Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Cerebrospinalvæsken MikroRNA Profilering Bruke Kvantitativ Real Time PCR

doi: 10.3791/51172 Published: January 22, 2014

Summary

Vi beskriver en protokoll av sanntids PCR å profilere microRNAs i cerebrospinalvæsken (CSF). Med unntak av RNA-ekstraksjonsmetoder, kan fremgangsmåten bli utvidet til RNA ekstrahert fra andre kroppsvæsker, dyrkede celler, eller vevsprøver.

Abstract

MicroRNAs (MiRNAs) utgjør en potent lag av genregulering ved å lede RISC å målrette områder ligger på mRNA og følgelig ved å modulere sin translasjonsforskning undertrykkelse. Endringer i miRNA uttrykk har vist seg å være involvert i utviklingen av alle de store komplekse sykdommer. Videre nyere funn viste at mirnas kan bli utskilt til det ekstracellulære miljøet og inn i blodbanen og andre kroppsvæsker der de kan sirkulere med høy stabilitet. Funksjonen til en slik sirkulerende mirnas fortsatt i stor grad unnvikende, men systema høy gjennomstrømning tilnærminger, for eksempel miRNA profilering arrays, har ført til identifisering av miRNA signaturer i flere patologiske tilstander, inkludert nevrodegenerative lidelser og flere typer kreft. I denne sammenheng, identifisering av miRNA ekspresjonsprofilen i cerebrospinalvæsken, som rapportert i vår nylig studie, gjør miRNAs attraktive kandidater for biomarkør analyse.

_content "> Det er flere verktøy tilgjengelig for profilering microRNAs som mikromatriser, kvantitativ real-time PCR (qPCR), og dyp sekvensering. Her beskriver vi en følsom metode for å profilere microRNAs i cerebrospinalvæsker av kvantitativ real-time PCR. Vi brukte Exiqon mikroRNA klare til bruk PCR menneskelige paneler I og II V2.R, som tillater påvisning av 742 unike menneskelige microRNAs. Vi utførte arrays i tre eksemplarer går og vi bearbeidet og analysert data ved hjelp av GENEX Professional 5-programvaren.

Ved hjelp av denne protokollen, har vi lykkes profilert microRNAs i ulike typer av cellelinjer og primære celler, CSF, plasma og formalinfiksert parafin-embedded vev.

Introduction

MicroRNAs tilhører familien av små (21-23 nt i lengde) kodende RNA som regulerer genuttrykk post-transcriptionally. microRNAs kan skilles ut i den ekstracellulære rom der de ser ut til å være relativt stabil. Mens bestemme endringer i miRNA uttrykk kan være et viktig skritt mot identifisering av biomarkører, utføre miRNA profiler og håndtering av en stor mengde data kan være skremmende.

Her beskriver vi en protokoll for å oppfatte endringer i miRNA uttrykk i cerebrospinalvæsken (gjelder andre kroppsvæsker) med en følsom real time PCR. Vi beskriver også bruk av programvaren for dataanalyse, herunder statistisk analyse og grafisk fremstilling av resultatene. Hele fremgangsmåten er forholdsvis enkel og ukomplisert, og, avhengig av antallet prøver som skal profilerte og antallet sanntid PCR-maskiner som er tilgjengelige, også relativt raskt. Den eksperimentelle delen krever nøyaktighet i håndteringRNA og pipettering til 384-brønners plater, mens dataanalyse ved hjelp GENEX krever litt grunnleggende kunnskaper i informatikk og statistikk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den følgende protokoll beskriver standard prosedyre for å isolere RNA fra CSF-og profil microRNAs ved hjelp av ferdige PCR-plater. Legg merke til at den organiske fase ekstraksjon er valgfritt, og at en bærer-RNA tilsettes til prøven ved ekstraksjon sikre maksimal gjenvinning av RNA. Følgelig er det ikke behov for å kvantifisere RNA.

Generelt kan et gjennomsnitt på 6-8 plater kjøres i en dag hvis cDNA syntetiseres dagen før (ca. 2 timer). Analyse av data blir utført når alle prøvene har blitt profilert og lastet inn i programvaren. Avhengig av antallet av samples / grupper eller deres kombinasjoner for sammenligning, kan data-analyse krever fra en til flere timer.

En. RNA Utvinning

Den RNA ekstraksjon ble utført fra CSF-prøver, som er lagret frosset ved -80 ° C i alikvoter inntil analyse. For denne prosedyren Mirvana Paris isolasjon kit ble brukt, etter produsentens instructions for den totale RNA isolering. Legg merke til at, selv om berikelse for små RNA-arter som er mulig med dette settet, er dette trinnet ikke er utført og RNA-ekstraksjon prosedyren er avsluttet etter det totale RNA isolering trinn. I tillegg, selv om Mirvana Paris isolasjonssett (for eksempel andre kommersielt tilgjengelige RNA isolasjon kits) krever ikke organisk ekstraksjon, en protokoll for denne fremgangsmåten kan bli funnet nedenfor.
Protokollen for RNA ekstraksjon består av to trinn:
1.1. Organisk Utvinning (ikke nødvendig hvis du bruker Mirvana Paris RNA ekstraksjon kit)
1.2.2. Total RNA isolering

1.1. Organisk ekstraksjon

1.1.1. Forbered reagenser

  1. Legg 375 mL av 2-mercaptoethanol til 2x Denaturing løsning, og lagre den ved 4 ° C.

1.1.2. Klargjør CSF

  1. Tine hver delmengde av CSF på isen før den RNA ekstraksjon. Tilsett 1 ug av MS2 RNA transportør til 0,5 ml tinte CSF og forsiktigmix. Merk at dersom det organiske ekstraksjon er utelatt, vil det MS2 bæreren tilsettes til prøven før RNA isolering er beskrevet i 1.2.2.1 nedenfor.
  2. Bland 0,5 ml 2x Denaturing løsning ved værelsestemperatur til CSF.
  3. Tilsett 1 ml av syre-fenol: kloroform til CSF pluss 2x Denaturing Løsning: være sikker på å trekkes tilbake bunnfase inneholdende syre-fenol: kloroform, og ikke den vandige buffer som ligger på toppen av blandingen. I tillegg oppmerksom på at syre-fenol: kloroform inneholder fenol, som er en gift og irriterende, bruk hansker og annet personlig verneutstyr når du arbeider med denne reagensen.
  4. Vortex i 30-60 sek for å blande. For enkelthets skyld de 2 ml prøve / denaturerende løsning / syre-fenol: kloroform blandingen er delt i to 1,5 ml Eppendorf-rør.
  5. Sentrifuger i 5 minutter ved maksimal hastighet (10.000 x g) ved romtemperatur.
  6. Fjern forsiktig vandige (øvre) fase uten å forstyrre den nedre fase eller den interfase og overføre den til enfriskt rør. Merk volumet gjenopprettes.

1.2. RNA isolasjon

Det anbefales å ha en dedikert benk, satt av pipetter, og stativer for håndtering av RNA prøver. Arbeidsområdet og verktøy er dekontamineres ved hjelp av RNase Zap spray og våtservietter før hvert forsøk.

1.2.1. Forbered reagenser:

  1. Til 21 ml av 100% etanol for å miRNA Vaskeløsning 1 og 40 ml av 100% etanol og vaskeløsning 2/3. Vær oppmerksom på at miRNA Wash Solution 1 inneholder guanidium thiocyanate som er et potensielt farlig stoff.

1.2.2. Total RNA isolering

  1. Legg 1,25 volumer av romtemperatur 100% etanol til den vandige fase fra den organiske ekstraksjon og bland grundig.
  2. Plasser et Filter Cartridge inn i en av de Collection Tubes.
  3. Pipette ikke mer enn 700 mL av lysatet / etanol blandingen på Filter Cartridge.
  4. Sentrifuger i 30 sekunder ved maksimalhastighet. Blandingen påføres på over 700 pl i suksessive anvendelser på samme filter. Kast gjennomstrømning etter hver sentrifugering og lagre Collection Tube for vasketrinnene.
  5. Påfør 700 mL miRNA Wash Solution 1 til Filter Cartridge og sentrifuger i 15 sek ved maksimal hastighet. Kast flyten gjennom fra samlingen Tube og skiftes filteret inn i den samme Collection Tube.
  6. Påfør 500 mL Vask Løsning 2/3 og sentrifuger i 15 sek ved maksimal hastighet. Kast flyten gjennom fra samlingen Tube og skiftes filteret inn i den samme Collection Tube. Påfør et andre 500 mL Vask Løsning 2/3 og sentrifuger i 15 sek ved maksimal hastighet. Kast flyten gjennom fra samlingen Tube og skiftes filteret inn i den samme Collection Tube. Snurr forsamlingen i 1 min ved maksimal hastighet for å fjerne resterende væske fra filteret.
  7. Overfør Filter Cartridge i en fersk Collection Tube. Påfør 100 & mu, L av forvarmet (95 ° C) nuclease-fritt vann til sentrum av filteret og lukke lokket. Sentrifuger for 30 sek ved maksimal hastighet for å gjenopprette RNA.
  8. Samle eluatet inneholdende RNA og lagre det ved -80 ° C for etterfølgende bruk.
  9. Kvantifisere en mL av RNA ved hjelp av Nanodrop 2000c spektrofotometer. Merk at RNA kvantifisering kan hoppes over hvis en RNA transportør er lagt til utvalget i løpet av RNA ekstraksjon. I dette tilfelle 8 pl av RNA er utsatt for cDNA-syntese som beskrevet nedenfor.

2. miRNA Profil: QRT-PCR protokoll

Protokollen for miRNA profilering består av to trinn:

  1. Første tråd cDNA syntese
  2. Real-time PCR forsterkning

2.1. Første tråd cDNA syntese

2.1.1. Fortynne mal RNA

  1. Justere hver av templat RNA-prøvene til en konsentrasjon på 5 ng / pl ved hjelp av nuklease fritt vann. DersomRNA er ikke kvantifisert (se trinn 1.2.2.9), og 8 pl av RNA blir anvendt for cDNA-syntese

2.1.2. Forbered reagenser

  1. Forsiktig tine 5x Reaction buffer og nukleasefritt fritt vann, og umiddelbart plassere på is.
  2. Bland ved virvling. Resuspender RNA spike-i ved å tilsette 40 ul nuklease fritt vann til røret, og bland ved virvling, la den på is i 15-20 min. Umiddelbart før bruk, ta enzymet mix fra fryseren, bland ved å flikke rørene og legg på is. Spinn ned alle reagenser.

2.1.3. Omvendt transkripsjon reaksjon setup

  1. Klargjør den nødvendige mengde RT arbeidsløsning i et 1,5 ml Eppendorf-rør, eller tilsvarende (i det forhold som er angitt i tabell 1, med unntak av RNA-malen), bland ved virvling (1-2 sek ved maks hastighet), kort spinn ned ( vi bruker en mini Eppendorf sentrifuge med fast hastighet, 10 sek) og plassere den på is. Merk at UniSp6 RNA pigg-In tilsettes til prøven før RT-reaksjonen (se tabell 1).
  2. Tilsett RT arbeidsløsning inn nuklease gratis PCR-rør.
  3. Tilsett mal RNA i hvert rør.
    Merk: Husk å beregne 10% overflødig volum / hver reagens for pipettering og / eller robot døde volum.
    Reagens Panel I Volum (mL) Panel I + II Volum (mL)
    5x reaksjon buffer 4.4 8.8
    Nukleasefritt fritt vann 9.9 19.8
    Enzyme blanding 2.2 4.4
    UniSp6 RNA Spike-i malen 1.1 2.2
    Mal total RNA (5 ng / mL) 4.4 8.8 Total Volume 22 44

    Tabell 1. Omvendt transkripsjon reaksjon oppsett.

2.1.4. Miks og spinne reagenser

  1. Bland reaksjonen ved forsiktig (1-2 sek) virvling for å sikre at alle reagenser blir grundig blandet. Etter blanding spinne ned (mini Eppendorf sentrifuge med fast hastighet, 10 sek).

2.1.5. Ruge og varme inaktivere

  1. Programmere en PCR maskin som følger:
  2. Inkuber i 60 min ved 42 ° C
  3. Varme inaktivere revers transkriptase i 5 min ved 95 ° C
  4. Umiddelbart kult å 4 ° C
  5. Oppbevar ved 4 ° C eller fryse
    Merk: protokollen kan avbrytes på dette stadiet. Den ufortynnede cDNA kan oppbevares ved -20 ° C i opp til 5 uker (valgfritt lagre ved 4 ° C i opp til 4 dager).

2.2.1. Forbered reagenser for Real-time PCR

  1. Plasser cDNA (fra trinn 2.1.5) på is.
  2. Tine nuclease gratis vann og PCR Master mix på is. Beskytt PCR Master mix ampuller fra lys ved å dekke dem med aluminiumsfolie. Umiddelbart før bruk blandes de PCR master blanding ved virvling 1-2 sekunder i et mini-sentrifuge og spinne ned ved 1500 x g i 1 min.

2.2.2. Kombiner SYBR Grønn mester mix, vann, og cDNA og legge til PCR-plater

Følgende prosedyre anbefales å unngå lave konsentrasjoner av cDNA fra holde tube overflaten:

  1. Før fjerning av platen tetning, kort spinn ned platen (e) i en kjølesentrifuge ved 1500 x g i 1 min.
  2. I en 15 ml konisk tube, kombinere 2x PCR Master mix og vann. Panel I: 2000 mL 2x mester mix og 1980 mL vann; Panel I + II: 4000 mL 2x mester mix og 3960 μ; L vann.
  3. Tilsett 20 pl cDNA (panel I) eller 40 pl cDNA (panel I + II), og bland.
  4. Bland forsiktig ved å virvle 1-2 sek og spinne ned i en kjølesentrifuge ved 1500 x g i 1 min.
  5. Plasser PCR Master mix / cDNA mix i en flerkanalspipette reservoaret. Kan være nødvendig å identifisere et reservoar som har lengden av multikanal pipette. Dette holder nivået av volumet høy nok slik at for like store volum alikvoter i løpet av multikanal. Dette er kritisk til de siste par porsjoner.
  6. Tilsett 10 ul PCR Master mix / cDNA-blanding til hver brønn av 384-brønners plate ved bruk av en 16-kanals pipette.
  7. Tett plate med optisk tetting.
  8. Spin-platen lett i en nedkjølt sentrifuge (1500 x g i 1 min), å blande oppløsningene og fjerne luftbobler.

    Merk: eksperimentet kan bli stanset på dette punktet. Oppbevar reaksjonene beskyttet mot lys ved 4 ° C i opptil 24 timer.

2.2.3. Real-Time PCR

Utfør real-time PCR forsterkning og smeltekurve analyse følgende parametrene angitt i tabell 2..

Prosess Trinn Innstillinger, Roche LC480
Polymerase Aktivering / Denaturering 95 ° C, 10 min
Amplification 45 Amplification sykluser ved
95 ° C, 10 sek
60 ° C, 1 min
Ramp-prisen
1,6 ° C / sek
Optisk lese
Smelte kurve analyse Ja

Tabell 2. Real-time PCR sykkelforhold ved hjelp av Roche LightCycler 480.

