Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Выделение и количественная оценка ботулинического нейротоксина Из комплексных матриц с использованием BoTest Matrix Анализы

Published: March 3, 2014 doi: 10.3791/51170
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1BioSentinel Inc., Madison, WI

Summary

BoTest Матрица нейротоксин ботулизма (BoNT) анализы обнаружения быстро очистить и количественно Бонт из целого ряда образцов матриц. Здесь мы приводим протокол для обнаружения и количественного определения BoNT от обоих твердых и жидких матриц и продемонстрировать анализа с помощью ботокса, помидоры, и молока.

Abstract

Точное обнаружение и количественное определение ботулинического нейротоксина (ботулинического токсина) в комплексных матриц требуется для фармацевтической, экологических и испытаний образцов пищевых продуктов. Быстрое BoNT тестирование продуктов питания необходим во время вспышки экспертизы, диагностики пациента и тестирования безопасности пищевых продуктов в то время как точная потенции испытания для производства ботулинического токсина типа на основе лекарственного препарата и безопасности пациентов. Широко используется мышь биопроб для тестирования ботулинического токсина очень чувствительна, но не хватает точности и пропускной необходимое для быстрого и регулярного тестирования ботулинического токсина. Кроме того, использование биоанализе в животных привело к призывам лекарственного продукта регулирующими органами и сторонниками за права животных в США и за рубежом, чтобы заменить биоанализ мыши для тестирования ботулинического токсина. Несколько в пробирке запасные анализы были разработаны, которые хорошо работают с очищенной BoNT в простых буферов, но большинство из них не было показано, что применимо к тестированию в очень сложных матриц. Здесь, протокол для обнаруженияBoNT в комплексных матриц с использованием BoTest Matrix анализов представлена. Анализ состоит из трех частей: Первая часть включает в себя подготовку образцов для тестирования, вторая часть является шагом иммунопреципитацию использованием анти-Бонт антител покрытием парамагнитные шарики, чтобы очистить Бонт из матрицы, и третья часть количественно протеолитической изолированной Бонт в Деятельность, использующая флуорогенный репортер. Протокол написана для высокой пропускной тестирования в 96-луночных планшетах с использованием как жидкие, так и твердые матрицы и требует около 2 ч ручного приготовления с всего раз анализе 4-26 часов в зависимости от типа образца, токсинов нагрузки и желаемого чувствительности. Данные представлены для BoNT / A тестирования с забуференным фосфатом физиологическим раствором, лекарственного продукта, культурального супернатанта, 2% молока и свежих томатов и включает обсуждение критических параметров успеха анализа.

Introduction

Нейротоксинов ботулина (BoNTs) являются самыми смертоносными вещества, известные, с внутривенных человека смертельных доз оценивается в 1-3 нг / кг 1,2. Семь структурно подобные серотипов BoNT, помечены через G, существует, каждый из которых состоит из тяжелой цепи домена, ответственного за связывание клеток, поглощение, и транслокации в цитозоль и легкой цепи, которая кодирует цинка эндопептидазы 3-5. Изысканный токсичность BoNT результатом, в частности, его специфического связывания и вступление в моторных нейронов в нервно-мышечном соединении 6. Оказавшись внутри нейрона, легкой цепи эндопептидаза специально расщепляет один или несколько из растворимого N-этилмалеимид чувствительных рецепторов белка привязанность фактором (SNARE) белков, необходимых для слияния пузырьков, ингибирования высвобождение нейромедиаторов и приводит к вялым параличом 7-14. Обычно известный как болезнь "ботулизма", паралич диафрагмы и межреберных мышц по BoNT в конечном итоге приводитдыхательная недостаточность и смерть, если ранней диагностики и лечения принимаются.

Человека пищевого ботулизма чаще всего ассоциируется с ботулинического токсина серотипов A, B, E, и F (BoNT / A, BoNT / B, и т.д.) и обычно возникает в результате употребления в пищу загрязненных продуктов питания 15,16, хотя несколько случаев раны ботулизма было зарегистрировано среди потребителей инъекционных наркотиков 17,18. В Соединенных Штатах, детский ботулизм в результате проглатывания Clostridium спор детьми в возрасте до одного является наиболее распространенной формой ботулизма 19-21. Тем не менее, были зарегистрированы пищевые вспышки ботулинического токсина в результате неправильного домашнего консервирования и переработки пищевых продуктов как в Соединенных Штатах и ​​за рубежом. Между 2000-2009 было зарегистрировано по меньшей мере 338 случаев пищевого ботулизма во всем мире в том числе шесть погибших 22. Способность быстро и чутко обнаружить пищевого происхождения вспышек ботулизма является одним из важнейших признаков того, что может помочь ранней диагностики 23,24. Кроме того, методы обнаружения, которые позволяют экономически эффективным и рутинное тестирование питания приведет к улучшению продовольственной безопасности.

Нейронов специфика Бонт и долго биологического полураспада также делает его мощным терапевтическим. В Соединенных Штатах, наркотики ботулинического токсина типа на основе утверждаются по контролю за продуктами и лекарствами для лечения косметических состояний и нервно-мышечных расстройств, связанных в том числе глабеллярных линий, цервикальной дистонии, мигрени, гиперактивного мочевого пузыря, и косоглазия. Многочисленные "не по прямому назначению" приложений задокументированы, в том числе высоких доз лечения тяжелой дисфункцией мышц 25-28. Точная токсин количественное имеет решающее значение для правильного дозирования, как недокомпенсация может привести к неэффективному лечению в то время как передозировка ставит пациентов риску потенциально вредных побочных эффектов. К сожалению, ни стандартизированный протокол потенции анализ не является общим для производителей, в результате чего неравенства четкости блок между ботулинического токсина типа на основе произво наркотиковк.т.н. 29-31.

Стандартный тест на BoNT является биоанализа мыши, в котором BoNT-содержащие образцы инъецировали внутрибрюшинно мышам и количество смертей, зарегистрированных в течение 1-7 дней 16,32,33. Биологический мыши очень чувствительна с пределов обнаружения (LOD) 5-10 пг BoNT / A 34, однако этические опасения по поводу использования животных, высокая стоимость обучения персонала и поддержание объектов животного, длинные раз анализе и отсутствие стандартизированные протоколы привели призывы разработать стандартизированную, животное без Бонт тестирования и методы количественной 35-39. В последнее время несколько альтернативные методы ботулинического токсина количественного были разработаны, которые предлагают мыши или почти мыши чувствительность биопроб 40-49. Эти методы обычно используют флуоресценцию, масс-спектрометрии, или иммунологические методы и предлагают раз опробования значительно короче биопроб мыши без использования животных. Масс-спектрометрии подходов в сочетании с иммунологической TechniqЕЭС были показаны для выявления и количественной BoNT содержится в продуктах питания и других сложных образцов, однако требования к обучению персонала и предел специализированное оборудование этих анализов 50-55. Большинство других альтернативных анализы не всегда применимы к сложной образца тестирования или не хватает пропускной способности, необходимой для регулярного тестирования ботулинического токсина. Сильно варьирует характер образца пищевой вязкости, рН, содержание солей и матричных компонентов представляет особенно трудную задачу, пытаясь развить в пробирке методы анализа с чувствительностью, чтобы соответствовать крайнюю потенцию BoNT. Кроме того, даже простые и относительно доброкачественные буферные системы, такие, как в результате ресуспендированием лекарственных продуктов ботулинического токсина типа на основе, содержат соли, альбумина и сахара стабилизаторы (т.е. наполнители), что значительно повлиять в пробирке BoNT потенции 56. Очистка Токсин требуется для точной деятельности тестирования всех, кроме простейших образцов 56-59.

BoTest Матричные анализы предназначен для быстрого, высокой пропускной способностью, и в соответствии количественное BoNT от очень сложных образцов с использованием оборудования обычно встречаются в научно-исследовательских лабораториях 56,60. Эти анализы использовать парамагнитные шарики, ковалентно связанные с серотипа конкретных анти-ботулинического токсина антител связываться и поглощения Бонт из образца, а затем удалить вмешиваясь матричные соединения промывкой. После промывания, граница протеолитическую активность ботулинического токсина затем количественно в оптимизированном реакционного буфера, используя репортер, совместимый с серотип ботулинического токсина проходит испытания. Эти репортеры флуорогенные белки, состоящие из N-концевой голубой флуоресцентный белок (СФП) фрагмент и желтый флуоресцентный производной (Венера) фрагмент С-концевой белок, связанный с помощью ботулинического токсина подложки, SNAP25 остатков 141-206 или синаптобревин остатков 33-94 составляющих BoTest / E или B / D / F / G репортеры, соответственно 45. Репортер расщепление BoNT контролируется с использованием Förster резонансный перенос энергии (FRET). При тон репортер не повреждена, возбуждение CFP приводит лад с Венеры, закалки эмиссию CFP и интересно излучение Венеры. Расщепление репортера по BoNT предотвращает FRET, что приводит к увеличению эмиссии CFP и снижения выброса Венера. BoNT активность может быть количественно измерена с помощью соотношение количества выбросов CFP и Венеры. LOD ниже 3 мкг возможны из широкого спектра пищевых продуктов с использованием высокой пропускной формат 96-луночный планшет 56. Увеличение чувствительности могут быть получены с использованием больших объемов образцов, так как анализ позволяет концентрацию токсина на поверхности шарика.

