Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Спинномозговой жидкости профилирования микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени

doi: 10.3791/51172 Published: January 22, 2014

Summary

Мы описываем протокол ПЦР в реальном времени к профилю микроРНК в спинномозговой жидкости (ликвора). За исключением протоколов экстракции РНК, процедура может быть расширена до РНК, выделенной из других жидкостей организма, культивируемых клеток или тканей образцов.

Abstract

Микро РНК (микроРНК) составляют мощный слой регуляции генов, направляя RISC таргетинг на сайты, расположенные на мРНК и, следовательно, путем модуляции их репрессии трансляции. Изменения в экспрессии микроРНК, как было показано, участвуют в развитии всех основных сложных заболеваний. Кроме того, недавние исследования показали, что микроРНК может быть секретируется во внеклеточную среду и попадают в кровоток и другие жидкости организма, где они могут циркулировать с высокой стабильностью. Функция такого циркулирующего микроРНК остается в значительной степени неуловимым, но систематические подходы высокой пропускной способностью, такие как микроРНК профилирования массивов, привели к идентификации подписей микроРНК в нескольких патологических состояний, в том числе нейродегенеративных расстройств и несколько видов рака. В этом контексте, выявление микроРНК профиля экспрессии в спинномозговой жидкости, о чем сообщается в недавнем исследовании, делает микроРНК привлекательными кандидатами для анализа биомаркеров.

_content "> Есть несколько инструментов, доступных для профилирования микроРНК, такие как микрочипы, количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР), и глубокое секвенирование. Здесь мы описываем чувствительный метод для профилирования микроРНК в спинно-мозговой жидкости с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Мы использовали Exiqon микроРНК готовые к использованию ПЦР человека панелей я и II V2.R, что позволяет обнаружение 742 уникальных человеческих микроРНК. Мы провели массивы в трех экземплярах трасс и мы обработаны и проанализированы данные с помощью программного обеспечения Genex Профессиональный 5.

Используя этот протокол, мы успешно профилированного микроРНК в различных типах клеточных линий и первичных элементов, CSF, плазмы и фиксированных формалином парафин тканях.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Микро РНК относятся к семейству малых (21-23 нт в длину) некодирующих РНК, которые регулируют экспрессию генов посттранскрипционно. микроРНК может быть секретируется в межклеточное пространство, где они появляются, чтобы быть относительно стабильным. При определении изменения в экспрессии микроРНК может быть важным шагом на пути выявления биомаркеров, выполняя профили микроРНК и обработке большого количества данных может быть пугающим.

Здесь мы опишем протокол для определения изменения в экспрессии микроРНК в спинномозговой жидкости (применимой к другими биологическими жидкостями) чувствительным ПЦР в реальном времени. Мы также описывают использование программного обеспечения для анализа данных, в том числе статистического анализа и графического представления результатов. Вся процедура относительно легко и просто и, в зависимости от количества образцов, профилированных и количество машин ПЦР в реальном времени, доступных, также относительно быстро. Экспериментальная часть требует точности в обработкеРНК и пипетки в 384-луночных планшетах, в то время как раздел анализа данных с использованием Genex требуется некоторые базовые знания в области информатики и статистики.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Следующий протокол описывает стандартную процедуру, чтобы изолировать РНК из CSF и профильных микроРНК с использованием готовых ПЦР планшет. Следует отметить, что извлечение органическую фазу не является обязательным, и что РНК носитель добавляют к образцу во время экстракции, обеспечивающих максимальный восстановление РНК. Следовательно, нет необходимости количественной оценки РНК.

В целом, в среднем 6-8 пластин могут быть запущены в течение одного дня, если кДНК синтезируется накануне (около 2 часов). Анализ данных выполняется, когда все образцы были профилированы и загружаются в программное обеспечение. В зависимости от количества образцов / групп или их комбинации для сравнения, анализ данных может потребовать от одного до нескольких часов.

1. Экстракция РНК

Выделение РНК проводили на образцах CSF, хранили замороженными при -80 ° C в аликвотах до анализа. Для этой процедуры используется набор для выделения Mirvana Париж, такой прибор производителястрельчатые на общую выделения РНК. Обратите внимание, что, хотя обогащение для мелких видов РНК можно с помощью этого комплекта, этот шаг не делается, и процедура извлечения РНК закончился после полной стадии выделения РНК. Кроме того, хотя изоляция комплект Mirvana Париж (как и другие коммерчески доступных наборов изоляции РНК) не требует органической экстракции, протокол для этой процедуры можно найти ниже.
Протокол для экстракции РНК состоит из двух этапов:
1.1. Органические Добыча (не требуется, если используется Mirvana Париж набора для экстракции РНК)
1.2.2. Всего Выделение РНК

1.1. Органическая добыча

1.1.1. Подготовка реагентов

  1. Добавить 375 мкл 2-меркаптоэтанола в 2 раза Денатурирующий решение, и хранить его при температуре 4 ° C.

1.1.2. Подготовьте CSF

  1. Оттепель каждый аликвоты CSF на льду перед экстракции РНК. Добавить 1 мкг РНК MS2 носителя в 0,5 мл размороженной CSF и осторожноперемешать. Заметим, что если органический извлечение опущен, носитель MS2 будет добавлен к образцу предварительного выделения РНК, описанной в 1.2.2.1 ниже.
  2. Смешайте 0,5 мл 2 раза денатурации раствора при комнатной температуре в CSF.
  3. Добавить 1 мл кислотного фенола: хлороформа в CSF плюс 2 х денатурации раствора: обязательно выведены нижнюю фазу, содержащую кислотно-фенол: хлороформ, а не водном буфере, который лежит на верхней части смеси. Кроме того, обратите внимание, что кислота фенол: хлороформ содержит фенол, который является ядом и раздражителем, используйте перчатки и другое оборудование и средства индивидуальной защиты при работе с этим реагентом.
  4. Vortex для 30-60 сек перемешать. Для удобства, 2 мл образца / денатурации раствора / кислотно-фенол: хлороформ смесь делятся на две пробирки 1,5 мл Eppendorf.
  5. Центрифуга течение 5 мин при максимальной скорости (10000 мкг) при комнатной температуре.
  6. Осторожно снимите водный (верхний) фазу, не нарушая нижнюю фазу или интерфазу и передать его насвежий труба. Обратите внимание на объем восстановлены.

1.2. Выделение РНК

Рекомендуется иметь специальный стенд, набор пипеток и стеллажи для обработки образцов РНК. Рабочая зона и инструменты обеззараживают с помощью РНКазы Zap спрей и салфетки до каждого эксперимента.

1.2.1. Подготовка реагентов:

  1. Добавить 21 мл 100% этанола, микроРНК промывочного раствора 1 и 40 мл 100% этанола, чтобы промывочного раствора 2/3. Обратите внимание, что микроРНК промывочный раствор 1 содержит гуанидина тиоцианата, который является потенциально опасным веществом.

1.2.2. Всего Выделение РНК

  1. Добавить 1,25 объемы комнатной температуре 100% этанола в водной фазы от органической экстракции и тщательно перемешать.
  2. Поместите фильтр-патрона в один из Коллекция трубок.
  3. Пипеток не более 700 мкл лизата / этанол на фильтр-картридж.
  4. Центрифуга в течение 30 сек при максимальнойскорость. Нанесите смесь превышающую 700 мкл в последовательном применении к тому же фильтр. Откажитесь от проточных после каждого центрифугирования и сохранить пробирку на стадии отмывки.
  5. Применить 700 мкл микроРНК промывочного раствора 1 к картридж фильтра и центрифуги в течение 15 сек при максимальной скорости. Откажитесь от потока через от пробирку и заменить фильтр-патрона в ту же пробирку.
  6. Применить 500 мкл промывочного раствора 2/3 и центрифуги в течение 15 сек при максимальной скорости. Откажитесь от потока через от пробирку и заменить фильтр-патрона в ту же пробирку. Нанесите второй 500 мкл промывочного раствора 2/3 и центрифуги в течение 15 сек при максимальной скорости. Откажитесь от потока через от пробирку и заменить фильтр-патрона в ту же пробирку. Спин сборку в течение 1 мин при максимальной скорости для удаления остаточной жидкости из фильтра.
  7. Перенести фильтр-патрона в свежем пробирку. Применить 100 & му; Л предварительно нагретого (до 95 ° С) нуклеазы без воды до центра фильтра и закройте крышкой. Центрифуга в течение 30 сек с максимальной скоростью, чтобы восстановить РНК.
  8. Сбор Элюат, содержащий РНК и хранить его при температуре -80 ° С в течение последующих применений.
  9. Количественная 1 мкл РНК с помощью NanoDrop 2000C спектрофотометр. Следует отметить, что количественное РНК может быть пропущен, если РНК носитель добавляют к образцу во время экстракции РНК. В этом случае 8 мкл РНК подвергают синтеза кДНК, как описано ниже.

2. микроРНК профиля: Qrt-ПЦР протокол

Протокол для микроРНК профилирования состоит из двух этапов:

  1. Первой цепи синтеза кДНК
  2. ПЦР в реальном времени усиления

2.1. Первой цепи синтеза кДНК

2.1.1. Развести матричную РНК

  1. Регулировка каждого из образцов РНК шаблона до концентрации 5 нг / мкл с использованием нуклеазы свободной воды. ЕслиРНК не определены (см. шаг 1.2.2.9), а затем 8 мкл РНК используются для синтеза кДНК

2.1.2. Подготовка реагентов

  1. Осторожно растопить 5x реакционного буфера и нуклеазному свободной воды, и сразу же разместить на льду.
  2. Смешайте встряхиванием. Ресуспендируют РНК шип в добавлением 40 мкл нуклеазы свободной воды к трубке и перемешать на вортексе; оставить его на льду в течение 15-20 мин. Непосредственно перед использованием, удалите смеси ферментов из морозильника, смешать, щелкая трубки и поместить на лед. Спином вниз все реагенты.

2.1.3. Обратный установки реакция транскрипции

  1. Подготовьте необходимое количество РТ рабочего раствора в 1,5 мл трубки Эппендорф, или эквивалент (в пропорциях, указанных в таблице 1, для РНК-матрицы исключением), перемешать встряхиванием (1-2 сек на максимальной скорости), кратко спином вниз ( мы используем мини Eppendorf центрифуги с фиксированной скоростью, 10 сек) и поместить его на льду. Обратите внимание, что РНК шип UniSp6В добавлении к образцу до реакции RT (см. таблицу 1).
  2. Внесите рабочего раствора RT в нуклеазных бесплатно ПЦР пробирок.
  3. Не включать матричную РНК в каждую пробирку.
    Примечание: не забудьте рассчитать 10% избыточного объема / каждый реагент для пипетки и / или роботизированной мертвого объема.
    Реагент Панель Я Объем (мкл) Панель I + II Объем (мкл)
    5x реакционного буфера 4.4 8.8
    Нуклеазы свободной воды 9.9 19.8
    Смесь ферментов 2.2 4.4
    UniSp6 РНК Спайк в шаблоне 1.1 2.2
    Шаблон общую РНК (5 нг / мкл) 4.4 8.8 Общий объем 22 44

    Таблица 1. Обратный настройки реакции транскрипции.

2.1.4. Смешайте и спин реагентов

  1. Смешайте реакцию нежной (1-2 сек) встряхиванием убедиться, что все реагенты тщательно перемешивают. После смешивания, спин вниз (мини Eppendorf центрифуги с фиксированной скоростью, 10 сек).

2.1.5. Выдержите и нагревать инактивированную

  1. Программирование машину ПЦР следующим образом:
  2. Инкубировать в течение 60 мин при 42 ° С
  3. Тепло-инактивации обратной транскриптазы в течение 5 мин при 95 ° С
  4. Остудите до 4 ° С
  5. Хранить при температуре 4 ° С или замораживания
    Примечание: протокол может быть прерван на данном этапе. Неразбавленный кДНК можно хранить при температуре -20 ° С в течение до 5 недель (опционально Хранить при температуре 4 ° С в течение 4 суток).

2.2.1. Подготовка реагентов для ПЦР в реальном времени

  1. Наведите кДНК (с шага 2.1.5) на льду.
  2. Оттепель нуклеазы свободной воды и ПЦР Мастер смесь на льду. Защита ПЦР флаконов Master Mix от света, покрывая их алюминиевой фольгой. Непосредственно перед использованием смешайте Master Mix ПЦР встряхиванием 1-2 секунды в мини центрифуги и спином вниз при 1500 мкг в течение 1 мин.

2.2.2. Объединить SYBR Green основной смеси, воду и кДНК и добавить в ПЦР планшет

Следующая процедура рекомендуется избегать низкие концентрации кДНК от присоединения к поверхности трубы:

  1. Перед снятием пластины печать, кратко спин вниз пластину (ы) в охлажденном центрифуге при 1500 мкг в течение 1 мин.
  2. В 15 мл коническую трубку, объединить 2x PCR Master смесь и воду. Панель I: 2000 мкл 2x мастер микс и 1980 мкл воды; Панель I + II: 4000 мкл 2x мастер микс и 3960 μ; Л воды.
  3. Добавить 20 мкл кДНК (панель I) или 40 мкл кДНК (панель I + II) и перемешать.
  4. Осторожно перемешать встряхиванием 1-2 секунды и спином вниз в охлаждаемой центрифуге при 1500 мкг в течение 1 мин.
  5. Поместите PCR Master Mix / кДНК смесь в резервуаре пипетки многоканальный. Вы можете иметь идентифицировать резервуар, который имеет длину многоканальной пипетки. Это держит уровень громкости достаточно высоко позволяет равные аликвоты объемом по всему многоканальный. Это очень важно в направлении последних нескольких аликвот.
  6. Разлить по 10 мкл PCR Master Mix / кДНК смешивать в каждую лунку 384-луночного планшета с помощью пипетки 16-канала.
  7. Уплотнение тарелку с оптическим уплотнением.
  8. Спин пластину кратко в охлаждаемой центрифуге (1500 мкг в течение 1 мин), для смешивания растворов и удаления пузырьков воздуха.

    Примечание: эксперимент может быть приостановлена ​​в этой точке. Хранить реакции защищенном от света месте при 4 ° С в течение до 24 часов.

2.2.3. В режиме реального времени PCR

Выполните в режиме реального времени ПЦР-амплификации и анализа кривых плавления следующие параметры, указанные в таблице 2.

Шаг процесса Настройки, Рош LC480
Полимеразной Активация / Денатурацию 95 ° С, 10 мин
Усиление 45 амплификации циклов при
95 ° С, 10 сек
60 ° С, 1 мин
Разгона скорость
1.6 ° C / сек
Оптический чтения
Таяние анализ кривой Да

Таблица 2. ПЦР в реальном времени условия цикла с использованием Roche LightCycler 480.

2.3. В режиме реального времени анализ данных ПЦР

В режиме реального времени анализ данных ПЦР делается с Exiqon Genex Professional 5.0, после тон рекомендовал инструкции. Genex шаг за шагом руководство может быть загружен в http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
Анализ данных состоит из трех этапов:

  1. Импорт данных
  2. Предварительная обработка данных
  3. Статистический анализ

2.3.1. Импорт данных

  1. В Рош LightCycler 480 выбора способа й производной анализа 2 и вычислить значения CQ. Данные экспортируются в виде таблицы и сохранить как текстовые файлы.
  2. Для импорта данных, открытая Genex и нажмите на кнопку Мастер импорта Exiqon и нажмите кнопку "Пуск". Следуйте инструкциям, чтобы выбрать формат, инструмент и пластины файл (ы) макета. Обратите внимание, что пластины файлы макета (Excel файлы) загружаемые с веб-сайта Exiqon ( http://www.exiqon.com/plate-layout-files ).
  3. Imporт Панели я и II и нажмите «Далее».
  4. В таблице генерируется после импорта файла содержит предопределенные столбцы. Образцы имена могут быть отредактированы и столбцы классификации могут быть добавлены или удалены на этом шаге. Нажмите "Next", когда вы сделали.
  5. Сохранить данные и загрузить в редакторе данных.

2.3.2. Предварительная обработка данных

  1. В соответствии с рекомендацией Exiqon и Genex, при сравнении нескольких пластин первое, что нужно сделать, это для калибровки данных между пластинами, выбрав калибровку между пластиной из меню предварительной обработки.
  2. Рекомендуется для работы массивов микроРНК в трех экземплярах трасс. Если микроРНК нет в по крайней мере два из трех реплик он будет установлен как nonexpressed.
  3. На следующем этапе в предварительной обработки, установить отсечения. Определение отрезать значение указывает, что данные с пороговым цикла (С т) выше этого значения, отбрасываются. В нынешних экспериментов с использованием спинномозговой образец жидкости, отрезать был установлен на уровне 39 лет. ТамEfore, все образцы с C т выше, чем 39 в трех реплик, будут отвергнуты. Если микроРНК имеет С т> 39 для одного зонда (один реплики из трех), что чтение будет заменен в среднем по C T для двух других зондов, при условии, что они оба ниже 39.
  4. Определить эталонные гены. Genex Профессиональный имеет возможность, чтобы использовать geNorm и / или NormFinder определить опорные гены. Выберите список микроРНК, которые имеют аналогичные значения CQ по всей выборке и работают geNorm и / или NormFinder. Согласно этому анализу, в примере представленная здесь, микроРНК-622 и микроРНК-1266 были самые единые ценности через образцов и в качестве опорных генов были выбраны (рис. 1).
  5. Далее, данные нормализованы с помощью опорных генов и полученные величины соответствуют ΔC т
  6. Если реакции синтеза кДНК проведены трижды, на данный момент значения должны быть усреднены.
  7. Подтвердить лист повторнодвигаться пустые и почти пустые столбцы. В окне предварительной обработки выберите "Подтвердить лист" и того, чтобы применять на Удалить пустые столбцы линии. В приведенном ниже линии, выбрал нужный процент достоверных данных и нажмите применить. Например, выберите 100%, если вы хотите сравнить только микроРНК, общие для всех образцов.
  8. С отсутствующими данными.
    Выберите "Нет данных о" из меню предварительной обработки и выбрал один из вариантов поступить с отсутствующими данными. Этот шаг необходим. Обратите внимание, что Genex даст вам ошибку, если вы попытаетесь установить файлы, которые содержат необработанные недостающие данные.
  9. Определить относительную количественную между группами образцов (то есть. Эксперимента в сравнении с контролем). Относительная количественная среди групп рассчитывается с использованием метода т ΔΔ C. В Genex, перейдите на вкладку предварительной обработки и выберите относительную количественную. В окне выбора референтной группы и нажмите применить. Заметим, что для графического представления и / или для дальнейших статистических анализов, выражениеДанные Эссионе должны быть преобразованы в логарифмической шкале. В меню предварительной обработки, выберите log2.

2.3.3. Статистический анализ

Программное обеспечение Genex позволяет широкий спектр статистических анализов, в том числе Т-теста и ANOVA.

  1. Загрузите конечный файл МДФ в Genex и открытого менеджера данных. Очень важно выбрать правильные образцы или группы образцов, для которых выполняется статистический анализ.
  2. Выберите "Статистика" и выбрал значок, соответствующий желаемому теста.
  3. Нажмите кнопку "Выполнить" в окне панели управления. Сохранение результатов в виде Excel или МДФ файлов.

2.3.4. Профилирование Выражение

Микро РНК и образцы могут быть классифицированы, собраны, и визуализируется на тепловых карт и дендрограмм, как следует

  1. Загрузите конечный файл МДФ в Genex и открытого менеджера данных. Используйте это окно для выбора и создания групп образцов или микроРНК. Нажмите кнопку "Применить", когда вы сделали.
  2. <литий> В левом верхнем углу выберите кластера и нажмите на значок Тепловая карта
  3. В окне панели управления выберите "Выполнить". Тепловая карта может быть сохранен в различных форматах, таких как TIFF или BMP, а также может быть скопирована и изменена по мере необходимости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Результаты этого исследования были опубликованы ранее 1. Рисунок 1 показывает результаты анализа кандидатов справочных микроРНК с использованием приложения geNorm. Соответственно, два микроРНК, микроРНК-622 и микроРНК-1266, были определены в качестве эталонных генов и были использованы для нормализации значений микроРНК.

Для изучения CSF у нас было три группы образцов: ВИЧ-(н = 10), HIVE (п = 4) и HIV + без энцефалита (ВИЧ +, п = 5). Эти две группы, улей и ВИЧ +, были по сравнению с контрольной ВИЧ-группы. После статистического анализа (раздел 2.3.3) уровни экспрессии одиннадцати микроРНК был найден статистически значимым 1. Рисунок 2 представляет собой коробку Сюжет этой одиннадцати микроРНК, микроРНК-1203,-1224-3p, -182 *,-19b-2 *, -204,-362-5р, -484, -720, -744 *, -934, -937 и. Каждая колонка показывает распределения данных по образцам в группе (зеленый для улья и красный для ВИЧ + без ENCEphalitis). Усы указывает медианное значение, 1-й (Q1) и 3-е место (Q3) квартиль и максимальные и минимальные nonoutliers.

Рисунок 1
Рисунок 1. Графический полоса, показывающая результаты применения geNorm в Genex. Десять микроРНК были проанализированы в качестве возможных справочных генов и результаты показывают, микроРНК-622 и микроРНК-1266 (красные полоски) как наиболее стабильно выраженных микроРНК. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2
Рисунок 2. Коробка график, показывающий распределение данных фили каждый из одиннадцати микроРНК внутри групп энцефалопатии (зеленый) и ВИЧ + без энцефалита (ВИЧ +, красный). Усы в каждой колонке указывают медиану, 1-й (Q1, дно коробки) и 3-е место (3 квартал, верхний из коробки) квартили, максимальные и минимальные значения, которые nonoutliers (черные линии). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Микро РНК являются малые РНК некодирующих, которые регулируют экспрессию генов путем ингибирования перевод и / или содействие деградации мРНК 2. Благодаря своей высокой стабильности в условиях бесклеточных, микроРНК были обнаружены во многих жидкостях организма. Кроме того, отличие профиль экспрессии микроРНК коррелирует со стадией и / или прогрессирования в различных опухолей человека 3-9.

Есть несколько инструментов, доступных в профиль микроРНК, в том числе классических массивов чип или последней технологии глубокой секвенирования. Тем не менее, мы решили использовать высокочувствительный КПЦР платформу 10, 11, который имеет дополнительное преимущество, требующих минимального количества РНК. Протокол miRCURY МШУ Универсальный РТ микроРНК ПЦР оптимизировано для использования 20 нг общей РНК в 20 мкл кДНК реакции синтеза, 40 нг для полного массива из двух панелей. Имея возможность использовать небольшое количество РНК очень важно при работе с valuabl е и с трудом поддающимися получить клинические образцы, такие как CSF или фиксированных формалином парафин тканях 1. Важно отметить, что использование небольших количеств РНК свести к минимуму концентрацию возможных ингибиторов, присутствующих в образце. Из значений Ct диапазон для всплеска заезда, скорее всего, указывают на наличие некоторых ингибиторов в образце. Спайк в зонды могут быть приобретены отдельно для тестирования образцы на наличие ингибиторов до микроРНК профилирования. Для этого теста, один ПЦР в реальном времени выполняются с использованием возрастающих концентраций РНК (будь нг или мкл).

В настоящем протоколе, мы сообщаем органическую добычу фазе до выделения РНК. Следует отметить, что многие новые наборы экстракции РНК не требуют эту процедуру. Например, мы успешно профилированные в плазме с помощью микроРНК miRCURY набор для выделения РНК biofluids для экстракции РНК непосредственно с 200 мкл плазмы (данные не показаны), без экстракции фенолом / хлороформом.

_content "> В общем, важно разработать эксперимент заранее, чтобы определить надлежащее количество повторов, необходимых для получения статистически значимых результатов. Количество повторов может зависеть от количества проб для анализа и может зависеть от вариации внутри образцов или группы образцов. Для нашего исследования, для которого мы использовали относительно небольшое количество образцов, 20 в общей сложности, мы решили настроить реакцию синтеза кДНК в трех экземплярах. Консалтинг с biostatistician перед постановке эксперимента может быть мудрым выбором и очень рекомендуется.

Определение C T пороговая величина является важным и зависит от типа образцов; для высокой экспрессией микроРНК он может быть установлен между 25-35, но для низких выраженных микроРНК, например, наших СМЖ, может быть установлена ​​выше. Другим важным шагом, когда дело доходит до анализа данных является выбор опорной гена (ов). Для некоторых надежных данных (таких как микроРНК профилирования в культивируемых клетках) AGЛОБАЛЬНАЯ нормализация, которая представляет среднее С Т всех образцов, могут быть использованы. Однако, это не вариант для образцов, как CSF, которые представляют вариации. Точно так же, мы не могли использовать в качестве опорных генов эти микроРНК, которые обычно считаются неизменными в жидкостях организма. Вместо этого, мы выбрали все микроРНК, которые показали аналогичную C T во всех образцах, включая реплик, и побежал анализ geNorm доступный в Genex (рис. 1). Результаты показали, микроРНК-1266 и микроРНК-622, как наименее переменно выраженных микроРНК, и они были использованы в качестве опорных генов. Сравнение экспрессии микроРНК между группами можно определить с помощью относительного количественного инструмент в Genex, который следует стандартную формулу 2 - (Ct-Ctrel). Наконец, результаты могут быть представлены в виде диаграмм тепла карте, графических баров или других типов участков, таких как коробки участка на рисунке 2. Другие типы визуализации, доступные в Genex включают иерархическую кластеризацию,Самоорганизованная Карта (СДЛ), и главный компонент (PCA). В дополнение к микроРНК, программное обеспечение Genex могут быть использованы для анализа других типов решеток, таких как длинных некодирующих РНК (lncRNAs) профилирования. Макет пластины могут быть импортированы в формате первенствовать и данные могут быть обработаны, как описано для анализа микроРНК. Действительно, мы профилированного lncRNAs из первичных эмбриональных мышиных нейронов коры, используя набор для выделения Mirvana микроРНК, как описано в вышеупомянутых шагов, и мы проанализировали данные, используя Genex (неопубликованные результаты).

Таким образом, мы описали протокол к профилю микроРНК в спинномозговой жидкости. С некоторыми модификациями, связанных с выделения РНК, эта процедура может быть приспособлена к профилю микроРНК в других жидкостях организма и / или другого типа ткани. Заметим, что в методике, описанной здесь, шаг органической экстракции выполняется до выделения РНК. В общем, это и не требуется при использовании коммерчески доступных наборов, таких как Mirvana Париж добraction комплект. Кроме того, при экстракции РНК из жидкостей организма и РНК-носитель добавляют в образцах нет необходимости количественной оценки РНК и 2-8 мкл РНК подвергают синтеза кДНК. Исходя из нашего опыта и учитывая высокие расходы, связанные с этим типом экспериментов, мы рекомендуем проверить несколько образцов, а затем консультации с статистиком в ряде образцов / реплик быть профилированными для получения статистически значимых результатов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Проект описывается поддержали Award Количество R01MH079751 (PI: Ф. Перуцци) из Национального института психического здоровья. Содержание является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института психического здоровья или Национального института здоровья.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Table 3. List of equipment.

Finnpipette Novus Multichannel Pipetter

Thermo Scientific

HH05279

Finntip Pipette Tips

Thermo Scientific

9400613

Thermal Cycler C1000

Biorad

0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes

Biorad

TLS0801

Flat Cap Strips

Biorad

TLS0803

LightCycler 480 Real-Time PCR System

Roche

LightCycler 480 Sealing Foil

Roche

04 729 757 001

Refrigerated Centrifuge 5804R

Eppendorf

Swing-bucket Rotor, 4-place

Eppendorf

A-4-44

Bench-Top Mini Centrifuge

Fisher

05-090-100

Bench-Top Vortex

Fisher

1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized

Fisher

02-681-5

Matrix Reagent Reservoir, 25 ml

Thermo Scientific

8093

Thermomixer Confort

Eppendorf

Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15

Sigma

Bench-Top Vortex

Velp Scientifica

F202A0173

Table 4. List of reagents.

Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns

Exiqon

203300

SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml

Exiqon

203400

Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free

Invitrogen

10977-015

MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R

Exiqon

203608

mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations

Ambion

AM1556

MS2 RNA carrier

Roche Applied Science

10165948001

2-mercaptoethanol 98%

Sigma Aldrich

M3148-25ml

Ethanol 100%

Carlo Erba

64-17-5

Nuclease free water

Qiagen

1039480

RNAse Zap

Ambion

AM9780

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pacifici, M., et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J. Cell. Physiol. 10, (2012).
  2. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).
  3. Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).
  4. Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
  5. De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders. Brain Res. 1338, 100-111 (2010).
  6. Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).
  7. Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis. Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).
  8. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  9. Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer. Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).
  10. Blondal, T., et al. Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids. Methods. 59, 1-6 (2013).
  11. Jensen, S. G., et al. Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs. BMC Genomics. 12, 435 (2011).
Спинномозговой жидкости профилирования микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pacifici, M., Delbue, S., Kadri, F., Peruzzi, F. Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR. J. Vis. Exp. (83), e51172, doi:10.3791/51172 (2014).More

Pacifici, M., Delbue, S., Kadri, F., Peruzzi, F. Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR. J. Vis. Exp. (83), e51172, doi:10.3791/51172 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter