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Medicine

मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग मस्तिष्कमेरु द्रव MicroRNA रूपरेखा

doi: 10.3791/51172 Published: January 22, 2014

Summary

हम मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) में microRNAs प्रोफ़ाइल करने के लिए वास्तविक समय पीसीआर के एक प्रोटोकॉल का वर्णन. शाही सेना निकासी प्रोटोकॉल के अपवाद के साथ, प्रक्रिया शरीर के अन्य तरल पदार्थ, सभ्य कोशिकाओं, या ऊतक नमूनों से निकाले शाही सेना के लिए बढ़ाया जा सकता है.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) उनकी translational दमन modulating द्वारा, फलस्वरूप, mRNAs पर स्थित साइटों को लक्षित करने के लिए और RISC मार्गदर्शक द्वारा जीन विनियमन का एक शक्तिशाली परत का गठन. MiRNA अभिव्यक्ति में परिवर्तन सभी प्रमुख जटिल रोगों के विकास में शामिल होना दिखाया गया है. इसके अलावा, हाल के निष्कर्षों miRNAs बाह्य वातावरण को स्रावित और वे उच्च स्थिरता के साथ प्रसारित कर सकते हैं जहां खून और शरीर के अन्य तरल पदार्थ में प्रवेश किया जा सकता है कि पता चला है. ऐसे परिसंचारी miRNAs के समारोह काफी हद तक मायावी बनी हुई है, लेकिन इस तरह के miRNA रूपरेखा सरणियों के रूप में व्यवस्थित उच्च throughput दृष्टिकोण, neurodegenerative विकारों और कैंसर के कई प्रकार के सहित कई रोग की स्थिति, में miRNA हस्ताक्षर की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है. इस संदर्भ में, मस्तिष्कमेरु द्रव में miRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल की पहचान, हमारी ताजा अध्ययन रिपोर्ट में, biomarker विश्लेषण के लिए miRNAs आकर्षक उम्मीदवार बनाता है.

_content "> इस तरह के प्रोटीन के रूप में microRNAs, रूपरेखा के लिए उपलब्ध कई उपकरण हैं, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR), और गहरी अनुक्रमण. यहाँ, हम मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा मस्तिष्कमेरु तरल पदार्थ में microRNAs प्रोफ़ाइल के लिए एक संवेदनशील विधि का वर्णन. हम Exiqon microRNA तैयार करने का उपयोग पीसीआर मानव पैनलों का इस्तेमाल किया मैं और अनुमति देता है जो द्वितीय V2.R, 742 अद्वितीय मानव microRNAs का पता लगाने. हम तीन प्रतियों रन में सरणियों प्रदर्शन किया और हम Genex व्यवसायी 5 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा संसाधित और विश्लेषण किया.

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं, सीएसएफ, प्लाज्मा, और formalin-तय आयल एम्बेडेड ऊतकों के विभिन्न प्रकारों में microRNAs profiled है.

Introduction

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MicroRNAs बाद transcriptionally जीन अभिव्यक्ति को विनियमित RNAs कि noncoding (लंबाई में NT 21-23) छोटे से परिवार से हूँ. microRNAs वे अपेक्षाकृत स्थिर होना दिखाई देते हैं, जहां बाह्य अंतरिक्ष में स्रावित किया जा सकता है. MiRNA अभिव्यक्ति में परिवर्तन का निर्धारण miRNA प्रोफाइल के प्रदर्शन और डेटा की एक बड़ी राशि को संभालने, बायोमार्कर की पहचान की ओर एक महत्वपूर्ण कदम हो सकता है डराना किया जा सकता है.

यहाँ, हम एक संवेदनशील वास्तविक समय पीसीआर द्वारा (अन्य तरल पदार्थ शरीर के लिए लागू) मस्तिष्कमेरु द्रव में miRNA अभिव्यक्ति में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. हम भी सांख्यिकीय विश्लेषण और परिणामों की चित्रमय प्रतिनिधित्व सहित, डेटा विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर के उपयोग का वर्णन. पूरी प्रक्रिया अपेक्षाकृत आसान और सरल है और profiled, और वास्तविक समय पीसीआर मशीनों की संख्या उपलब्ध भी अपेक्षाकृत जल्दी करने के नमूनों की संख्या पर निर्भर करता है. प्रयोगात्मक भाग से निपटने में सटीकता की आवश्यकता384 अच्छी तरह से प्लेटों में शाही सेना और pipetting, genex का उपयोग कर डेटा विश्लेषण अनुभाग सूचना विज्ञान और सांख्यिकी में कुछ बुनियादी ज्ञान की आवश्यकता है.

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Protocol

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निम्नलिखित प्रोटोकॉल तैयार पीसीआर प्लेट का उपयोग सीएसएफ और प्रोफाइल microRNAs से शाही सेना को अलग करने के लिए मानक प्रक्रिया का वर्णन है. जैविक चरण निष्कर्षण वैकल्पिक है, और एक वाहक शाही सेना शाही सेना के अधिक से अधिक वसूली सुनिश्चित करने के निष्कर्षण के दौरान नमूने के लिए जोड़ा गया है जो कि नोट. नतीजतन, शाही सेना यों की कोई जरूरत नहीं है.

सीडीएनए (लगभग 2 घंटे) पहले दिन संश्लेषित है अगर कुल मिलाकर, 6-8 प्लेटों के एक औसत एक दिन में चलाया जा सकता है. सभी नमूनों profiled और सॉफ्टवेयर में लोड किया गया है जब डेटा का विश्लेषण किया जाता है. तुलना के लिए नमूने / समूह या उनके संयोजन की संख्या पर निर्भर करता है, डेटा विश्लेषण एक से कई घंटे की आवश्यकता हो सकती.

1. शाही सेना निष्कर्षण

शाही सेना निकासी, सीएसएफ के नमूनों से प्रदर्शन किया गया था संग्रहीत विश्लेषण जब तक aliquots में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है. इस प्रक्रिया के लिए mirVana पेरिस अलगाव किट निर्माता के वाद्य निम्नलिखित, इस्तेमाल किया गया थाकुल शाही सेना अलगाव के लिए ctions. छोटे आरएनए प्रजातियों के लिए संवर्धन इस किट के साथ संभव है, हालांकि, इस कदम से नहीं किया है और शाही सेना निकासी प्रक्रिया कुल शाही सेना अलगाव कदम के बाद समाप्त हो गया है, कृपया ध्यान दें. (अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए अलगाव किट की तरह) mirVana पेरिस अलगाव किट जैविक निकासी की आवश्यकता नहीं है, हालांकि इसके अलावा, इस प्रक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल के नीचे पाया जा सकता है.
शाही सेना निकासी के लिए प्रोटोकॉल के दो चरण होते हैं:
1.1. कार्बनिक निष्कर्षण (mirVana पेरिस शाही सेना निकासी किट का उपयोग कर यदि आवश्यक नहीं है)
1.2.2. कुल शाही सेना अलगाव

1.1. कार्बनिक निकासी

1.1.1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. समाधान denaturing 2x 2-mercaptoethanol के 375 μl जोड़ें, और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

1.1.2. सीएसएफ की तैयारी

  1. शाही सेना निकासी से पहले बर्फ पर सीएसएफ के हर विभाज्य पिघलना. धीरे 0.5 thawed सीएसएफ के मिलीग्राम और को MS2 शाही सेना वाहक की 1 ग्राम जोड़ेंमिश्रण. जैविक निष्कर्षण छोड़ा जाता है, MS2 वाहक नीचे 1.2.2.1 में वर्णित नमूना पूर्व शाही सेना अलगाव में जोड़ दिया जाएगा ध्यान दें.
  2. सीएसएफ के लिए कमरे के तापमान पर 2x denaturing समाधान के 0.5 मिलीलीटर मिलाएं.
  3. सीएसएफ प्लस 2x denaturing समाधान के लिए क्लोरोफॉर्म: एसिड phenol के 1 मिलीलीटर जोड़ें क्लोरोफॉर्म, नहीं मिश्रण की चोटी पर स्थित है कि जलीय बफर: एसिड फिनोल युक्त नीचे चरण वापस ले लिया करने के लिए सुनिश्चित करें. क्लोरोफॉर्म इस अभिकर्मक के साथ कार्य करते समय एक जहर और एक अड़चन, उपयोग के दस्ताने और अन्य व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण है जो फिनोल, शामिल: इसके अतिरिक्त, एसिड फिनोल कि ध्यान दें.
  4. 30-60 सेकंड मिश्रण करने के लिए भंवर. सुविधा के लिए, नमूना के 2 मिलीग्राम / समाधान / एसिड फिनोल denaturing: क्लोरोफॉर्म मिश्रण दो 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों में विभाजित हैं.
  5. कमरे के तापमान पर अधिकतम गति पर 5 मिनट (10,000 XG) के लिए अपकेंद्रित्र.
  6. ध्यान से कम चरण या अंतरावस्था परेशान बिना जलीय (ऊपरी) चरण को हटाने और एक के लिए स्थानांतरणताजा ट्यूब. बरामद मात्रा ध्यान दें.

1.2. शाही सेना अलगाव

यह एक समर्पित pipettes के सेट बेंच,, और शाही सेना के नमूने से निपटने के लिए रैक की सिफारिश की है. कार्य क्षेत्र और उपकरण RNase जैप स्प्रे का उपयोग करके decontaminated और पिछले एक प्रयोग पोंछे रहे हैं.

1.2.1. अभिकर्मकों तैयार:

  1. MiRNA धो समाधान 1 के लिए 100% इथेनॉल के 21 मिलीलीटर जोड़ें और धो समाधान 2/3 के लिए 40 एमएल 100% इथेनॉल. MiRNA धो समाधान 1 एक संभावित खतरनाक पदार्थ है कि guanidium thiocyanate होता है कि कृपया ध्यान दें.