2.3. Real-time PCR analyse av data

Sanntid PCR data analyse er gjort med Exiqon GENEX Professional 5.0, etter than anbefalte instruksjoner. Den GENEX trinn-for-trinn manuell kan lastes ned på http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
Dataanalyse består av tre trinn:

  1. Import av data
  2. Forbehandling av data
  3. Statistisk analyse

2.3.1. Import av data

  1. I Roche LightCycler 480 velge 2 nd derivat analysemetode og beregne CQ verdier. Data eksporteres som en tabell og lagres som tekstfiler.
  2. For å importere dataene, åpen GENEX og klikk på Exiqon import veiviserknappen og klikk "Start". Følg instruksjonene for å velge format, instrument og plate layout filen (e). Merk at platelayoutfiler (Excel-filer) er lastet ned fra Exiqon nettsiden ( http://www.exiqon.com/plate-layout-files ).
  3. Viktigt Panels I og II, og klikk "Next".
  4. Tabellen generert etter fil import inneholder forhåndsdefinerte kolonner. Prøvenavnene kan redigeres og klassifiserings kolonner kan legges til eller fjernes på dette trinnet. Klikk "Next" når du er ferdig.
  5. Lagre data og laste til Data Editor.

2.3.2. Forbehandling av data

  1. Som anbefalt av Exiqon og GENEX, når man sammenligner flere plater den første tingen å gjøre er å kalibrere data mellom platene ved å velge inter-plate kalibreringen fra preprosessering menyen.
  2. Det anbefales å kjøre miRNA arrays i tre eksemplarer går. Hvis en miRNA ikke er til stede i minst to av tre kopier det vil bli angitt som nonexpressed.
  3. I neste trinn i forbehandling, satt en avskåret. Definere en avskåret verdi angir at data med en terskel syklus (C t) høyere enn denne verdien forkastes. I de foreliggende eksperimenter ved hjelp av cerebrospinalvæske prøven, ble avskåret angitt ved 39. Therefore vil alle prøver med en C-t større enn 39 i de tre kopier kastes. Hvis en miRNA har en C-t> 39 for en probe (en kopi av tre), at avlesning skal erstattes med gjennomsnittet av C t for de to andre prober, forutsatt at de begge er under 39.
  4. Definer referanse gener. GENEX Professional har muligheten til å benytte geNorm og / eller NormFinder å identifisere referanse gener. Velg en liste over mirnas som har lignende Cq verdier på tvers av alle prøve og kjøre geNorm og / eller NormFinder. I henhold til denne analysen, i eksempelet gitt her, Mir-622 og Mir-1266 hadde den mest ensartede verdier for prøvene og ble valgt som referansegener (figur 1).
  5. Deretter blir data normalisert ved hjelp av referansegener, og verdiene oppnådd tilsvare A C T
  6. Hvis ble utført cDNA syntese reaksjoner i triplicates, på dette punktet verdiene skal i gjennomsnitt.
  7. Validere ark å reflytte tomme og nesten tomme kolonner. I forbehandling vinduet velger du "Bekreft ark" og enn søke på Fjern tomme kolonner linje. I linjen nedenfor, valgte den ønskede andel av gyldige data og klikk gjelde. For eksempel, velg 100% hvis du ønsker å sammenligne bare mirnas felles for alle prøvene.
  8. Håndtere manglende data.
    Velg "Manglende data" fra forhåndsbehandling menyen og valgte ett av alternativene for å håndtere manglende data. Dette trinnet er nødvendig. Merk at GENEX vil gi deg feil hvis du prøver å laste inn filer som inneholder Ubehandlede manglende data.
  9. Bestem relativ kvantifisering mellom grupper av prøver (dvs.. Eksperiment versus kontroll). Relativ kvantifisering blant grupper er beregnet ved hjelp av ΔΔ C t-metoden. I GENEX, klikker du på fanen forbehandling og velg relativ kvantifisering. I vinduet velger du referansegruppen og traff gjelder. Merk at for grafiske fremstillinger og / eller for videre statistiske analyser, expression data skal konverteres til en logaritmisk skala. I forbehandling menyen, velg log2.

2.3.3. Statistisk analyse

GENEX programvaren tillater et bredt spekter av statistiske analyser, inkludert T-test og ANOVA.

  1. Legg den endelige mdf filen inn GENEX og åpne data manager. Det er viktig å velge de korrekte prøver eller grupper av prøver som statistisk analyse utføres.
  2. Velg "Statistikk" og valgte ikonet som tilsvarer ønsket test.
  3. Klikk "Kjør" i kontrollpanelet vinduet. Lagre resultater som excel eller mdf filer.

2.3.4. Expression profilering

MicroRNAs og prøvene kan klassifiseres, gruppert, og visualisert på varme kart og dendrogrammer, som følger

  1. Legg den endelige mdf filen inn GENEX og åpne data manager. Bruk dette vinduet til å velge og lage grupper på prøver eller miRNAs. Klikk på "Apply" når du er ferdig.
  2. <li> I øvre venstre hjørne velger klynge og klikk på heatmap ikonet
  3. I panelet vinduet kontroll klikk "Kjør". Heatmap kan lagres i ulike formater som TIFF eller BMP, det kan også bli kopiert og modifisert etter behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultater fra denne studien, har tidligere blitt publisert en. Figur 1 viser resultatene fra analysen av kandidatreferanse microRNAs bruker geNorm søknad. Følgelig to microRNAs, Mir-622 og Mir-1266, ble identifisert som referanse gener og ble brukt til å normalisere miRNA verdier.

For CSF studien vi hadde tre grupper av prøver: HIV-(n = 10), HIVE (n = 4), og HIV + uten Encefalitt (HIV +, n = 5). De to gruppene, HIVE og HIV +, ble sammenlignet med kontrollgruppen HIV-gruppen. Etter statistisk analyse (avsnitt 2.3.3) uttrykk nivåer av elleve microRNAs ble funnet statistisk signifikant en. Figur 2 representerer en boks Handlingen i denne elleve microRNAs, Mir-1203,-1224-3p, -182 *,-19b-2 *, -204,-362-5p, -484, -720, -744 *, -934, og -937. Hver kolonne viser fordelingen av data på tvers av prøvene i gruppen (grønn for HIVE og rødt for HIV + uten encephalitis). Værhår indikerer medianen, den 1 st (Q1) og 3 rd (Q3) kvartil, og maksimums-og minimums nonoutliers.

Figur 1
Figur 1. Grafisk bar som viser resultater fra geNorm søknad innen GENEX. Ti microRNAs ble analysert som mulige referanse gener og resultatene indikerer Mir-622 og Mir-1266 (røde søyler) som de mest stabilt uttrykt mirnas. Klikk her for å se større bilde.

Fig. 2
Figur 2. Box plott som viser fordelingen av data feller. Linjene i hver kolonne angir hver av de elleve miRNAs innenfor gruppene av HIVE (grønn) og HIV + uten encefalitt (HIV +, red) medianen, 1 st (Q1, bunnen av boksen) og 3 rd (Q3, topp av boksen) kvartiler, maksimums-og minimumsverdier som er nonoutliers (svarte linjer). Klikk her for å se større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MicroRNAs er små noncoding RNA som regulerer genuttrykk ved å hemme oversettelse og / eller fremme mRNA degradering to. På grunn av deres høye stabilitet i celle-frie betingelser, har microRNAs blitt påvist i mange kroppsvæsker. Videre har distinkte ekspresjonsprofilen av microRNAs blitt korrelert med stadium og / eller progresjon i forskjellige humane kreftformer 3-9.

Det finnes flere verktøy tilgjengelig for å profilere microRNAs, inkludert klassiske chip arrays eller den nyeste dyp sekvensering teknologi. Imidlertid, har vi valgt å benytte en svært følsom qPCR plattform 10, 11, som har den ytterligere fordelen av å kreve minimal mengde av RNA. Den miRCURY LNA Universal RT mikroRNA PCR protokollen er optimalisert for å bruke 20 ng total RNA per 20 mL cDNA syntese reaksjon, 40 ng for hele to-panelantenne. Å ha muligheten til å bruke liten mengde RNA er svært viktig når du arbeider med verdifull e og vanskelige å få kliniske prøver som CSF eller formalinfiksert parafin-embedded vev en. Viktigere, utnytte lave mengder RNA redusere konsentrasjonen av mulige inhibitorer som finnes i prøven. Utenfor rekkevidde Ct verdier for pigg-in vil sannsynligvis indikere tilstedeværelse av noen hemmere i prøven. Pigg-in prober kan kjøpes separat å teste prøvene for tilstedeværelse av inhibitorer før miRNA profilering. For denne test er enkel sanntid PCR utført ved bruk av økende konsentrasjoner av RNA (enten ng or ul).

I den foreliggende protokoll, rapporterer vi den organiske fase ekstraksjon før RNA isolering. Det bør bemerkes at mange nye RNA ekstraksjon kits ikke krever denne fremgangsmåten. For eksempel har vi lykkes profilert plasma miRNAs hjelp av miRCURY RNA isolert kit biofluids for RNA-ekstraksjon direkte fra 200 pl plasma (data ikke vist), uten fenol / kloroform ekstraksjon.

_content "> Generelt er det viktig å utforme forsøket på forhånd for å bestemme den riktige antall replikater for å oppnå statistisk signifikante resultater. Antall replikater kan være avhengig av antallet prøver som skal analyseres, og kan avhenge variasjoner innenfor de prøver eller gruppe av prøver. For vår studie, som vi brukte et relativt lavt antall prøver, 20 totalt, har vi besluttet å sette opp cDNA syntese reaksjonen i triplicates. Consulting med en biostatistician før du setter opp forsøkene kan være et klokt valg, og er sterkt anbefalt.

Bestemmelse av C t avskåret verdien er viktig, og avhenger av typen av prøver, for høyt uttrykte miRNAs det kan settes til mellom 25 til 35, men for lav til uttrykk miRNAs, som våre CSF-prøver, kan settes høyere. Et annet kritisk punkt når det gjelder dataanalyse er valget av referanse gen (er). For noen robuste data (for eksempel miRNA profilering i dyrkede celler) agLobal normalisering, som representerer den gjennomsnittlige C t for alle prøvene, kan anvendes. Men dette er ikke et alternativ for prøver som CSF som presenterer variasjoner. Tilsvarende kunne vi ikke bruke som referanse gener de MiRNAs som er generelt ansett uendret i kroppsvæsker. I stedet valgte vi alle miRNAs som viste lignende C t på tvers av alle prøvene, inkludert kopier, og kjørte geNorm analyse tilgjengelig i GENEX (Figur 1). Resultatene indikerte Mir-1266 og Mir-622 som de minst variabelt uttrykt mirnas og de ble brukt som referanse gener. Sammenligning av ekspresjonen av miRNAs mellom grupper kan bestemmes ved hjelp av den relative mengdeverktøyet i Genex, som følger standarden formelen 2 - (Ct-Ctrel). Endelig kan resultatene bli visualisert som varme kartdiagram, grafiske stolper eller andre typer plott, som i feltet plottet i figur 2.. Andre typer visualisering tilgjengelige i GENEX inkluderer hierarkisk clustering,Selvorganisert Kart (SOM), og Principal Component Analysis (PCA). I tillegg til miRNAs kan Genex programvaren brukes for analyse av andre typer av matriser som lange noncoding RNA (lncRNAs) profilering. Platen layout kan importeres i excel-format og data kan håndteres som beskrevet for miRNA analyse. Faktisk har vi profilert lncRNAs fra primær embryonale mus kortikale nevroner bruker Mirvana miRNA isolasjon kit som beskrevet i trinnene ovenfor, og vi analysert data ved hjelp GENEX (upubliserte resultater).

I sammendraget, beskrev vi en protokoll for å profilere microRNAs i cerebrospinalvæsken. Med noen modifikasjoner i forbindelse med RNA-ekstraksjon, kan denne fremgangsmåten tilpasses til profil miRNAs i andre kroppsvæsker og / eller andre typer vev. Legg merke til at i den fremgangsmåte som er beskrevet her, er et trinn med organisk ekstraksjon utføres før RNA isolasjon. Generelt er dette ikke nødvendig ved bruk av kommersielt tilgjengelige kit, slik som Mirvana Paris extraction kit. I tillegg blir ved ekstrahering RNA fra kroppsvæsker og en bærer-RNA tilsettes til prøvene er det ikke nødvendig å kvantifisere RNA og 2-8 pl RNA er utsatt for cDNA-syntese. Fra vår erfaring og vurderer de høye kostnadene knyttet til denne typen eksperimenter, anbefaler vi at du tester noen prøver først, og deretter konsultere med en statistiker for antall prøver / kopier for å bli profilert for å oppnå statistisk signifikante resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Prosjektet er beskrevet ble støttet av Award Antall R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) fra National Institute of Mental Health. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institute of Mental Health eller National Institute of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Table 3. List of equipment.

Finnpipette Novus Multichannel Pipetter

Thermo Scientific

HH05279

Finntip Pipette Tips

Thermo Scientific

9400613

Thermal Cycler C1000

Biorad

0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes

Biorad

TLS0801

Flat Cap Strips

Biorad

TLS0803

LightCycler 480 Real-Time PCR System

Roche

LightCycler 480 Sealing Foil

Roche

04 729 757 001

Refrigerated Centrifuge 5804R

Eppendorf

Swing-bucket Rotor, 4-place

Eppendorf

A-4-44

Bench-Top Mini Centrifuge

Fisher

05-090-100

Bench-Top Vortex

Fisher

1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized

Fisher

02-681-5

Matrix Reagent Reservoir, 25 ml

Thermo Scientific

8093

Thermomixer Confort

Eppendorf

Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15

Sigma

Bench-Top Vortex

Velp Scientifica

F202A0173

Table 4. List of reagents.

Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns

Exiqon

203300

SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml

Exiqon

203400

Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free

Invitrogen

10977-015

MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R

Exiqon

203608

mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations

Ambion

AM1556

MS2 RNA carrier

Roche Applied Science

10165948001

2-mercaptoethanol 98%

Sigma Aldrich

M3148-25ml

Ethanol 100%

Carlo Erba

64-17-5

Nuclease free water

Qiagen

1039480

RNAse Zap

Ambion

AM9780

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pacifici, M., et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J. Cell. Physiol. 10, (2012).
  2. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).
  3. Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).
  4. Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
  5. De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders. Brain Res. 1338, 100-111 (2010).
  6. Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).
  7. Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis. Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).
  8. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  9. Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer. Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).
  10. Blondal, T., et al. Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids. Methods. 59, 1-6 (2013).
  11. Jensen, S. G., et al. Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs. BMC Genomics. 12, 435 (2011).
Cerebrospinalvæsken MikroRNA Profilering Bruke Kvantitativ Real Time PCR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pacifici, M., Delbue, S., Kadri, F., Peruzzi, F. Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR. J. Vis. Exp. (83), e51172, doi:10.3791/51172 (2014).More

Pacifici, M., Delbue, S., Kadri, F., Peruzzi, F. Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR. J. Vis. Exp. (83), e51172, doi:10.3791/51172 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter