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Medicine

정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

doi: 10.3791/51172 Published: January 22, 2014

Summary

우리는 뇌척수액 (CSF)에서 마이크로 RNA 프로필 실시간 PCR의 프로토콜을 설명합니다. RNA 추출 프로토콜을 제외하고, 절차는 다른 체액, 배양 된 세포 또는 조직 표본에서 추출한 RNA로 확장 될 수있다.

Abstract

마이크로 RNA (의 miRNA)는 자신의 번역 억압을 조절함으로써, 결과적으로의 mRNA에있는 사이트를 대상으로하는 RISC를 안내하여 유전자 조절의 강력한 층을 구성한다. miRNA의 발현의 변화는 모든 주요 복잡한 질병의 발달에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 최근의 연구 결과는의 miRNA가 세포 외 환경을 분비하고 높은 안정성을 순환 할 수있는 혈액 및 기타 체액을 입력 할 수 있음을 보여 주었다. 이러한 순환의 miRNA의 기능은 크게 애매 남아 있지만, 이러한 miRNA의 프로파일 배열과 같은 체계적인 높은 처리 방법은, 신경 퇴행성 질환 및 암의 여러 종류 등 여러 가지 병적 인 상태에서의 miRNA 서명의 식별로 이어질있다. 이러한 맥락에서, 뇌척수액에서의 miRNA 발현 프로파일의 식별은, 우리의 최근의 연구에보고 된, 바이오 마커 분석의 miRNAs 매력적인 후보가 있습니다.

_content ">와 같은 마이크로 어레이와 같은 마이크로 RNA를 프로파일 링 할 수있는 몇 가지 도구가 있습니다, 정량 실시간 PCR (qPCR에), 깊은 시퀀싱. 여기에서, 우리는 정량 실시간 PCR에 의해 뇌척수액의 마이크로 RNA를 프로필에 민감한 방법을 설명합니다. 우리 Exiqon 마이크로 RNA 즉시 사용 PCR 인간의 패널을 사용하는 I와 수 II V2.R, 742 독특한 인간 마이크로 RNA의 검출. 우리는 세중 실행의 배열을 수행하고 우리가 제넥스 프로 5 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하고 분석했다.

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 세포 선 및 일차 전지, CSF, 플라즈마, 포르말린 고정 파라핀 조직의 다양한 종류의 마이크로 RNA를 프로파일했다.

Introduction

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마이크로 RNA는 이후 전사적으로 유전자 발현을 조절하는 RNA를 비 암호화 (길이 NT 21-23) 소규모의 가족에 속한다. 마이크로 RNA들이 비교적 안정적인 것으로 나타나는 세포 외 공간으로 분비 될 수있다. miRNA의 발현의 변화를 결정하는 miRNA의 프로파일을 수행하고 많은 양의 데이터를 처리, 생체 식별 향한 중요한 단계 일 수 있지만 위협 할 수있다.

여기, 우리는 민감한 실시간 PCR에 의한 (기타 체액에 적용) 뇌척수액에서의 miRNA 발현의 변화를 확인하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 또한 통계 분석 결과의 그래픽 표현을 포함하여, 데이터 분석을위한 소프트웨어의 사용을 설명한다. 전체 절차는 비교적 쉽고 간단하며, 프로파일 및 실시간 PCR 기계의 수를 사용할 수 있습니다, 또한 상대적으로 빨리 할 수​​있는 샘플의 수에 따라 달라집니다. 실험 부분은 처리의 정확성을 필요로384 - 웰 플레이트에 RNA와 피펫, 제넥스를 사용하여 데이터 분석 섹션 정보학 및 통계의 몇 가지 기본 지식을 필요로하는 동안.

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Protocol

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다음 프로토콜은 준비 PCR 플레이트를 사용하여 CSF 및 프로필 마이크로 RNA에서 RNA를 분리하는 표준 절차를 설명합니다. 유기 상 추출은 선택 사항이며, 캐리어 RNA가 RNA의 최대 회수를 보장하는 동안 추출 시료에 첨가되어 있습니다. 결과적으로, RNA를 정량화 할 필요가 없다.

cDNA를가 (약 2 시간) 전날 합성하면 전반적으로, 6 ~ 8 판의 평균 하루에 실행할 수 있습니다. 모든 샘플은 프로파일 및 소프트웨어에로드 된 경우 데이터의 분석을 수행한다. 비교를위한 샘플 / 개 또는 그들의 조합의 수에 따라, 데이터 분석은 하나에서 여러 시간에 필요할 수도있다.

1. RNA 추출

RNA 추출이, CSF 샘플에서 수행 된 저장 분석까지 분량 씩 -80 ° C에 냉동. 이 절차 mirVana 파리 격리 키트 제조업체의 악기에 따라 사용총 RNA의 분리를위한 ctions. 작은 RNA 종에 대한 농축이 키트와 함께 가능하지만,이 단계가 완료되지 않고 RNA 추출 절차는 총 RNA의 분리 단계 이후에 종료,주의하시기 바랍니다. (다른 상업적으로 이용 가능한 RNA 분리 키트 등) mirVana 파리 분리 키트는 유기 추출을 필요로하지 않지만 또한,이 절차에 대한 프로토콜은 아래에서 확인할 수 있습니다.
RNA 추출을위한 프로토콜은 두 단계로 구성
1.1. 유기 추출 (mirVana 파리 RNA 추출 키트를 사용하는 경우에는 필요하지 않음)
1.2.2. 총 RNA 분리

1.1. 유기 추출

1.1.1. 시약 준비

  1. 솔루션을 변성 2 배 2 - 머 캅토 에탄올 375 μl를 추가하고, 4 ℃에서 저장

1.1.2. CSF를 준비

  1. RNA 추출하기 전에 얼음에 CSF의 모든 나누어지는 해동. 부드럽게 0.5 해동 CSF의 ML과에 MS2의 RNA 캐리어의 1 μg을 추가혼합. 유기 추출 생략하면 MS2 캐리어 아래 1.2.2.1에 설명 된 샘플 종래 RNA 분리에 첨가되므로주의.
  2. CSF에 실온에서 2 배 변성 용액 0.5 ㎖를 혼합한다.
  3. CSF 플러스 2 배 변성 용액에 클로로포름 : 산 - 페놀의 1 ML을 추가 클로로포름,하지 혼합물의 상단에 자리 잡고 수성 버퍼 : 산 - 페놀을 포함하는 아래 단계를 철회해야합니다. 클로로포름이 시약을 사용하여 작업 할 때 독 및 자극을 사용 장갑 등 개인 보호 장비 페놀을 포함 또한, 산 - 페놀이 있습니다.
  4. 30 ~ 60 초 혼합하는 소용돌이. 편의를 위해 샘플의 2 ㎖는 / 솔루션 / 산 변성 페놀 : 클로로포름의 혼합을 두 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 나누어집니다.
  5. 실온에서 최대 속도에서 5 분 (10,000 ×)에 대한 원심 분리기.
  6. 조심스럽게 낮은 단계 또는 계면을 방해하지 않고 수성 (위) 단계를 제거하고로 전송신선한 관. 복구 볼륨을합니다.

1.2. RNA 분리

그것은 전용 피펫 세트 벤치 및 RNA 샘플을 처리하기위한 랙을 가지고하는 것이 좋습니다. 작업 영역과 도구의 RNase 보내 겠 스프레이를 사용하여 오염을 제거하고 이전에 각 실험을 쳐있다.

1.2.1. 시약을 준비한다 :

  1. miRNA의 세척 용액 1에 100 % 에탄올 21 mL를 넣고 세척 솔루션 2 / 3 ~ 40 ㎖를 100 % 에탄올. miRNA의 세척 용액 1은 잠재적으로 위험한 물질이다 guanidium 티오 시아 네이트를 포함하고 있다는 사실에 유의하시기 바랍니다.

1.2.2. 총 RNA 분리

  1. 유기 추출에서 수상에 상온 100 % 에탄올 1.25 볼륨을 첨가하고 잘 섞는다.
  2. 컬렉션 튜브 중 하나에 필터 카트리지를 놓습니다.
  3. 필터 카트리지에 해물 / 에탄올 혼합물의 피펫 이하 700 μL.
  4. 최대 30 초 동안 원심 분리기속도. 같은 필터로 연속 응용 프로그램에서 700 μl를 초과하는 혼합물을 적용합니다. 모든 원심 분리 한 후 흐름을 통해 폐기 및 세척 단계는 포집 관을 저장합니다.
  5. 최대 속도에서 15 초 동안 필터 카트리지와 원심 분리기에 700 ㎕의 miRNA의 세척 용액 1을 적용합니다. 포집 관에서를 통해 흐름을 폐기하고 동일한 컬렉션 튜브로 필터 카트리지를 교체합니다.
  6. 최대 속도에서 15 초 500 μL 세척 솔루션 2 / 3와 원심 분리기를 적용합니다. 포집 관에서를 통해 흐름을 폐기하고 동일한 컬렉션 튜브로 필터 카트리지를 교체합니다. 최대 속도에서 15 초 동안 두 번째 500 μL 세척 솔루션 2 / 3와 원심 분리기를 적용합니다. 포집 관에서를 통해 흐름을 폐기하고 동일한 컬렉션 튜브로 필터 카트리지를 교체합니다. 필터에서 잔여 액을 제거하기 위해 최대 속도로 1 분 동안 어셈블리를 스핀.
  7. 신선한 컬렉션 튜브로 필터 카트리지를 전송합니다. 신청 (100) 및 무, 필터의 중심에 예열 (95 ° C)에서의 nuclease 무료 물 리터, 뚜껑을 닫습니다. RNA를 복구하기 위해 최대 속도로 30 초 동안 원심 분리기.
  8. 용출액을 포함하는 RNA를 수집하고 이후의 응용 프로그램에 대한 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.
  9. NanoDrop의 2000C 분광 광도계를 사용하여 RNA의 1 μl를 정량화. RNA을 운반 RNA 추출시 샘플에 추가 된 경우 RNA 정량은 건너 뛸 수 있습니다. 아래에 자세히 그 경우 RNA의 8 μL는 cDNA 합성을 실시한다.

2. miRNA의 프로필 : QRT-PCR 프로토콜

miRNA의 프로파일에 대한 프로토콜은 두 단계로 구성

  1. 첫 번째 가닥 cDNA 합성
  2. 실시간 PCR 증폭

2.1. 첫 번째 가닥 cDNA 합성

2.1.1. 템플릿 RNA를 희석

  1. 5 NG / 뉴 클레아 무료로 물을 사용 μL의 농도로 템플릿 RNA 샘플의 각을 조정합니다. 만약RNA (단계 1.2.2.9 참조) 정량화되지 않은, 다음 RNA의 8 μL는 cDNA 합성에 사용된다

2.1.2. 시약 준비

  1. 조심스럽게 배 반응 버퍼를 해동하고 무료 물을 클레아, 즉시 얼음에 배치합니다.
  2. 소용돌이로 교반하여 혼합. 재현 탁 RNA 스파이크의 튜브에 40 ㎕의 클레아 무료 물을 추가하고 소용돌이로 교반하여 혼합하여, 15 ~ 20 분 동안 얼음에두고.에게 즉시 사용하기 전에, 냉장고에서 효소의 혼합을 제거 튜브를 가볍게 치면 혼합하고 얼음에 배치합니다. 모든 시약을 스핀 다운.

2.1.3. 역전사 반응 설치

  1. 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브, 또는 동등한 RT 작업 솔루션의 필요한 금액을 준비 (비율 RNA 템플릿을 제외하고, 표 1), (최대 속도로 1 ~ 2 초) 텍싱하여 혼합, 간단하게 (스핀 다운 우리는 고정 속도, 10 초)와 미니 에펜 도르프의 원심 분리기를 사용하여 얼음에 놓습니다. 참고 UniSp6의 RNA 스파이크인은 (표 1 참조) RT 반응 전에 시료에 첨가한다.
  2. 클레아 무료 PCR 튜브에 RT 작업 용액을 분사합니다.
  3. 각 튜브에 템플릿 RNA를 분배.
    참고 : 10 %를 초과하는 볼륨 / 피펫 및 / 또는 로봇 죽은 볼륨에 대한 각각의 시약을 계산하는 것을 기억하십시오.
    시약 패널 I 양 (μL) 패널 I + II 볼륨 (μL)
    배 반응 버퍼 4.4 8.8
    클레아 무료 물 9.9 19.8
    효소 혼합 2.2 4.4
    UniSp6 RNA 스파이크의 템플릿 1.1 2.2
    템플릿 총 RNA (5 NG / μL) 4.4 8.8 총 양 22 44

    표 1. 전사 반응 설정 반전.

2.1.4. 혼합 시약을 회전

  1. 모든 시약이 완전히 혼합되도록 부드러운 (1-2 초) 소용돌이로 교반하여 반응을 섞는다. 혼합 한 후, (고정 속도, 10 초 미니 에펜 도르프 원심 분리기)를 스핀 다운.

2.1.5. 품어 열을 비활성화

  1. 다음과 같이 PCR 기계를 프로그램 :
  2. 42 ° C에서 60 분 알을 품다
  3. 95 ° C에서 5 분의 역전사 효소를 열 불 활성화
  4. 4 ° C에 즉시 차가운
  5. 4 ° C에서 또는 동결에 보관
    참고 : 프로토콜이 단계에서 중단 할 수있다. 희석 cDNA를 최대 오주 (최대 4 일 동안 4 ° C에서 선택적 저장소)에 -20 ° C로 유지 될 수있다.

2.2.1. 실시간 PCR 시약을 준비

  1. 얼음에 (단계 2.1.5에서)의 cDNA를 놓습니다.
  2. 얼음 해동 클레아 무료 물과 PCR 마스터 믹스. 알루미늄 호일로 덮어서 빛으로부터 PCR 마스터 믹스 튜브를 보호합니다. 즉시 사용하기 전에, 미니 원심 분리기 1 ~ 2 초 텍싱하여 PCR 마스터 믹스를 혼합하고 1 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운.

2.2.2. SYBR 녹색 마스터 믹스, 물, 그리고 cDNA를 결합하고 PCR 플레이트에 추가

다음 절차는 튜브의 표면에 부착 된 cDNA의 낮은 농도를하지 않는 것이 좋습니다 :

  1. 플레이트 씰을 제거하기 전에, 간단히 1 분 1,500 XG에서 냉장 원심 분리기에 플레이트 (들)을 스핀 다운.
  2. 15 ML 원뿔 튜브에 2 배 PCR 마스터 믹스와 물을 결합한다. 패널 I : 2,000 μL 2X 마스터 믹스 1980 μL 물, 패널 I + II : 4,000 μL 2X 마스터 믹스와 3,960 μ, L의 물.
  3. 20 μL의 cDNA를 (패널 I) 또는 40 μL의 cDNA를 (내가 II를 + 패널)을 추가하고 혼합한다.
  4. 1 ~ 2 초 텍싱하여 부드럽게 혼합 1 분 1,500 XG에서 냉장 원심 분리기의 회전 속도.
  5. 멀티 채널 피펫 저수지에서 PCR 마스터 믹스 / cDNA를 혼합 배치합니다. 당신은 멀티 채널 피펫의 길이가 저수지를 식별 할 수 있습니다. 이것은 채널에 걸쳐 동일 부피의 분취 량을 허용 충분히 높은 볼륨의 레벨을 유지한다. 이것은 지난 몇 분주으로 중요합니다.
  6. 10 ㎕의 PCR 마스터 믹스를 분배 / cDNA를 16 채널 피펫을 사용하여 384 - 웰 플레이트의 각 웰에 섞는다.
  7. 광학 밀봉와 플레이트를 밀봉.
  8. 솔루션을 혼합 기포를 제거하기 위해, 냉장 원심 분리기 (1 분 1,500 XG)에서 간단히 플레이트 스핀.

    참고 : 실험이 시점에서 일시 정지 될 수있다. 최대 24 시간 동안 4 ° C에서 빛으로부터 보호 반응을 저장합니다.

2.2.3. 실시간 PCR

표 2에 설명 된 매개 변수를 다음과 실시간 PCR 증폭과 융해 곡선 분석을 수행합니다.

공정 단계 설정, 로슈 LC480
중합 효소의 활성화 / 변성 95 ° C에서 10 분
확대 증폭 45 사이클에서
95 ° C에서 10 초
60 ° C에서 1 분
램프 속도
1.6 ° C / 초
광학 읽기
용융 곡선 분석

표 2. 로슈 LightCycler 480을 사용하여 실시간 PCR 사이클 조건.

2.3. 실시간 PCR 데이터 분석

실시간 PCR 데이터 분석, Exiqon 제넥스 프로 5.0와 함께 이루어집니다 다음 t그는 지침을 권장합니다. 제넥스 단계별 설명서에서 다운로드 할 수 있습니다 http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
데이터 분석은 세 단계로 구성

  1. 데이터 가져 오기
  2. 데이터의 전처리
  3. 통계 분석

2.3.1. 데이터 가져 오기

  1. 로슈 LightCycler 480에서 2 미분 분석 방법을 선택하고 Cq와 값을 계산합니다. 데이터는 테이블로 내 보낸 텍스트 파일로 저장됩니다.
  2. 데이터, 오픈 제넥스을 가져 Exiqon 가져 오기 마법사 버튼을 클릭하고 "시작"을 클릭합니다. 형식, 악기와 플레이트 레이아웃 파일을 선택하는 지침을 따르십시오. 그 플레이트 레이아웃 파일 (엑셀 파일) Exiqon 웹 사이트 (에서 다운로드 참고 http://www.exiqon.com/plate-layout-files을 ).
  3. IMPORT 패널은 I 및 II와 "다음"을 클릭합니다.
  4. 파일 가져 오기 한 후 생성 된 테이블은 사전 정의 된 열이 포함되어 있습니다. 샘플 단순 편집 할 수 및 분류 컬럼이 추가되거나이 단계에서 제거 될 수있다. 작업이 완료되어 "다음"을 클릭합니다.
  5. 데이터를 저장하고 데이터 편집기에로드 할 수 있습니다.

2.3.2. 데이터의 전처리

  1. Exiqon와 제넥스에서 권장하는 여러 판을 비교할 때, 할 수있는 첫 번째 일은 사전 메뉴에서 간 판 교정을 선택하여 판 사이의 데이터를 보정하는 것입니다.
  2. 그것은 세중 실행에 miRNA의 배열을 실행하는 것이 좋습니다. miRNA의 세 개의 복제본 중 적어도 두에없는 경우는 nonexpressed로 설정됩니다.
  3. 사전 처리의 다음 단계에서, 상처를 출발했다. 차단 값을 정의 임계 사이클 (C의 T)이 값보다 높은과 데이터가 삭제되는 것을 나타냅니다. 뇌척수액 검체를 사용하여 본 실험에서, 컷 오프는 39로 설정 하였다. 거기efore, 세 개의 복제본의 39보다 C의 t 이상과 모든 시료는 삭제됩니다. miRNA의 한 프로브 (세 가지 중 하나의 복제)에> 39 C의 t가있는 경우, 그 독서는 다른 두 프로브 C (T)의 평균으로 대체가 39 아래에 둘 다 제공됩니다.
  4. 참조 유전자를 정의합니다. 제넥스 전문 참조 유전자를 식별하는 geNorm 및 / 또는 NormFinder을 활용하는 옵션이 있습니다. 모든 샘플에 걸쳐 유사한 Cq와 값을 가지고 geNorm 및 / 또는 NormFinder를 실행의 miRNAs의 목록을 선택합니다. 이 분석에 따르면, 여기에 제공된 예에서, 미르 - 622과 미르 - 1266 샘플에서 가장 균일 한 값을 가지고 있었다 (그림 1) 참조 유전자로 선택되었다.
  5. 다음에, 데이터는 표준 발현 유전자를 사용하여 정규화 및 얻어진 값 ΔC의 t에 해당된다
  6. cDNA 합성 반응은 삼중으로 수행 된 경우,이 시점에서 값을 평균화한다.
  7. 다시 시트의 유효성을 확인빈 거의 빈 열을 이동합니다. 전처리 창에서 선택 "시트의 유효성을 검사합니다"하고 제거 빈 열 라인에 적용보다. 아래 행에서 유효한 데이터의 원하는 비율을 선택하고 적용을 클릭합니다. 모든 샘플에 공통된의 miRNA를 비교하고자하는 경우 예를 들어, 100 %를 선택합니다.
  8. 누락 된 데이터를 처리합니다.
    전처리 메뉴에서 "누락 된 데이터"를 선택하고 누락 된 데이터를 처리 할 수​​있는 옵션 중 하나를 선택했다. 이 단계가 필요합니다. 당신이 처리되지 않은 누락 된 데이터가 포함 된 파일을로드하려고하면 제넥스는 당신에게 오류를 줄 것이다합니다.
  9. 샘플 (제어 대 즉. 실험) 그룹의 상대 정량을 결정합니다. 집단 간의 상대 정량은 ΔΔ C의 T 방법을 사용하여 계산됩니다. 제넥스에서 사전 탭을 클릭하고 상대 정량을 선택합니다. 창에서 참조 그룹을 선택하고 적용 누르십시오. EXPR, 그래픽 표현과 / 또는 추가 통계 분석을 위해 그것을 참고ession 데이터는 로그 스케일로 변환해야합니다. 전처리 메뉴에서 LOG2을 선택합니다.

2.3.3. 통계 분석

제넥스 소프트웨어는 T-테스트 및 ANOVA 통계 분석 등의 폭 넓은 범위를 허용한다.

  1. 제넥스와 공개 데이터 관리자로 최종 MDF 파일을로드합니다. 통계적 분석이 수행되는 샘플의 정확한 샘플 또는 그룹을 선택하는 것이 중요하다.
  2. "통계"를 선택하고 원하는 테스트에 해당하는 아이콘을 선택했다.
  3. 제어판 창에서 "실행"을 클릭합니다. Excel 또는 MDF 파일로 결과를 저장합니다.

2.3.4. 발현 프로파일

다음과 같이 마이크로 RNA 샘플은, 분류, 클러스터링 및 열지도 및 계통도에 가시화 될 수있다

  1. 제넥스와 공개 데이터 관리자로 최종 MDF 파일을로드합니다. 샘플이나의 miRNAs의 그룹을 선택하고 작성하려면이 창을 사용합니다. 당신이 완료되면 "적용"을 클릭합니다.
  2. <왼쪽 상단 모서리를 선택 클러스터의 리>와 히트 맵 아이콘을 클릭
  3. 제어판 창에서 "실행"을 클릭합니다. 히트 맵은 TIFF 나 BMP 등의 다양한 형식으로 저장할 수 있습니다, 그것은 또한 복사하고 필요에 따라 수정 될 수 있습니다.

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Representative Results

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이 연구 결과는 이전에 1 발표되었다. geNorm 응용 프로그램을 사용하여 후보 참조 마이크로 RNA의 분석 1은 결과를 그림. 따라서,이 마이크로 RNA, 미르 - 622 미르-1266은 표준 발현 유전자로서 식별하고, miRNA의 값을 정규화하기 위해 사용되었다.

CSF의 연구를 위해 우리가 샘플의 세 그룹을했다 : HIV-(N = 10), HIVE 뇌염없이 (N = 4), 그리고 HIV + (HIV +, N = 5). 두 그룹은 HIVE 및 HIV +는, 제어 HIV-그룹과 비교 하​​였다. 통계 분석 후 (2.3.3 절) 열한 마이크로 RNA의 발현 수준이 1 통계적으로 유의. 2이 열한 마이크로 RNA의 상자 플롯을 나타내는 그림 발견, 미르-1203-1224-3P, -182 *,-19B-2 * -204,-362-5P, -484, -720, -744 * -934 및 -937. 각 열은 줬어없이 HIV +에 대한 그룹 (HIVE 녹색과 빨간색 내의 샘플에서 데이터의 분포를 보여줍니다phalitis). 수염은 중간, 1 차 (Q1) 및 3 차 (Q3) 분위수, 최대 및 최소 nonoutliers를 나타냅니다.

그림 1
그림 1. 제넥스 내 geNorm 응용 프로그램에서 결과를 보여주는 그래픽 막대가. 열 마이크로 RNA가 가능한 참조 유전자와 결과로 분석 하였다는 가장 안정적으로 발현의 miRNAs로 미르 - 622과 미르 - 1266 (빨간색 막대)를 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 데이터 (F)의 분포를 나타내는 박스 플롯또는 뇌염 (빨강 HIV +)없이 HIVE (녹색) 및 HIV +의 그룹 내 열한의 miRNA의 각. 각 열의 수염은 중간, 1 일 (상자의 Q1, 아래) 및 3 차 (Q3, 최고를 나타냅니다 상자)가 분위수, nonoutliers (검은 선)입니다 최대 값과 최소값. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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마이크로 RNA는 번역 억제 및 / 또는 mRNA의 분해 2를 촉진하여 유전자 발현을 조절하는 작은 비 암호화 RNA를합니다. 때문에 세포가없는 조건에서 높은 안정성, 마이크로 RNA는 많은 체액에서 검출되었다. 또한, 마이크로 RNA의 서로 다른 발현 양상은 인간의 암 3-9의 다양한 단계 및 / 또는 진행과 상관 관계가있다.

고전 칩 배열하거나 최신 깊은 시퀀싱 기술을 포함한 마이크로 RNA 프로필에 사용할 수있는 여러 가지 도구가 있습니다. 그러나, 우리는 RNA를 최소한의 양을 요구하는 추가적인 장점을 갖는다 고감도의 qPCR 플랫폼 (10), (11)을 이용하기로했다. miRCURY LNA 범용 RT 마이크로 RNA PCR 프로토콜은 (40)은 전체 두 패널 배열 겨, 20 μL의 cDNA 합성 반응 당 총 RNA를 겨 (20)를 사용하도록 최적화되어 있습니다. valuabl 다룰 때 RNA의 소량을 사용하는 옵션을 갖는 것은 매우 중요하다 전자와 같은 CSF 또는 포르말린 고정 파라핀 조직 1과 어려운 얻을 임상 검체. 중요한 사실은, 소량의 RNA를 이용하면 시료에 존재 가능한 억제제의 농도를 최소화한다. 스파이크에 대한 범위 캐럿 값의 부족 가능성이 샘플의 일부 억제제의 존재를 나타냅니다. 스파이크의 프로브는 이전의 miRNA 프로파일에 억제제의 존재에 대한 샘플을 테스트하기 위해 별도로 구입할 수 있습니다. 이 테스트의 경우, 하나의 실시간 PCR은 (여부 NG 또는 μL) RNA의 증가 농도를 사용하여 수행됩니다.

본 프로토콜에서 우리는 이전의 RNA 분리에 유기 상 추출을보고합니다. 그것은 많은 새로운 RNA 추출 키트이 절차를 필요로하지 않는다는 것을 유의해야한다. 예를 들어, 우리는 성공적으로 페놀 / 클로로포름 추출 않고 직접 플라즈마 (데이터는 도시하지 않음) 200 μL로부터 RNA 추출을 위해 miRCURY RNA 분리 키트를 이용하여 biofluids 플라즈마의 miRNAs 파일링있다.

일반적 _content ">, 통계적으로 의미있는 결과를 얻기 위해 필요한 반복 실험의 적절한 수를 결정하기 위해 사전에 실험을 설계하는 것이 중요하다. 반복 실험의 수는 분석 할 샘플의 수에 의존 할 수 있으며,에 의존 할 수있다 샘플 또는 샘플의 그룹 내 변화. 우리는 샘플, 총 20의 상대적으로 낮은 번호를 사용하는 우리의 연구를 위해, 우리는 삼중의 cDNA 합성 반응을 설정하기로 결정했다. 실험을 설정하기 전에 생물 통계 학자와 컨설팅 수도 현명한 선택이 매우 좋습니다.

C (T)를 정의하는 것은 차단 값은 중요하고 샘플의 종류에 따라 달라집니다 높은 표현의 miRNAs 것은 25 ~ 35 사이에서 설정 될 수 있지만, 이러한 우리의 CSF 표본 낮은 표현의 miRNA에 대한 높은 설정할 수 있습니다. 이 데이터 분석에 있어서는 또 다른 중요한 단계는 참조 유전자 (들)의 선택이다. AG에 (예 : miRNA의 배양 세포에서 프로파일 링 등) 몇 가지 강력한 데이터에 대한모든 시료의 평균 C의 t를 나타내는 lobal 정규화가 사용될 수있다. 그러나,이 변화를 제시 CSF와 같은 샘플에 대한 옵션이 아닙니다. 마찬가지로, 우리는 참조 유전자 일반적으로 체액의 변경으로 간주되는 그의 miRNA로 활용할 수 없습니다. 대신, 우리는 복제를 포함한 모든 샘플에 걸쳐 유사한 C (T)를 보여 모두의 miRNAs를 선택하고, 제넥스에서 사용할 수있는 geNorm 분석 (그림 1)를 달렸다. 결과는 가장 다양하게 표현 된 miRNAs로 미르 - 1266 미르-622을 표시하고는 참조 유전자로 사용되었다. (코네티컷 Ctrel) - 그룹 사이의 miRNAs의 발현의 비교 표준 화학식 ​​2를 다음 제넥스의 상대적인 정량 도구를 사용하여 결정될 수있다. 마지막으로, 결과는 열지도 다이어그램, 그래픽 바 또는 그림 2의 박스 플롯으로 플롯, 다른 형식으로 시각화 할 수 있습니다. 제넥스 가능 시각화 다른 유형의 계층 적 클러스터링을 포함자기 조직화지도 (SOM) 및 주성분 분석 (PCA). 의 miRNAs 외에도 제넥스 소프트웨어는 긴 비 암호화 RNA들 (lncRNAs) 프로파일과 같은 배열의 다른 유형의 분석에 이용 될 수있다. 플레이트 레이아웃 엑셀 포맷으로 가져올 수 및 miRNA의 분석 기술 한 바와 같이 데이터를 처리 할 수​​있다. 사실, 우리는 위의 단계에 설명 된대로 mirVana miRNA의 분리 키트를 사용하여 기본 배아 마우스 대뇌 피질의 신경 세포에서 lncRNAs 윤곽을 그리고 우리는 제넥스 (게시되지 않은 결과)를 사용하여 데이터를 분석했다.

요약하면, 우리는 뇌척수액의 마이크로 RNA를 프로파일 프로토콜을 설명했다. RNA 추출과 관련된 일부 수정,이 과정은 다른 신체 유체 및 / 또는 조직의 다른 타입의 miRNAs 프로필하도록 구성 될 수있다. 여기에서 설명하는 절차에서, 유기 추출하는 단계는 이전의 RNA 분리를 수행합니다. 상업적으로 이용 가능한 장비를 사용하는 경우 일반적으로이 그러한 miRVANA 파리 내선으로, 필요하지 않습니다raction 키트. 또, 체액에서 RNA와 캐리어 RNA를 추출 할 때은 RNA 및 2-8 μL의 RNA는 cDNA 합성을 실시하고 정량화 할 필요가없는 샘플에 첨가한다. 우리의 경험과 실험의이 유형과 관련된 높은 비용을 고려에서, 우리는 먼저 몇 가지 샘플을 테스트 할 것을 권장하고 통계적으로 의미있는 결과를 얻기 위해 프로파일 링 할 샘플 / 복제본의 수에 대한 통계 학자와 상담.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

정신 건강의 국립 연구소에서 : 설명이 프로젝트는 보너스 번호 R01MH079751 (F. PERUZZI PI)에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 정신 건강의 국립 연구소 또는 건강의 국립 연구소의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Table 3. List of equipment.

Finnpipette Novus Multichannel Pipetter

Thermo Scientific

HH05279

Finntip Pipette Tips

Thermo Scientific

9400613

Thermal Cycler C1000

Biorad

0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes

Biorad

TLS0801

Flat Cap Strips

Biorad

TLS0803

LightCycler 480 Real-Time PCR System

Roche

LightCycler 480 Sealing Foil

Roche

04 729 757 001

Refrigerated Centrifuge 5804R

Eppendorf

Swing-bucket Rotor, 4-place

Eppendorf

A-4-44

Bench-Top Mini Centrifuge

Fisher

05-090-100

Bench-Top Vortex

Fisher

1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized

Fisher

02-681-5

Matrix Reagent Reservoir, 25 ml

Thermo Scientific

8093

Thermomixer Confort

Eppendorf

Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15

Sigma

Bench-Top Vortex

Velp Scientifica

F202A0173

Table 4. List of reagents.

Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns

Exiqon

203300

SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml

Exiqon

203400

Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free

Invitrogen

10977-015

MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R

Exiqon

203608

mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations

Ambion

AM1556

MS2 RNA carrier

Roche Applied Science

10165948001

2-mercaptoethanol 98%

Sigma Aldrich

M3148-25ml

Ethanol 100%

Carlo Erba

64-17-5

Nuclease free water

Qiagen

1039480

RNAse Zap

Ambion

AM9780

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References

  1. Pacifici, M., et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J. Cell. Physiol. 10, (2012).
  2. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).
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  4. Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
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  10. Blondal, T., et al. Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids. Methods. 59, 1-6 (2013).
  11. Jensen, S. G., et al. Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs. BMC Genomics. 12, 435 (2011).
정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일
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Pacifici, M., Delbue, S., Kadri, F., Peruzzi, F. Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR. J. Vis. Exp. (83), e51172, doi:10.3791/51172 (2014).More

Pacifici, M., Delbue, S., Kadri, F., Peruzzi, F. Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR. J. Vis. Exp. (83), e51172, doi:10.3791/51172 (2014).

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