1.2.2. कुल शाही सेना अलगाव

  1. जैविक निकासी से जलीय चरण के लिए कमरे के तापमान 100% इथेनॉल 1.25 मात्रा में जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
  2. संग्रह ट्यूबों में से एक में एक फिल्टर कारतूस रखें.
  3. फिल्टर कारतूस पर lysate / इथेनॉल मिश्रण के पिपेट नहीं 700 से अधिक μl.
  4. अधिकतम पर 30 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्रगति. एक ही फिल्टर करने के लिए लगातार आवेदन पत्र में 700 μl से अधिक मिश्रण लागू करें. हर Centrifugation के बाद प्रवाह के माध्यम से त्यागें और धोने कदम के लिए संग्रह ट्यूब बचा.
  5. अधिकतम गति पर 15 सेकंड के लिए फिल्टर कारतूस और अपकेंद्रित्र के लिए 700 μl miRNA धो समाधान 1 लागू करें. संग्रह ट्यूब से प्रवाह के माध्यम से त्यागें और एक ही संग्रह ट्यूब में फिल्टर कारतूस की जगह.
  6. अधिकतम गति पर 15 सेकंड के लिए 500 μl धो समाधान 2/3 और अपकेंद्रित्र लागू करें. संग्रह ट्यूब से प्रवाह के माध्यम से त्यागें और एक ही संग्रह ट्यूब में फिल्टर कारतूस की जगह. अधिकतम गति पर 15 सेकंड के लिए एक दूसरे 500 μl धो समाधान 2/3 और अपकेंद्रित्र लागू करें. संग्रह ट्यूब से प्रवाह के माध्यम से त्यागें और एक ही संग्रह ट्यूब में फिल्टर कारतूस की जगह. फिल्टर से अवशिष्ट तरल पदार्थ को निकालने के लिए अधिकतम गति से 1 मिनट के लिए विधानसभा स्पिन.
  7. एक ताजा संग्रह ट्यूब में फिल्टर कारतूस स्थानांतरण. लागू 100 और म्यू; फिल्टर के केंद्र के लिए preheated (95 डिग्री सेल्सियस) nuclease मुक्त पानी के एल, और टोपी बंद करें. शाही सेना की वसूली के लिए अधिकतम गति पर 30 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र.
  8. Eluate युक्त शाही सेना लीजिए और इसे बाद में आवेदन पत्र के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  9. NanoDrop 2000C स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग शाही सेना के 1 μl यों. एक शाही सेना वाहक शाही सेना निकासी के दौरान नमूने के लिए जोड़ा जाता है, तो शाही सेना मात्रा का ठहराव छोड़ी जा सकती हैं कि ध्यान दें. नीचे दिए गए विवरण के अनुसार उस मामले में शाही सेना के 8 μl सीडीएनए संश्लेषण के अधीन हैं.

2. miRNA प्रोफाइल: QRT-पीसीआर प्रोटोकॉल

miRNA रूपरेखा के लिए प्रोटोकॉल के दो चरण होते हैं:

  1. सबसे पहले कतरा सीडीएनए संश्लेषण
  2. वास्तविक समय पीसीआर प्रवर्धन

2.1. सबसे पहले कतरा सीडीएनए संश्लेषण

2.1.1. टेम्पलेट शाही सेना पतला

  1. 5 एनजी / nuclease मुफ्त पानी का उपयोग μl के एक एकाग्रता के लिए टेम्पलेट शाही सेना के नमूने में से प्रत्येक को समायोजित करें. अगरशाही सेना (कदम 1.2.2.9 देखें) की मात्रा निर्धारित नहीं किया गया है, तो शाही सेना के 8 μl सीडीएनए संश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है

2.1.2. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. धीरे 5x प्रतिक्रिया बफर पिघलना और मुफ्त पानी nuclease, और तुरंत बर्फ पर जगह है.
  2. Vortexing द्वारा मिलाएं. Resuspend आरएनए कील में ट्यूब के लिए 40 μl nuclease मुफ्त पानी जोड़ने और vortexing द्वारा मिश्रण द्वारा, 15-20 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें. तुरंत उपयोग से पहले, फ्रीजर से एंजाइम मिश्रण को दूर ट्यूबों flicking द्वारा मिश्रण और बर्फ पर जगह है. सभी अभिकर्मकों स्पिन.

2.1.3. रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया सेटअप

  1. एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब, या समकक्ष में आर टी काम कर समाधान के लिए आवश्यक राशि को तैयार (अनुपात में शाही सेना टेम्पलेट के लिए छोड़कर, 1 टेबल में संकेत दिया), (अधिकतम गति पर 1-2 सेकंड) vortexing द्वारा मिश्रण, संक्षेप में (नीचे स्पिन हम निश्चित गति, 10 सेकंड) के साथ एक छोटा Eppendorf अपकेंद्रित्र का उपयोग करें और बर्फ पर जगह है. ध्यान दें कि UniSp6 आरएनए कीलमें (1 टेबल देखें) आरटी प्रतिक्रिया से पहले नमूने के लिए जोड़ा गया है.
  2. Nuclease मुफ्त पीसीआर ट्यूबों में आर टी काम कर समाधान बांटना.
  3. प्रत्येक ट्यूब में टेम्पलेट शाही सेना बांटना.
    नोट: 10% अतिरिक्त मात्रा / pipetting और / या रोबोट मृत मात्रा के लिए प्रत्येक अभिकर्मक की गणना करने के लिए याद है.
    अभिकर्मक पैनल मैं मात्रा (μl) पैनल मैं + द्वितीय खंड (μl)
    5x प्रतिक्रिया बफर 4.4 8.8
    Nuclease मुफ्त पानी 9.9 19.8
    एनजाइम मिश्रण 2.2 4.4
    UniSp6 आरएनए कील में टेम्पलेट 1.1 2.2
    खाका कुल शाही सेना (5 एनजी / μl) 4.4 8.8 कुल मात्रा 22 44

    तालिका 1. प्रतिलेखन प्रतिक्रिया सेटअप उल्टा.

2.1.4. मिक्स और अभिकर्मकों स्पिन

  1. सभी अभिकर्मकों अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए कोमल (1-2 सेकंड) vortexing द्वारा प्रतिक्रिया मिश्रण. मिश्रण के बाद, (नियत गति, 10 सेकंड के साथ मिनी Eppendorf अपकेंद्रित्र) नीचे स्पिन.

2.1.5. सेते हैं और गर्मी निष्क्रिय

  1. पालन ​​के रूप में एक पीसीआर मशीन कार्यक्रम:
  2. 42 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सेते
  3. 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस हीट निष्क्रिय
  4. 4 डिग्री सेल्सियस तक तुरंत शांत
  5. 4 डिग्री सेल्सियस या फ्रीज में स्टोर
    नोट: प्रोटोकॉल इस स्तर पर बाधित किया जा सकता है. undiluted सीडीएनए अप करने के लिए 5 हफ्तों (अप करने के लिए 4 दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर वैकल्पिक स्टोर) के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है.

2.2.1. वास्तविक समय पीसीआर के लिए अभिकर्मकों तैयार करें

  1. बर्फ पर (कदम 2.1.5 से) सीडीएनए रखें.
  2. बर्फ पर पिघलना nuclease मुफ्त पानी और पीसीआर मास्टर मिश्रण. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ उन्हें कवर द्वारा प्रकाश से पीसीआर मास्टर मिक्स शीशियों को सुरक्षित रखें. तुरंत उपयोग करने से पहले, एक छोटा अपकेंद्रित्र में 1-2 सेकंड vortexing द्वारा पीसीआर मास्टर मिश्रण मिश्रण और 1 मिनट के लिए 1500 XG पर नीचे स्पिन.

2.2.2. SYBR ग्रीन मास्टर मिश्रण, पानी, और सीडीएनए का मिश्रण है और पीसीआर प्लेटों को जोड़ने

निम्नलिखित प्रक्रिया ट्यूब सतह का पालन से सीडीएनए की कम मात्रा से बचने के लिए सिफारिश की है:

  1. थाली सील हटाने से पहले, संक्षेप में 1 मिनट के लिए 1500 XG पर एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में थाली (ओं) नीचे स्पिन.
  2. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, 2x पीसीआर मास्टर मिश्रण और पानी का मिश्रण. पैनल मैं: 2,000 μl 2x मास्टर मिश्रण और 1,980 μl पानी, पैनल मैं + द्वितीय: 4,000 μl 2x मास्टर मिश्रण और 3,960 μ, एल पानी.
  3. 20 μl सीडीएनए (पैनल मैं) या 40 μl सीडीएनए (मैं द्वितीय + पैनल) और मिश्रण जोड़ें.
  4. 1-2 सेकंड vortexing द्वारा धीरे मिलाएं और 1 मिनट के लिए 1500 XG पर एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में नीचे स्पिन.
  5. एक multichannel विंदुक जलाशय में पीसीआर मास्टर मिक्स / सीडीएनए मिश्रण रखें. आप multichannel विंदुक की लंबाई है कि एक जलाशय की पहचान करना पड़ सकता है. इस मल्टीचैनल भर में बराबर मात्रा aliquots के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त उच्च मात्रा का स्तर रहता है. यह पिछले कुछ aliquots की दिशा में महत्वपूर्ण है.
  6. 10 μl पीसीआर मास्टर मिश्रण बांटना / सीडीएनए एक 16 चैनल पिपेट का उपयोग 384 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से मिलाएं.
  7. ऑप्टिकल सील के साथ थाली सील.
  8. समाधान मिश्रण और हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए, एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र (1 मिनट के लिए 1500 XG) में संक्षेप में थाली स्पिन.

    नोट: प्रयोग में इस बिंदु पर रोक दिया जा सकता. अप करने के लिए 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से सुरक्षित प्रतिक्रियाओं स्टोर.

2.2.3. रियल टाइम पीसीआर

तालिका 2 में विस्तृत निम्नलिखित मानकों के वास्तविक समय पीसीआर प्रवर्धन और पिघलने वक्र विश्लेषण करते हैं.

प्रक्रिया कदम सेटिंग्स, रॉश LC480
पोलीमरेज़ सक्रियण / विकृतीकरण 95 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट
प्रवर्धन 45 प्रवर्धन चक्र में
95 डिग्री सेल्सियस, 10 सेकंड
60 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट
रैंप दर
1.6 डिग्री सेल्सियस / सेक
ऑप्टिकल पढ़ें
पिघलती वक्र विश्लेषण हां

तालिका 2. रॉश LightCycler 480 का उपयोग वास्तविक समय पीसीआर चक्र की स्थिति.

2.3. वास्तविक समय पीसीआर डेटा विश्लेषण

वास्तविक समय पीसीआर डेटा विश्लेषण, Exiqon Genex व्यावसायिक 5.0 के साथ किया जाता है निम्नलिखित टीउन्होंने निर्देश सिफारिश की. Genex कदम दर कदम मार्गदर्शन में डाउनलोड किया जा सकता http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
डेटा विश्लेषण तीन चरण होते हैं:

  1. डेटा का आयात
  2. डेटा की preprocessing
  3. सांख्यिकीय विश्लेषण

2.3.1. डेटा का आयात

  1. रॉश LightCycler 480 में 2 एन डी व्युत्पन्न विश्लेषण विधि का चयन करें और CQ मूल्यों की गणना. डेटा एक तालिका के रूप में निर्यात और पाठ फ़ाइलों के रूप में सहेज कर रहे हैं.
  2. डेटा, खुला Genex आयात और Exiqon आयात विज़ार्ड बटन पर क्लिक करें और "प्रारंभ" पर क्लिक करें. प्रारूप, साधन और प्लेट लेआउट फ़ाइल (ओं) का चयन करने के लिए निर्देशों का पालन करें. उस प्लेट लेआउट फ़ाइलें (फाइल एक्सेल) Exiqon वेब साइट (से डाउनलोड कर रहे हैं नोट http://www.exiqon.com/plate-layout-files ).
  3. महत्वटी पैनलों मैं और द्वितीय और "अगली" पर क्लिक करें.
  4. फ़ाइल आयात के बाद उत्पन्न तालिका पूर्वनिर्धारित स्तंभ हैं. नमूने के नाम से संपादित किया जा सकता है और वर्गीकरण कॉलम जोड़ा या इस कदम पर हटाया जा सकता है. जब आप कर रहे "अगली" पर क्लिक करें.
  5. डेटा को बचाने और डाटा संपादक को लोड.

2.3.2. डेटा की preprocessing

  1. Exiqon और Genex की सिफारिश के अनुसार कई प्लेटें तुलना करते समय, पहली बात करने preprocessing मेनू से अंतर - प्लेट अंशांकन चुनकर प्लेटों के बीच डेटा को ठीक करना है.
  2. यह तीन प्रतियों रन में miRNA सरणियों चलाने की सिफारिश की है. एक miRNA तीन प्रतिकृतियां के बाहर कम से कम दो में मौजूद नहीं है यह nonexpressed के रूप में स्थापित किया जाएगा.
  3. Preprocessing में अगले चरण में, एक कट बंद सेट. एक काट मूल्य को परिभाषित सीमा चक्र (सी टी) इस मूल्य से अधिक के साथ डेटा खारिज कर रहे हैं कि इंगित करता है. मस्तिष्कमेरु द्रव नमूना का उपयोग वर्तमान प्रयोगों में, कट ऑफ 39 में स्थापित किया गया था. वहाँefore, तीन प्रतिकृतियां में 39 की तुलना में एक सी टी उच्चतर के साथ सभी नमूनों खारिज कर दिया जाएगा. एक miRNA एक जांच (तीन के बाहर एक प्रतिकृति) के लिए> 39 एक सी टी है, तो उस पढ़ने, अन्य दो जांच के लिए सी टी के औसत के साथ बदल दिया कि वे 39 से नीचे दोनों कर रहे हैं प्रदान की जाएगी.
  4. संदर्भ जीन परिभाषित करें. Genex पेशेवर संदर्भ जीन की पहचान करने के लिए geNorm और / या NormFinder का उपयोग करने का विकल्प है. सभी नमूना भर में समान सीक्यू मूल्यों और geNorm और / या NormFinder चलने वाले miRNAs की एक सूची का चयन करें. इस विश्लेषण के अनुसार, यहां दिए गए उदाहरण में, मीर 622 और मीर-1266 नमूने भर में सबसे वर्दी मूल्यों की थी और चित्रा (1) संदर्भ जीन के रूप में चुना गया.
  5. अगला, डेटा संदर्भ जीन का उपयोग सामान्यीकृत और प्राप्त मूल्यों ΔC टी के अनुरूप रहे हैं
  6. सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रियाओं triplicates में प्रदर्शन किया गया है, इस बिंदु पर मूल्यों का औसत जाना चाहिए.
  7. पुन: करने की चादर मान्यखाली और लगभग खाली कॉलम चाल है. Preprocessing विंडो में चयन "चादर मान्य" और निकालें खाली कॉलम लाइन पर लागू की तुलना में. नीचे लाइन में, वैध डेटा के वांछित प्रतिशत का फैसला किया और लागू करें. आप सभी नमूनों के लिए आम ही miRNAs की तुलना करना चाहते हैं तो उदाहरण के लिए, 100% का चयन करें.
  8. लापता डेटा को संभाल.
    Preprocessing मेनू से "लापता डेटा" का चयन करें और लापता डेटा को संभालने के लिए विकल्पों में से एक को चुना. यह कदम जरूरी है. आप मैनेज्ड लापता डेटा होते हैं लोड करने की कोशिश अगर genex आप त्रुटि दे देंगे.
  9. नमूने (नियंत्रण बनाम यानी. प्रयोग) के समूहों के बीच रिश्तेदार मात्रा का ठहराव निर्धारित करते हैं. समूहों के बीच सापेक्ष मात्रा का ठहराव ΔΔ सी टी पद्धति का उपयोग करके गणना की है. Genex में, preprocessing टैब पर क्लिक करें और रिश्तेदार मात्रा का ठहराव का चयन करें. खिड़की में संदर्भ समूह का चयन करें और लागू मारा. Expr, ग्राफिकल निरूपण के लिए और / या आगे सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए ध्यान दें किession डेटा एक लघुगणक स्केल करने के लिए परिवर्तित किया जाना चाहिए. Preprocessing मेनू में, log2 का चयन करें.

2.3.3. सांख्यिकीय विश्लेषण

Genex सॉफ्टवेयर टी परीक्षण और एनोवा सहित सांख्यिकीय विश्लेषण, की एक विस्तृत श्रृंखला की अनुमति देता है.

  1. Genex और खुले डेटा प्रबंधक में अंतिम MDF फ़ाइल लोड. यह सांख्यिकीय विश्लेषण किया जाता है जिसके लिए नमूने के सही नमूने या समूहों का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  2. "सांख्यिकी" का चयन करें और इच्छित परीक्षण के लिए इसी आइकन चुना है.
  3. नियंत्रण कक्ष की खिड़की में "भागो" पर क्लिक करें. एक्सेल या MDF फ़ाइलों के रूप में परिणामों को बचाने के.

2.3.4. अभिव्यक्ति की रूपरेखा

इस प्रकार के रूप microRNAs और नमूने,, वर्गीकृत क्लस्टर, और गर्मी नक्शे और dendrograms पर देखे जा सकते हैं

  1. Genex और खुले डेटा प्रबंधक में अंतिम MDF फ़ाइल लोड. नमूने या miRNAs के समूहों का चयन करें और बनाने के लिए इस विंडो का उपयोग करें. जब आप कर रहे "लागू करें" पर क्लिक करें.
  2. <ऊपरी बाएँ कोने का चयन क्लस्टर में ली> और हीटमैप आइकन पर क्लिक करें
  3. नियंत्रण कक्ष विंडो में "भागो" पर क्लिक करें. हीटमैप ऐसी झगड़ा या बीएमपी के रूप में विभिन्न स्वरूपों में सहेजा जा सकता है, यह भी नकल की है और जरूरत के रूप में संशोधित किया जा सकता है.

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Representative Results

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इस अध्ययन के परिणाम से पहले 1 प्रकाशित किया गया है. GeNorm आवेदन का उपयोग उम्मीदवार संदर्भ microRNAs के विश्लेषण से 1 शो परिणाम चित्रा. तदनुसार, दो microRNAs, मीर 622 और मीर-1266, संदर्भ जीन के रूप में पहचान की गई और miRNA मूल्यों को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया.

सीएसएफ अध्ययन के लिए हम नमूने के तीन समूहों था: एचआईवी (एन = 10), छत्ता इन्सेफेलाइटिस के बिना (n = 4), और एचआईवी + (एचआईवी +, एन = 5). दो समूहों, छत्ता और एचआईवी +, नियंत्रण एचआईवी समूह के साथ तुलना की गई. सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद (धारा 2.3.3) ग्यारह microRNAs की अभिव्यक्ति के स्तर 1 सांख्यिकीय महत्वपूर्ण. 2 इस ग्यारह microRNAs के एक बॉक्स साजिश का प्रतिनिधित्व करता चित्रा पाया गया था, मीर-1203,-1224-3P, -182 *-19b-2 *, -204,-362-5p, -484, -720, -744 *, -934, और -937. प्रत्येक स्तंभ खिलाडि़यों के बिना एचआईवी + के लिए समूह (हाइव के लिए हरे और लाल रंग के भीतर नमूनों में डेटा के वितरण से पता चलता हैphalitis). मूंछ मंझला, 1 सेंट (Q1) और 3 (Q3) चतुर्थक, और अधिकतम और न्यूनतम nonoutliers संकेत मिलता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Genex भीतर geNorm आवेदन से परिणाम दिखा ग्राफिक बार. दस microRNAs संभव संदर्भ जीन और परिणाम के रूप में विश्लेषण किया गया सबसे stably व्यक्त miRNAs के रूप में मीर 622 और मीर 1266 (लाल बार) से संकेत मिलता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. डेटा एफ का वितरण दिखा बॉक्स साजिशया इन्सेफेलाइटिस (लाल एचआईवी +,) के बिना छत्ता (हरा) और एचआईवी + के समूहों के भीतर ग्यारह miRNAs की प्रत्येक. प्रत्येक स्तंभ में मूंछ मंझला, 1 सेंट (बॉक्स के Q1, नीचे) और 3 (Q3, ऊपर से संकेत मिलता है बॉक्स की) quartiles, nonoutliers (काली लाइनें) कर रहे हैं कि अधिकतम और न्यूनतम मूल्यों. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

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MicroRNAs अनुवाद बाधा और / या mRNA गिरावट 2 बढ़ावा देने के द्वारा जीन अभिव्यक्ति को विनियमित कि छोटे noncoding RNAs हैं. कारण सेल मुक्त परिस्थितियों में अपने उच्च स्थिरता के लिए, microRNAs कई शरीर के तरल पदार्थ में पाया गया है. इसके अलावा, microRNAs की विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रोफाइल मानव कैंसर 3-9 की एक किस्म में मंच और / या प्रगति के साथ जोड़ा गया है.

शास्त्रीय चिप सरणियों या नवीनतम गहरी अनुक्रमण प्रौद्योगिकी सहित microRNAs प्रोफ़ाइल उपलब्ध कई उपकरण मौजूद हैं. हालांकि, हम RNAs के कम से कम राशि की आवश्यकता के अतिरिक्त लाभ है जो एक बेहद संवेदनशील qPCR मंच 10, 11, का उपयोग करने का विकल्प चुना. miRCURY LNA यूनिवर्सल आरटी microRNA पीसीआर प्रोटोकॉल 40 पूर्ण दो पैनल सरणी के लिए एनजी, 20 μl सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया प्रति कुल शाही सेना एनजी 20 उपयोग करने के लिए अनुकूलित है. Valuabl के साथ काम कर जब शाही सेना की छोटी राशि का उपयोग करने का विकल्प होने अत्यधिक महत्वपूर्ण है ई और ऐसे सीएसएफ या formalin-तय आयल एम्बेडेड ऊतकों 1 के रूप में कड़ी मेहनत से प्राप्त नैदानिक ​​नमूनों. महत्वपूर्ण बात है, शाही सेना के कम मात्रा में उपयोग के नमूने में मौजूद संभव inhibitors की एकाग्रता कम से कम. कील में लिए श्रृंखला सीटी मूल्यों से बाहर होने की संभावना नमूने में कुछ inhibitors की उपस्थिति का संकेत होगा. कील में जांच पूर्व miRNA रूपरेखा को inhibitors की उपस्थिति के लिए नमूने का परीक्षण करने के लिए अलग से खरीदा जा सकता है. इस परीक्षण के लिए, एक वास्तविक समय पीसीआर (चाहे एनजी या μl) शाही सेना की बढ़ती सांद्रता का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं.

वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम पूर्व शाही सेना अलगाव को जैविक चरण निकासी की रिपोर्ट. यह कई नई शाही सेना निकासी किट इस प्रक्रिया की आवश्यकता नहीं है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, हम सफलतापूर्वक फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के बिना सीधे प्लाज्मा (नहीं दिखाया डेटा) के 200 μl से शाही सेना निकासी के लिए miRCURY आरएनए अलगाव किट biofluids का उपयोग प्लाज्मा miRNAs profiled है.

सामान्य में _content ">, यह सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रतिकृति की उचित संख्या निर्धारित करने के लिए अग्रिम में प्रयोग की रूपरेखा तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है. replicates की संख्या विश्लेषण किया जा नमूनों की संख्या पर निर्भर हो सकता है और पर निर्भर हो सकता है नमूने या नमूनों के समूह के भीतर विविधताओं. हम नमूने, कुल 20 की एक अपेक्षाकृत कम संख्या का इस्तेमाल किया जिसके लिए हमारा अध्ययन के लिए, हम triplicates में सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया की स्थापना करने का निर्णय लिया. प्रयोगों की स्थापना से पहले एक biostatistician के साथ परामर्श कर सकते हैं एक बुद्धिमान विकल्प हो सकता है और अत्यधिक की सिफारिश की है.

सी टी परिभाषित काट मूल्य महत्वपूर्ण है और नमूने के प्रकार पर निर्भर करता है, अत्यधिक व्यक्त miRNAs के लिए यह 25-35 के बीच स्थापित किया जा सकता है, लेकिन इस तरह हमारे सीएसएफ नमूनों के रूप में कम व्यक्त miRNAs, के लिए, उच्च सेट किया जा सकता है. यह डेटा विश्लेषण करने के लिए आता है, जब एक और महत्वपूर्ण कदम संदर्भ जीन (एस) का स्थान है. एजी (जैसे miRNA संवर्धित कोशिकाओं में रूपरेखा के रूप में) कुछ मजबूत डेटा के लिएसभी नमूनों की औसत सी टी का प्रतिनिधित्व करता है जो lobal सामान्य बनाने, इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, इस विविधताओं कि वर्तमान सीएसएफ तरह के नमूने के लिए एक विकल्प नहीं है. इसी तरह, हम संदर्भ जीन आम तौर पर शरीर के तरल पदार्थ में अपरिवर्तित माना जाता है कि उन miRNAs के रूप में उपयोग नहीं कर सकता है. इसके बजाय, हम प्रतिकृतियां सहित सभी नमूनों भर में समान सी टी से पता चला है कि सभी miRNAs, चयनित, और Genex में उपलब्ध geNorm विश्लेषण (चित्रा 1) भाग गया. परिणाम कम से कम variably व्यक्त miRNAs रूप मीर-1266 और मीर 622 संकेत दिया है और वे संदर्भ जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया. (सीटी-Ctrel) - समूहों के बीच miRNAs की अभिव्यक्ति की तुलना मानक सूत्र 2 जो इस प्रकार Genex में रिश्तेदार मात्रा का ठहराव उपकरण, का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है. अंत में, परिणाम गर्मी का नक्शा आरेख, ग्राफिक सलाखों या ऐसे चित्रा 2 में बॉक्स साजिश के रूप में भूखंडों, अन्य प्रकार के रूप में देखे जा सकते हैं. Genex में उपलब्ध दृश्य के अन्य प्रकार पदानुक्रम क्लस्टरिंग शामिल हैं,स्वयं संगठित मानचित्र (सोम), और प्रधानाचार्य घटक विश्लेषण (पीसीए). MiRNAs के अलावा, genex सॉफ्टवेयर इतने लंबे noncoding RNAs (lncRNAs) रूपरेखा के रूप में सरणियों के अन्य प्रकार के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. थाली लेआउट एक्सेल प्रारूप में आयात किया जा सकता है और miRNA विश्लेषण के लिए वर्णित के रूप में डेटा संभाला जा सकता है. दरअसल, हम उपरोक्त चरणों में वर्णित के रूप में mirVana miRNA अलगाव किट का उपयोग प्राथमिक भ्रूण माउस cortical न्यूरॉन्स से lncRNAs profiled है और हम genex (अप्रकाशित परिणाम) का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण किया.

संक्षेप में, हम मस्तिष्कमेरु द्रव में microRNAs प्रोफ़ाइल के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया. शाही सेना निकासी से संबंधित कुछ संशोधनों के साथ, इस प्रक्रिया में शरीर के अन्य तरल पदार्थ और / या ऊतकों के अन्य प्रकार में miRNAs प्रोफ़ाइल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता. यहाँ वर्णित प्रक्रिया में, जैविक निष्कर्षण के एक कदम के पूर्व शाही सेना अलगाव के लिए किया जाता है कि ध्यान दें. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करते समय सामान्य में, इस तरह के miRVANA पेरिस ext के रूप में, की आवश्यकता नहीं हैraction किट. इसके अलावा, शरीर के तरल पदार्थ से शाही सेना और एक वाहक आरएनए निकालने जब शाही सेना और 2-8 μl शाही सेना सीडीएनए संश्लेषण के अधीन हैं यों की कोई आवश्यकता नहीं है नमूने में जोड़ा जाता है. हमारे अनुभव और प्रयोगों के इस प्रकार से संबंधित उच्च लागत पर विचार से, हम पहले कुछ नमूने जांच की सिफारिश, और फिर सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के क्रम में प्रोफाइल किए गए नमूनों / प्रतिकृतियां की संख्या के लिए एक सांख्यिकीविद् के साथ परामर्श.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से: वर्णित परियोजना पुरस्कार संख्या R01MH079751 (एफ Peruzzi पीआई) द्वारा समर्थित किया गया. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Table 3. List of equipment.

Finnpipette Novus Multichannel Pipetter

Thermo Scientific

HH05279

Finntip Pipette Tips

Thermo Scientific

9400613

Thermal Cycler C1000

Biorad

0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes

Biorad

TLS0801

Flat Cap Strips

Biorad

TLS0803

LightCycler 480 Real-Time PCR System

Roche

LightCycler 480 Sealing Foil

Roche

04 729 757 001

Refrigerated Centrifuge 5804R

Eppendorf

Swing-bucket Rotor, 4-place

Eppendorf

A-4-44

Bench-Top Mini Centrifuge

Fisher

05-090-100

Bench-Top Vortex

Fisher

1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized

Fisher

02-681-5

Matrix Reagent Reservoir, 25 ml

Thermo Scientific

8093

Thermomixer Confort

Eppendorf

Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15

Sigma

Bench-Top Vortex

Velp Scientifica

F202A0173

Table 4. List of reagents.

Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns

Exiqon

203300

SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml

Exiqon

203400

Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free

Invitrogen

10977-015

MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R

Exiqon

203608

mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations

Ambion

AM1556

MS2 RNA carrier

Roche Applied Science

10165948001

2-mercaptoethanol 98%

Sigma Aldrich

M3148-25ml

Ethanol 100%

Carlo Erba

64-17-5

Nuclease free water

Qiagen

1039480

RNAse Zap

Ambion

AM9780

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References

  1. Pacifici, M., et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J. Cell. Physiol. 10, (2012).
  2. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).
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मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग मस्तिष्कमेरु द्रव MicroRNA रूपरेखा
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Cite this Article

Pacifici, M., Delbue, S., Kadri, F., Peruzzi, F. Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR. J. Vis. Exp. (83), e51172, doi:10.3791/51172 (2014).More

Pacifici, M., Delbue, S., Kadri, F., Peruzzi, F. Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR. J. Vis. Exp. (83), e51172, doi:10.3791/51172 (2014).

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