Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

BoTest Matrix Tahliller kullanma Kompleksi Matris itibaren İzolasyon ve Botulinum nörotoksin Kantitasyonu

doi: 10.3791/51170 Published: March 3, 2014

Summary

BoTest Matrix botulinum nörotoksin (BoNT) algılama deneyleri hızla arındırmak ve numune matrisleri bir dizi BoNT'yi ölçmek. Burada, katı ve sıvı matrislerden BoNT tayini ve ölçümü için bir protokol mevcut ve BOTOX, domates ve süt ile deneyi göstermektedir.

Abstract

Doğru tespiti ve karmaşık matrisler botulinum nörotoksininden (BoNT) ölçümü ilaç, çevresel ve gıda örnek test için gereklidir. Doğru gücü test BoNT-bazlı ilaç ürün üretim ve hasta güvenliği için gerekli ise, gıda maddelerinin hızlı BoNT'den testi salgını adli tıp, hasta tanı ve gıda güvenliği test sırasında gereklidir. BoNT testi için yaygın olarak kullanılan fare biyodeney son derece hassas ama hızlı ve rutin BoNT'den test için gerekli hassasiyet ve üretim yoksun. Ayrıca, hayvanların bioassay kullanımı BoNT'den test için fare biyodeney yerine ABD ve yurtdışında uyuşturucu ürün düzenleyici otoriteler ve hayvan hakları savunucuları tarafından aramalar sonuçlandı. Birçok in vitro tahliller yerine basit tamponlar içinde saflaştırılmış BoNT ile iyi çalışır geliştirilmiştir, ama en çok karmaşık matrisler test edilmesi için geçerli olduğu gösterilmiştir edilmemiştir. Burada, tespit edilmesi için bir protokolBoTest Matrix tahliller kullanılarak kompleks matrislerde BoNT sunulmuştur. Deney üç bölümden oluşur: ilk bölümü test için numune hazırlanmasını gerektirir, ikinci bölümü matris BoNT'yi arındırmak için bir anti-BoNT antikor kaplı paramanyetik boncuklar kullanarak bir immunopresipitasyon adımdır, ve üçüncü bölümü izole BoNT en proteolitik rakamlarla Bir florogenik raportör kullanılarak faaliyet. Protokol, sıvı ve katı hem matrisler kullanılarak 96 oyuklu plakalarda yüksek verimli testler için yazılı ve 4-26 saat arasında, toplam deney katı numune türü, toksin yükü ve arzu edilen duyarlılığına bağlı olarak manuel preparatın yaklaşık 2 saat gerektirir. Veriler, fosfat tamponlu tuzlu su, bir ilaç ürünü, kültür yüzer,% 2 süt, taze domates ile BoNT / A test için sunulan ve deney başarısı için kritik bir parametre içeren bir tartışma vardır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Botulinum nörotoksinler (BoNTs) 1-3 ng tahmin damar insan öldürücü dozları ile bilinen en ölümcül maddelerdir / 1,2 kg arasındadır. BoNT yedi serotip yapısal olarak benzer, her bir hücre, bir çinko endopeptidaz 3-5 kodlayan sitosol ve bir hafif zincir içine alımı ve translokasyon bağlanması için sorumlu bir ağır zincir alanı kapsayan, biri, G olarak etiketlenmiş. BoNT'nin nefis toksisite kısmen, sonuçları, nöromüsküler kavşağı 6 motor nöronların içine kendi özgül bağlanma ve giriş. Bir kez nöron içinde, hafif zincir endopeptidaz spesifik olarak ayrıştıran, çözünür N-etilmaleimit duyarlı faktör bağlanma protein reseptörü (SNARE) vesikül füzyonu için gerekli proteinler, bir veya daha fazla, nörotransmitter salımını inhibe ve gevşek felce 7-14 yol açar. Yaygın hastalığı "botulizm" BoNT'nin tarafından diyafram ve interkostal kasların felci olarak bilinen sonuçta sonuçlarıErken tanı ve tedavi sürece solunum yetmezliği ve ölüm alınır.

İnsan gıda kaynaklı botulizm en yaygın BoNT'den serotip A, B, E ile ilişkili ve genellikle F (BoNT / A, BoNT / B, vb) ve kontamine gıda 15,16 yenmesi sonucu oluşur, ancak yara botulizm birçok davada intravenöz uyuşturucu kullananlar 17,18 arasında rapor edilmiştir. Amerika Birleşik Devletleri'nde, bir yaşın altındaki çocuklar tarafından Clostridium sporlarının alımından kaynaklanan bebek botulizm botulizm 19-21 en sık görülen şeklidir. Ancak, yanlış ev konserve ve gıda işleme kaynaklanan gıda kaynaklı salgınların BoNT'den yurtdışında Amerika Birleşik Devletleri ve hem de bildirildi. 2000-2009 yılları arasında, gıda kaynaklı botulizm en az 338 olgu altı ölümlerin 22 olmak üzere dünya çapında bildirildi. Hızlı ve hassas gıda kaynaklı botulizm salgınları tespit yeteneği erken tanısına yardımcı olabilecek bir kritik göstergesidir 23,24. Ayrıca, maliyet-etkin ve rutin gıda test izin algılama yöntemleri geliştirilmiş gıda güvenliği sağlayacaktır.

BoNT nöronal özgüllük ve uzun biyolojik yarı ömrü, aynı zamanda güçlü bir tedavi sağlar. Amerika Birleşik Devletleri'nde, BoNT bazlı ilaçlar kozmetik koşulları ve kaş hatları, servikal distoni, migren baş ağrısı, aşırı aktif mesane, ve şaşılık içeren nöromüsküler ile ilgili hastalıkların tedavisi için Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanmıştır. Çok sayıda "off-label" uygulamalar şiddetli kas disfonksiyonu 25-28 için yüksek doz tedaviler de dahil olmak üzere, belgelenmiştir. Doz aşımı potansiyel zararlı yan etkileri hastaları risk altına sokar iken düşük dozun etkisiz tedaviye neden olabilir Doğru toksin ölçümü, doğru doz için önemlidir. Ne yazık ki, hiçbir standart gücü tahlil protokolü BoNT-bazlı ilaç süreden arasında birim tanımı eşitsizlikler sonucunda, üreticiler arasında paylaşılırcts 29-31.

BoNT için standart deney BoNT içeren örnekler farelere intraperitoneal olarak enjekte edilmiş ve ölüm sayıları 1-7 gün boyunca 16,32,33 kaydedildiği fare deneyidir. Fare biyodeney 5-10 pg BoNT / A 34 algılama sınırları (LOD) ile çok hassas olmakla birlikte, hayvan kullanımı üzerinde etik kaygılar, yüksek eğitim personelinin maliyeti ve hayvan tesisleri, uzun tahlil kez, ve eksikliği sürdürülmesi standartlaştırılmış protokoller standartlaştırılmış, hayvan ücretsiz BoNT'den test ve ölçüm yöntemlerinin 35-39 geliştirmek aramalar sonuçlandı. Son zamanlarda, çeşitli alternatif BoNT'den ölçümü yöntemleri fareyi veya yakınındaki-fare biyodeney hassasiyetini 40-49 sunuyoruz geliştirilmiştir. Bu yöntemler yaygın olarak floresan, kütle-spektrometresi, veya immünolojik yöntemleri kullanmak ve hayvan kullanmadan fare biyolojik deneyi daha kısa deney süresine sahiptir. Kütle spektrometrisi immünolojik techniq kombine yaklaşımlarUes algılamak ve BoNT'den gıda ve diğer karmaşık numunelerde bulunan ölçmek gösterilmiştir, ancak, personel eğitim gereksinimleri ve özel ekipman limiti bu deneyler 50-55. Diğer birçok alternatif deneyler, kompleks numune test kolayca uygulanabilir değildir ya da rutin BoNT test için gerekli olan hacmi yoksundur. BoNT aşırı gücü maç için duyarlılık ile in vitro deney yöntemleri geliştirmek çalışırken gıda örneği viskozite, pH, tuz içeriği ve matris bileşenlerinin son derece değişken doğası özellikle zor bir zorluktur. Ayrıca, bu tür BoNT bazlı ilaç ürünleri yeniden süspansiyon haline getirilmesinden kaynaklanan gibi daha basit ve nispeten iyi huylu tampon sistemleri, önemli in vitro BoNT gücü 56 etki tuzu, albumin ve şeker stabilizatörler (örneğin, katkı maddeleri) içerebilir. Toksin arıtma örnekler 56-59 en basit ama doğru aktivitesi test etmek için gereklidir.

BoTest Matrix deneyleri hızlı, yüksek verimlilik için tasarlanmış ve yaygın araştırma laboratuvarlarında 56,60 bulunan ekipman kullanılarak karmaşık örneklerinden BoNT'nin tutarlı ölçümü yapılmıştır. Bu deneyler kovalent olarak bağlamak ve bir numune dışarı BoNT'yi ayırmak ve daha sonra yıkanarak matris müdahale bileşikleri çıkarmak için serotip spesifik anti-BoNT antikorları ile bağlantılı para-manyetik boncuk kullanır. Yıkamanın ardından, bağlı BoNT proteolitik aktivitesi daha sonra BoNT serotip test edilen ile uyumlu bir raportör kullanılarak optimize edilmiş bir reaksiyon tampon maddesi içinde ölçülür. Bu muhabir bir N-terminal siyan flüoresan protein (CFP) yarımı oluşturan bir alt-tabaka BoNT, SNAP25 kalıntıları 141-206 veya sinaptobrevin kalıntıları 33-94 ile bağlantılı bir C-terminal sarı floresan protein türevi (Venus) yarımı kapsayan florojenik proteinlerdir BoTest A / E veya B / D / F / G gazetecilere, sırasıyla 45. BoNT ile Reporter yarılma Förster rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak izlenir. Ne zaman tO muhabir CFP uyarma OBP emisyonu ve heyecan verici Venüs emisyonu söndürme, Venüs FRET sonuçları, bozulmamış. BoNT ile muhabir yarılması CFP yayma ve Venus emisyonunda azalma bir artışa yol açan, FRET önler. BoNT aktivitesi daha sonra kantitatif olarak CFP ve Venüs emisyon oranı kullanılarak ölçülebilir. 3 pg altında LOD yüksek verimli bir 96-yuvalı plaka formatı kullanılarak 56 yiyecekler çok geniş bir yelpazede mümkündür. Tahlil, kürecik yüzeyinde toksin konsantrasyonu sağlar çünkü artan duyarlılık daha büyük örnek hacimleri kullanılarak elde edilebilir.

BoNTs A, B, E ve F için BoTest Matrix deneyleri geliştirilmiş ve gıda, ilaç ve çevresel numuneler 56,60 ile test edilmiştir. Burada, (örneğin ilaç, BoNT tamponu içinde) ve yüksek karmaşıklık (örneğin gıda, çevre) örnekleri düşük karmaşıklık BoNT saptanması için bu deneyleri yürütmek için işlemleri tarif eder. Belirli işleme yöntemleriBirkaç örnek türleri bu protokolde ele ve burada tarif değil örnek türleri genellikle sunulan yöntemleri bir arada kullanılarak adapte edilebilir için. Protokol geliştirilmiş ve test BoNT / A ile değil, başka bir yerde 56,60 gösterildiği gibi, ilgili deneyler kullanılarak diğer BoNT serotiplerine uyarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. Deneyi Reaktiflerin hazırlanması

  1. Çözülme 200x ditiyotreitol (DTT), 10x Matrix Bağlama tamponu (10x bağlanma tamponu Bundan sonra), 10x nötralizasyon tamponu (pH yiyecek veya dengesiz örnekleri için) ve 15 dakika boyunca BoTest 10x reaksiyon tamponu, oda sıcaklığında (10x reaksiyon tamponu Bundan sonra) (RT) kadar veya tamamen çözülmüş. Bu protokolde kullanılan tamponlar ve reaktiflerin bir listesi için Tablo 1'e bakınız. Bu protokol için gerekli malzeme ve ekipman listesi için Tablo 2'ye bakınız.
  2. Karıştırmak için 5 saniye için çözülmüş tamponlar vorteks. 10x Binding tampon bulutlu bir görünüme sahip olurken 10x Nötralizasyon tamponu, 200xDTT ve 10x reaksiyon tampon net görünmelidir. 37 ° C'de 5 dakika boyunca 10x reaksiyon tamponu ısıtın ve çözülme aşağıdaki parçalı görünürse vorteks tekrarlayın.
  3. 1x reaksiyon tampon maddesi 3.8 ml oluşturmak.
    1. 15 ml konik tüp "1x Reaksiyon tamponu" Etiket ve 3.42 ml moleküler biyoloji notu wat eklemeker, 380 ul 10x reaksiyon tamponu ve 19 ul DTT 200x. Inversiyon tampon iyice karıştırın.
    2. Temiz bir traş makinesi bıçak kullanılarak kesimlerde tek EDTA içermeyen proteaz inhibitörü tablet Kesme ve 1x reaksiyon tampon maddesi (geri kalan kısmı, tablet daha sonra kullanılmak üzere 4 ° C de muhafaza edilebilir) için, tabletin dörtte birini ekleyin. NB Proteaz inhibitörleri olmayabilir saflaştırılmış toksin ve basit tamponlar (örneğin ilaç numuneleri) kullanıyorsanız gerekli.
    3. Vortex proteaz tablet tamamen eriyene kadar 1x reaksiyon tampon maddesi.
  4. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca Matrix bir boncuk (bundan sonra IP-A boncuk) ısıtın.
  5. Işıktan korunmalıdır oda sıcaklığında BoTest A / E muhabiri (A / E muhabir bundan sonra) çözülme.
  6. 15 ml konik tüp "0.5 uM A / E muhabir" Etiket ve 1.8 ml 1x Reaksiyon tamponu 20 mcM A / E muhabir stokunun 45 ul ekleyin. Pipetle iyice karıştırın ve ışıktan korunan buz üzerinde saklayın.

2. Durmakard Eğri Numune Üretimi

Burada tarif edilen Standart eğri, yarı-log seyreltilerde (Tablo 3) 10-30,000 MLD 50 / g yiyecek ya ml tampon için bir alanı kapsamaktadır. Son kullanıcı geçerli olarak alternatif konsantrasyonlarını kullanmak serbesttir.

  1. Spiking ve referans malzemesi ile matris kuluçkalanması. Mümkünse matris etkilerini azaltmak için, bilinmeyen aynı matrisin bir seyreltici kullanılarak standart bir eğri oluşturur. Ek, BoNT-negatif matris (örneğin, alan veya BoNT salgın örnek testi) mevcut değilse, bir seyreltici madde olarak jelatin fosfat tamponu (GPB) ya da fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) kullanarak. Aşağıda uygun protokol takip tercih edilen bir matris içine BoNT / A spike, standart bir eğri oluşturur.
    1. Düşük karmaşıklık örnekler (örneğin PBS, GPB ya da farmasötik)
      1. Bir 15 ml konik tüp, uygun tampon 10 ml ilave edilir ve bir kenara. Bu örnek için standar seyreltici olarak kullanılacakd eğrisi ve bilinmeyen seyreltikleri (Bölüm 4).
      2. Bir mikro santrifüj tüpüne 1.2 ml tampon ekleyin.
      3. DİKKAT: Bu adım, BoNT'yi kullanır ve taşıma ve toksin ile temas eden herhangi bir reaktif ve malzeme atarken son derece dikkatli kullanılmalıdır. Kişisel koruyucu ekipman ve tüm malzemelerin uygun bertaraf kullanımı BoNT'nin İşçi OSHA kurallar (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) US Department göre yapılmalıdır. Nihai konsantrasyon 30000 MLD 50 ug / ml (36.000 MLD 50 toplam) olduğu gibi 1.2 ml örnek BoNT / A ilave edin.
    2. Sıvı gıda numuneleri (veya diğer karmaşık sıvı örnekleri) Not: İlk test sıvı matrikslerde partikül madde (. Örneğin hamuru) olarak açıklığa kavuşturulması örneklerinden kurtarıldı süpernatantın hacmini belirlemek için tavsiye edilir değişecektir. Bu protokol, 1.4 mi samp kurtarıldı olacak açıklık yüzer en az 1,2 ml kabulle. Gerekirse numune boyutunu artırın.
      1. 15 ml konik tüp 10 ml sıvı gıda ekleyin ve bir kenara koyun. Bu örnek, standart eğri ve bilinmeyen seyreltmeleri (Bölüm 4) yönelik olarak seyreltici şeklinde kullanılır.
      2. Boş bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü tartılır ve kütle kaydedin.
      3. Tartılan mikrosantrifüj tüpüne sıvı gıda 1.4 ml ilave edilir.
      4. Mikrosantrifüj tüpü yeniden tartın ve boş boru kütlesini çıkarılarak eklenen gıda numunenin kütlesi hesaplanır.
      5. DİKKAT: Bu adım, BoNT'yi kullanır ve taşıma ve toksin ile temas eden herhangi bir reaktif ve malzeme atarken son derece dikkatli kullanılmalıdır. Kişisel koruyucu ekipman ve tüm malzemelerin uygun bertaraf kullanımı BoNT'nin İşçi OSHA kurallar (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) US Department göre yapılmalıdır. 30,000 MLD 50 / g yiyecek nihai konsantrasyonda 1.4 mi numuneye BoNT / A ilave edin.
      6. Inkübasyonseyreltici te ve doğal kontaminasyon taklit, gıda matris etkileşim BoNT zaman vermek üzere, 2 saat boyunca, oda sıcaklığında ya da 4 ° C 'de örnekleri çivili.
    3. Katı gıda örnekleri (ya da diğer katı numune) Not: Başlangıç ​​testi 1 ml GPB / g yiyecek ilave edildikten sonra homojen hale getirilir ve berraklaştırılmış süpernatan örnekleri kurtarıldı hacmini belirlemek için tavsiye edilir. Bu protokol, en azından 1.2 ml yüzer madde, 2 g numunesinden elde edilecek açıklık varsayar. Gerekirse numune boyutunu artırın.
      1. 50 ml konik tüp içine 10 gr katı numune tartılır ve bir kenara koyun. Bu seyreltici olarak kullanılacaktır.
      2. Ikinci bir 50 ml konik tüp içine 2 g katı gıda numunesi tartılır.
      3. DİKKAT: Bu adım, BoNT'yi kullanır ve taşıma ve toksin ile temas eden herhangi bir reaktif ve malzeme atarken son derece dikkatli kullanılmalıdır. Kişisel koruyucu ekipman ve tüm malzeme uygun bertaraf Kullanımıs (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) BoNT'nin İşçi OSHA kurallar US Department göre yapılmalıdır. 30,000 MLD 50 / g yiyecek (60,000 toplam MLD 50) bir son konsantrasyon elde etmek için 2 g numunenin yüzeyine BoNT / A ilave edin.
      4. Doğal kontaminasyonu taklit, gıda matris etkileşim BoNT zaman vermek üzere, 2 saat boyunca, oda sıcaklığında ya da 4 ° C'de bir seyreltici ve çivili örnekleri inkübe edin.
  2. Örnek homojenizasyon ve tampon ayarı. Numune türüne göre yukarıda oluşturulan çivili standart eğri örneği ve seyreltici işleyin.
    1. Düşük karmaşıklığı örnekleri
      1. Başka bir örnek işlem gereklidir.
    2. Sıvı gıda numuneleri (veya diğer karmaşık sıvı örnekleri)
      1. Resim örnek homojenleştirme gereklidir.
      2. 1.4 ml 140 ul 10x nötralizasyon tampon ekleme çivili numune ve 1 ml 10x Neutralizatiyon 10 ml seyreltici örnek tampon. De tersine çevirerek örnekleri karıştırın.
      3. Kısmen 6000 x g ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj ile her iki numunenin açıklamak Hemen süpernatantlar çıkarmak ve yeni tüplere aktarın.
    3. Katı gıda örnekleri (ya da diğer katı numune)
      1. 10 g örnek seyreltici için 2 g BoNT / A-çivili bir katı gıda numunesi ve 10 ml GPB 2 ml GPB (1 mi GPB / g yiyecek) eklenir.
      2. Iyice karışana kadar bir havan tokmağı kullanılarak örnekleri homojenize. Numunenin doğasına bağlı olarak, kabul edilebilir bir homojenize edilemeyen malzemenin küçük parçalar, olabilir. Alternatif olarak, mekanik homojenleştirme yöntemleri kullanılabilmektedir. Bu inaktif hem de toksinin aerosol olabilir bir blender kullanılması tavsiye edilmez.
      3. (Hacim 20 mi ise, örneğin, 2 mi), yaklaşık toplam hacmine bağlı olarak, seyreltici bir örneğe 10x nötralizasyon tampon 1/10th hacim. Tahmin etmektoplam BoNT / A-çivili numunenin hacmi ve 10x Nötralizasyonu tampon 1/10th hacim eklemek. De tersine çevirerek örnekleri karıştırın.
      4. Kısmen 6000 x g ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj ile her iki numunenin açıklamak Hemen süpernatantlar çıkarmak ve yeni tüplere aktarın.
  3. Test için standart bir eğri seri dilüsyonları hazırlanması
    1. Seyreltici olarak D1 olarak BoNT / A-çivili standart eğri örnek ve nonspiked örnek kullanarak, Tablo 3'e göre, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde kalan standart eğri örnekleri oluşturur.

3. Bilinmeyen Örnekleri hazırlayın

Bu bölüm, bölüm 2 paralel olarak tamamlanabilir.

  1. Bilinmeyenlerin sayısını ve seyreltilerini belirleyin. Mümkünse üç nüsha olarak bilinmeyenler sınayın.
    1. Kalitatif analizi için, tarif edildiği gibi yapılır numuneyi işlemek için gerekli olan daha başka seyreltilmeden bilinmeyen çalıştırmakAşağıda yatak.
    2. Aşağıda tarif edildiği gibi kantitatif analizi için, bir veya daha fazla numune analiz tepkisinin doğrusal aralığı içinde olmasını sağlamak için, en az iki 1:10 seyreltme numune hazırlayın. Mümkünse, Bölüm 3'te tarif edildiği gibi matris etkilerini azaltmak için, bilinmeyen aynı matrisin bir seyreltici kullanılarak dilüsyonları oluşturur. Aksi takdirde, seyreltici olarak PBS veya GPB kullanın.
  2. Yaratma ve örnek tipine göre bilinmeyen örnekler seyreltmek.
    1. Düşük karmaşıklık bilinmeyenler (örneğin PBS, GBP veya ilaç)
      1. Bilinmeyen seyreltme 1 üretmek için bir mikro tüp bilinmeyen en az 750 ul ekleyin.
      2. Bilinmeyen seyreltme 2, 3 etiketli iki mikrosantrifüj tüplerine 675 ul seyreltici ekleyin. Seyreltici standart eğri üretimi için kullanılan, aynı malzeme olacaktır.
      3. Seri olarak seyreltme 2 tüp içine seyreltme 1 75 ul transfer edilmiş ve karıştırma ile seyreltme 1 seyreltin.
      4. Seri zaman dilüe olabilmeSeyreltme 3 tüp içine seyreltme 2 75 ul aktarma ve karıştırma e seyreltme 2.
    2. Sıvı gıda bilinmeyenler (veya diğer karmaşık sıvı örnekleri) Not: İlk test 3. Bölüm'de olarak açıklığa kavuşturulması örneklerinden kurtarıldı süpernatantın hacmini belirlemek için tavsiye edilir. Gerekirse numune boyutunu artırın.
      1. Bir mikrosantrifüj tüp sıvı bilinmeyen ≥ 875 ul ekleyin.
      2. Numunenin (875 ul, bir örnek için, örneğin 87.5 ul), 10x nötralizasyon tampon 1/10th hacim.
      3. Kısmen 6000 x g ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj ile örnek açıklamak Hemen yeni bir tüpe süpernatantı aktarın. Bu Bilinmeyen seyreltme 1'dir.
      4. Bilinmeyen seyreltme 2 ve 3 etiketli iki tüpe 675 ul seyreltici ekleyin. Seyreltici standart eğri üretimi için kullanılan aynı işleme malzemesi olacaktır.
      5. Seri olarak transferi ile seyreltme 1 seyreltikhalka 75 seyreltme 2 boru ve karıştırma içine seyreltme 1 ul.
      6. Seri olarak seyreltme 3 tüp içine seyreltme 2 75 ul transfer edilmiş ve karıştırma ile seyreltme 2 seyreltin.
    3. Katı gıda bilinmeyenler (ya da diğer katı örnekler) Not: İlk test 3. Bölüm'de olarak açıklığa kavuşturulması örneklerinden kurtarıldı süpernatantın hacmini belirlemek için tavsiye edilir. Gerekirse numune boyutunu artırın.
      1. 50 ml konik bir tüp içine 2 g katı madde bilinmeyen numune tartılır.
      2. 2 g katı madde numunesine 2 mi GPB (1 mi GPB / g yiyecek) eklenir.
      3. Bölüm 3.2.3.2 'de tarif edildiği gibi, numunelerde homojenize.
      4. (Hacim 4 mi ise, örneğin, 0.4 mi), yaklaşık toplam hacmine göre numuneye 10x nötralizasyon tampon 1/10th hacim. De tersine çevirerek örnekleri karıştırın.
      5. Kısmen 6000 x g ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj ile örnek açıklamak Immediatelbir mikro tüp y transferi ≥ 750 ul yüzer. Bu Bilinmeyen seyreltme 1'dir.
      6. Bilinmeyen seyreltme 2, 3 etiketli iki tüplere 675 ml seyreltici ekleyin. Seyreltici standart eğri üretimi için kullanılan aynı işleme malzemesi olacaktır.
      7. Seri olarak seyreltme 2 tüp içine seyreltme 1 75 ul transfer edilmiş ve karıştırma ile seyreltme 1 seyreltin.
      8. Seri olarak seyreltme 3 tüp içine seyreltme 2 75 ul transfer edilmiş ve karıştırma ile seyreltme 2 seyreltin.

4. Final Örnek Açıklama

Test sıvı ya da katı yiyecek örnekleri bir mikrosantrifüj içinde ≥ 14,000 x g'de santrifüj 5 dakika boyunca her numune tam olarak açıklamak için örnek ise. Hemen süpernatantlar çıkarmak ve yeni tüplere aktarın.

5. Plaka Kurulum ve BoNT / A Aşağı Çekme

  1. Özel plaka düzeni uygulamaya bağlı olmakla birlikte, dış kuyuları kullanmak yok gibi yanikenar etkileri önlemek için. Örnek D9 6 kuyu gerektirir iken her bilinmeyen numune ve standart eğri örnek D1-D8 3 kuyu gerektirir. Önerilen bir plaka düzeni Şekil 1 'de gösterilmiştir.
  2. Her bir kullanılmak üzere 20 ul 10x bağlanma tamponu ekleyin.
  3. Her bir açıklık 200 ul seyreltme ya da üç katlı test için üç kuyu (D9 altı oyuk) her bir ekleme için bilinmemektedir. Bir mikro-mikserde 10 saniye için plaka karıştırın.
  4. IP-A boncuk ekleyin.
    1. En yüksek hızda 10 saniye vorteksleyin IP-A boncukları. Boncuklar tamamen yeniden süspanse ve homojen değilse vorteks devam edin.
    2. Pipet 20 ul IP-A, her numune için iyi boncuklar.
    3. Bir mikro-mikserde 30 saniye boyunca plaka karıştırın.
  5. 750 rpm'de 2 saat, 25 ° C ya da oda sıcaklığında bir döner plaka inkübatör kullanılarak inkübe edin. Deney performansı üreten ve inkübasyon adımları sırasında IP-A boncuk süspansiyonu sağlamak son derece bağlıdır. Bir microp ile her zaman tekrar süspansiyon boncukTüm İnkübasyon sırasında bir yörünge mikrotiter plaka çalkalayıcı kullanılarak süspansiyon peletleme ve bakımını sonra geç karıştırıcı.

6. Plaka Yıkama ve Boncuk Tekrar Süspansiyonu

  1. Elle veya manyetik boncuk uyumlu bir otomatik plaka yıkayıcı kullanılarak ya da plakaları yıkayın. Manyetik boncuk için yapılandırılmış bir otomatik plaka yıkayıcı ölçüde tahlil verimini arttırır.
    1. Manuel Yıkama
      1. 50 ml konik tüp "1x Yıkama tampon" ve 45 ml moleküler biyoloji sınıf su ve 5 ml 10x Matrix Yıkama Tampon eklemek etiketleyin. Inversiyon tampon iyice karıştırın.
      2. Dönen plaka inkübatör plaka kaldırmak.
      3. Hemen 5 dakika için 96 oyuklu bir manyetik boncuk ayırma plakası üzerindeki plaka yerleştirilir.
      4. 96 oyuklu manyetik boncuk ayırma levhası üzerindeki plaka tutarken, yavaşça çıkarın ve bir tek ya da çok kanallı bir pipet kullanılarak örnek kuyu süpernatantlar atın. Aspire etmeyinboncuk-boncuk görsel yanlışlıkla çıkarılması için pipet aspire tampon izlemek. Kaldırma tanık ise, hafifçe de reseparate geri ucu içeriğini ekleyin ve kaldırma tekrarlayın.
      5. De her bir örneğe 300 ul 1x Yıkama tamponu ekleyin.
      6. Tam bir mikro-mikserde 30 saniye boyunca karıştırma plakası ve boncukları tekrar süspansiyon.
      7. 2 dakika için 96-yuvalı manyetik boncuk ayırma plakası üzerinde inkübe edin.
      8. Çıkarın ve daha önce olduğu gibi, numune kuyulardan süpernatantlar atın.
      9. Tekrar 4 yıkama toplam 6.1.1.5-6.1.1.8 üç kez daha adımları.
      10. 96 oyuklu manyetik boncuk ayırma levhası üzerindeki plaka ile, görsel olarak da yüzer kaldırma teyit etmek için kontrol kuyuları, gerektiğinde fazla kalıntı tampon kaldırmak için bir pipet kullanın. Bazı tampon kuyularda kalacak ve bakım boncuk kaldırılması veya boncuk kurumayı önlemek için alınmalıdır.
      11. Her numune oyuğuna 50 ul 1x reaksiyon tampon maddesi eklenir ve 30 se için plaka karıştırınc bir mikro mikser üzerinde tam olarak boncuklar tekrar süspansiyon. Gerekirse, tam olarak boncuklar tekrar süspansiyon bir pipet kullanın.
    2. Otomatik Plaka Yıkama
      1. Tablo 4 'e göre kurulum ve program makinesi. Yüksek kaliteli (örn. nanopure) su ile temizleyin ve yıkayın yıkayıcı.
      2. Başbakan programını "Başbakan" çalıştırarak yıkama.
      3. Dönen plaka inkübatör plaka kaldırmak.
      4. Hemen plaka yıkayıcı üzerinde 96 oyuklu bir manyetik boncuk ayırma plakası üzerindeki plaka yerleştirilir.
      5. Bağlantı programı "Master Yıkama" çalıştırın. İlk program adımı yıkayıcı sabit olacak bir 5 dakika inkübasyon adımdır.
      6. Program tamamlandıktan sonra, yıkama gelen plaka kaldırmak de her bir örnek için, 50 ul 1x reaksiyon tampon ekleyin ve tamamen boncuk yeniden askıya almak için bir mikro-mikserde 30 saniye boyunca plaka karıştırın. Gerekirse, tam olarak boncuklar tekrar süspansiyon bir pipet kullanın.

    7. Deneyi Başlatma ve Kuluçka

    1. Her numune oyuğuna 50 ul 0.5 uM A / E raportör (bkz. Bölüm 1 e bakınız) ilave edilir ve tam olarak boncuklar yeniden askıya almak için bir mikro-mikserde 30 saniye boyunca karıştırılır.
    2. Kenar etkileri önlemek için, her bir plaka üzerinde kullanılmamış oyuğuna 100 ul su ekleyin.
    3. Plaka sızdırmaz bantla kapatın ve plaka 25 ° C ya da RT, 750 rpm'de dönen bir plaka kuluçka ile kuluçkalayın. Inkübasyon sırasında ışıktan plakasını koruyun.

    8. Veri Toplama ve Analizi

    Not: Bu, deneme arzu edilen duyarlılık elde edilene kadar birkaç kez ölçülebilir, gerçek zamanlı bir tahlildir, gerekli bir durdurma reaktif vardır. Önerilen ilk okuma kez 2, 4, ve deney hassasiyet ile 24 saat inkübasyon süresi kuluçka süresi ile artar.

    1. Bilgi toplama
      1. Her okuma zamanda, dönen plaka inkübatör plaka kaldırmak, mühür kaldırabilirsinizbant ing ve hemen, 96 oyuklu manyetik boncuk ayırma plakası üzerindeki plaka yerleştirilir. Taneler, 2 dakika boyunca ayrı izin verin.
      2. Mikroplaka okuyucu plaka koyun ve ~ 470 de emisyonları ölçmek ve ~ 434 nm uyarma altında ~ 526 nm.
      3. Ek okuma kez arzu edildiği takdirde, mikro mikserde 30 saniye boyunca boncuk tekrar süspansiyon plaka kapatın ve döner levha Plakaları kuluçka makinesine geri döner.
    2. Veri analizi
      1. 470 nm'de RFU değeri 526 nm'deki nispi floresan ünitesi (RFU) değerine bölünmesi ile her numune için emisyon oranını hesaplar.
      2. Standart eğri veri noktaları için log [BoNT / A] karşı emisyon oranını çiziniz. Test edilen BoNT / A gücü aralığına bağlı olarak, bir sigmoidal doz-tepki eğrisi (Örnek Sonuçlar bakınız) elde edilir.
      3. Değişken eğim doz-yanıt eğrisinde Y = Alt + (Alt-Üst) / ile standart eğri verileri sığdırmak (1 +10 ^ ((logEC 50-X) * Yamaç)) X olduğunukonsantrasyonunun logaritma, Y bir tepkidir ve Y'nin Alt başlar ve bir sigmoidal şekli ile üst kısmına gider.
      4. Algılama sınırlarını (LOD) belirlemek, miktar (LOQ) ve yarı maksimal etkin konsantrasyonu (EC 50) sınırlar. Algılama sınırları boş kontrol altında bir emisyon oranı en az 3, standart sapma (SD) sahip olan bir numune olarak tanımlanır (n = 6). Miktar tayini sınırları örnek en az 10 SDS boş kontrol altında bir emisyon oranına sahip olan olarak tanımlanır (n = 6). EC 50 sigmoidal doz-cevap eğrisi uyum belirlenir.
      5. Sigmoidal doz-tepki standart bir eğriye karşı herhangi bir bilinmeyen numunelerin potens sokmak.
        1. Nicel sonuçlar için, bilinmeyen bir örnek ideal standart eğrinin doğrusal bölümü dahilinde olmalıdır. (% 20-80 toplam deney cevap pencere hesaplanması, standart eğrinin lineer kısmı yaklaşık olarak ise, örneğin, standart eğri r emisyon oranıanges 0,5-2,5, doğrusal aralık) 0,9-2,1 aralıkları standart eğrinin bir bölümü olacaktır.
        2. Nitel sonuçları elde etmek için, standart eğrinin LOD ve LOQ karşı bilinmeyen bir örneği karşılaştırın.
        3. Standart eğrinin sınırları ötesinde bilinmeyen örnekler tahmin etmeyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Açıklanan protokol adımları özetleyen bir diyagramı Şekil 2 de gösterilmiştir. Analiz numunesi tipine ve istenen tahlil duyarlılığına bağlı olarak tamamlamak için 4-26 saat arasında gerektirir, fakat sadece ~ 2 saat süre eller üzerinde. Deney, 96 oyuklu plakalarda ve test yapılmaktadır tipine bağlı olduğu, plaka başına standartlar dahil olmak üzere 20 kadar numune, üçlü test sağlar.

Şekil 3, BoNT kullanılarak temsili deney sonuçları göstermektedir / A holotoksin PBS'ye çivili ve A / E raportör ile 2, 4, ve 24 saat inkübe edildikten sonra, tarif edilen protokol ile test edilmiştir. Saflaştırılmış BoNT / A holotoksin ~ 150 kDa, tanımlanmış bir moleküler ağırlığa, toksin kompleksi için daha geniş anlamıyla 700-900 kDa ile karşılaştırıldığında, çünkü, bu deney için seçilen ve saflık hassas konsantrasyonlarda çok hassas çapalama izin edildi. Emisyon oranı, 470 nm'de edilene 526 nm'de emisyon oranı, 434 uyarma sonrasındanm, her zaman bir noktada BoNT'nin / A konsantrasyonu (MLD 50 değer BoNT / A üreticinin gücü test dayanmaktadır) karşı çizilmiştir. BoNT ile muhabir yarılması eden plaka okuyucusu ile tamamen ayrışmış muhabir için yaklaşık 0.7 için sağlam muhabir için yaklaşık 2.7 arasında değişmektedir emisyon oranı bir azalma olarak ölçülür. Bu RFUs her bir floresan levha okuyucu önlemler bu yana, emisyon oranı gerçek değeri kullanılan plaka okuyucusu bağımlı olacaktır, dikkat etmek önemlidir. Eğrisinde sola doğru bir kayma tarafından görüldüğü gibi artmış bir raportör bölünmesinde raportör sonuçları ile inkübasyon süresi uzun süreli. Üç kopya olarak test veri noktaları, ortalama düşük SD görüntü ve azalmış toksin yük ile artan salım oranının beklenen eğilimi takip edin. Bu beklenen trendi takip etmek testin başarısızlığı seyreltme nesil ya da veri komplo sırasında bir hata olabilir. Hiçbir BoNT / A içeren kontrollerin emisyon oranları da durin sabit kalmasıSpesifik olmayan proteaz aktivitesinin eksikliği gösteren g enkübasyon (Şekil 3, ek),.

Farmasötik BoNT / A örnekleri ölçmek için bu protokol kullanılarak bir örneği Şekil 4'te gösterilmektedir. Standart bir eğri saflaştırılmış BoNT / A holotoksin ile PBS içinde üretilir ve% 0.9 salin içinde yeniden hidre liyofilize BOTOX bir tek 100 U şişe üretilen ilaç ürününün seyreltmeleri ile paralel olarak işlemden geçirildi. (İdeal olarak, standart eğri BOTOX referans daha oluşur ama bu malzemelerin kolaylıkla mevcut değildi.) Numuneler 50 ul numune tamponu 10x bağlama kullanılmadan iki kopya halinde test edildi haricinde ile tarif edilen protokol kullanılarak test edilmiştir. Standart eğri, A / E raportör ile 24 saat inkübasyon, aşağıdaki BoNT / A konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Her bilinmeyen numunenin emisyon oranı daha sonra, standart eğri çapında kesişim çizilerek görselleştirildi. Bu deneyde, hatStandart eğri (% 20-80 yanıt deney window) ar kısmı 2,11-1,05 bir emisyon oranı arasında kalan ve bu şekilde de kesik çizgili kutu ile belirtilir. Bu doğrusal aralığı içinde üç bilinmeyenler konsantrasyonu daha sonra standart bir eğri (Şekil 4, ek) enterpole edilmiştir. Bu örnek, standart bir eğriye karşı herhangi bir tespit ya da bilinmeyen bir örneği ölçmek için kullanılacak olan genel bir yöntem gösterir.

Taze domates ve% 2 süt protokolün performans ve bir katı (domates) ve sıvı gıda (% 2 süt) matris hem kullanarak hassasiyeti göstermek için seçildi. Bu preparat, doğal bir Clostridium kirlenme sırasında üretilen toksin için benzer çekirdek holotoksin ve nörotoksin ile ilişkili proteinleri (UEP) oluşan BoNT / A kompleksi Bu deneyler için seçilmiştir. Şekil 5A'da, A / E raportör yarılması olarak ölçülmüş BoNT / A, kurtarma gösterildiği gibi, b görülmektediroth matrisler. Raportör ile artan Kuluçka süresi deneyi hassasiyeti artar, ancak içindeki gıda üzerinde taşımak BoNT / A'dan gözlenen bölünme sonuçlarını ve özgül olmayan proteaz gösteren, hiçbir toksin kontrol (Şekil 5A, sokmalar) azalma emisyon oranı ile sonuçlanmaz deneyi. Beklenen eğilim ile muhabir bölünme azalma Şekil 3, veri görüntüler düşük değişkenlik gibi ve aşağıdaki toksin konsantrasyonu azalmıştır.

BoNT / A LOD, LOQ ve gösterildiği gibi, her bir zaman noktasında her iki maddeler için EC 50 Tablo 5'te özetlenmiştir. LOD ve LOQ daha düşük üç ve on SD'lerin sırasıyla zeminden (BoNT / A içeren örnekler) altında bir emisyon oranı ile düşük yoğunluklu numune olarak tanımlanır. Sigmoidal doz-yanıt eğrisine interpolasyon düşük teorik sınırlarını hesaplamak için de kullanılabilir, ancak bu sınırlar, test edilen veri noktaları ile sınırlıdır. Bazı matrix-to-matriks etkileri boncuk ve yıkama sırasında boncukların kurtarma için toksinin bağlayıcı etkileyebilir olarak LOD ve LOQ matris değişkenlik beklenmektedir. Bu fark çok GPB domates örnekleri homojenize etmek için gerekli olan ek seyreltme sonuçları Şekil 5A'da, verilerden domates en fazla% 2 süt daha fazla toksini iyileşme olduğunu görünür iken.

, Bir katı matris gıda olmasının yanı sıra, domates 10x nötralizasyon tampon eklenmesi ile elde pH ve iyonik güç ayarlı, deney başarısı için kritik olan kayda değer bir örnek türüdür. Dahil olan veya olmayan domates test ederken, Şekil 5B, deney yanıtları göstermektedir Nötralizasyon 10x tampon eklendi. Örneklerden BoNT / A'nın zayıf kurtarma 10x nötralizasyon tampon sonucu eklemek için ve test edilen tüm BoNT / A konsantrasyonları arasında sabit bir emisyon oranı ile gösterilmiştir Failure. 10x Nötralizasyon tamponu ilavesi olsa, rToksinin hassas algılama esults.

BoNT başka proteazlar, A / E raportör klivaj olabilir çünkü ele değilse karmaşık matrisler içinde ihtiva Spesifik olmayan proteazlar, yanlış pozitif yol açabilir. Spesifik olmayan proteazlar gıda örnek endojen veya Clostridium kültür yüzer olarak saflaştırılmamış BoNT preparatlar kullanırken sokulabilir. Kapsamlı boncuk yıkama en özel olmayan proteazlar kaldırır, ancak, bunlar tepkime tampon çözeltisine proteaz inhibitörlerinin eklenmesi önemlidir 6 modifiye edilmiş bir A / E muhabir, BoTest KO (KO raportör kullanılarak Clostridium BoNT / A kültür yüzer bulunan spesifik olmayan proteaz aktivitesini gösterir Şekil. .) KO raportör BoNT / A bölme sitesi mutasyona edilmiş olması hariç olmak üzere A / E raportör ile aynıdır artık BoNT / A parçalanabilen şekildedir Bu nedenle, herhangi bir raportör gözlemlenen spesifik olmayan proteaz bölünme aktivitesi sonuçları. KO muhabiri cle arasında yüksek düzeydeavage kültür süpernatanı proteaz etkinliğinin yüksek düzeyde işaret eder, ancak bu faaliyet etkin proteaz inhibitörlerinin ilavesiyle etkisiz hale gelir.

Basit bir örnek veri tamponları ve gıda matrisler, yüksek ölçüde BoNT / A tespiti için protokol yararını göstermektedir. Bazı gıdalar küçük tahlil ayarlamalar gerekebilir, ancak açıklanan protokol yiyecek türlerinin çoğunluğu ile iyi sonuçlar vermesi gerekir.

Şekil 1
Şekil 1.. Önerilen plaka düzeni. Numuneler mümkün kenar etkileri önlemek için plakanın iç 60 kuyulara sınırlıdır. Bilinmeyen ya da arzu edildiği gibi, standart eğri örnekleri eklenebilir. Kullanılmayan tüm kuyular muhabiri inkübasyon sırasında 100 ul su ile dolu olmalıdır. CLIDaha büyük resmi görmek için buraya ck.

Şekil 2,
Şekil 2,. Açıklanan protokole şematik gösterimi. Protokol her önemli bir adım, etiketlenmiş bir kutu ile gösterilir ve sonraki yaklaşık deney zaman çizelgesi (tam ölçeğine göre olmayan) ile hizalanır. Renk vericiler örnekleri örnek işleme gerektirir ve böylece gıda örneklerinin aşağı protokolünü girmeyin. Bilinmeyenler için seri seyreltme nesil çevresinde kesik çizgili kutu bu isteğe bağlı olduğunu gösterir, ancak önerilen, adım. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,
BoNT / tanımlanan protokol kullanılarak PBS içinde bir holotoksin Şekil 3.. Detection.Saflaştırılmış BoNT / A holotoksin PBS'ye çivili ve 1 nM bir üst BoNT / A konsantrasyonu ile tarif edilen protokol kullanılarak test edilmiştir. Bütün numuneler üç kopya halinde test edildi ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını temsil eder. Rapor edilen güç toksinin üreticinin fare biyolojik deneyi test dayanmaktadır. Standart eğrinin emisyon oranı (434 nm 'de uyarım üzerine 470 nm'ye 526 nm emisyon oranı) A / E raportör ile 2, 4, ve 24 saat kuluçkadan sonra ölçülen ve BoNT / A konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir . resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 4,
Açıklanan protokol kullanılarak BOTOX ilaç ürününün Şekil 4.. Miktarının belirlenmesi. Liyofilize BOTOX ilaç ürününün tek bir 100 U şişe resuspe oldu nded 220 ul% 0.9 tuzlu su içinde, seri olarak seyreltildi ve saflaştırılmış BoNT / A holotoksin kullanılarak PBS içinde yapılan standart bir eğriye karşı bilinmeyen olarak test edilmiştir. Numuneler, 50 ul örnekler ikişer kez bağlama tamponunda 10x olmadan test edilmiştir dışında, tarif edilen protokole göre test edilmiştir. Standart eğri değişken eğim sigmoidal doz-yanıt denklemine, standart eğri numuneleri emisyon oranını uygun ve BoNT / A konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir hesaplanmıştır. Bu A / E raportör ile birlikte 24 saatlik bir kuluçkadan sonra, standart eğri ile kesiştiği yerde her bilinmeyen bir örnek gösterilmektedir. Lineer aralığı (kesikli gölgeli kutu) içinde yer alan bilinmeyen numune konsantrasyonları, standart eğrisinden enterpole edilmiştir. Her BOTOX bilinmeyen için etiket etiketli etki gücüne göre numunede mevcut birimlerinin sayısıdır. Hata çubukları ortalamanın standart sapmasını temsil eder.t = "_blank"> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 5,
Açıklanan protokol kullanılarak BoNT / A-çivili% 2 süt, taze domates test Şekil 5. Recovery.% 2 süt ve taze domates numuneleri saflaştırılmış BoNT / A kompleksi ile tutturuldu ve tarif edilen protokol kullanılarak test edilmiştir. Bütün numuneler üç kopya halinde test edildi ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını temsil eder. (A)% 2 süt, taze domates standart eğrilerinin emisyon oranı, 2, aşağıdaki 4 ölçülür ve A / E raportör ile 24 saat kuluçka edilmiştir ve BoNT / A kuvvetinin bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. deney hatası içinde domates test sonuçları sırasında 10x nötralizasyon tampon eklemek için (B) Failure. Taze domates numuneleri ile veya Nötr 10x eklenmeden ya da tarif edilen protokole göre test edilmiştir-laşma tamponu. Gösterilen veriler 4 saat zaman noktası için. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 6,
Karmaşık matrisleri test ederken Şekil 6,. Proteaz inhibitörleri gerekmektedir. Clostridium BoNT / A (suş Hall A) kültür üst fazı seri PBS içinde seyreltilmiş ve proteaz inhibitörleri ile birlikte veya olmadan reaksiyon tamponu ilave edildi ve bir ya da her ikisi ile, tarif edilen protokol kullanılarak test edilmiştir / E ve KO muhabirler. Emisyon oranı A / E veya KO muhabir her ikisi ile 24 saat kuluçkadan sonra ölçülen ve BoNT / A güçte bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. KO muhabir önemli bölünme proteaz inhibitörlerinin eklenmeden görüldü ama dahil tarafından etkisiz. Bütün numuneler üç kopya ve hata b test edildiars ortalamanın standart sapmasını temsil eder. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Tampon Bileşim Depolama Sıcaklığı Istikrar Notlar
10x Matrix Bağlama Buffer 500 mM HEPES-NaOH, pH 7.1, 250 mM NaCl,% 1 Tween-20,% 5 kazein,% 0.05 NaN3 -20 Veya -80 ° C Çözündükten sonra, 4 ° C'de beş gün arasında, en az kararlı BoTest Matrix A Botulinum Detection Kit ile birlikte
10x Matrix Yıkama Tampon 119 mM fosfat, pH 7.4, 1.370 mM NaCl, 27 mM KCI,% 1 Tween-20 -20 Veya -80 ° C Çözündükten sonra, 4 ° C'de beş gün arasında, en az kararlı BoTest Matrix A Botulinum Detection Kit ile birlikte
10x Nötralizasyon Buffer 1 M HEPES-NaOH, pH 8.0, 1 M NaCl 4 ° C 4 ° C'de altı aya kadar stabildir
10x BoTest Reaksiyon Tamponu 500 mM HEPES-NaOH, pH 7.1, 50 mM NaCl,% 1 Tween-20, 100 uM ZnCl2 -20 Veya -80 ° C Çözündükten sonra, 4 ° C'de beş gün arasında, en az kararlı BoTest Matrix A Botulinum Detection Kit ile birlikte
BoTest A / E Reporter 50 mM HEPES-NaOH, 10 mM NaCI,% 15 gliserol içinde 20 uM -80 ° C Küçük miktarlarda saklayın. Çözündükten sonra, 4 ° C'de beş gün arasında, en az stabildir. BoTest Matrix A Botulinum Detection Kit ile birlikte
Jelatin Phosphate Buffer (GPB) 33.3 mM NaH 2 PO 4, pH 6.2, 2 g / L jelatin 4 ° C 4 ° C'de 1 aya kadar stabildir
200x ditiyotreitol (DTT) 1 M DTT -20 ° C -20 ° C'de 6 aya kadar stabildir Yapmak ve küçük (100 ul) hacimde depolamak
1x PBS-T 11.9 mM fosfat, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCI,% 0.1 Tween-20 4 ° C 4 ° C'de 1 aya kadar stabildir 10x Fisher PBS (BP399-1) kullanılarak yapılabilir
Matrix A Boncuk (IP-A Boncuk) Manyetik boncuklar kovalent PBS içinde tavuk anti-BoNT / A antikora konjüge. % 0.1 Tween-20,% 0.05 sodyum azit,% 0.25 kazein, ve% 50 Gliserol -20 ° C -20 ° C ile çıkarılması üzerine 4 ° C'de beş gün arasında, en az kararlı -80 ° C'de DONDURMAYIN

Tablo 1. Tarif edilen protokol için gerekli Tamponlar. 10x NötralizasyonTampon, yalnızca oldukça karmaşık (örneğin gıda) numuneler için ve test edilen örneklerin doğasına bağlı olarak gerekli olabilir.

Malzeme / Ekipman Adı Şirket Katalog Numarası Yorumlar / Açıklama
BoTest Matrix A Botulinum nörotoksin Tespit Kiti BioSentinel A1015 BoNT / B ve F için Tespit kitleri de mevcuttur.
Varioskan Flaş floresan mikroplaka okuyucu Thermo Fisher Scientific- 5250040 434 nm eksitasyon ve 470 nm ve 526 nm emisyon özelliği olan en monokromatör ya da filtre tabanlı üniteleri kullanılabilir.
96 oyuklu manyetik boncuk ayırma Plaka V & P Bilimsel VP771H Diğer manyetik plakalar kullanılabilir, ancak plaka b ayırmak için tasarlanmış olmalıdırkuyunun tarafına EADS.
Manyetik Boncuk-Uyumlu Tabak Yıkama BioTek ELx405 vSRM İsteğe bağlı, sadece otomatik yıkama için gerekli. Diğer manyetik boncuk uyumlu levha yıkayıcılar de kullanılabilir, ancak kullanımdan önce test edilmelidir.
Microcentrifuge Çeşitli N / A İsteğe bağlı, ancak santrifüj ihtiyaç örnekleri için gereklidir.
MixMate plaka mikser Eppendorf 22674200
Orbital Çalkalayıcı Çeşitli N / A Sıcaklık kontrolü mevcut ise, oda sıcaklığında ya da 25 ° C 'de kullanılmış
EDTA içermeyen proteaz inhibitör Tabletler Roche 4693132001 Sadece yiyecek veya çevresel test için gerekli. Proteaz inhibitörleri EDTA'sız olmalıdır.
BoNT / A Metabiologics N / A İsteğe bağlı, sadece standardizasyon ve ölçümü için gerekli
Siyah, Düz dipli, 96 oyuklu levhalar NUNC 237105 Plakalar kabul edilmemelidir
96 oyuklu bir plaka Sızdırmazlık Bant Thermo Scientific 15036

Tablo 2.. Malzemeler ve tarif protokol için gerekli ekipman. Bazı malzeme ve ekipman isteğe bağlı ya da mevcut ekipmana bağlı olarak ikame edilebilir. Ek uygunluğu test ve optimizasyon alternatif ekipman kullanılarak durumunda gerekli olabilir.

</ Tr>
Numune Adı Cilt Toksin Cilt Seyrelticide [BoNT / A] (MLD 50 / ml) veya (MLD 50 / g gıda) log [BoNT / A] (MLD 50 / ml) veya (MLD 50 / g gıda) D1 1.200 ul Hazır N / A 30.000 4.48
D2 300 ul D1 600 ul 10.000 4
D3 90 ul D1 810 ul 3.000 3.48
D4 90 ul D2 810 ul 1.000 3
D5 90 ul D3 810 ul 300 2.48
D6 90 ul D4 810 ul 100 2
D7 90 ul D5 810 ul 30 1.48
D8 90 ul D6 810 ul 10 1
D9 N / A 1.400 ul N / A N / A

Tablo 3:., Standart eğri numuneleri için seyreltme Bu tablo büyüklüğü basamağı üzerinden 3.5 yarım-log dilüsyonlarda standart bir eğri oluşturur. Yeter Hayır BoNT boş numune (D9) = 6, n çalıştırmak için oluşturulur. Eğer istenirse ilave seyreltileri ilave edilebilir.

<td> 0
Program Adı Değişken Değer Yorumlar
Asal Reaktif Şişesi A
Başbakan Hacim 400
Prime Debi 7
Prime sonra emmek? N
Matrix Yıkama Reaktif Şişesi A Kalan proteaz aktivitesi, eğer yıkama sayısı arttırılabilir.
Yöntem
4
/ Salla Soak Y
Süre emmek 180
Islatın önce sallamak? N
Prime sonra ıslatın? N
Disp
Hacim dağıtmak 300
Akış puanla dağıtmak 5
Yükseklik dağıtmak 130
Hor. Pos dağıtın. 0
Aspire devre dışı? Y
Alt Yıkama First? N
Başlamadan Önce Başbakan? N
Aspir
Aspirasyon Yükseklik 40
Hor. Aspire Pos. 0
Aspirasyon Oranı 5
Aspirasyon Gecikme
Çapraz aspire? N
Aspirasyon Final? Y
Final Aspirasyon Gecikme 0
Matrix bekletin Süre emmek 300 Artan emmek süre daha yapışkan gıdalar boncuk kurtarma artabilir.
Islatın önce sallamak? N
Usta Yıkama Matrix bekletin Bu Matrix bekletin çalıştırmak için bir 'bağlantı' programı ve birlikte Matrix Yıkama programları.
Matrix Yıkama

Tablo 4.. Manyetik boncuk-uyumlu otomatik plaka yıkayıcı program ayarları. Aşağıdaki programlar tabak yıkayıcı kuyu tarafına ve boncuk çeker bir mıknatıs ile donatılmış olduğunu varsayalım anahtarlama modülü tampon şekilde ayarlanmış 1x Yıkama Tampon ( PBS-t) Bu programlar BioTek ELx405 özgü valf A bağlanmıştır. Programlama talimatları için araç kullanım kılavuzuna başvurun. Diğer manyetik boncuk uyumlu bir otomatik levha yıkayıcılar veya vakum manifoldu kullanılabilir, ancak test yıkama verimliliği maksimize ayarlarını belirlemek ve yıkama sırasında kordon kaybını en aza indirmek için gerekli olacaktır. Yıkama sonrası boncuk iyileşmenin ilk testi, kullanılan spesifik plaka yıkayıcı tavsiye edilir.

<td> LOD
Gıda Matrix Metrik 2 saat 4 saat 24 saat
MLD 50 / g gıda MLD 50 / kuyu MLD 50 / g gıda MLD 50 / kuyu MLD 50 / g gıda MLD 50 / kuyu
Süt 300 58 100 19 30 6
LOQ 1.000 193 300 58 100 19
EC 50 2,404 464 590 114 92 18
Taze Domates LOD 1.000 91 300 27 30 3
LOQ 1.000 91 1.000 91 100 9
EC 50 7561 687 1.932 176 229 21

Tablo 5. Algılama sınırları (LOD), tayin sınırları (LOQ), ve yarım-mLOD ve LOQ düşen en düşük konsantrasyon veri noktası olarak tanımlanmaktadır ise Şekil 2A'da gösterilen% 2 süt, taze domates test için aximal etkili konsantrasyonu (EC50). EC 50 sigmoidal doz-cevap eğrisi uyum türetilmiş no BoNT kontrol (n = 6), sırasıyla, aşağıdaki 3 ya da 10 ya da standart sapmaları. Veriler MLD 50 / g yiyecek ve 200 ul numune hacminde kuyucuk başına test edilen toplam MLD 50 s hem de sunulmuştur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol BoNT'yi / karmaşık matrisler bir kompleks, holotoksin veya Clostridium kültür süpernatant ölçülmesi için prosedürler açıklanmaktadır. Deney hassasiyeti serotipleri ve tahliller arasında değişir, ancak ilgili Matrix deneyleri 56,60 diğer BoNT serotipleri (örneğin, BoNT / B, E, ve F) test sırasında protokol, ancak, aynıdır. Bu protokol olası numune her türü için hesap değil ve bazı modifikasyonlar belirli örnek kompozisyon ve arzu edilen uygulamaya bağlı olarak gerekli olabilir. Matrisler yiyecek örnekleri (örn. yiyecek meydan okuma testi) veya farmasötik yardımcı tamponları (örn. BoNT-bazlı ilaç ürün test) içerebilir. Kompleks renk vericiler (örneğin, hayvan dokusu veya çevresel), sıvı ve katı numuneleri gıda örnekleri olarak tedavi edilmelidir. Bu protokol, 200 ul / kaynak örnek hacimlerini içerir, fakat kadar az 50 ul / oyuk 10x bağlanma gösteren hacmine karşılık gelen bir düzeltme ile test edilebilirg tamponu. 50 ul daha küçük örnekler test edilmeden önce ≥ 50 ul GPB veya PBS ile seyreltilmelidir.

Gıda maddelerinin son derece değişken doğası gıda BoNT'den tespiti ve ölçümü için özel bir sorun teşkil etmektedir. Numune, pH, viskozite, iyonik kuvvet ve parçacık maddenin varlığı tüm potansiyel gıda matris içinde toksinin aktivitesini etkileyebilir ve toksin doğru, in vitro ölçümü için gıda izole edilmesi gerektirebilir. Birçok gıdalar ya da toksin preparatları da kaldırılır veya yalnızca BoNT spesifik proteaz etkinliği ölçülmüştür olduğundan emin olmak için protein-tabanlı zaman haberci kullanılarak inaktive edilmelidir endojen proteazlar içerir. Bu tür farmasötik katkı maddesi tampon olarak da basit, iyi tanımlanmış tampon matrisler, miktar 35,56-59,61 önce çıkarılması gerekir BoNT aktivitesine müdahale bileşikleri içerebilir. İmmunopresipitasyon hızlı, yüksek derecede serotip spesifik BoNT Puri sunarbahsedilmekte yöntem ancak "gerçek dünya" gıda, çevre, ve ilaç örneklerinde bulunan düşük toksin konsantrasyonlarının izole etmek için yüksek afiniteli antikorlar gerektirir.

Açıklanan protokol, BoNT / A çekirdek holotoksin 56 toksin ağır zincir reseptör alanına doğru yönlendirilmiş bir anti-BoNT / A antikorları ile kaplı para-manyetik boncuklar kullanılarak toksin arındırır. Clostridium türleri, ancak, doğal olarak ilişkili olarak çekirdek holotoksin oluşan toksin kompleksleri üretmek UEP'lerin 62-64 ile. UEP gastro-intestinal sisteminde proteaz saldırısından toksin korumak ve bağırsak epitel 63,65 karşısında toksin taşınmasını kolaylaştırmak inanılmaktadır. UEP çekirdek holotoksin (veriler gösterilmemiştir) için IP-A boncuk anti-BoNT / A antikorların bağlanmasını inhibe eder. Bu engelleme BoNT / A holotoksin ve UEP'nının ayrışacaktır karmaşık ve izin etkili toksin neden, 6.25 ~ yukarıdaki örnek pH artırarak rahatladıIP-A bağlanmasının 66 boncuk. Bu nedenle, 6.5 'in üzerinde için örnek pH'ın ayarlanması deneyi (Şekil 5B) başarısı için çok önemlidir. Protokolde kullanılan 10x bağlanma tamponu standart deney koşulları, pH değerini yükseltme için bir dolgu maddesi içermektedir. Ancak, birçok asitli gıdaların bağlama tamponu tamponlama kapasitesini aşabilir. Ek 10x nötralizasyon tampon büyük numune tamponlama kapasitesini arttırır ve gıda matrislerin çoğunluğu nötralize gerekir.

Deney için bir diğer önemli parametre, örnek iyonik gücüdür. Santrifüjleme ile numunelerin açıklık immünopresipitasyonu aşağıdaki etkin boncuk yıkama ve geri kazanım için gereklidir. Taze domates ile test örnekleri sadece işlenmiş ve santrifüj edildiğinde hiçbir BoNT / A iyileşme görüldüğünü ortaya koydu. Biz BoNT / A bu santrifüj sırasında pelet neden domates eti ile ilişkilendirmek ve eksik olabilir varsaydıktest yüzer. Bu bulundu BoNT ve geliştirilmiş toksin kurtarma (Şekil 5B) ile sonuçlanan matris arasındaki pH sınırlı etkileşimleri nötralize edici, daha da önemlisi, iyonik gücünü artırmak ya da. BoNT kurtarma için gerekli olmasa da, daha yüksek tuz konsantrasyonları, aynı zamanda, immüno-çökeltme ve sertliğini arttırmak ve daha az spesifik olmayan protein elde edilmesi ile sonuçlanır, özellikle düşük tuz gıdalarda olacağını göstermiştir değil, ancak tahmin edilmektedir.

Örnek pH ve iyonik mukavemeti, protokolde ayar 10x nötralizasyonu tamponu eklenerek gerçekleştirilir ve gıdalar geniş bir yelpazesi ile uyumlu olmalıdır. 10x Nötralizasyon tampon yüksek bir tamponlama kapasitesine sahip olsa da, bazı yüksek asitli gıdalar, ek pH ayarlaması gerekebilir. Tampon Ayrıca aşağıdaki örnek pH Test kötü tahlil performans görülürse eğer önerilen ve örnek hacmi izin verir. Diğer pH ayarlama s ilavesi ile elde edilebilir1 M HEPES, pH 8 arasında merkezi miktarlar, gerekirse. Kötü sonuçlar, belirli bir gıda maddesi ile birlikte görülür ancak, 10x nötralizasyon tamponu 1 M HEPES, pH 8 ile ikame edilmiş olabilir; 10x nötralizasyon tampon tarafından sunulan ek NaCl saltiest gıdalar ama için kabul edilebilir olması gerekir. PBS içinde 1,2 M kadar NaCl konsantrasyonlarında tarif edilen protokol test zaman hiç bir önemli fark gözlenmemiştir.

Bu protokol numunelerin çoğunluğu için geçerli olmakla birlikte, pH, iyon gücü ve / veya proteaz içeriğin aşırı gıdaların deneyi ile iyi sonuçlar vermeyebilir. Bazı gıdalar da zayıf boncuk kazanımı ile sonuçlanan, GPB ilave edildikten sonra çok yapışkan kalabilir. Örneğin PBS gibi basit bir tampon maddesi ile önceden seyreltme ile örneklerin sonuçları iyileştirebilir. Yıkama sayısını arttırmak ya da (artan NaCl konsantrasyonuyla) sıkılığının yıkama ve EDTA içermeyen proteaz inhibitörlerinin konsantrasyonunun arttırılması da sonuçlarını geliştirmek eğer spesifik olmayan proteaz contaminatiyon görülmektedir. Otomatik plaka yıkama kullanırken Enstrüman temizliği de çok önemlidir. Diğer laboratuvar deneyleri proteazlara (örneğin, tripsin) ile birlikte sıhhi tesisat ve enjeksiyon memeleri kirlenmesi tahlil sırasında proteazların kasıtsız giriş yol açabilir. Üreticisinin kullanım kılavuzuna göre plaka yıkama kapsamlı bir temizlik tahlil çalıştırmadan önce tavsiye edilir.

BoTest Matrix deneyleri karmaşık matrislerde BoNT saptanması ve nicelenmesi için ilk ticari, aktivite bazlı tahliller bulunmaktadır. Standart fare Biyoassay karşılaştırıldığında, deney daha az pahalı, hızlı ve özel tesisler veya hayvan kullanımı 56 dair etik kaygılar için gerek olmaksızın yüksek verim test sağlar. Diğer in vitro BoNT saptama yöntemleri tarif edilmiştir fakat karışık bir numune matrisleri ile uyumlu olduğu gösterilmiştir değil, özel ekipman gerektirir, ya da ticari olarak uygunlğ değildirle 35,42-44,46-55. Tahliller, aynı zamanda, geleneksel enzim-bağlı imüno-deney (ELISA) tekniği, sadece toksin kütle rapor ise, toksin endoproteaz etkinliğini ölçmek aktivite bazlı tahliller bulunmaktadır. Faaliyet tabanlı ELISA deneyleri, daha önce tarif edilmiştir, ancak bu deneyler, gıda matrisler çalışmak için ve örnek matris 41 toksin saflaştırma ve kapsayacak olmayan göstermiştir değildi. Matris bileşikler genellikle BoNT aktivitesi 35,56-59 müdahale yana toksin numuneden saflaştırılır değilse kompleks örneklerin toksisite önemli düşük tahmin oluşabilir.

Protokol hakim sonra, değişiklikler örnek hacimlerini artırmak ve örnek duyarlılığı artırmak için yapılabilir. Örneğin, boncuklara toksinin bağlayıcı santrifüjleme ile toplama öncesinde daha büyük, dökme örnekler (örn., 10 ml veya daha yüksek) gerçekleştirilebilir. Bu boncuklar daha sonra bir 96 oyuklu plakaya ilave edilir ve tarif aşağıdaki deneye tabi tutulabilird protokolü. Bir log daha fazla duyarlılık artar artan örneklem büyüklüğü 56 ile gözlenmiştir. Bu durumda, tarif edilen protokol takip da fare biyolojik deneyi ile tespit edilemeyebilir numunelerde bulunan BoNT miktarda tespit etmek için daha büyük bir hacim örnekleri ile birlikte kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin ve WC Tucker BioSentinel Inc BioSentinel çalışanları veya sahipleri şu anda üretir ve bu raporda sunulan reaktiflerin bazı ticari gelmiştir.

Acknowledgments

Yazarlar değerli tartışmalar ve tavsiye için H. Olivaresi ve D. Ruge teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma, bir NSF SBIR ödülü (BioSentinel Inc IIP-1127245) ve Savunma Bakanlığı sözleşme (BioSentinel Inc W81XWH-07-2-0045) tarafından kısmen desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A Metabiologics Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Fisher Scientific 15036

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
  2. Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
  3. Montal, M. Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu. Rev. Biochem. 79, 591-617 (2010).
  4. Lacy, D. B., Stevens, R. C. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins. J. Mol. Biol. 291, 1091-1104 (1999).
  5. Montecucco, C., Schiavo, G. Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins. Q. Rev. Biophys. 28, 423-472 (1995).
  6. Ahnert-Hilger, G., Munster-Wandowski, A., Holtje, M. Synaptic vesicle proteins: targets and routes for botulinum neurotoxins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 159-177 (2013).
  7. Yamasaki, S., et al. Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinal neurotoxins and tetanus toxin. J. Biol. Chem. 269, 12764-12772 (1994).
  8. Schiavo, G., et al. Identification of the nerve terminal targets of botulinum neurotoxin serotypes A, D, and E. J. Biol. Chem. 268, 23784-23787 (1993).
  9. Schiavo, G., et al. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature. 359, 832-835 (1992).
  10. Schiavo, G., et al. Botulinum G neurotoxin cleaves VAMP/synaptobrevin at a single Ala-Ala peptide bond. J. Biol. Chem. 269, 20213-20216 (1994).
  11. Rossetto, O., et al. SNARE motif and neurotoxins. Nature. 372, 415-416 (1994).
  12. Montecucco, C., Schiavo, G. Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Mol. Microbiol. 13, 1-8 (1994).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  14. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin C1 blocks neurotransmitter release by means of cleaving HPC-1/syntaxin. EMBO J. 12, 4821-4828 (1993).
  15. Cherington, M. Clinical spectrum of botulism. Muscle Nerve. 21, 701-710 (1998).
  16. Lindstrom, M., Korkeala, H. Laboratory diagnostics of botulism. Clin. Microbiol. Rev. 19, 298-314 (2006).
  17. Werner, S. B., Passaro, D., McGee, J., Schechter, R., Vugia, D. J. Wound botulism in California, 1951-1998: recent epidemic in heroin injectors. Clin. Infect. Dis. 31, 1018-1024 (2000).
  18. Passaro, D. J., Werner, S. B., McGee, J., MacKenzie, W. R., Vugia, D. J. Wound botulism associated with black tar heroin among injecting drug users. J. Am. Med. Assoc. 279, 859-863 (1998).
  19. Brook, I. Infant botulism. J. Perinatol. 27, 175-180 (2007).
  20. Arnon, S. S. Honey, infant botulism and the sudden infant death syndrome. West J. Med. 132, 58-59 (1980).
  21. Arnon, S. S. Infant botulism. Annu. Rev. Med. 31, 541-560 (1980).
  22. Peck, M. W., Stringer, S. C., Carter, A. T. Clostridium botulinum in the post-genomic era. Food Microbiol. 28, 183-191 (2011).
  23. Sharma, S. K., Whiting, R. C. Methods for detection of Clostridium botulinum toxin in foods. J. Food Prot. 68, 1256-1263 (2005).
  24. Sobel, J. Botulism. Clin. Infect. Dis. 41, 1167-1173 (2005).
  25. Chen, S. Clinical uses of botulinum neurotoxins: current indications, limitations and future developments. Toxins. 4, 913-939 (2012).
  26. Sinha, D., Karri, K., Arunkalaivanan, A. S. Applications of Botulinum toxin in urogynaecology. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 133, 4-11 (2007).
  27. Dmochowski, R., Sand, P. K. Botulinum toxin A in the overactive bladder: current status and future directions. BJU Int. 99, 247-262 (2007).
  28. Benecke, R., Dressler, D. Botulinum toxin treatment of axial and cervical dystonia. Disabil. Rehabil. 29, 1769-1777 (2007).
  29. Hunt, T., Clarke, K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin. Neuropharmacol. 32, 28-31 (2009).
  30. Marchetti, A., et al. Retrospective evaluation of the dose of Dysport and BOTOX in the management of cervical dystonia and blepharospasm the REAL DOSE study. Mov. Disord. 20, 937-944 (2005).
  31. Wohlfarth, K., Sycha, T., Ranoux, D., Naver, H., Caird, D. Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment. 25, 1573-1584 (2009).
  32. AOAC International, Clostridium botulinum and its toxins in foods (method 977.26 section 17.7.01). (2001).
  33. Schantz, E. J., Kautter, D. A. Microbiological methods: standardized assay for Clostridium botulinum toxins. J. AOAC. 61, 96-99 (1978).
  34. Ferreira, J. L. Comparison of amplified ELISA and mouse bioassay procedures for determination of botulinal toxins A, B, E, and F. J. AOAC. Int. 84, 85-88 (2001).
  35. Directive 2003/15/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Union. (2003).
  36. Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM Scientific Workshop on Alternative Methods to Refine, Reduce or Replace the Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing. Report No. 08-6416, NIH. (2008).
  37. Bitz, S. The botulinum neurotoxin LD50 test - problems and solutions. ALTEX. 27, 114-116 (2010).
  38. Balls, M. Replacing the animal testing of botulinum toxin: time to smooth out the wrinkles. Altern. Lab. Anim. 38, 1-2 (2010).
  39. Balls, M. Botulinum toxin testing in animals: the questions remain unanswered. Altern. Lab. Anim. 31, 611-615 (2003).
  40. Singh, A. K., Stanker, L. H., Sharma, S. K. Botulinum neurotoxin: where are we with detection technologies. Crit. Rev. Microbiol. 39, 43-56 (2013).
  41. Liu, Y. Y., Rigsby, P., Sesardic, D., Marks, J. D., Jones, R. G. A functional dual-coated (FDC) microtiter plate method to replace the botulinum toxin LD50 test. Anal. Biochem. 425, 28-35 (2012).
  42. Ouimet, T., Duquesnoy, S., Poras, H., Fournie-Zaluski, M. C., Roques, B. P. Comparison of Fluorigenic Peptide Substrates PL50, SNAPtide, and BoTest A/E for BoNT/A Detection and Quantification: Exosite Binding Confers High-Assay Sensitivity. J. Biomol. Screen. (2013).
  43. Scotcher, M. C., Cheng, L. W., Stanker, L. H. Detection of botulinum neurotoxin serotype B at sub mouse LD(50) levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk. PLoS One. 5, (2010).
  44. Mason, J. T., Xu, L., Sheng, Z. M., O'Leary, T. J. A liposome-PCR assay for the ultrasensitive detection of biological toxins. Nat. Biotechnol. 24, 555-557 (2006).
  45. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Anal. Biochem. 411, 200-209 (2011).
  46. Hines, H. B., et al. Use of a recombinant fluorescent substrate with cleavage sites for all botulinum neurotoxins in high-throughput screening of natural product extracts for inhibitors of serotypes A, B, and E. Appl. Environ. Microbiol. 74, 653-659 (2008).
  47. Gilmore, M. A., et al. Depolarization after resonance energy transfer (DARET): a sensitive fluorescence-based assay for botulinum neurotoxin protease activity. Anal. Biochem. 413, 36-42 (2011).
  48. Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
  49. Bagramyan, K., Barash, J. R., Arnon, S. S., Kalkum, M. Attomolar detection of botulinum toxin type A in complex biological matrices. PLoS One. 3, (2008).
  50. Wang, D., Baudys, J., Kalb, S. R., Barr, J. R. Improved detection of botulinum neurotoxin type A in stool by mass spectrometry. Anal. Biochem. 412, 67-73 (2011).
  51. Parks, B. A., et al. Quantification of botulinum neurotoxin serotypes A and B from serum using mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 9047-9053 (2011).
  52. Kalb, S. R., Goodnough, M. C., Malizio, C. J., Pirkle, J. L., Barr, J. R. Detection of botulinum neurotoxin A in a spiked milk sample with subtype identification through toxin proteomics. Anal. Chem. 77, 6140-6146 (2005).
  53. Kalb, S. R., et al. The use of Endopep-MS for the detection of botulinum toxins A, B, E, and F in serum and stool samples. Anal. Biochem. 351, 84-92 (2006).
  54. Boyer, A. E., et al. From the mouse to the mass spectrometer: detection and differentiation of the endoproteinase activities of botulinum neurotoxins A-G by mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 3916-3924 (2005).
  55. Barr, J. R., et al. Botulinum neurotoxin detection and differentiation by mass spectrometry. Emerg. Infect. Dis. 11, 1578-1583 (2005).
  56. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7687-7697 (2012).
  57. Jones, R. G., Ochiai, M., Liu, Y., Ekong, T., Sesardic, D. Development of improved SNAP25 endopeptidase immuno-assays for botulinum type A and E toxins. J. Immunol. Methods. 329, 92-101 (2008).
  58. Ekong, T. A., Feavers, I. M., Sesardic, D. Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology. 143 (pt 10), 3337-3347 (1997).
  59. Shone, C. C., Roberts, A. K. Peptide substrate specificity and properties of the zinc-endopeptidase activity of botulinum type B neurotoxin. Eur. J. Biochem. 225, 263-270 (1994).
  60. Piazza, T. M., et al. In vitro detection and quantification of botulinum neurotoxin type e activity in avian blood. Appl. Environ. Microbiol. 77, 7815-7822 (2011).
  61. Mizanur, R. M., Gorbet, J., Swaminathan, S., Ahmed, S. A. Inhibition of catalytic activities of botulinum neurotoxin light chains of serotypes A, B and E by acetate, sulfate and calcium. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 3, 313-321 (2012).
  62. Sugii, S., Sakaguchi, G. Molecular construction of Clostridium botulinum type A toxins. Infect. Immun. 12, 1262-1270 (1975).
  63. Sharma, S. K., Ramzan, M. A., Singh, B. R. Separation of the components of type A botulinum neurotoxin complex by electrophoresis. Toxicon. 41, 321-331 (2003).
  64. Bryant, A. M., Davis, J., Cai, S., Singh, B. R. Molecular composition and extinction coefficient of native botulinum neurotoxin complex produced by Clostridium botulinum hall A strain. Protein. J. 32, 106-117 (2013).
  65. Kukreja, R. V., Singh, B. R. Comparative role of neurotoxin-associated proteins in the structural stability and endopeptidase activity of botulinum neurotoxin complex types A and E. 46, 14316-14324 (2007).
  66. Eisele, K. H., Fink, K., Vey, M., Taylor, H. V. Studies on the dissociation of botulinum neurotoxin type A complexes. Toxicon. 57, 555-565 (2011).
BoTest Matrix Tahliller kullanma Kompleksi Matris itibaren İzolasyon ve Botulinum nörotoksin Kantitasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).More

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter