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Neuroscience

Isolamento e Quantificação da neurotoxina botulínica a partir de matrizes complexas usando os BoTest Matrix Ensaios

doi: 10.3791/51170 Published: March 3, 2014

Summary

A neurotoxina botulínica BoTest Matrix (BoNT) ensaios de detecção de purificar e quantificar rapidamente BoNT a partir de uma variedade de matrizes de amostra. Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e quantificação de BoNT a partir de matrizes sólidos e líquidos e demonstrar o ensaio com BOTOX, tomate e leite.

Abstract

Detecção e quantificação de neurotoxina botulínica (TB) em matrizes complexas exacta é necessário para produtos farmacêuticos, ambientais e de teste da amostra de alimento. É necessário o teste rápido BoNT de alimentos durante surto forense, o diagnóstico do paciente e testes de segurança de alimentos, enquanto for necessário os testes de potência exata para fabricação de produtos à base de drogas BoNT e segurança do paciente. O bioensaio amplamente utilizado para testes de BoNT é altamente sensível, mas não tem a precisão e rendimento necessário para o teste rápido e rotineiro BoNT. Além disso, o uso do bio-ensaio de animais resultou em apelos de autoridades reguladoras de produtos de drogas e defensores dos direitos dos animais em os EUA e no exterior para substituir o bioensaio em ratos para testar BoNT. Vários ensaios in vitro de substituição têm sido desenvolvidos que funcionam bem com BoNT purificada em tampões simples, mas a maior parte não tem sido mostrado para ser aplicável a ensaios em matrizes altamente complexas. Aqui, um protocolo para a detecção deBoNT em matrizes complexas utilizando os BoTest Matrix ensaios é apresentado. O ensaio consiste em três partes: A primeira parte envolve a preparação das amostras para teste, a segunda parte é um passo de imunoprecipitação utilizando anticorpos anti-BoNT esferas paramagnéticas revestidas de anti-corpo para purificar BoNT a partir da matriz, e a terceira parte quantifica proteolítica da BoNT isolado atividade usando um repórter fluorogênico. O protocolo é escrito para o teste de alto rendimento em placas de 96 poços utilizando matrizes tanto de líquidos e sólidos e requer cerca de 2 hr da preparação manual com tempos totais de doseamento de 4-26 horas, dependendo do tipo de amostra, carga de toxinas, e sensibilidade desejada. Os dados são apresentados para BoNT / D teste com solução salina tamponada com fosfato, um medicamento, o sobrenadante de cultura, de 2% de leite, e os tomates frescos e inclui a discussão de parâmetros críticos para o sucesso do ensaio.

Introduction

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Neurotoxinas botulínicas (BoNTs) são as substâncias mais letais conhecidos, com doses letais humanos intravenosos estimadas em 1-3 ng / kg 1,2. Sete serotipos estruturalmente semelhantes de BoNT, rotulados de A a G, existem, cada um constituído por um domínio de cadeia pesada responsável pela ligação à célula, a absorção e a translocação para o citosol e uma cadeia leve que codifica uma endopeptidase de zinco 3-5. A toxicidade requintado de BoNT resulta, em parte, a sua entrada obrigatória e específica para os neurônios motores na junção neuromuscular 6. Uma vez dentro do neurônio, a endopeptidase cadeia leve cliva especificamente um ou mais do-N-sensível etilmaleimida receptor solúvel da proteína fator de fixação (SNARE) proteínas necessárias para a fusão das vesículas, inibindo a liberação de neurotransmissores e levando a paralisia flácida 7-14. Vulgarmente conhecida como a doença "botulismo", paralisia do diafragma e músculos intercostais por BoNT finalmente, resulta eminsuficiência respiratória e morte, a menos que o diagnóstico precoce eo tratamento são recebidos.

Transmitidas por alimentos Humano botulismo é mais comumente associado com BoNT sorotipos A, B, E e F (BoNT / A, BoNT / B, etc) e, geralmente, resulta da ingestão de alimentos contaminados 15,16, embora, vários casos de botulismo de feridas foram relatados entre os usuários de drogas injetáveis ​​17,18. Nos Estados Unidos, o botulismo infantil resultante da ingestão de esporos de Clostridium por crianças com menos de um ano de idade é a forma mais comum de botulismo 19-21. No entanto, de origem alimentar surtos BoNT resultantes de conservas casa imprópria e processamento de alimentos foram relatados, tanto nos Estados Unidos e no exterior. Entre 2000-2009, pelo menos 338 casos de botulismo alimentar foram relatados em todo o mundo, incluindo seis mortes 22. A capacidade de detectar com rapidez e sensibilidade surtos de botulismo de origem alimentar é uma indicação importante que pode auxiliar no diagnóstico precoce 23,24. Além disso, os métodos de detecção que permitem que o custo-benefício e análise de alimentos de rotina vai levar à melhoria da segurança alimentar.

Especificidade neuronal do BoNT e longa meia-vida biológica, também faz com que seja um agente terapêutico potente. Nos Estados Unidos, as drogas à base de BoNT são aprovados pela Food and Drug Administration para o tratamento de condições de cosméticos e perturbações relacionadas com neuromusculares incluindo linhas glabelares, distonia cervical, enxaqueca, bexiga hiperactiva, e estrabismo. Inúmeras aplicações "off-label" são documentados, incluindo tratamentos com altas doses para a disfunção muscular grave 25-28. Accurate quantificação de toxina é fundamental para o doseamento correcto, como subdoses podem conduzir a um tratamento ineficaz, enquanto sobredosagem coloca os doentes em risco de efeitos secundários potencialmente prejudiciais. Infelizmente, nenhum protocolo de teste de potência padronizada é compartilhada entre fabricantes, resultando em desigualdades definição unidade entre produtores de drogas baseado em BoNTcts 29-31.

O teste padrão para BoNT é o bioensaio em que BoNT contendo amostras são injetadas por via intraperitoneal em camundongos e os números de óbitos registrados mais de 1-7 dias 16,32,33. O bioensaio é muito sensível com limites de detecção (LOD) de 5-10 pg BoNT / A 34, no entanto, as preocupações éticas sobre o uso de animais, o alto custo de treinamento de pessoal e manutenção de instalações de animais, longos tempos de ensaio, bem como a falta de protocolos padronizados resultou em chamadas para desenvolver padronizado, livre de animal testes BoNT e métodos de quantificação 35-39. Recentemente, vários métodos alternativos de quantificação BoNT foram desenvolvidos que oferecem mouse ou quase-rato sensibilidade bioensaio 40-49. Esses métodos geralmente usam de fluorescência, espectrometria de massa, ou métodos imunológicos e oferecer tempos de ensaio consideravelmente mais curto que o bioensaio em ratos sem uso de animais. Espectrometria de massa combinada com abordagens techniq imunológicaues foram mostrados para detectar e quantificar BoNT contida nos alimentos e outras amostras complexas, no entanto, os requisitos de formação de pessoal e equipamento especializado limite Estes ensaios 50-55. A maioria dos outros ensaios alternativos não são facilmente aplicáveis ​​a testes de amostras complexas ou não têm o rendimento necessário para o teste BoNT rotina. A natureza altamente variável de viscosidade da amostra de alimento, pH, teor de sal, e constituintes da matriz apresenta um desafio especialmente difícil quando tentando desenvolver métodos in vitro de ensaio com sensibilidade para combinar a potência extrema de BoNT. Além disso, mesmo sistemas de tampão simples e relativamente benignas, tais como os que resultam da libertação de medicamentos à base de BoNT, conter sal, albumina, e estabilizadores de açúcar (isto é, excipientes) que ter um impacto significativo na potência in vitro de BoNT 56. Purificação Toxina é necessário para testes atividade precisa de todos, mas a mais simples das amostras 56-59.

OBoTest ensaios Matrix foram projetados para rápida, de alta taxa de transferência, e quantificação consistente de BoNT a partir de amostras de alta complexidade, utilizando equipamentos comumente encontrados em laboratórios de pesquisa 56,60. Estes ensaios use esferas paramagnéticas covalentemente ligadas a anticorpos anti-BoNT sorotipo-específicos para ligar e seqüestrar BoNT de uma amostra e, em seguida, remover a interferir compostos de matriz por lavagem. Após a lavagem, a atividade proteolítica limite BoNT é então quantificada em um tampão de reação otimizada usando um repórter compatível com o sorotipo BoNT sendo testado. Estes repórteres são proteínas f luorogénicos que consistem de uma proteína fluorescente ciano N-terminal (PCP) e uma porção proteína fluorescente amarela derivado do C-terminal (Vénus) radical ligado por um substrato de BoNT, os resíduos 141-206 ou os resíduos de SNAP25 sinaptobrevina 33-94 constituindo o BoTest A / E ou B / D / F repórteres / g, respectivamente 45. Repórter clivagem por BoNT é monitorado usando Förster transferência de energia por ressonância (FRET). Quando tO repórter está intacta, excitação do PCP resulta em FRET a Vênus, extinguindo PCP emissão e emissão Vênus emocionante. A clivagem do repórter por BoNT impede FRET, levando a um aumento na emissão de PCP e diminuição da emissão de Vénus. Actividade de BoNT pode então ser medida quantitativamente usando a razão das emissões PCP e Vénus. LOD inferior a 3 pg são possíveis a partir de uma vasta gama de alimentos, utilizando um formato de placa de 96 poços de alto rendimento 56. O aumento de sensibilidade pode ser obtido usando os volumes de amostra maiores uma vez que o ensaio permite a concentração de toxina na superfície do grânulo.

Os ensaios Matrix BoTest para BoNTs A, B, E, e F foram desenvolvidos e testados com alimentos, produtos farmacêuticos e amostras ambientais 56,60. Aqui, nós descrevemos processos para a execução destes ensaios para a detecção de BoNT em baixa complexidade (por exemplo, produtos farmacêuticos, BoNT em tampão) e alta complexidade (por exemplo, alimentos, ambiental) amostras. Métodos de processamento específicospara vários tipos de amostras são abordadas neste protocolo e tipos de amostras não descritos aqui geralmente pode ser adaptado usando uma combinação dos métodos apresentados. O protocolo foi desenvolvido e testado com BoNT / A, mas pode ser adaptado para outros serótipos de BoNT utilizando os seus respectivos ensaios, como demonstrado em outros lugares 56,60.

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Protocol

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1. Preparação de ensaio Reagentes

  1. Thaw ditiotreitol 200x (DTT), 10x Matrix Binding Buffer (10x Binding seguir buffer), 10x tampão de neutralização (apenas alimentos ou de pH amostras desequilibradas) e 10x tampão de reação BoTest (doravante 10x Reaction buffer) à temperatura ambiente (RT) por 15 min ou até que esteja completamente descongelado. Ver Tabela 1 para uma lista de buffers e dos reagentes utilizados neste protocolo. Ver Tabela 2 para uma lista de materiais e equipamentos necessários para esse protocolo.
  2. Agitar no vortex os buffers descongelados para 5 segundos para misturar. 10x tampão de neutralização, 200xDTT, e tampão de reacção 10x deve aparecer claro, enquanto o tampão de ligação 10x terá uma aparência turva. Aquecer o tampão de reacção 10 x durante 5 minutos a 37 ° C e repetir vórtex se apresentar turva seguinte descongelamento.
  3. Gerar 3,8 ml de tampão de reacção 1x.
    1. Rotular um "tampão de reação 1x" 15 ml cônico tubo e adicionar 3,42 ml de biologia molecular grau water, tampão de reação de 380 mL de 10x, e 19 mL de 200x TDT. Misturar tampão bem por inversão.
    2. Inibidores de cortar um único inibidor da protease livre de EDTA comprimido em quadrantes, usando uma lâmina limpa e adicionar um quarto do comprimido para o tampão de reacção 1x (a parte restante comprimido pode ser armazenado a 4 ° C para uso posterior). NB protease não pode ser necessário se usar a toxina purificada e buffers simples (por exemplo, amostras farmacêuticas).
    3. Vortex o tampão de reacção 1x até que o comprimido de protease é totalmente dissolvido.
  4. Aquecer os grânulos da matriz A (esferas de IP-A seguir) durante 20 min a RT.
  5. Descongelar o repórter BoTest A / E (A / E repórter a seguir) a TA protegido da luz.
  6. Rotular um tubo de 15 ml "0,5 mM A / E repórter" e adicionar 45 mL de 20 mM estoque A / E repórter ml de tampão de reação 1,8 1x. Misturar bem por pipetagem e armazenar em gelo ao abrigo da luz.

2. Suporteard Geração Curve Amostra

A curva padrão descrito aqui abrange 10-30,000 MLD 50 / g de alimento ou por ml de tampão em diluições semi-log (Tabela 3). O usuário final é livre para usar concentrações alternadas conforme aplicável.

  1. Spiking e incubando as matrizes com o material de referência. Gerar a curva padrão, utilizando um diluente da mesma matriz que a desconhecida, se possível, para reduzir os efeitos da matriz. Utilize tampão de fosfato de gelatina (GPB) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) como diluente, se matriz adicional, BoNT-negativa não está disponível (por exemplo, campo ou o teste da amostra de BoNT surto). Gerar a curva padrão por cravação de BoNT / A para a matriz de escolha apropriada seguindo o protocolo abaixo.
    1. Amostras de baixa complexidade (por exemplo, PBS, GPB, ou farmacêutico)
      1. Adicionar 10 ml da solução tampão apropriada a um tubo de 15 ml e de lado. Este exemplo vai ser utilizada como diluente para a standard curva e diluições desconhecidos (Seção 4).
      2. Adicionar 1,2 ml de tampão a um tubo de microcentrífuga.
      3. ATENÇÃO: Esta etapa usa BoNT e extremo cuidado deve ser usado no manuseio e eliminação de quaisquer reagentes e materiais que entram em contacto com a toxina. O uso de equipamentos de proteção individual e destinação adequada de todos os materiais devem ser realizadas de acordo com o Departamento de Trabalho diretrizes da OSHA para BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) dos EUA. Adicionar BoNT / A para a 1,2 ml da amostra de tal modo que a concentração final é de 30.000 MLD 50 / ml (36.000 MLD 50 no total).
    2. Amostras de alimentos líquidos (ou outras amostras líquidas complexos) Nota: O teste inicial é recomendado para determinar o volume de sobrenadante recuperado a partir de amostras clarificadas como o material particulado (. Celulose, por exemplo) em matrizes líquidas irá variar. Este protocolo assume pelo menos 1,2 ml de sobrenadante clarificado será recuperado a partir de um samp 1,4 mlle. Aumentar tamanho da amostra, se necessário.
      1. Adicionar 10 ml do alimento líquido para um tubo cônico de 15 ml e reserve. Esta amostra será utilizado como diluente para a curva padrão e diluições desconhecidos (Seção 4).
      2. Pesar um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml vazio e gravar sua massa.
      3. Adicionar 1.4 ml do produto alimentar líquido para o tubo de microcentrífuga pesado.
      4. Pesar de novo o tubo de microcentrífuga e calcular a massa da amostra de alimento adicionado, subtraindo a massa do tubo vazio.
      5. ATENÇÃO: Esta etapa usa BoNT e extremo cuidado deve ser usado no manuseio e eliminação de quaisquer reagentes e materiais que entram em contacto com a toxina. O uso de equipamentos de proteção individual e destinação adequada de todos os materiais devem ser realizadas de acordo com o Departamento de Trabalho diretrizes da OSHA para BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) dos EUA. Adicionar BoNT / A para a amostra de 1,4 ml a uma concentração final de 30.000 MLD 50 / g de alimento.
      6. Incubaçãote o diluente e amostras à TA ou a 4 ° C durante 2 horas para se obter o tempo de BoNT para interagir com a matriz do alimento, imitando uma contaminação natural.
    3. As amostras sólidas de alimentos (ou outras amostras sólidas) Nota: O teste inicial é recomendado para determinar o volume de sobrenadante recuperado a partir de amostras homogeneizadas e esclarecidas após a adição de 1 ml GPB / g de alimentos. Este protocolo pressupõe que, pelo menos, 1,2 ml de sobrenadante clarificado será recuperada a partir de uma amostra de 2 g. Aumentar tamanho da amostra, se necessário.
      1. Pesar 10 g de amostra sólida em um tubo cônico de 50 ml e reserve. Isto será utilizado como diluente.
      2. Pesar 2 g sólida amostra de alimento em um segundo tubo cônico de 50 ml.
      3. ATENÇÃO: Esta etapa usa BoNT e extremo cuidado deve ser usado no manuseio e eliminação de quaisquer reagentes e materiais que entram em contacto com a toxina. O uso de equipamentos de proteção individual e destinação adequada de todo o materials deve ser realizada de acordo com o Departamento de Trabalho diretrizes da OSHA para BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) dos EUA. Adicionar BoNT / A para a superfície da amostra de 2 g a uma concentração final de 30.000 MLD 50 / g de alimento (60.000 MLD total de 50).
      4. Incubar o diluente e amostras misturadas à TA ou a 4 ° C durante 2 horas para se obter o tempo de BoNT para interagir com a matriz do alimento, imitando uma contaminação natural.
  2. Ajuste de homogeneização da amostra e tampão. Processar a amostra curva padrão cravado e diluente gerado acima de acordo com o tipo de amostra.
    1. Amostras de baixa complexidade
      1. Sem posterior processamento da amostra é necessário.
    2. Amostras de alimentos líquidos (ou outras amostras líquidas complexas)
      1. Nenhuma amostra de homogeneização é necessário.
      2. Adicionar 140 mL de buffer 10x Neutralização de 1,4 ml cravado amostra e 1 ml de 10x Neutralizatiões de tampão à amostra de 10 ml de diluente. Misture bem as amostras por inversão.
      3. Pouco esclarecer ambas as amostras por centrifugação durante 10 min a 6.000 x g e 4 ° C. Remover imediatamente o sobrenadante e transferir para novos tubos.
    3. Amostras de alimentos sólidos (ou outras amostras sólidas)
      1. Adicionar 2 ml GPB (1 ml GPB / g de alimentos) para a 2 g BoNT / cravado-A amostra de alimentos sólidos e 10 ml GPB a 10 g de amostra diluente.
      2. Homogeneizar as amostras usando um pilão até ficar bem misturado. Dependendo da natureza da amostra, pode haver pequenas porções de material que não pode ser homogeneizadas, o que é aceitável. Alternativamente, podem ser utilizados métodos de homogeneização mecânica. Utilização de um misturador não é recomendada, uma vez que podem inactivar bem como nebulizar a toxina.
      3. Adicionar o volume 1/10th de 10x tampão de neutralização para o diluente de amostra com base no volume total aproximada (por exemplo, 2 ml, se o volume a 20 ml). Extrapolaro volume total da BoNT / cravado-se uma amostra e adicionar o volume 1/10th de 10x tampão de neutralização. Misture bem as amostras por inversão.
      4. Pouco esclarecer ambas as amostras por centrifugação durante 10 min a 6.000 x g e 4 ° C. Remover imediatamente o sobrenadante e transferir para novos tubos.
  3. Preparar diluições em série da curva padrão para o teste
    1. Usando a BoNT / cravado-se uma amostra da curva padrão como D1 e a amostra nonspiked como diluente, gerar as restantes amostras da curva padrão em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga de acordo com a Tabela 3.

3. Prepare amostras desconhecidas

Esta seção pode ser concluída em paralelo com a secção 2.

  1. Determinar o número de incógnitas e diluições. Teste incógnitas em triplicado, se possível.
    1. Para ensaios qualitativos, execute as incógnitas sem qualquer diluição adicional do que o necessário para processar a amostra como descricama abaixo.
    2. Para os ensaios quantitativos, preparam-se pelo menos duas amostras de diluição 1:10, tal como descrito abaixo, para assegurar que um ou mais amostras de cair dentro do intervalo linear da resposta do ensaio. Gerar diluições usando um diluente da mesma matriz que a desconhecida, se possível, para reduzir os efeitos da matriz, tal como descrito na Seção 3. Caso contrário, usam PBS ou GPB como o diluente.
  2. Gerando e diluindo amostras desconhecidas acordo com o tipo de amostra.
    1. Incógnitas baixa complexidade (por exemplo, PBS, GPB, ou farmacêutico)
      1. Adicionar pelo menos 750 mL desconhecidos para um tubo de microcentrífuga para gerar diluição Desconhecido 1.
      2. Adicionar 675 ul de diluente para dois tubos de microcentrífuga rotulados diluição Desconhecido 2 e 3. O diluente será o mesmo material usado para a geração da curva padrão.
      3. Diluir em série de diluição 1 transferindo 75 ul de diluição de 1 para dentro do tubo de diluição 2 e misturar.
      4. Serially dilute diluição 2, transferindo 75 ul de diluição de 2 para o tubo de diluição de 3 e misturar.
    2. Incógnitas alimentos líquidos (ou outras amostras líquidas complexas) Nota: O teste inicial é recomendado para determinar o volume de sobrenadante recuperado a partir de amostras esclarecidas, como discutido na Seção 3. Aumentar tamanho da amostra, se necessário.
      1. Adicionar ≥ 875 ul do desconhecido líquido para um tubo de microcentrífuga.
      2. Adicionar volume de 1/10th de 10x tampão de neutralização para a amostra (por exemplo, 87,5 mL de uma amostra de 875 mL).
      3. Pouco clarificar a amostra através de centrifugação durante 10 min a 6.000 x g e 4 ° C. Imediatamente transferir o sobrenadante para um novo tubo. Esta é a diluição Desconhecido 1.
      4. Adicionar 675 ul de diluente para dois tubos etiquetados diluição Desconhecido 2 e 3. O diluente será o mesmo material usado para a geração processado curva padrão.
      5. Diluir em série diluição de 1 por transferênciaanel 75 ul de diluição de 1 para o tubo 2 a diluição e mistura.
      6. Diluir em série de diluição 2, transferindo 75 ul de diluição de 2 para o tubo de diluição de 3 e misturar.
    3. Incógnitas sólidos alimentares (ou outras amostras sólidas) Nota: O teste inicial é recomendado para determinar o volume de sobrenadante recuperado a partir de amostras esclarecidas, como discutido na Seção 3. Aumentar tamanho da amostra, se necessário.
      1. Pesar 2 g sólida desconhecido amostra em um tubo cônico de 50 ml.
      2. Adicionar 2 ml de GPB (1 ml GPB / g de alimento) a 2 g da amostra sólida.
      3. Homogeneizar as amostras conforme descrito na Seção 3.2.3.2.
      4. Adicionar o volume 1/10th de 10x tampão de neutralização para a amostra baseada no volume total aproximada (por exemplo, 0,4 ml, se o volume é de 4 ml). Misture bem as amostras por inversão.
      5. Pouco clarificar a amostra através de centrifugação durante 10 min a 6.000 x g e 4 ° C. Immediateltransferência y ≥ 750 ul de sobrenadante para um tubo de microcentrífuga. Esta é a diluição Desconhecido 1.
      6. Adicionar 675 ml de diluente para dois tubos etiquetados diluição Desconhecido 2 e 3. O diluente será o mesmo material usado para a geração processado curva padrão.
      7. Diluir em série de diluição 1 transferindo 75 ul de diluição de 1 para dentro do tubo de diluição 2 e misturar.
      8. Diluir em série de diluição 2, transferindo 75 ul de diluição de 2 para o tubo de diluição de 3 e misturar.

4. Esclarecimento amostra final

Se o teste de amostras de alimentos líquidos ou sólidos, centrifugar todas as amostras durante 5 min a ≥ 14.000 xg numa microcentrífuga para esclarecer completamente as amostras. Remover imediatamente o sobrenadante e transferir para novos tubos.

5. Configuração Placa e BoNT / A Pull Down

  1. O layout da placa específica é dependente de aplicação, no entanto, não use os poços fora de formapara evitar efeitos de borda. Cada amostra desconhecida e da amostra curva padrão D1-D8 requer 3 poços, enquanto amostra D9 requer 6 poços. A disposição da placa sugerida é mostrada na Figura 1.
  2. Adicionar 20 ul de tampão de ligação 10x a cada cavidade a ser usada.
  3. Adicionar 200 mL de cada diluição esclarecidas e desconhecido para cada um dos três poços (seis poços para D9) para testes triplicado. Misture a placa durante 10 segundos num misturador de microplacas.
  4. Adicionar os grânulos de IP-A.
    1. Vortex as contas IP-A para 10 seg na velocidade mais alta. Continuar vórtex se contas não são totalmente ressuspenso e homogênea.
    2. Pipetar 20 ul grânulos IP-A a cada amostra.
    3. Misture a placa durante 30 segundos num misturador de microplacas.
  5. Incubar a placa utilizando uma placa incubadora rotativa durante 2 horas a 750 rpm, 25 ° C ou TA. O desempenho do ensaio é altamente dependente de gerar e manter o IP-A suspensão de esferas durante todas as etapas de incubação. Grânulos sempre ressuspender com um Microfonesmisturador de tarde após a peletização ea manter a suspensão utilizando uma placa de microtitulação shaker orbital durante todas as etapas de incubação.

6. Lavar prato e Bead ressuspensão

  1. Lavar as placas à mão ou usando um cordão compatível com placa magnética automatizado lavadora. Um lavador de placas automático configurado para esferas magnéticas aumenta muito ensaio rendimento.
    1. Lavagem manual
      1. Rotular um tubo de 50 ml "tampão de lavagem 1X" e adicione 45 ml de biologia molecular da água grau e 5 ml 10x Matrix Wash Buffer. Misturar tampão bem por inversão.
      2. Remova a placa da placa rotativa incubadora.
      3. Colocar imediatamente o prato sobre uma placa de separação 96 bem grânulo magnético durante 5 min.
      4. Mantendo a placa sobre a placa de separação magnética talão 96 cavidades, suavemente remover e descartar os sobrenadantes dos poços de amostra, utilizando uma pipeta multi-canal único ou. Não aspiraresferas de monitorar visualmente o buffer aspirado na ponta da pipeta para a remoção acidental de contas. Se a remoção é testemunhado, adicione delicadamente o conteúdo da ponta de volta para o bem, reseparate, e repetir a remoção.
      5. Adicionar 300 mL de buffer 1x de lavagem a cada amostra.
      6. Totalmente ressuspender as esferas através da mistura da placa durante 30 segundos num misturador de microplacas.
      7. Incubar a placa sobre a placa de separação 96 bem esfera magnética durante 2 min.
      8. Remover e descartar os sobrenadantes dos poços de amostra, tal como antes.
      9. Repita os passos 6.1.1.5-6.1.1.8 mais três vezes, para um total de quatro lavagens.
      10. Com a placa sobre a placa de separação 96 bem esférulas magnéticas, inspeccionar visualmente os poços para confirmar ainda a remoção do sobrenadante, utilizar uma pipeta para remover o excesso de tampão residual, conforme necessário. Alguns tampão irá permanecer nos poços e deve ser tomado cuidado para evitar a remoção do grânulo ou secagem do grânulo.
      11. Adicionar tampão de reacção 50 ul de 1x em cada poço de amostra e misturar a placa de 30 sic num agitador de microplacas para ressuspender completamente os grânulos. Se necessário, utilizar uma pipeta para ressuspender completamente os grânulos.
    2. Lavar placa automatizada
      1. Configuração e programa a máquina de lavar de acordo com a Tabela 4. Limpe e lave a máquina de lavar com alta qualidade (por exemplo, nanopura) de água.
      2. Primeiro a máquina de lavar, executando o programa "Prime".
      3. Remova a placa da placa rotativa incubadora.
      4. Colocar imediatamente a placa sobre a placa de separação 96 bem esfera magnética sobre a placa de máquina de lavar.
      5. Execute o programa link "Mestre Wash". O primeiro passo do programa é um passo de incubação de 5 min em que a máquina de lavar estiver parado.
      6. Após a conclusão do programa, remover o prato da máquina de lavar, adiciona 1X tampão de reação de 50 jil de cada poço de amostra, e misturar a placa durante 30 segundos num misturador de microplacas para ressuspender completamente os grânulos. Se necessário, utilizar uma pipeta para ressuspender completamente os grânulos.

    7. Ensaio Iniciação e Incubação

    1. Adicionar 50 ul de 0,5 uM A / E repórter (ver ponto 1) a cada poço de amostra e mistura-se durante 30 segundos num misturador de microplacas para ressuspender completamente os grânulos.
    2. Adicionar 100 mL de água em cada poço não utilizado na placa para evitar efeitos de borda.
    3. Selar a placa com fita de selagem da placa e incubar a placa utilizando uma placa incubador rotativo a 750 rpm, 25 ° C ou TA. Proteja a placa da luz durante a incubação.

    8. Coleta e Análise de Dados

    Nota: Este ensaio é um ensaio em tempo real que pode ser medida várias vezes até que a sensibilidade desejada é obtida, não existem reagentes de paragem necessários. Tempos de leitura iniciais recomendados são 2, 4, e 24 horas de tempo de incubação, com a sensibilidade do ensaio com o aumento do tempo de incubação.

    1. A coleta de dados
      1. Em cada tempo ler, retire a placa da placa rotativa incubadora, retire o seloção de fita, e colocar imediatamente a placa sobre a placa de separação 96 bem esfera magnética. Permitir que as esferas se separar durante 2 min.
      2. Coloque a placa no leitor de microplacas e medir as emissões em ~ 470 e ~ 526 nm sob excitação em ~ 434 nm.
      3. Se os tempos de leitura adicionais são desejados, ressuspender as contas por 30 segundos no mixer de microplacas, selar a placa, e retornar a placa para a placa rotativa incubadora.
    2. A análise dos dados
      1. Calcula-se a razão de emissão para cada amostra dividindo a unidade de fluorescência relativa valor (RFU) a 526 nm, pelo valor RFU a 470 nm.
      2. Traçar a taxa de emissão versus o log [BoNT / A] para os pontos de dados padrão de curva. Dependendo do substrato de BoNT / A potência testado, uma curva dose-resposta sigmoidal serão obtidos (ver resultados representativos).
      3. Coloque os dados da curva padrão, com inclinação da curva dose-resposta variável Y = inferior + (superior-inferior) / (1 ​​+ 10 ^ ((LogEc 50-X) * hillslope)) onde X é alogaritmo da concentração, Y é a resposta, e Y começa na parte inferior e vai ao topo com uma forma sigmoidal.
      4. Determinar os limites de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ), e concentração eficaz semi-máxima (EC50). Os limites de detecção são definidos como uma amostra que tem uma relação de emissão inferior a 3 desvios-padrão (SDS) abaixo dos controlos em branco (n = 6). Limites de quantificação são definidos como uma amostra que tem uma relação de emissão inferior a 10 SDs abaixo dos controlos em branco (n = 6). CE 50 é determinada a partir da sigmoidal de dose-resposta de ajuste de curva.
      5. Interpolar a potência de quaisquer amostras desconhecidas contra a curva padrão de dose-resposta sigmoidal.
        1. Para obter resultados quantitativos, na amostra desconhecida, devem, idealmente, cai dentro da porção linear da curva padrão. Aproximado a porção linear da curva padrão calcular a janela de resposta total de ensaio a 20-80% (por exemplo, se a taxa de emissão da curva padrão de ranges 0,5-2,5, o intervalo linear seria a porção linear da curva padrão que varia 0,9-2,1).
        2. Para obter resultados qualitativos, comparar a amostra desconhecida com o LOD e LOQ da curva padrão.
        3. Não extrapolar amostras desconhecidas para além dos limites da curva padrão.

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Representative Results

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Um diagrama que resume as etapas do protocolo descrito é mostrado na Figura 2. O ensaio requer entre 4-26 horas para ser concluído, dependendo do tipo de amostra e sensibilidade do ensaio desejado, mas apenas ~ 2 horas de hands-on do tempo. O ensaio é realizado em placas de 96 poços e, dependendo do tipo de teste a ser realizado, permite o teste em triplicado de uma amostra de 20, incluindo as normas por placa.

A Figura 3 mostra os resultados do ensaio usando representativos de BoNT / A holotoxina cravado em PBS e testadas com o protocolo descrito a seguir de 2, 4, e 24 horas de incubação com o A / E repórter. Purificada BoNT / A holotoxina foi escolhido para esta experiência, porque o seu peso molecular definido de ~ 150 kDa, em comparação com a definição mais ampla de 700-900 kDa para o complexo da toxina, e pureza permitir picos muito precisos em concentrações precisas. A razão de emissão, a proporção de emissão de 526 nm a 470 nm, em que a sequência de excitação a 434nm, em cada ponto de tempo é representada graficamente em função de BoNT / A concentração (o valor DML 50 baseia-se em testes de potência de BoNT / fabricante do A). A clivagem do repórter por BoNT é medido como uma redução da taxa de emissão, o qual com a leitor de placa varia entre cerca de 2,7 para o repórter intacta a cerca de 0,7 para o repórter totalmente clivado. É importante notar que, uma vez que cada leitor de placas de fluorescência medidas em RFUs, o valor real da taxa de emissão será dependente do leitor de placas utilizadas. Prolongou o tempo de incubação com os resultados repórter em maior clivagem repórter como pode ser visto pelo deslocamento para a esquerda na curva. Os pontos de dados, testadas em triplicado, exibir baixa DP da média e seguir a tendência prevista do aumento da taxa de emissão com a diminuição da carga de toxinas. A falha do ensaio para seguir esta tendência esperada pode indicar um erro durante a geração de diluição ou plotagem de dados. Os índices de emissão dos controles que não contenham BoNT / A também permanecer estável during a incubação (figura 3, inserir), indicando a falta de actividade de protease não específica.

Um exemplo da utilização deste protocolo para quantificar as amostras farmacêuticas de BoNT / A é mostrado na Figura 4. Uma curva padrão foi gerada em PBS com purificada BoNT / A holotoxina e processadas em paralelo com as diluições de medicamento gerados a partir de um único frasco de 100 L de BOTOX liofilizado reidratado em 0,9% de solução salina. (Idealmente, a curva padrão seria composto de lotes de referência de BOTOX mas tais materiais não são facilmente acessíveis.) As amostras foram testadas utilizando o protocolo descrito com a excepção de que as amostras 50 ul foram testadas em duplicado, sem o uso de 10x tampão de ligação. A curva padrão foi representada graficamente como uma função de BoNT / concentração A seguir a incubação de 24 horas com o A / E repórter. A taxa de emissão de cada amostra desconhecida foram então visualizadas através da representação gráfica sua intersecção através da curva padrão. Neste ensaio, a linhaporção de ar da curva padrão (janela resposta do ensaio a 20-80%) situa-se entre uma taxa de emissão de 2,11-1,05 e é indicado pela caixa a tracejado na figura. As concentrações dos três incógnitas que se enquadram dentro desta gama linear foram então interpolada a partir da curva padrão (Figura 4, inserção). Este exemplo demonstra a metodologia geral que seria usado para detectar ou quantificar qualquer amostra desconhecida relativamente a uma curva padrão.

Tomates frescos e 2% de leite foram escolhidas para demonstrar o desempenho e sensibilidade usando tanto um sólido (tomate) e de alimentos líquidos (leite de 2%) a matriz do protocolo. BoNT / complexo Um composto da holotoxina do núcleo e as proteínas associadas à neurotoxina (PNA) foi escolhido para estas experiências, porque esta preparação se assemelha a toxina produzida durante uma contaminação Clostridium natural. Como mostrado na Figura 5A, a recuperação de BoNT / A, medido como a clivagem do A / E repórter, é observada com bmatrizes oth. Aumento do tempo de incubação com o repórter aumenta a sensibilidade do ensaio, mas não resulta em índices de emissões diminuíram para os controlos sem toxina (Figura 5A, inserções), indicando os resultados observados de clivagem de BoNT / A e protease inespecífica não transitar de alimentos no ensaio. Tal como acontece com a Figura 3, os dados apresenta baixa variabilidade e segue a tendência esperada de diminuição repórter clivagem com a diminuição da concentração de toxinas.

A BoNT / A LOD, LOQ e EC 50 para ambos os alimentos em cada ponto de tempo, apresentada encontram-se resumidos na Tabela 5. O LOD e LOQ são definidos como a concentração da amostra com uma menor taxa de emissão inferior a três e dez SDs abaixo do fundo (amostras não contendo BoNT / A), respectivamente. Estes limites são restritas para os pontos de dados testados, embora a interpolação da curva de dose-resposta sigmoidal pode ser utilizada para calcular os limites teóricas inferiores. Alguns matriz-de-variabilidade na matriz LOD e LOQ é esperado, como os efeitos da matriz podem influenciar a ligação da toxina aos grânulos e a recuperação de grânulos durante a lavagem. Enquanto parece que havia mais recuperação toxina a partir do leite de 2% do que os tomates a partir dos dados da Figura 5A, grande parte desta diferença resulta da diluição adicional necessário para homogeneizar amostras de tomate em GPB.

Além de ser uma matriz de comida sólida, os tomates são um tipo de amostra de salientar que o pH e a força iónica de ajustamento, conseguida através da adição de 10x tampão de neutralização, é crítico para o sucesso do ensaio. Figura 5B ilustra as respostas de ensaio no ensaio tomates com ou sem a inclusão de o tampão de neutralização de 10x. A não adicionar os resultados 10x tampão de neutralização em fraca recuperação de BoNT / A a partir de amostras e é demonstrada por uma razão de emissão constante em todas as concentrações testadas de BoNT / D. A adição do tampão de neutralização de 10x, embora, resultados de detecção sensível da toxina.

Proteases inespecíficas contidos em matrizes complexas pode levar a falsos positivos se não forem tomadas desde que não sejam BoNT proteases possam decompor a A / E repórter. Proteases não específicas pode ser endógeno à amostra de alimento ou introduzida a utilização de preparações BoNT não purificada, como sobrenadantes de cultura de Clostridium. Lavagem talão completa vai remover mais proteases não específicas, no entanto, a adição de inibidores de protease para o tampão de reacção é crítico Figura 6 demonstra a actividade de protease não específica encontrada em Clostridium BoNT / A sobrenadantes de cultura utilizando um repórter A / E modificado, BoTest KO (KO repórter. ). O repórter KO é o mesmo que o repórter A / E, com a excepção de que o substrato de BoNT / D sítio de clivagem foi mutado de tal forma que já não é clivada por BoNT / A. Portanto, qualquer clivagem repórter observado resulta da atividade de protease inespecífica. Os altos níveis de KO repórter cleAvage indica o sobrenadante da cultura contém um elevado nível de actividade da protease, mas que a actividade seja efectivamente anulada pela adição de inibidores da protease.

Os dados da amostra demonstram a utilidade do protocolo para a produção elevada de BoNT / A detecção em tampões simples e matrizes alimentares. Certos alimentos podem exigir pequenos ajustes de doseamento, mas o protocolo descrito deve produzir bons resultados com a maioria dos tipos de alimentos.

Figura 1
Figura 1. Sugerida disposição da placa. Amostras são restritas para os interiores de 60 poços da placa de modo a evitar possíveis efeitos de borda. Amostras da curva padrão desconhecidos ou pode ser adicionado como desejado. Todos os poços não utilizados devem ser preenchidos com 100 mL de água durante repórter incubação. Click aqui para ver imagem ampliada.

Figura 2
Figura 2. Esquema do protocolo descrito. Cada passo importante no protocolo é indicado por uma caixa marcada e alinhada ao lado de uma linha de tempo de ensaio estimada (não à escala). Amostras não alimentares não requerem processamento da amostra e assim entrar no protocolo a jusante de amostras de alimentos. A caixa tracejada ao redor geração diluição em série para as incógnitas indica este é um opcional, mas recomendado, passo. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 3
Figura 3. Detecção de BoNT / A holotoxina em PBS utilizando o protocolo descrito.Purificada BoNT / A holotoxina foi cravado em PBS e testadas utilizando o protocolo descrito com um substrato de BoNT / A concentração máxima de 1 nM. Todas as amostras foram testadas em triplicado e as barras de erro representam o desvio padrão da média. Relatado potência é baseada em testes de rato bioensaio do fabricante da toxina. A razão de emissão (a proporção de emissão de 526 nm a 470 nm após excitação a 434 nm) da curva padrão foi medida após 2, 4, e 24 horas de incubação com A / E repórter e representados graficamente como uma função de BoNT / A concentração . Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 4
Figura 4. Quantificação de medicamento BOTOX utilizando o protocolo descrito. Um único frasco de 100 L de produto liofilizado droga foi BOTOX resuspe NDED em 220 ul de soro fisiológico 0,9%, diluídas em série e testadas como amostras contra uma curva padrão feita em PBS utilizando purificada BoNT / A holotoxina. As amostras foram testadas de acordo com o protocolo descrito, excepto que 50 amostras ul foram testados sem 10x tampão de ligação em duplicado. A curva padrão foi calculado pelo ajuste da taxa de emissão de as amostras da curva padrão para a equação de dose-resposta sigmoidal de inclinação variável, e é representada graficamente como uma função de BoNT / A concentração. Cada amostra desconhecida é mostrada, onde se cruza com a curva padrão após um período de incubação de 24 horas com o repórter de A / E. As concentrações das amostras desconhecidas que caem dentro do intervalo linear (caixa sombreado a tracejado) foram interpolados a partir da curva padrão. A etiqueta para cada desconhecido BOTOX é o número de unidades presente na amostra com base na potência marcada. As barras de erro representam o desvio padrão da média.t = "_blank"> Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 5
Figura 5. Recuperação de BoNT / cravado-A 2% de leite e testes tomates frescos utilizando o protocolo descrito. Amostras de 2% de leite e tomates frescos foram adicionadas com purificada BoNT / A complexa e testada usando o protocolo descrito. Todas as amostras foram testadas em triplicado e as barras de erro representam o desvio padrão da média. (A) A taxa de emissão de leite a 2% e os tomates frescos curvas padrão foram determinados após 2, 4, e 24 horas de incubação com A / E repórter e representados graficamente como uma função de BoNT / A potência. (B) A omissão do tampão 10x Neutralização durante testes de tomate resulta na falha do ensaio. As amostras de tomate fresco foram testados de acordo com o protocolo descrito com ou sem adição de 10x Neutrotampão ização. Os dados apresentados para o ponto de tempo de 4 horas. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 6
Os inibidores de protease Figura 6. São necessárias no ensaio de matrizes complexas. Clostridium BoNT / A (pavilhão da estirpe A) sobrenadante de cultura foi diluída em série em PBS e testadas utilizando o protocolo descrito quer com ou sem inibidores de protease adicionada ao tampão de reacção e com tanto o A / E e KO repórteres. A razão de emissão foi medida após 24 horas de incubação com ambos os A / E ou repórteres KO e representados graficamente como uma função de BoNT / A potência. Clivagem significativa do repórter KO foi visto sem adição de inibidores da protease, mas foi negada por sua inclusão. Todas as amostras foram testadas em triplicado e o erro Bars representam o desvio padrão da média. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Amortecedor Composição Temperatura de armazenamento Estabilidade Notas
10x Matrix Binding Buffer 500 mM de HEPES-NaOH, pH 7,1, NaCl 250 mM, 1% de Tween-20, 5% de caseína, 0,05% de NaN3 -20 Ou -80 ° C Estável durante um período mínimo de cinco dias, a 4 ° C durante o descongelamento Fornecido com Kit BoTest Matrix A detecção botulínica
10x Matrix tampão de lavagem 119 mM de fosfato, pH 7,4, NaCl 1,370 mM, KCl a 27 mM, 1% de Tween-20 -20 Ou -80 ° C Estável durante um período mínimo de cinco dias, a 4 ° C durante o descongelamento Fornecido com Kit BoTest Matrix A detecção botulínica
10x Neutralização de buffer 1 M de HEPES-NaOH, pH 8,0, NaCl 1 M 4 ° C Estável por até seis meses a 4 ° C
10x BoTest Tampão de reacção 500 mM de HEPES-NaOH, pH 7,1, NaCl 50 mM, 1% de Tween-20, 100 mM de ZnCl2 -20 Ou -80 ° C Estável durante um período mínimo de cinco dias, a 4 ° C durante o descongelamento Fornecido com Kit BoTest Matrix A detecção botulínica
BoTest A / E Reporter 20 ^ M em 50 mM de HEPES-NaOH, 10 mM de NaCl, 15% glicerol -80 ° C Guarde em pequenas alíquotas. Estável durante um período mínimo de cinco dias, a 4 ° C após o descongelamento. Fornecido com Kit BoTest Matrix A detecção botulínica
Gelatina tampão fosfato (GPB) NaH 33,3 mM 2 PO 4, pH 6,2, 2 g / L de gelatina 4 ° C Estável por até 1 mês a 4 ° C
200x ditiotreitol (DTT) DTT 1 M -20 ° C Estável por até 6 meses a -20 ° C Faça e armazenar pequenas (100 ul) alíquotas
1x PBS-t 11,9 mM de fosfato, pH 7,4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 0,1% de Tween-20 4 ° C Estável por até 1 mês a 4 ° C Pode ser feita usando 10x PBS de Fisher (BP399-1)
Matriz A Beads (IP-grânulos) Contas magnéticas covalentemente conjugado a galinha anti-BoNT / A anticorpo em PBS. 0,1% de Tween-20, 0,05% de Azida de sódio, 0,25% de caseína e 50% de glicerol -20 ° C Estável durante um período mínimo de cinco dias, a 4 ° C durante a remoção de -20 ° C. NÃO CONGELAR a -80 ° C

Tabela 1. Tampões necessários para o protocolo descrito. Neutralização 10xTampão é apenas para (por exemplo alimentares) amostras altamente complexos e não pode ser necessária, dependendo da natureza das amostras a serem ensaiadas.

Nome do Material / Equipamento Companhia Número de Catálogo Comentários / Descrição
BoTest Matrix A neurotoxina botulínica do Kit de Detecção BioSentinel A1015 Kits de detecção de BoNT / B e C, também estão disponíveis.
Varioskan flash leitor de fluorescência de microplacas Thermo-Fisher Scientific 5250040 Pode ser usado a maioria dos-ou monocromador unidades à base de filtro com 434 nm de excitação e 470 nm e 526 nm, a capacidade de emissão.
96 poços grânulo magnético Separação Placa V & P Científica VP771H Outras placas magnéticos podem ser utilizados, mas a placa deve ser concebido para separar o beads ao lado do poço.
Magnetic Louça Placa Bead-Compatível BioTek ELx405 vSRM Opcional, necessário apenas para a placa de lavagem automática. Outros lavadores de placas magnéticas talão compatível também pode ser usado, mas deve ser verificada antes da utilização.
Microcentrífuga Vário N / D Opcional, necessário apenas para as amostras que necessitam de centrifugação.
MixMate misturador placa Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Vário N / D Usado à TA ou a 25 ° C, se o controlo da temperatura está disponível
Sem EDTA Inibidor de Protease Tablets Roche 4693132001 Só exigido para o alimento ou o teste ambiental. Os inibidores de protease deve ser livre de EDTA.
BoNT / A Metabiologics N / D Opcional, necessário apenas para fins de padronização e quantificação
Preto, placas de 96 poços de fundo plano NUNC 237105 As placas não devem ser tratados
96 poços de fita da placa de selagem Thermo Scientific 15036

Tabela 2. Materiais e equipamento necessário para o protocolo descrito. Alguns materiais e equipamentos são opcionais ou pode ser substituído de acordo com o equipamento disponível. Podem ser necessários testes adicionais adequação e otimização de se utilizar equipamento alternativo.

</ Tr>
Nome Amostra Volume Toxina Volume de diluente [BoNT / A] (MLD 50 / ml) ou (DLM 50 / g de alimentos) log [BoNT / A] (MLD 50 / ml) ou (DLM 50 / g de alimentos) D1 ML 1.200 Estoque N / D 30.000 4,48
D2 300 ul D1 600 mL 10.000 4
D3 90 mL D1 810 mL 3000 3.48
D4 90 mL D2 810 mL 1000 3
D5 90 mL D3 810 mL 300 2,48
D6 90 mL D4 810 mL 100 2
D7 90 mL D5 810 mL 30 1,48
D8 90 mL D6 810 mL 10 1
D9 N / D 1400 mL N / D N / D

Tabela 3:. Tabela de diluição para amostras da curva padrão A tabela gera uma curva padrão em diluições meio-log com mais de 3,5 ordens de grandeza. Chega Sem BoNT amostra em branco (D9) é gerado para executar um n = 6. Diluições adicionais podem ser adicionados se desejado.

<td> 0
Nome do Programa Variável Valor Comentários
Primordial Reagente Bottle A
Volume Prime 400
Primeiro-Vazão 7
Mergulhe Após Prime? N
Matrix Wash Reagente Bottle A O número de lavagens pode ser aumentada se a actividade de protease residual.
Método
4
Mergulhe / Agitar Y
Mergulhe Duração 180
Agite Antes Mergulhe? N
Primeiro Depois Mergulhe? N
Disp
Dispense Volume 300
Dispensar Vazão 5
Dispensar Altura 130
Hor. Dispensar Pos. 0
Desativar Aspirar? Y
Inferior Wash primeiro? N
Primeiro Antes de Iniciar? N
Aspir
Aspiração Altura 40
Hor. Aspirar Pos. 0
Aspiração Taxa 5
Aspiração Delay
Transversalmente Aspirar? N
Final de aspiração? Y
Final Aspiração Delay 0
Matrix Mergulhe Mergulhe Duração 300 Duração absorver aumentada pode aumentar a recuperação de talão de alimentos mais viscosos.
Agite Antes Mergulhe? N
Mestre Wash Matrix Mergulhe Este é um programa 'Link' para executar o Matrix Mergulhe e programas Matrix Wash juntos.
Matrix Wash

Tabela 4. Magnética automatizados configurações do programa de lavagem de placas de talão-compatível. Os seguintes programas de assumir que o lavador de placas é equipada com um íman que atrai os grânulos para o lado das cavidades e que o tampão de módulo de comutação está configurado de tal modo que 1x tampão de lavagem ( PBS-T) é ligado a válvula A. Estes programas são específicos para o BioTek ELx405. Consulte o manual do instrumento para obter instruções de programação. Outros cordão compatível com lavadoras de placa automático ou colectores de vácuo pode ser utilizado magnético, no entanto, os testes serão necessários para definir as configurações que maximizam a eficiência de lavagem e minimizar a perda de talão durante a lavagem. Os testes iniciais de recuperação talão após lavagem é recomendada independentemente de a máquina de lavar prato específico usado.

<td> LOD
Matrix Food Métrico 2 hr 4 hr 24 hr
MLD 50 / g de alimentos MLD 50 / poço MLD 50 / g de alimentos MLD 50 / poço MLD 50 / g de alimentos MLD 50 / poço
Leite 300 58 100 19 30 6
LOQ 1000 193 300 58 100 19
CE 50 2404 464 590 114 92 18
Tomates Frescos LOD 1000 91 300 27 30 3
LOQ 1000 91 1000 91 100 9
CE 50 7561 687 1932 176 229 21

Tabela 5. Limites de detecção (LOD), os limites de quantificação (LOQ), e meia-maximal concentração eficaz (EC 50) para o leite a 2% e o teste de tomate fresco mostrado na Figura 2A. A CE 50 é derivada da sigmoidal de dose-resposta de ajustamento da curva enquanto que o LOD e LOQ são definidos como sendo o ponto de dados de concentração mais baixa que cai ou 3 ou 10 desvios padrão abaixo os controlos sem BoNT (n = 6), respectivamente. Os dados são apresentados em ambos MLD 50 / g de alimento e no total 50 MLD s testadas por poço em o volume de amostra de 200 uL.

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Discussion

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Este protocolo descreve procedimentos para a quantificação de BoNT / A complexa, holotoxina, Clostridium ou de sobrenadante de cultura em matrizes complexas. O protocolo é o mesmo, no entanto, ao testar outros serotipos BoNT (por exemplo, de BoNT / B, E e F), com os seus respectivos ensaios de matriz 56,60, embora a sensibilidade do ensaio irá variar entre os serotipos e ensaios. Este protocolo não conta para cada tipo de amostra possível e algumas modificações que podem ser necessárias, dependendo da composição específica e da aplicação da amostra desejada. Matrizes podem incluir amostras de alimentos (por exemplo, testes de provocação alimentar) ou buffers excipiente farmacêutico (testes de produtos à base de drogas BoNT por exemplo). Complexo não alimentares (por exemplo, tecido animal ou ambiental) líquido e amostras sólidas devem ser tratados como amostras de alimentos. Este protocolo utiliza volumes de 200 ul / poço de amostra, mas tão pouco quanto 50 ul / poço pode ser testado com o ajustamento correspondente ao volume de 10x bindintampão g. As amostras mais pequenas do que 50 ul deve ser diluída com RGF ou PBS a ≥ 50 mL antes do teste.

A natureza altamente variável de alimentos representa um desafio particular para a detecção e quantificação BoNT nos alimentos. Amostra pH, a viscosidade, a força iónica, bem como a presença de partículas em suspensão podem potencialmente afectar a actividade da toxina no interior da matriz de comida e exigem que a toxina ser isolado a partir do alimento para precisas, in vitro, a quantificação. Muitos alimentos ou preparações de toxina também conter proteases endógenas que devem ser removidas ou inactivadas quando usando repórteres à base de proteínas para garantir que apenas a actividade de protease específica de BoNT-é medido. Mesmo matrizes simples, bem definidas, de tampão tais como tampões de excipientes farmacêuticos, podem conter compostos que interferem com a actividade de BoNT que deve ser removida antes da quantificação 35,56-59,61. Imunoprecipitação oferece um rápido, altamente sorotipo-específica BoNT purimétodo cação, mas requer anticorpos de alta afinidade para isolar as baixas concentrações de toxina encontrada em alimentos "mundo real", ambiental e amostras farmacêuticas.

O protocolo descrito purifica a toxina usando esferas paramagnéticas revestidas com anticorpos anti-BoNT / A dirigidos para o domínio do receptor da cadeia pesada da toxina do BoNT / A holotoxina núcleo 56. Espécies de Clostridium, no entanto, naturalmente produzir complexos de toxina que consistem na holotoxina núcleo em associação com PAN 62-64. Os PNA proteger a toxina do ataque por proteases no tracto gastro-intestinal e são acreditados para facilitar o transporte da toxina através do epitélio da intestino 63,65. Os PNA inibir a ligação dos anticorpos PI-Um cordão anti-BoNT / A para a holotoxina núcleo (dados não mostrados). Esta inibição é aliviada através do aumento do pH da amostra acima de ~ 6,25, fazendo com que o substrato de BoNT / A toxina eficaz complexo de dissociar-se em holotoxina e PAN e permitindoligação ao IP-grânulos 66. Por esta razão, o ajustamento do pH da amostra para acima de 6,5 é crítico para o sucesso do ensaio (Figura 5B). A 10x tampão de ligação utilizado no protocolo contém um agente tampão para ajudar a elevar o pH para as condições de ensaio standard. No entanto, muitos alimentos ácidos pode sobrecarregar a capacidade tampão do tampão de ligação. O tampão de neutralização adicional 10x aumenta grandemente a capacidade de tamponamento da amostra e deve neutralizar a maioria das matrizes alimentares.

Outro parâmetro importante para o ensaio é a força iónica da amostra. Esclarecimento das amostras por centrifugação é necessária para a lavagem talão eficaz e recuperação após imunoprecipitação. Testes com tomates frescos revelou que nenhum de BoNT / A recuperação foi observada quando as amostras foram simplesmente processado e centrifugado. Colocámos a hipótese de BoNT / A, pode associar-se a polpa de tomate fazendo-a sedimentar durante a centrifugação e tornar-se ausente dosobrenadante testado. Nós descobrimos que o aumento da força iónica ou, de forma mais significativa, neutralizando as interacções limitadas de pH entre BoNT e a matriz, resultando em melhoria da recuperação da toxina (Figura 5B). Embora não seja necessário para a recuperação de BoNT, espera-se, embora não demonstrado, que as concentrações mais elevadas de sal também vai aumentar o rigor da imunoprecipitação e resultar na recuperação de proteína não específica inferior, especialmente em alimentos com baixo teor de sal.

PH da amostra e do ajustamento da força iónica no protocolo é realizada pela adição de 10x tampão de neutralização e deve ser compatível com uma ampla variedade de alimentos. Enquanto o tampão de neutralização 10x tem uma elevada capacidade de tamponamento, alguns alimentos altamente ácidos podem necessitar de um ajustamento de pH adicional. Teste do pH da amostra após a adição de tampão é recomendado se o mau desempenho do ensaio é observado e volume de amostra permite. Ajuste adicional do pH pode ser alcançada através da adição de svolumes de shopping de 1 M HEPES pH 8, se necessário. O NaCl adicional introduzida pelo tampão de neutralização 10x deve ser aceitável para todos os alimentos, mas mais salgado, no entanto, 10x tampão de neutralização pode ser substituído com HEPES 1 M pH 8, se os maus resultados são vistos com um determinado produto alimentar. Não houve diferenças significativas foram observadas ao testar o protocolo descrito em concentrações de NaCl até 1,2 M em PBS.

Embora este protocolo é aplicável para a maioria das amostras, os alimentos nos extremos de pH, força iónica, e / ou o conteúdo de protease pode não se obter bons resultados com o ensaio. Alguns alimentos também podem permanecer muito viscoso a seguir à adição de GPB, resultando numa fraca recuperação do grânulo. Pré-diluição de amostras com um tampão simples, tais como PBS pode melhorar os resultados. Aumentando o número de lavagens ou lavagem de rigor (por aumento da concentração de NaCl) e o aumento da concentração dos inibidores de protease isento de EDTA podem também melhorar os resultados se não específica contaminada de proteaseião é observada. Instrumento de limpeza também é muito importante quando se usa placa de lavagem automática. A contaminação das canalizações e de injecção com pontas com proteases (por exemplo, tripsina) a partir de outros ensaios laboratoriais podem levar à introdução involuntária de proteases durante o ensaio. A limpeza completa da máquina de lavar prato de acordo com o manual do usuário do fabricante é recomendada antes da execução do ensaio.

Os ensaios Matrix BoTest são os primeiros comercializados, ensaios baseados em atividade para a detecção e quantificação BoNT em matrizes complexas. Comparado com o bioensaio de mouse padrão, o teste é rápido, mais barato, e permite o teste de alto rendimento, sem a necessidade de instalações especializadas ou preocupações éticas a respeito do uso de animais 56. Outros in vitro BoNT métodos de detecção foram descritos, mas não foram mostrados para ser compatível com matrizes complexas, requerem equipamento especializado, ou não são comercialmente disponle 35,42-44,46-55. Os ensaios são também ensaios baseados em actividades que medem a actividade de endoprotease toxina, enquanto ensaio de imunossorvente tradicional ligado a enzima (ELISA), técnicas de apenas comunicar massa toxina. Ensaios de ELISA à base de actividade foram anteriormente descritos, mas esses ensaios não foram demonstradas para trabalhar com matrizes alimentares e não englobam a purificação da toxina a partir da matriz da amostra 41. Subestimação significativa da toxicidade de amostras complexas podem ocorrer se a toxina não é purificado a partir da amostra desde que os compostos de matriz muitas vezes interferir com a actividade de BoNT 35,56-59.

Uma vez que o protocolo é dominado, modificações podem ser feitas para aumentar o volume da amostra e aumentar a sensibilidade da amostra. Por exemplo, a ligação da toxina aos grânulos podem ser realizados em amostras maiores (por exemplo, volume de 10 ml ou superior) antes da recolha por centrifugação. Estes grânulos podem, então, ser adicionados a uma placa de 96 poços e ensaiaram-se a seguir a descreverprotocolo d. Aumentos na sensibilidade maior do que um log têm sido observadas com o aumento do tamanho da amostra 56. Assim, o protocolo descrito pode ser utilizado com as amostras de maior volume para detectar até mesmo quantidades vestigiais de BoNT contidos em amostras que podem passar sem ser detectado por bioensaio.

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Disclosures

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin e WC Tucker são funcionários ou proprietários de BioSentinel Inc. BioSentinel atualmente fabrica e comercializou alguns dos reagentes apresentados neste relatório.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a H. Olivares e D. Ruge para discussões e conselhos valiosos. Esta pesquisa foi apoiada em parte por um prêmio NSF SBIR (IIP-1127245 para BioSentinel Inc.) e um contrato do Departamento de Defesa (W81XWH-07-2-0045 para BioSentinel Inc.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A Metabiologics Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Fisher Scientific 15036

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Isolamento e Quantificação da neurotoxina botulínica a partir de matrizes complexas usando os BoTest Matrix Ensaios
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Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).More

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).

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