Матрица анализы BoTest для BoNTs А, В, Е и F были разработаны и протестированы с пищевой, фармацевтической, и проб окружающей среды 56,60. Здесь мы описываем процедуры для выполнения этих анализов для обнаружения BoNT в низкой сложности (например, фармацевтической, BoNT в буфере) и высокая сложность (например, продукты питания, экологической) образцы. Конкретные методы обработкина несколько типов образцов, рассматриваются в данном протоколе и типов образцов, не описанные здесь, как правило, могут быть адаптированы с помощью комбинации представленных методов. Протокол был разработан и испытан с BoNT / A, но адаптированы к условиям других серотипов ботулинического токсина использовали свою анализов, как показано в другом месте 56,60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка реагентов для анализа

  1. Thaw 200x дитиотреитола (DTT), 10x Матрица Связывающий буфер (10х буфера для связывания далее), 10x нейтрализации буфера (рН пищевых или несбалансированные образцы только) и 10x BoTest Реакционный буфер (10х реакционного буфера далее) при комнатной температуре (RT) в течение 15 мин или до полного оттаивают. См. Таблицу 1 для списка буферов и реагентов, используемых в данном протоколе. См. Таблицу 2 для списка материалов и оборудования, необходимых для этого протокола.
  2. Vortex талой буферы для 5 сек перемешать. 10x Нейтрализация буфера, 200xDTT и 10x Реакция буфер должен появиться ясно в то время как связывание буфера 10x будет иметь мутный вид. Нагревают 10x реакционного буфера в течение 5 мин при 37 ° С и повторить вихревание, если он появляется облачно следующее размораживание.
  3. Генерация 3,8 мл 1x реакционного буфера.
    1. Этикетка 15 мл коническую трубку "1x реакционного буфера" и добавить 3,42 мл молекулярная биология класс Ватэ-э, 380 мкл 10х Реакция буфера и 19 мкл 200x DTT. Смешайте буфера хорошо инверсии.
    2. Ингибиторы вырезать отдельную ЭДТА без ингибитор протеазы таблетку в кварталах с использованием чистой лезвие и добавить одну четверть таблетки на 1х реакционного буфера (остальные таблетки часть может храниться при 4 ° С для дальнейшего использования). NB протеазы не может быть необходимо, если с использованием очищенного токсина и простые буферы (например, фармацевтические образцов).
    3. Vortex 1x буфер Реакция пока протеазы таблетки полностью не растворится.
  4. Теплый бисер Матрица A (IP-бусы далее) в течение 20 мин при комнатной температуре.
  5. Оттепель репортеру BoTest / E (A / E репортер далее) при комнатной температуре в защищенном от света месте.
  6. Этикетка 15 мл коническую трубку "0,5 мкМ / E-репортер" и добавить 45 мкл 20 мкМ / E репортера складе до 1,8 мл 1x реакционного буфера. Тщательно перемешать с помощью пипетки и хранить на защищенном от света льда.

2. СтоятьARD Образец Кривая поколения

Стандартная кривая описано здесь охватывает 10-30,000 MLD 50 / г пищи или за буфером мл в разведении полулогарифмических (табл. 3). Конечный пользователь может свободно использовать альтернативные концентрации в зависимости от обстоятельств.

  1. Прокалывание и инкубации матрицы с справочного материала. Генерация стандартной кривой с использованием разбавителя из той же матрицей, как неизвестный, по возможности, снизить матричные эффекты. Использование желатина фосфатного буфера (ГПБ) или фосфатно-солевом буфере (PBS) в качестве разбавителя, если дополнительные, BoNT-отрицательных матрица не доступны (например, поле или BoNT вспышка тестирование образец). Генерирование стандартную кривую пики BoNT / A в матрицу выбора после соответствующего протокола ниже.
    1. Образцы низкой сложности (например, PBS, ГПБ, или фармацевтической)
      1. Добавьте 10 мл соответствующего буфера в 15 мл коническую трубку и отложите в сторону. Этот пример будет использован в качестве разбавител дл стандартизации Организацииг кривой и неизвестные разведения (раздел 4).
      2. Добавить 1,2 мл буфера для микроцентрифужных трубки.
      3. ВНИМАНИЕ: Этот шаг использует Бонт и крайняя осторожность должна быть использована при обработке и утилизации любых реагентов и материалов, которые входят в контакт с токсином. Использование средств индивидуальной защиты и правильной утилизации всех материалов должны выполняться в соответствии с Министерством труда США OSHA принципов для BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Добавить BoNT / A в 1,2 мл образца так, чтобы конечная концентрация 30 000 50 MLD / мл (36000 MLD 50 всего).
    2. Образцы Жидкие пищевые (или другие сложные жидкие образцы) Примечание: Первоначальное тестирование рекомендуется определить объем супернатанта оправился от выясненных образцов как твердых частиц (. Например целлюлозно) в жидких матриц будет меняться. Этот протокол предполагает не менее 1,2 мл осветленной надосадочной будет оправился от 1,4 мл SAMPле. Увеличение размера выборки при необходимости.
      1. Добавьте 10 мл жидкой пищи к 15 мл коническую трубку и отложите ее в сторону. Этот образец будет использоваться в качестве разбавителя для стандартной кривой и неизвестных разведения (раздел 4).
      2. Взвесьте пустой 1,5 трубки микроцентрифужных мл и записать его массу.
      3. Добавить 1,4 мл жидкого пищи взвешенной микроцентрифужных трубки.
      4. Взвешивают в микроцентрифужную пробирку и рассчитать массу добавленного образца пищевого путем вычитания массы пустой трубы.
      5. ВНИМАНИЕ: Этот шаг использует Бонт и крайняя осторожность должна быть использована при обработке и утилизации любых реагентов и материалов, которые входят в контакт с токсином. Использование средств индивидуальной защиты и правильной утилизации всех материалов должны выполняться в соответствии с Министерством труда США OSHA принципов для BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Добавить BoNT / A в образце 1,4 мл при конечной концентрации 30 000 50 MLD / г пищи.
      6. Инкубациит.е разбавитель и шипами образцы при комнатной температуре или температуре 4 ° С в течение 2 часов, чтобы дать время BoNT взаимодействовать с пищевой матрицы, имитируя естественное загрязнение.
    3. Образцы твердой пищи (или в других твердых образцов) Примечание: Первоначальное тестирование рекомендуется определить объем супернатанта, выделенного из усредненных и осветленных образцов после добавления 1 мл ГПБ / г пищи. Этот протокол предполагает, что по крайней мере 1,2 мл осветленный супернатант будут восстановлены из 2 г образца. Увеличение размера выборки при необходимости.
      1. Взвесить 10 г твердого образца в 50 мл коническую трубку и отложите в сторону. Это будет использоваться в качестве разбавителя.
      2. Взвесить 2 г твердого образца пищи во второй 50 мл коническую трубку.
      3. ВНИМАНИЕ: Этот шаг использует Бонт и крайняя осторожность должна быть использована при обработке и утилизации любых реагентов и материалов, которые входят в контакт с токсином. Использование средств индивидуальной защиты и правильной утилизации всех материаловс должны выполняться в соответствии с Министерством труда США OSHA принципов для BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Добавить BoNT / A в поверхности 2 г образца в конечной концентрации 30 000 50 MLD / г пищи (60000 общий MLD 50).
      4. Инкубируйте разбавитель и шипами образцов при комнатной температуре или температуре 4 ° С в течение 2 часов, чтобы дать время BoNT взаимодействовать с пищевой матрицы, имитируя естественное загрязнение.
  2. Образец гомогенизации и буфер регулировки. Обработайте шипами стандартного образца кривой и разбавителя сгенерированный выше в зависимости от типа образца.
    1. Низкие образцы сложности
      1. Никакой дополнительной обработки образцов не требуется.
    2. Образцы жидких пищевых продуктов (или другие сложные жидкие образцы)
      1. Нет образец гомогенизации не требуется.
      2. Добавить 140 мкл 10x нейтрализации буфера с 1,4 мл шипами образец и 1 мл 10x Обезвреживаион буфер для разбавителя образца на 10 мл. Смешайте образцы хорошо инверсии.
      3. Частично прояснить оба образца центрифугированием в течение 10 мин при 6000 х г и 4 ° С. Немедленно снять супернатанты и передавать в новые пробирки.
    3. Образцы твердой пищи (или в других твердых образцов)
      1. Добавить 2 мл ГПБ (1 мл ГПБ / г пищи) к 2 г BoNT / A-шипами твердого образца продуктов питания и 10 мл ГПБ в 10 г разбавителя образца.
      2. Гомогенизируют образцы, используя пестик пока полностью не смешиваются. В зависимости от природы пробы, могут быть небольшие куски материала, который не может быть гомогенизируют, который является приемлемым. С другой стороны, могут быть использованы механические методы гомогенизации. Использование блендер не рекомендуется, поскольку это может инактивировать а также аэрозоль токсин.
      3. Добавить объем 1/10th из 10х буфера для нейтрализации разбавителя образца на основе приближенного общего объема (например, 2 мл, если объем 20 мл). ЭкстраполироватьОбщий объем / образец ботулинического токсина А-шипами и добавить объем 1/10th из 10х нейтрализации буфера. Смешайте образцы хорошо инверсии.
      4. Частично прояснить оба образца центрифугированием в течение 10 мин при 6000 х г и 4 ° С. Немедленно снять супернатанты и передавать в новые пробирки.
  3. Подготовка стандартной кривой серийные разведения для тестирования
    1. Использование BoNT / A-шипами стандартного образца кривую, как D1 и nonspiked образец в качестве разбавителя, генерировать оставшиеся стандартных образцов кривой в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках в соответствии с таблицей 3.

3. Подготовка неизвестных образцов

В этом разделе может быть завершена в параллельной секции 2.

  1. Определить количество и разведения неизвестных. Проверьте неизвестных в трех экземплярах, если это возможно.
    1. Для качественных анализов, запускать неизвестные без дальнейшего разбавления, чем требуется для обработки образца, как descriкровать ниже.
    2. Для количественных анализов, подготовка по меньшей мере два 1:10 разбавление образцов, как описано ниже, чтобы гарантировать, что один или более образцов попадают в пределах линейного диапазона ответа анализа. Создать разведения с использованием разбавителя из той же матрицей, как неизвестное, если это возможно, чтобы уменьшить матричные эффекты, как описано в разделе 3. В противном случае, использовать PBS или ГПБ в качестве разбавителя.
  2. Создание и разбавления неизвестных образцов в зависимости от типа образца.
    1. Низкие неизвестных сложности (например, PBS, ГПБ, или фармацевтической)
      1. Добавить по крайней мере, 750 мкл неизвестные микроцентрифужных трубки для генерации Неизвестный разбавление 1.
      2. Добавить 675 мкл разбавителя для двух микропробирок меченых Неизвестный разбавления 2 и 3. Разбавитель будет таким же материал, используемый для стандартной кривой поколения.
      3. Серийно разбавить разбавление 1 путем передачи 75 мкл разведения 1 в разведение 2 трубки и смешивания.
      4. Серийно разбавлятье разведение 2 путем передачи 75 мкл разведения 2 в разведение 3 трубки и смешивания.
    2. Жидкие неизвестные питания (или другие сложные жидкие образцы) Примечание: Первоначальное тестирование рекомендуется определить объем супернатанта оправился от выясненных образцов, как описано в разделе 3. Увеличение размера выборки при необходимости.
      1. Добавить ≥ 875 мкл жидкой неизвестны микроцентрифужных трубки.
      2. Добавить объем 1/10th из 10х нейтрализации буфера образца (например, 87,5 мкл для 875 мкл образца).
      3. Частично уточнить образец центрифугированием в течение 10 мин при 6000 х г и 4 ° С. Сразу передачи супернатант в новую пробирку. Это неизвестно разбавления 1.
      4. Добавить 675 мкл разбавителя для двух труб меченых Неизвестный разбавления 2 и 3. Разбавитель будет таким же обработке материал, используемый для стандартной кривой поколения.
      5. Серийно разбавить разбавление 1 переводомкольцо 75 мкл разведения 1 в разведение 2 трубки и смешивания.
      6. Серийно разбавить разбавление 2 путем передачи 75 мкл разведения 2 в разведение 3 трубки и смешивания.
    3. Твердые неизвестные питания (или в других твердых образцов) Примечание: Первоначальное тестирование рекомендуется определить объем супернатанта оправился от выясненных образцов, как описано в разделе 3. Увеличение размера выборки при необходимости.
      1. Взвесить 2 г твердого неизвестного образца в 50 мл коническую трубку.
      2. Добавить 2 мл ГПБ (1 мл ГПБ / г пищи) к 2 г твердого образца.
      3. Гомогенизируют образцы, как описано в разделе 3.2.3.2.
      4. Добавить объем 1/10th из 10х буфера нейтрализации к образцу на основе приближенного общего объема (например, 0,4 мл если объем 4 мл). Смешайте образцы хорошо инверсии.
      5. Частично уточнить образец центрифугированием в течение 10 мин при 6000 х г и 4 ° С. Immediatelу передачи ≥ 750 мкл супернатанта в микроцентрифужных трубки. Это неизвестно разбавления 1.
      6. Добавить 675 мл разбавителя до двух трубок меченых Неизвестный разбавления 2 и 3. Разбавитель будет таким же обработке материал, используемый для стандартной кривой поколения.
      7. Серийно разбавить разбавление 1 путем передачи 75 мкл разведения 1 в разведение 2 трубки и смешивания.
      8. Серийно разбавить разбавление 2 путем передачи 75 мкл разведения 2 в разведение 3 трубки и смешивания.

4. Окончательная проба Разъяснение

Если тестирование жидкие или твердые образцы продуктов питания, центрифуги все образцы в течение 5 мин при ≥ 14000 мкг в микроцентрифуге в полной мере прояснить образцы. Немедленно снять супернатанты и передавать в новые пробирки.

5. Тарелка Настройка и BoNT / Pull Down

  1. Конкретная схема пластины зависит от приложения, однако, не следует использовать внешние скважин с тем,чтобы избежать краевых эффектов. Каждый неизвестный образец и стандартный образец кривая D1-D8 требуется 3 скважины в то время как образец D9 требуется 6 скважин. Предлагаемый макет пластина показано на рисунке 1.
  2. Добавить 20 мкл 10х буфера для связывания в каждую лунку быть использованы.
  3. Добавить 200 мкл каждого осветленной разбавления и неизвестно к каждому из трех скважин (шесть скважин для D9) для трех экземплярах тестирования. Смешайте пластины в течение 10 сек на микропланшет-смесителе.
  4. Добавить бусинки IP-A.
    1. Вихревые шарики IP-A в течение 10 секунд на максимальной скорости. Продолжить вихревание если шарики не полностью ресуспендировали и однородным.
    2. Внесите 20 мкл IP-Бусы в каждом образце хорошо.
    3. Смешайте пластины в течение 30 сек на микропланшет-смесителе.
  5. Инкубировать при помощи вращающейся пластины инкубатор в течение 2 часов при 750 оборотах в минуту, 25 ° С или комнатной температуре. Проведение теста сильно зависит от генерации и поддержании IP-шарик суспензии в течение всех этапов инкубации. Всегда ресуспендируйте шарики с micropпоздно смеситель после гранулирования и поддерживать приостановку используя орбитальный микропланшетах шейкер в течение всех этапов инкубации.

6. Тарелка Стиральная и бисера Ресуспендирование

  1. Вымойте тарелки вручную или с помощью магнитного шарика-совместимый автоматизированный плоскую шайбу. Автоматизированная промывания планшетов настроен на магнитных шариков значительно увеличивает анализа пропускной способности.
    1. Руководство Стиральная
      1. Этикетка 50 мл коническую трубку "1x промывочного буфера" и добавить 45 мл молекулярная биология класс воды и 5 мл 10x Матрица промывочного буфера. Смешайте буфера хорошо инверсии.
      2. Извлеките пластину с вращающейся пластины инкубаторе.
      3. Сразу же место пластину на 96-луночном магнитный шарик разделительной пластине в течение 5 мин.
      4. Удерживая пластину на 96-луночного разделения магнитного шарик плиты, аккуратно снимите и выбросьте супернатанты из образца скважин с помощью пипетки одно-или многоканальный. Не аспирациибисер-визуально контролировать атмосферный буфер в пипетки для случайного удаления борта. Если удаление свидетелем, мягко добавить содержимое наконечников обратно в скважины, reseparate, и повторите удаление.
      5. Добавить 300 мкл буфера 1x Wash к каждому образцу хорошо.
      6. Полностью ресуспендируют бисером путем смешивания пластины в течение 30 сек на микропланшет-смесителе.
      7. Инкубировать на 96-а магнитное борта разделительной пластины в течение 2 мин.
      8. Снимите и выбросьте супернатанты из образца скважин, как и раньше.
      9. Повторите шаги 6.1.1.5-6.1.1.8 еще три раза в общей сложности 4 стирок.
      10. С пластины на 96-а магнитное борта разделительной пластины, осмотрите скважин для подтверждения даже надосадочную удаление; использовать пипетку, чтобы удалить лишнюю остаточный буфер по мере необходимости. Некоторые буфера останется в скважинах и необходимо позаботиться, чтобы избежать удаления шарик или шарик сушки.
      11. Добавить 50 мкл 1x буфер реакция на каждого образца скважины и смешать тарелку для 30 SEс на микропланшет смесителя полностью ресуспендируют бисером. При необходимости используйте пипетку, чтобы полностью ресуспендируют бисером.
    2. Автоматизированная Стиральная плиты
      1. Установка и программа шайба согласно таблице 4. Чистый и флеш шайба с высоким качеством (например NanoPure) воды.
      2. Премьер-шайба, запустив программу "Премьер".
      3. Извлеките пластину с вращающейся пластины инкубаторе.
      4. Сразу же место пластину на 96-а магнитное борта разделительной пластины на пластины шайбой.
      5. Запустите программу ссылка «Мастер Wash". Первым шагом программы является шагом инкубации 5 мин, где шайба будет стационарным.
      6. После завершения программы, удалить пластину из мойки, добавить 50 мкл 1x реакционного буфера к каждому образцу хорошо, и смешать пластину в течение 30 сек на микропланшет смесителя полностью ресуспендируют бисером. При необходимости используйте пипетку, чтобы полностью ресуспендируют бисером.

    7. Анализ Инициирование и Инкубационный

    1. Добавить 50 мкл 0,5 мкМ / E репортера (см. раздел 1) для каждого образца скважины и перемешивать в течение 30 сек на микропланшет смесителя полностью ресуспендируют бисером.
    2. Добавить 100 мкл воды для каждого неиспользуемого скважины на тарелку, чтобы предотвратить краевые эффекты.
    3. Уплотнение пластину с пластиной герметизирующей лентой и инкубируют планшет с использованием вращающейся пластины инкубатор при 750 оборотах в минуту, 25 ° C или RT. Защитите пластину от света во время инкубации.

    8. Сбор и анализ данных

    Примечание: Этот анализ в режиме реального времени анализ, который может быть измерена несколько раз, пока не будет достигнуто желаемое чувствительность, нет никаких стоп-реагенты. Рекомендуемые начальные время чтения являются 2, 4 и 24 часа в сутки время инкубации с чувствительности анализа возрастает со временем инкубации.

    1. Сбор данных
      1. На каждом читать времени, удалить пластину из вращающейся пластины инкубатора, снять пломбуING ленту, и сразу же поместите пластину на 96-а магнитное борта разделительной пластины. Разрешить шарики, чтобы отделить в течение 2 мин.
      2. Место пластины в микропланшетного и измерять выбросы на ~ 470 и ~ 526 нм при возбуждении в ~ 434 нм.
      3. Если дополнительные время чтения желательно, ресуспендируют бисером в течение 30 сек на микропланшет-смеситель, запечатать пластину, и вернуть пластину к вращающейся пластины инкубаторе.
    2. Анализ данных
      1. Рассчитать отношение выбросов для каждого образца путем деления относительного блок флуоресценции значение (РФС) на 526 нм по значению РФС на 470 нм.
      2. Участок соотношение выбросов по сравнению с журнала [BoNT / A] для стандартных точек данных кривой. В зависимости от BoNT / A диапазоне потенции проверено, сигмоидальная кривую доза-реакция будет получена (см. репрезентативные результаты).
      3. Установите стандартные данные кривой с переменным наклоном доза-реакция кривой Y = Нижняя + (верх-низ) / (1 ​​+10 ^ ((LogEc 50-X) * Hillslope)), где X являетсялогарифм концентрации, Y является ответом, и Y начинается в нижней части и идет к вершине с сигмоидальной форме.
      4. Определить границы обнаружения (LOD), пределы количественного (ПКО) и полумаксимальной эффективной концентрации (ЕС 50). Пределы обнаружения определяются в качестве образца, имеющего соотношение выбросов менее 3 стандартных отклонения (SDS) ниже пустых управления (N = 6). Пределы количественного определяются как образец, имеющий степень эмиссии менее 10 СД ниже пустых управления (N = 6). EC 50 определяется из сигмоидальной кривой подгонки доза-ответ.
      5. Интерполировать потенцию неизвестных образцов против сигмоидальной стандартной кривой доза-реакция.
        1. Для количественных результатов, неизвестный образец в идеале должна находиться в пределах линейной части калибровочной кривой. Аппроксимировать линейной части калибровочной кривой путем расчета общее окно отклика анализ 20-80% (например, если коэффициент эмиссии стандартной кривой гАнгес от 0,5-2,5, линейный диапазон будет часть стандартной кривой в диапазоне от 0,9-2,1).
        2. Для качественных результатов, сравнение неизвестного образца по отношению к LOD и LOQ стандартной кривой.
        3. Не экстраполировать неизвестных образцов за пределы стандартной кривой.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Схема подведения шаги в описанной протокола показано на рисунке 2. Анализ требует от 4-26 часов, чтобы завершить в зависимости от типа образца и желаемой чувствительности анализа, но только ~ 2 часа из практического времени. Анализ проводят в 96-луночных планшетах и, в зависимости от типа тестирование выполняется, позволяет трех экземплярах тестирование до 20 образцов в том числе стандарты на чашку.

Фиг.3 показывает репрезентативные результаты анализа с использованием BoNT / A голотоксин шипами в PBS и испытаны с описанным протоколом следующим 2, 4 и 24 ч инкубации с / E репортера. Очищенный BoNT / A голотоксин был выбран для этого эксперимента, поскольку его определен молекулярный вес ~ 150 кДа, по сравнению с более широко определены 700-900 кДа для токсина комплекса, а чистота позволяют очень точное пики при точных концентраций. Отношение излучение, коэффициент излучения на 526 нм к таковому при 470 нм при возбуждении на 434нм, в каждый момент времени строили графики зависимости BoNT / A концентрации (значение MLD 50 основан на потенции Тестирование / A изготовителя Бонт). Расщепление репортера по BoNT измеряется как уменьшение коэффициента эмиссии, который с нашей планшет-ридере составляет от около 2,7 для интактного репортера до около 0,7 для полностью расщепленной репортера. Важно отметить, что, так как каждый флуоресценции пластина читатель мер в RFUs, фактическое значение коэффициента излучения будет зависеть от ридере используется. Длительное время инкубации с репортером приводит к увеличению репортера расщепления, как видно на левый поворот кривой. Точки данных, испытанные в трех экземплярах, демонстрируют низкую SD от среднего и следуйте ожидаемую тенденцию к росту соотношения выбросов с пониженной нагрузкой токсина. Отказ анализа следовать этому ожидаемый тренд может свидетельствовать об ошибке во время генерации разбавления или черчения данных. Коэффициенты выбросов управления, не содержащих BoNT / A также остаются стабильными Даринаг инкубационный (рис. 3, вставка), что указывает на отсутствие неспецифической активности протеаз.

Пример использования этого протокола для количественного фармацевтические образцы BoNT / A показано на рисунке 4. Стандартную кривую генерируется в PBS с очищенной BoNT / A голотоксина и обработаны параллельно с разведений лекарственного препарата, полученных из одного флакона 100 U лиофилизированного БОТОКС разведенной водой в 0,9% солевом растворе. (В идеале, стандартная кривая будет состоять из опорных большим количеством БОТОКС но такой материал не был легко доступен.) Образцы были испытаны с использованием описанного протокола с тем исключением, что 50 мкл образцы были протестированы в двух экземплярах без использования 10х буфера для связывания. Стандартную кривую на графике как функцию от концентрации BoNT / A следующих 24 ч инкубации с / E репортера. Отношение излучение каждого неизвестного образца затем визуализировали путем построения его пересечение через стандартной кривой. В этом анализе линияар часть стандартной кривой (окно ответ анализ 20-80%) находится между отношением излучения 2.11-1.05 и обозначено пунктирным прямоугольником на рисунке. Концентрации трех неизвестных, которые попадают в данном линейном диапазоне Затем интерполированное по стандартной кривой (рис. 4, вставка). Этот пример демонстрирует общую методологию, которая будет использоваться для обнаружения или определения любого неизвестного образца по стандартной кривой.

Свежие помидоры и 2% молока были выбраны, чтобы продемонстрировать производительность и чувствительность с использованием как твердое вещество (помидор) и жидкую пищу (2% молока) матрицу Протокола. BoNT / Комплекс состоит из основного голотоксин и нейротоксина белков, ассоциированных (НПД) был выбран для этих экспериментов, потому что этот препарат напоминает токсина, вырабатываемого во время стихийного загрязнения Clostridium. Как показано на фиг.5А, восстановление BoNT / A, измеренной как расщепления A / E репортера, наблюдается при бПр матрицы. Увеличение времени инкубации с репортером увеличивает чувствительность анализа, но не приводит к снижению коэффициентов выбросов для никем не контролируется токсина (рис. 5а, вставками), что указывает на наблюдаемые результаты расщепления из BoNT / A и не неспецифическую протеазы переносятся из пищи в анализ. Как и фиг.3, отображает данные низкой изменчивости и следует ожидать тенденция снизилась репортер расщепление со снижением концентрации токсина.

BoNT / A LOD, ПКО, и EC 50 для обоих продуктов в каждой временной точке, показанной суммированы в таблице 5. LOD и ПКО определяются как самой низкой концентрации образца с соотношением выбросов ниже, чем три и десять СД ниже фоновых (образцов, не содержащих BoNT / A) соответственно. Эти ограничения ограничивается точек данных тестируемых, хотя интерполяция в сигмоидальной кривой доза-ответ может быть использована для вычисления теоретических нижние пределы. Некоторые матрица-к-изменчивость матрица в LOD и LOQ, как ожидается, как матричные эффекты могут влиять на связывание токсина с гранулами и восстановления шариков во время стирки. Хотя казалось бы, что там было больше токсина восстановление после 2% молока, чем помидоры по данным на рисунке 5А, большая часть этой разницы является результатом дополнительного разбавления, необходимого для гомогенизации образцов томата в ГПБ.

Помимо того, что твердая матрица питание, помидоры Примечательно тип образца, где рН и ионной силы наладка, достигается путем добавления 10-кратным нейтрализации буфера, имеет решающее значение для успеха анализа. 5В иллюстрирует ответы опробования при тестировании помидоры с или без включения 10x Нейтрализация буфера. Несоблюдение добавить 10x нейтрализации результатов буфера в плохом восстановления BoNT / A от образцов и демонстрируется постоянном соотношении выбросов во всех протестированных концентрациях BoNT / A. Добавление 10х буфера нейтрализации, хотя, гesults в чувствительного обнаружения токсина.

Неспецифические протеазы, содержащиеся в комплексных матриц может привести к ложным срабатываниям, если не рассматриваются, так как, кроме BoNT протеазы могут расщеплять / E репортер. Неспецифические протеазы могут быть эндогенными к образцу пищи или введены при использовании неочищенные препараты, такие как BoNT Clostridium культуральных супернатантов. Тщательное шарик стиральная будет удалить наиболее неспецифические протеазы, однако, добавление ингибиторов протеаз в реакционном буфере имеет решающее значение Рисунок 6 демонстрирует неспецифическую активность протеаз, найденный в Clostridium BoNT / A культуральных супернатантов с использованием модифицированного A / E репортер, BoTest KO (KO-репортера. ). KO репортер таким же, как A / E репортера с тем исключением, что BoNT / A сайт расщепления был изменен так, что он больше не расщепляется BoNT / A. Таким образом, любое наблюдаемое репортер декольте результатом неспецифической активности протеаз. Высокие уровни KO репортера НКУAvage указывает культуральный супернатант содержит высокий уровень активности протеазы, но активность эффективно сведены на нет добавлением ингибиторов протеазы.

Данные примеры показывают полезность протокола для высокой пропускной ботулинического токсина обнаружения / A в простых буферов и пищевых матриц. Некоторые пищевые продукты могут потребовать небольших корректировок опробования, но описаны протокол должен дать хорошие результаты с большинством видов продовольствия.

Рисунок 1
Рисунок 1. Рекомендуемая схема пластины. Образцы ограничены внутренними 60 лунках планшета, чтобы избежать возможных последствий края. Неизвестные или стандартные образцы кривой могут быть добавлены по желанию. Все неиспользуемые скважины должны быть заполнены 100 мкл воды во время репортера инкубации. Cliобы здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2
Рисунок 2. Схематическое обзор описанного протокола. Каждый крупный шаг в протоколе указывается меченым коробки и выровнены в следующем, по оценкам аналитической шкале (не в масштабе). Образцы Непродовольственные не требуют обработки пробы и так войти в протокол вниз по течению проб пищевых продуктов. Пунктирная рамка вокруг поколения серийных разведений для неизвестных указывает, что это необязательно, но рекомендуется, шаг. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3
Рисунок 3. Обнаружение BoNT / A голотоксина в PBS с использованием описанного протокола.Очищенная BoNT / голотоксин был шипами в PBS и испытаны с использованием описанного протокола с верхней концентрации BoNT / A 1 нМ. Все образцы были испытаны в трех экземплярах и планки погрешностей представляют стандартное отклонение от среднего значения. Сообщается потенции основана на мыши биопроб заводских испытаний токсина. Отношение излучение (отношение излучения на 526 нм до 470 нм при возбуждении при 434 нм) из стандартной кривой была измерена следующее 2, 4 и 24 ч инкубации с / E репортера и нанесены в зависимости от BoNT / A концентрации . Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 4
Рисунок 4. Количественная оценка BOTOX наркотиков продукта с использованием описанного протокола. Один 100 ед флакон лиофилизированного BOTOX лекарственного продукта был resuspe nded в 220 мкл 0,9% физиологического раствора, серийно разводили и испытаны как неизвестные по стандартной кривой, полученной в PBS с использованием очищенного BoNT / голотоксина. Образцы были испытаны в соответствии с описанным протоколом исключением того, что 50 мкл образцы были испытаны без 10х буфера для связывания в двух экземплярах. Стандартную кривую рассчитывается путем установки коэффициента излучения стандартных образцов кривой с переменным наклоном сигмоидальной уравнения доза-ответ и на графике как функцию от BoNT / A концентрации. Каждый неизвестный образец показано где она пересекает со стандартной кривой после 24 ч инкубации с / E репортера. Концентрации неизвестных образцов, входящих в линейном диапазоне (пунктирная затененных коробки) интерполировались по стандартной кривой. Этикетка для каждого BOTOX неизвестное количество единиц в образце присутствует на основе меченых потенции. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение от среднего значения.т = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 5
Рисунок 5. Восстановление BoNT / A-шипами 2% молока и тестирования свежих помидоров, используя описанный протокол. Образцы 2% молока и свежих помидоров вносили очищенный комплекс BoNT / A и испытаны с использованием описанного протокола. Все образцы были испытаны в трех экземплярах и Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение от среднего значения. (A) Отношение излучение 2% молока и свежих томатов Стандартные кривые были измерены следующие 2, 4 и 24 ч инкубации с / E репортера и нанесены в зависимости от BoNT / A потенции. (B) Неспособность включать буфер 10x нейтрализации в течение результаты тестирования в томатный недостаточности анализа. Образцы свежих помидоров были испытаны в соответствии с описанным протоколом с или без добавления 10x нейтральногозации буфера. Отображаются данные о временной точки 4 час. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 6
Рисунок 6. Ингибиторы протеазы необходимы при тестировании сложных матриц. Clostridium BoNT / A (штамм Hall) культуральный супернатант разводили серийно в PBS и испытаны с использованием описанного протокола с или без ингибиторов протеазы добавляется в реакционном буфере и как с / E и KO репортеры. Отношение излучение измеряли следующие 24 ч инкубации как с A / E KO или репортеров и нанесены в зависимости от BoNT / A потенции. Значительный разрыв репортера KO был замечен без добавления ингибиторов протеазы, но был сведен на нет их включения. Все образцы были испытаны в трех экземплярах и ошибок ЪARS представляют стандартное отклонение от среднего значения. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Буфер Состав Температура хранения Стабильность Примечания
10x Матрица Binding Buffer 500 мМ HEPES-NaOH, рН 7,1, 250 мМ NaCl, 1% Твин-20, 5% казеина, 0,05% NaN 3 -20 Или -80 ° С Стабильный в течение как минимум пяти дней при 4 ° С при оттаивании Поставляется с комплектом BoTest Матрица ботулинического обнаружения
10x Матрица промывочного буфера 119 мм фосфаты, рН 7,4, 1370 мМ NaCl, 27 мМ КСl, 1% Твин-20 -20 Или -80 ° С Стабильный в течение как минимум пяти дней при 4 ° С при оттаивании Поставляется с комплектом BoTest Матрица ботулинического обнаружения
10x Нейтрализация буфера 1 М HEPES-NaOH, рН 8,0, 1 М NaCl 4 ° C Стабильный на срок до шести месяцев при 4 ° С
10x BoTest реакционного буфера 500 мМ HEPES-NaOH, рН 7,1, 50 мМ NaCl, 1% Твин-20, 100 мкМ ZnCl 2 -20 Или -80 ° С Стабильный в течение как минимум пяти дней при 4 ° С при оттаивании Поставляется с комплектом BoTest Матрица ботулинического обнаружения
BoTest / E Репортер 20 мкМ в 50 мМ HEPES-NaOH, 10 мМ NaCl, 15% глицерина -80 ° C Храните малыми порциями. Стабильный в течение как минимум пяти дней при 4 ° С при оттаивании. Поставляется с комплектом BoTest Матрица ботулинического обнаружения
Желатин фосфатный буфер (ГПБ) 33,3 мм NaH 2 PO 4, рН 6,2, 2 г / л желатина 4 ° C Стабильный на срок до 1 месяца при 4 ° С
200x дитиотреитол (DTT) 1 М DTT -20 ° C Стабильный до 6 месяцев при температуре -20 ° C Марка и хранения небольших (100 мкл) аликвоты
1x PBS-T 11,9 мМ фосфаты, рН 7,4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 0,1% Tween-20 4 ° C Стабильный на срок до 1 месяца при 4 ° С Могут быть сделаны с помощью 10x PBS от Фишер (BP399-1)
Матричные бусы (IP-бусы) Магнитные гранулы ковалентно конъюгирован с куриным анти-BoNT / A антитела в PBS. 0,1% Tween-20, 0,05% азид натрия, 0,25% казеина и 50% глицерина -20 ° C Стабильный в течение как минимум пяти дней при 4 ° С при удалении от -20 ° С. НЕ замерзает при -80 ° С

Таблица 1. Буферы, необходимые для описанного протокола. 10x НейтрализацияБуфер только для очень сложных (например, пищевых) образцов и может не потребоваться в зависимости от природы образцов, подвергаемые исследованию.

Название материала / Оборудование Компания Номер по каталогу Комментарии / Описание
BoTest Матрица ботулинического нейротоксина Обнаружение Комплект BioSentinel A1015 Комплекты обнаружения для BoNT / B и F, также доступны.
Varioskan вспышки флуоресценции Микропланшетный считыватель Термо-Fisher Scientific 5250040 Большинство монохроматор-или фильтр на основе блоков с 434 нм возбуждения и 470 нм и возможности эмиссии 526 нм могут быть использованы.
96-а магнитный шарик разделительной пластины В & P Научно VP771H Другие магнитные пластины могут быть использованы, но пластина должна быть разработана, чтобы отделить бEADS в сторону колодца.
Магнитный шарик-Совместимость плиты шайба BioTek ELx405 VSRM Дополнительно, требуется только для автоматизированной пластины стирки. Другие магнитные шарик-совместимый пластина шайбы могут быть также использованы, но должны быть проверены перед использованием.
Микроцентрифуга Различный N / A Дополнительно, требуется только для образцов, нуждающихся центрифугирования.
MixMate пластина смеситель Эппендорф 22674200
Орбитальный шейкер Различный N / A Используется при комнатной температуре или при 25 ° С Если контроль температуры доступен
ЭДТА без ингибитора протеазы таблетки Рош 4693132001 Требуется только для пищи или окружающей среде испытывать. Ингибиторы протеазы должны быть ЭДТА-бесплатно.
BoNT / Metabiologics N / A Дополнительно, требуется только для стандартизации и количественного целей
Черный, Плоскодонные 96-луночные NUNC 237105 Плиты не должны рассматриваться
96-луночный планшет уплотнительная лента Thermo Scientific 15036

Таблица 2. Материалы и оборудование, необходимое для описанного протокола. Некоторые материалы и оборудование не являются обязательными или могут быть заменены в зависимости от имеющегося оборудования. Дополнительное тестирование пригодности и оптимизация может потребоваться при использовании альтернативного оборудования.

</ TR>
Образец Имя Объем Токсин Объем разбавителя [BoNT / A] (MLD 50 / мл) или (MLD 50 / г пищи) войти [BoNT / A] (MLD 50 / мл) или (MLD 50 / г пищи) D1 1200 мкл со N / A 30000 4.48
D2 300 мкл D1 600 мкл 10000 4
D3 90 мкл D1 810 мкл 3000 3.48
D4 90 мкл D2 810 мкл 1000 3
D5 90 мкл D3 810 мкл 300 2.48
D6 90 мкл D4 810 мкл 100 2
D7 90 мкл D5 810 мкл 30 1.48
D8 90 мкл D6 810 мкл 10 1
D9 N / A 1400 мкл N / A N / A

Таблица 3:. Разведение стол для стандартных образцов кривой Эта таблица генерирует стандартную кривую в разведении полулогарифмических над 3,5 порядков. Достаточно Нет BoNT пустой образца (D9) генерируется для запуска N = 6. Дополнительные разведения могут быть добавлены, если это необходимо.

<TD> 0
Название программы Переменная Значение Комментарии
Простое число Флакон с реагентом
Премьер Объем 400
Премьер Расход 7
Замочите После Prime? N
Матрица Вымойте Флакон с реагентом Число промывок может быть увеличена, если наблюдается остаточная активность протеазы.
Метод
4
Замочите / Shake Y
Замочите Продолжительность 180
Встряхнуть перед Замочите? N
Премьер После Замочите? N
Disp
Внесите Volume 300
Внесите РАСХОД 5
Внесите Рост 130
Гор. Внесите Поз. 0
Отключение Аспирируйте? Y
Нижняя Вымойте Впервые? N
Премьер Перед запуском? N
Aspir
Стремление Высота 40
Гор. Аспирируйте Поз. 0
Стремление Оценить 5
Стремление задержки
Поперек Аспирируйте? N
Финал Стремление? Y
Финал Стремление задержки 0
Матрица Замочите Замочите Продолжительность 300 Увеличение замочить продолжительность может увеличить восстановление шарик из более вязких продуктов.
Встряхнуть перед Замочите? N
Мастер Вымойте Матрица Замочите Это программа 'Ссылка' для запуска Матрица Замочите и программы Матрица Вымойте вместе.
Матрица Вымойте

Таблица 4. Магнитный автоматизированные настройки программы шарик-совместимая пластина шайбы. Следующие программы полагать, что устройство для промывания планшетов оснащен магнитом, который тянет шарики в сторону лунки и что буфер переключения модуль настроен таким образом, что 1x промывочного буфера ( РBS-т) крепится к клапана А. Эти программы являются специфическими для BioTek ELx405. Обратитесь к руководству инструментом для получения инструкций по программированию. Другое магнитного шарик-совместимая автоматическое пластинчатые шайбы или вакуумные магистрали могут быть использованы, однако, тестирование будет необходимо для определения параметров, которые максимизируют эффективность стирки и свести к минимуму потери шарик во время стирки. Первоначальное тестирование восстановления шарик После промывания рекомендуется независимо от конкретного используемого пластины шайбой.

<TD> LOD
Питание Матрица Метрика 2 часа 4 ч 24 часа в сутки
MLD 50 / г пищи MLD 50 / а MLD 50 / г пищи MLD 50 / а MLD 50 / г пищи MLD 50 / а
Молоко 300 58 100 19 30 6
LOQ 1000 193 300 58 100 19
ЕС 50 2404 464 590 114 92 18
Свежие помидоры LOD 1000 91 300 27 30 3
LOQ 1000 91 1000 91 100 9
ЕС 50 7561 687 1932 176 229 21

Таблица 5. Пределы обнаружения (LOD), пределы количественного (ПКО), а половина-мaximal эффективная концентрация (ЕС50) для 2% молока и свежих помидоров тестирования, показанной на рисунке 2А. EC 50 является производным от сигмоидальной кривой посадки доза-реакция в то время как ППС и ПКО определяются как самая низкая точка данных концентрация, которая падает либо 3 или 10 стандартных отклонения ниже без средств управления ботулинического токсина (N = 6), соответственно. Данные представлены как в MLD 50 / г пищи и общего MLD 50 с протестированных на лунку в объеме 200 мкл образца.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает процедуры для количественного BoNT / A сложный, голотоксина или Clostridium супернатанта культуры в комплексных матриц. Протокол то же самое, однако, при тестировании других серотипов ботулинического токсина (например BoNT / B, E, и F) с соответствующими Matrix анализов 56,60, хотя анализ чувствительности будет варьироваться в зависимости от серотипов и анализов. Этот протокол не учитывает для каждого типа образца возможно и некоторые модификации могут потребоваться в зависимости от конкретного состава образца и желаемого применения. Матрицы могут включать образцы блюда (например, продуктов питания вызов тестирование) или фармацевтическим наполнителем буферы (тестирования например BoNT продукт на основе наркотиков). Комплекс непищевые (например ткани животных или окружающей среды) жидкие и твердые образцы следует рассматривать в качестве образцов пищевых продуктов. Этот протокол использует 200 мкл / лунку образцов объемом, но так мало, как 50 мкл / лунку может быть проверена с соответствующей корректировкой объема 10x Bindinг буфера. Образцы меньше, чем 50 мкл следует разбавить ГПБ или PBS до ≥ 50 мкл до тестирования.

Сильно варьирует характер продуктов питания представляет собой особую проблему для обнаружения ботулинического токсина и количественного в пище. Пример рН, вязкость, ионную силу и присутствие твердых частиц может все потенциально влиять на активность токсина в пищевой матрицы и требуют, что токсин быть изолированы от пищи для точного количественного определения, в пробирке. Многие пищевые продукты или токсина препараты также содержат эндогенные протеазы которые должны быть удалены или инактивированные при использовании на основе белков журналистам для того, чтобы только ботулинического токсина типа конкретных протеазы активность измеряют. Даже простые, четко определенные буферные материалов, таких, как фармацевтические буферов наполнителя, может содержать соединения, которые препятствуют ботулинического токсина деятельности, которые должны быть удалены до количественного 35,56-59,61. Иммунопреципитация предлагает быстрый и очень серотип-специфических Бонт пуриМетод фикация но требует высокоаффинных антител изолировать низкие концентрации токсина, найденные в "реальном мире" пищи, экологических и фармацевтических образцов.

Описанный протокол очищает токсин использованием парамагнитных гранулах, покрытых анти-BoNT / A антителами, направленными к токсина домена тяжелой цепи рецептора в BoNT / A основной голотоксина 56. Clostridium видов, однако, естественно производят токсин комплексов, состоящих из сердцевины голотоксина в сочетании с НПД 62-64. НПД защитить токсин из протеазы атаки в желудочно-кишечном тракте и, как полагают, чтобы облегчить токсина транспорт через кишечного эпителия 63,65. НПД ингибируют связывание IP-шарик анти-BoNT / A антител в основной голотоксин (данные не показаны). Это торможение освобождается за счет увеличения величину рН выше ~ 6,25, в результате чего BoNT / A сложный для диссоциации в голотоксин и НПД и позволяющей эффективно токсинпривязки к IP-бусы 66. По этой причине, регулируя величину рН выше 6,5 имеет решающее значение для успеха анализа (рис. 5б). Связывающем буфере 10x используется в протоколе содержит буферный агент, чтобы помочь повысить рН в стандартных условиях анализа. Тем не менее, многие кислые продукты могут сокрушить буферную емкость буфера для связывания. Дополнительный 10x Нейтрализация буфера значительно увеличивает пропускную способность образца буферизации и должны нейтрализовать большинство пищевых матриц.

Другим важным параметром для анализа образец является ионная сила. Разъяснение образцов центрифугированием требуется для эффективного мытья борта и восстановления следующей иммунопреципитацией. Тестирование со свежими помидорами, показало, что не BoNT / восстановление не было видно, когда образцы были просто обрабатываются и центрифугировали. Мы предположили, что BoNT / A можно связать с плотью томатным заставляя его осаждения во время центрифугирования и стать отсутствуетиспытания супернатант. Мы обнаружили, что более значительного увеличения ионной силы или, нейтрализации рН ограниченные взаимодействия между BoNT и матрицы, в результате улучшения восстановления токсина (фиг. 5B). Хотя это и не требуется для восстановления BoNT, ожидается, хотя и не продемонстрировал, что более высокие концентрации солей будут также увеличивать строгость иммунопреципитации и привести к менее неспецифической восстановления белка, особенно в низких продуктов соли.

Пример рН и ионной силы регулировка в протоколе выполняется путем добавления 10х буфера нейтрализации и должны быть совместимы с широким спектром продуктов. В то время как 10-кратный Нейтрализация буфер имеет высокую буферную емкость, некоторые весьма кислые продукты могут потребовать дополнительной настройки рН. Тестирование образца рН следующие буферной того рекомендуется, если наблюдается плохая работа анализ и объем образца позволяет. Дополнительная регулировка рН может быть достигнуто путем добавления хобъемы Молл 1М HEPES рН 8, если требуется. Дополнительный NaCl введен 10x нейтрализации буфера должен быть приемлемым для всех, кроме самых соленых продуктов, однако 10x Нейтрализация буфер может быть заменен на 1 М HEPES рН 8, если плохие результаты видны с заданной пищевых продуктов. Никаких существенных различий не наблюдалось при тестировании описанного протокола при концентрациях NaCl до 1,2 М в PBS.

Хотя этот протокол применяется к большинству образцов, продукты в крайности рН, ионной силы, и / или содержания протеазы не может дать хорошие результаты с анализом. Некоторые продукты могут также оставаться слишком вязким после добавления ГПБ, что приводит к плохой восстановления борта. Предварительное разведение образцов с простым буфером, таким как PBS может улучшить результаты. Увеличение количества промываний или мыть жесткости (по возрастающей концентрации NaCl) и увеличение концентрации ЭДТА, свободной от ингибиторов протеазы может также улучшить результаты, если неспецифический протеазы contaminatионный наблюдается. Чистота приборов также очень важно при использовании автоматической промывки пластины. Загрязнение водопроводных и форсунок с протеаз (например, трипсина) из других лабораторных анализов может привести к непреднамеренной интродукции протеаз во время анализа. Тщательная очистка пластины шайбой соответствии с руководством пользователя изготовителя в рекомендуется перед запуском теста.

Матрица анализы BoTest первые коммерциализированные, деятельность на основе анализы для обнаружения ботулинического токсина и количественного в комплексных матриц. По сравнению со стандартным биопроб мыши, анализ быстро, дешевле и позволяет с высокой пропускной тестирование без необходимости специализированных учреждениях или этических проблем, касающихся использования животных 56. Другие пробирке ботулинического токсина методы обнаружения в были описаны, но не были показаны, чтобы быть совместимым со сложными образцами матриц, требуют специального оборудования, или не коммерчески состле 35,42-44,46-55. Анализы также Активность на основе анализов, которые измеряют токсина эндопротеазу активностью, тогда как методы традиционной иммуноферментный анализ (ELISA) только сообщают токсина массы. Активность на основе ELISA анализы описано ранее, но эти тесты не были продемонстрированы на работу с пищевыми матриц и не охватывают очищение токсина от матрицы образца 41. Значительное недооценка токсичности сложных образцов может возникнуть, если токсин не очищают от образца с матричные соединения часто вмешивается в деятельность ботулинического токсина 35,56-59.

После того как протокол освоен, модификации могут быть сделаны, чтобы увеличить объемы проб и повысить чувствительность образца. Например, связывание токсина с гранулами можно проводить в более крупных, массивных образцов (например, 10 мл или более) до сбора центрифугированием. Эти гранулы затем могут быть добавлены в 96-луночный планшет с и анализировали следующие описанияд протокол. Увеличение чувствительности более чем одного журнала были обнаружены с повышенным размером выборки 56. Таким образом, описанный протокол может быть использован с большими образцами объема обнаружить даже следовых количеств BoNT, содержащихся в образцах, которые могут остаться незамеченными при биоанализа мыши.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

FM Даннинг, ТМ Пьяцца, Ф. Zeytin, и туалет Такер являются сотрудниками или владельцы BioSentinel Инк BioSentinel в настоящее время производит и освоен некоторые из реагентов, представленных в данном отчете.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить H. Olivares и Д. Руге за ценные обсуждения и консультации. Это исследование было поддержано частично за счет премии NSF SBIR (МИП-1127245 в BioSentinel Инк) и Министерства обороны контракта (W81XWH-07-2-0045 в BioSentinel Inc.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A Metabiologics Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Fisher Scientific 15036

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
  2. Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
  3. Montal, M. Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu. Rev. Biochem. 79, 591-617 (2010).
  4. Lacy, D. B., Stevens, R. C. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins. J. Mol. Biol. 291, 1091-1104 (1999).
  5. Montecucco, C., Schiavo, G. Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins. Q. Rev. Biophys. 28, 423-472 (1995).
  6. Ahnert-Hilger, G., Munster-Wandowski, A., Holtje, M. Synaptic vesicle proteins: targets and routes for botulinum neurotoxins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 159-177 (2013).
  7. Yamasaki, S., et al. Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinal neurotoxins and tetanus toxin. J. Biol. Chem. 269, 12764-12772 (1994).
  8. Schiavo, G., et al. Identification of the nerve terminal targets of botulinum neurotoxin serotypes A, D, and E. J. Biol. Chem. 268, 23784-23787 (1993).
  9. Schiavo, G., et al. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature. 359, 832-835 (1992).
  10. Schiavo, G., et al. Botulinum G neurotoxin cleaves VAMP/synaptobrevin at a single Ala-Ala peptide bond. J. Biol. Chem. 269, 20213-20216 (1994).
  11. Rossetto, O., et al. SNARE motif and neurotoxins. Nature. 372, 415-416 (1994).
  12. Montecucco, C., Schiavo, G. Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Mol. Microbiol. 13, 1-8 (1994).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  14. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin C1 blocks neurotransmitter release by means of cleaving HPC-1/syntaxin. EMBO J. 12, 4821-4828 (1993).
  15. Cherington, M. Clinical spectrum of botulism. Muscle Nerve. 21, 701-710 (1998).
  16. Lindstrom, M., Korkeala, H. Laboratory diagnostics of botulism. Clin. Microbiol. Rev. 19, 298-314 (2006).
  17. Werner, S. B., Passaro, D., McGee, J., Schechter, R., Vugia, D. J. Wound botulism in California, 1951-1998: recent epidemic in heroin injectors. Clin. Infect. Dis. 31, 1018-1024 (2000).
  18. Passaro, D. J., Werner, S. B., McGee, J., MacKenzie, W. R., Vugia, D. J. Wound botulism associated with black tar heroin among injecting drug users. J. Am. Med. Assoc. 279, 859-863 (1998).
  19. Brook, I. Infant botulism. J. Perinatol. 27, 175-180 (2007).
  20. Arnon, S. S. Honey, infant botulism and the sudden infant death syndrome. West J. Med. 132, 58-59 (1980).
  21. Arnon, S. S. Infant botulism. Annu. Rev. Med. 31, 541-560 (1980).
  22. Peck, M. W., Stringer, S. C., Carter, A. T. Clostridium botulinum in the post-genomic era. Food Microbiol. 28, 183-191 (2011).
  23. Sharma, S. K., Whiting, R. C. Methods for detection of Clostridium botulinum toxin in foods. J. Food Prot. 68, 1256-1263 (2005).
  24. Sobel, J. Botulism. Clin. Infect. Dis. 41, 1167-1173 (2005).
  25. Chen, S. Clinical uses of botulinum neurotoxins: current indications, limitations and future developments. Toxins. 4, 913-939 (2012).
  26. Sinha, D., Karri, K., Arunkalaivanan, A. S. Applications of Botulinum toxin in urogynaecology. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 133, 4-11 (2007).
  27. Dmochowski, R., Sand, P. K. Botulinum toxin A in the overactive bladder: current status and future directions. BJU Int. 99, 247-262 (2007).
  28. Benecke, R., Dressler, D. Botulinum toxin treatment of axial and cervical dystonia. Disabil. Rehabil. 29, 1769-1777 (2007).
  29. Hunt, T., Clarke, K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin. Neuropharmacol. 32, 28-31 (2009).
  30. Marchetti, A., et al. Retrospective evaluation of the dose of Dysport and BOTOX in the management of cervical dystonia and blepharospasm the REAL DOSE study. Mov. Disord. 20, 937-944 (2005).
  31. Wohlfarth, K., Sycha, T., Ranoux, D., Naver, H., Caird, D. Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment. 25, 1573-1584 (2009).
  32. AOAC International, Clostridium botulinum and its toxins in foods (method 977.26 section 17.7.01). , (2001).
  33. Schantz, E. J., Kautter, D. A. Microbiological methods: standardized assay for Clostridium botulinum toxins. J. AOAC. 61, 96-99 (1978).
  34. Ferreira, J. L. Comparison of amplified ELISA and mouse bioassay procedures for determination of botulinal toxins A, B, E, and F. J. AOAC. Int. 84, 85-88 (2001).
  35. Directive 2003/15/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Union. , (2003).
  36. Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM Scientific Workshop on Alternative Methods to Refine, Reduce or Replace the Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing. Report No. 08-6416, NIH. , (2008).
  37. Bitz, S. The botulinum neurotoxin LD50 test - problems and solutions. ALTEX. 27, 114-116 (2010).
  38. Balls, M. Replacing the animal testing of botulinum toxin: time to smooth out the wrinkles. Altern. Lab. Anim. 38, 1-2 (2010).
  39. Balls, M. Botulinum toxin testing in animals: the questions remain unanswered. Altern. Lab. Anim. 31, 611-615 (2003).
  40. Singh, A. K., Stanker, L. H., Sharma, S. K. Botulinum neurotoxin: where are we with detection technologies. Crit. Rev. Microbiol. 39, 43-56 (2013).
  41. Liu, Y. Y., Rigsby, P., Sesardic, D., Marks, J. D., Jones, R. G. A functional dual-coated (FDC) microtiter plate method to replace the botulinum toxin LD50 test. Anal. Biochem. 425, 28-35 (2012).
  42. Ouimet, T., Duquesnoy, S., Poras, H., Fournie-Zaluski, M. C., Roques, B. P. Comparison of Fluorigenic Peptide Substrates PL50, SNAPtide, and BoTest A/E for BoNT/A Detection and Quantification: Exosite Binding Confers High-Assay Sensitivity. J. Biomol. Screen. , (2013).
  43. Scotcher, M. C., Cheng, L. W., Stanker, L. H. Detection of botulinum neurotoxin serotype B at sub mouse LD(50) levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk. PLoS One. 5, (2010).
  44. Mason, J. T., Xu, L., Sheng, Z. M., O'Leary, T. J. A liposome-PCR assay for the ultrasensitive detection of biological toxins. Nat. Biotechnol. 24, 555-557 (2006).
  45. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Anal. Biochem. 411, 200-209 (2011).
  46. Hines, H. B., et al. Use of a recombinant fluorescent substrate with cleavage sites for all botulinum neurotoxins in high-throughput screening of natural product extracts for inhibitors of serotypes A, B, and E. Appl. Environ. Microbiol. 74, 653-659 (2008).
  47. Gilmore, M. A., et al. Depolarization after resonance energy transfer (DARET): a sensitive fluorescence-based assay for botulinum neurotoxin protease activity. Anal. Biochem. 413, 36-42 (2011).
  48. Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
  49. Bagramyan, K., Barash, J. R., Arnon, S. S., Kalkum, M. Attomolar detection of botulinum toxin type A in complex biological matrices. PLoS One. 3, (2008).
  50. Wang, D., Baudys, J., Kalb, S. R., Barr, J. R. Improved detection of botulinum neurotoxin type A in stool by mass spectrometry. Anal. Biochem. 412, 67-73 (2011).
  51. Parks, B. A., et al. Quantification of botulinum neurotoxin serotypes A and B from serum using mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 9047-9053 (2011).
  52. Kalb, S. R., Goodnough, M. C., Malizio, C. J., Pirkle, J. L., Barr, J. R. Detection of botulinum neurotoxin A in a spiked milk sample with subtype identification through toxin proteomics. Anal. Chem. 77, 6140-6146 (2005).
  53. Kalb, S. R., et al. The use of Endopep-MS for the detection of botulinum toxins A, B, E, and F in serum and stool samples. Anal. Biochem. 351, 84-92 (2006).
  54. Boyer, A. E., et al. From the mouse to the mass spectrometer: detection and differentiation of the endoproteinase activities of botulinum neurotoxins A-G by mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 3916-3924 (2005).
  55. Barr, J. R., et al. Botulinum neurotoxin detection and differentiation by mass spectrometry. Emerg. Infect. Dis. 11, 1578-1583 (2005).
  56. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7687-7697 (2012).
  57. Jones, R. G., Ochiai, M., Liu, Y., Ekong, T., Sesardic, D. Development of improved SNAP25 endopeptidase immuno-assays for botulinum type A and E toxins. J. Immunol. Methods. 329, 92-101 (2008).
  58. Ekong, T. A., Feavers, I. M., Sesardic, D. Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology. 143 (pt 10), 3337-3347 (1997).
  59. Shone, C. C., Roberts, A. K. Peptide substrate specificity and properties of the zinc-endopeptidase activity of botulinum type B neurotoxin. Eur. J. Biochem. 225, 263-270 (1994).
  60. Piazza, T. M., et al. In vitro detection and quantification of botulinum neurotoxin type e activity in avian blood. Appl. Environ. Microbiol. 77, 7815-7822 (2011).
  61. Mizanur, R. M., Gorbet, J., Swaminathan, S., Ahmed, S. A. Inhibition of catalytic activities of botulinum neurotoxin light chains of serotypes A, B and E by acetate, sulfate and calcium. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 3, 313-321 (2012).
  62. Sugii, S., Sakaguchi, G. Molecular construction of Clostridium botulinum type A toxins. Infect. Immun. 12, 1262-1270 (1975).
  63. Sharma, S. K., Ramzan, M. A., Singh, B. R. Separation of the components of type A botulinum neurotoxin complex by electrophoresis. Toxicon. 41, 321-331 (2003).
  64. Bryant, A. M., Davis, J., Cai, S., Singh, B. R. Molecular composition and extinction coefficient of native botulinum neurotoxin complex produced by Clostridium botulinum hall A strain. Protein. J. 32, 106-117 (2013).
  65. Kukreja, R. V., Singh, B. R. Comparative role of neurotoxin-associated proteins in the structural stability and endopeptidase activity of botulinum neurotoxin complex types A and E. 46, 14316-14324 (2007).
  66. Eisele, K. H., Fink, K., Vey, M., Taylor, H. V. Studies on the dissociation of botulinum neurotoxin type A complexes. Toxicon. 57, 555-565 (2011).

Tags

Neuroscience выпуск 85 ботулинический тестирование питания обнаружение количественное комплексные матрицы BoTest Матрица Clostridium потенция тестирование
Выделение и количественная оценка ботулинического нейротоксина Из комплексных матриц с использованием BoTest Matrix Анализы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunning, F. M., Piazza, T. M.,… More

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter