見出した。のBoNT回復に必要ではないが、より高い塩濃度はまた、免疫沈降法の厳密性を高め、より少ない非特異的なタンパク質回収をもたらし、特に、低塩食品にすることを、実証していないが、期待されている。

プロトコルにおける試料のpHおよびイオン強度の調整は、10倍の中和緩衝液の添加によって実行され、食品の広い範囲に適合すべきである。 10倍の中和緩衝液は、高い緩衝能力を有しているが、いくつかの高酸性食品は、追加のpH調整を必要とし得る。貧弱なアッセイ性能を観察し、サンプル量が可能とされている場合、バッファのほか、次のサンプルのpHの検査が推奨されます。追加のpH調整は、sの添加によって達成することができ1のHEPES pHが8のモールボリューム、必要に応じて。 10倍の中和バッファーによって導入される追加のNaClがsaltiest食品を除くすべての許容されるべきである。悪い結果が与えられた食品で見ている場合は、10倍の中和緩衝液は、1M HEPES（pH8）で置き換えることができます。 PBS中の1.2MまでのNaCl濃度で記述されたプロトコルをテストするときに有意な差は観察されなかった。

このプロトコルは、サンプルの大部分に適用可能であるが、pH、イオン強度、および/またはプロテアーゼ含有量の極値における食品は、アッセイで良好な結果が得られないかもしれない。一部の食品には、貧しい人々のビーズの回収、その結果、GPBを添加した後の粘性が高すぎ残ることがあります。 PBSなどの単純なバッファーでサンプルの前希釈は結果が改善されることがあります。非特異的プロテアーゼ汚染する場合は洗浄回数を増やすか、ストリンジェンシーを洗浄（NaCl濃度増加により）及びEDTAフリーのプロテアーゼ阻害剤の濃度を増加させることはまた、結果を改善することができるイオンが観察される。自動プレート洗浄を使用している場合、機器の清浄度も非常に重要です。他の実験アッセイからのプロテアーゼ（ 例えばトリプシン）で配管や注射ノズルの汚染はアッセイ中のプロテアーゼの非意図的導入につながることができます。メーカーの取り扱い説明書に従って、プレートウォッシャーの徹底的な清掃は、アッセイを実行する前に、お勧めします。

BoTestマトリックスアッセイは、複雑なマトリックス中のBoNTの検出および定量化のための最初の商用化、アクティビティベースのアッセイである。標準マウスバイオアッセイと比較して、アッセイは安価、高速であり、専門施設または動物使用56に関して倫理的な問題を必要とせずに高スループット試験を可能にする。他のインビトロのBoNTの検出方法が記載されているが、複雑なサンプルマトリックスと適合性であることが示されていないが、特殊な機器を必要とし、又は商業的にご利用できませんル·35,42-44,46-55。アッセイはまた、従来の酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）技術だけ毒素の質量を報告するのに対し、毒素エンドプロテアーゼ活性を測定する活性に基づくアッセイである。活動基準ELISAアッセイは、以前に説明したが、これらのアッセイは、食品マトリックスで動作することが実証されておらず、サンプルマトリックス41からの毒素の精製を包含しない。マトリックス化合物は多くの場合のBoNT活動35,56-59を妨害するため、毒素は、サンプルから精製されていない場合は、複雑なサンプルの毒性の大幅な過小評価が発生することがあります。

プロトコルが習得されると、修飾は、サンプル量を増加させ、サンプル感度を増加させることができる。例えば、ビーズに毒素の結合を遠心分離により収集する前に大きく、バルクサンプル（ 例えば 10ミリリットル以上）で行うことができる。これらのビーズは、次いで、96ウェルプレートに添加し、説明する以下のアッセイすることができるDプロトコル。つのログを超える感度の増加は、増加したサンプルサイズ56で観察された。従って、記載されたプロトコルであっても、マウスのバイオアッセイによって検出されない行くことができる試料中に含まれるのBoNT微量検出するために、大きな体積のサンプルで使用することができる。

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Disclosures

FMの督促、TM広場、F. Zeytin、トイレタッカーはBioSentinel株式会社BioSentinelの従業員または所有者である現在、製造、本報告書で提示された試薬の一部を商品化しました。

Acknowledgments

著者らは、貴重な議論やアドバイスをH·オリバーレスとDルーゲに感謝したいと思います。この研究は、NSFのSBIR賞（BioSentinel社へIIP-1127245）と国防省の契約（BioSentinel社へW81XWH-07-2から0045）によって部分的にサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A Metabiologics Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Fisher Scientific 15036

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神経科学、発行85、ボツリヌス、食品検査、検出、定量、複雑なマトリックス、BoTestマトリックス、クロストリジウム、効力試験
BoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化
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Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).

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