Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

doi: 10.3791/51172 Published: January 22, 2014

Summary

Biz beyin omurilik sıvısı (BOS) microRNA profili gerçek zamanlı PCR bir protokol açıklar. RNA ekstre etme protokolleri hariç, prosedür diğer vücut sıvıları, kültürlenmiş hücreler ya da doku örneklerinden elde edilen RNA ile uzatılabilir.

Abstract

MikroRNA'lar (miRNA'lar) onların dönüşümsel baskıyı modüle ederek, dolayısıyla, mRNA'ların üzerinde bulunan siteleri hedef ve RISC yönlendirerek gen regülasyonu güçlü bir katman oluşturur. MiRNA ifadesindeki değişiklikler tüm önemli kompleks hastalıkların gelişimi dahil olmak üzere gösterilmiştir. Ayrıca, son bulgular miRNAs hücre dışı çevreye salgılanır ve yüksek stabiliteye sahip dolaşabilir kan ve diğer vücut sıvıları butonu edilebileceğini göstermiştir. Bu tür dolaşan miRNAs fonksiyonu büyük ölçüde zor olmaya devam etmektedir, ancak bu miRNA profil dizileri gibi sistematik bir yüksek veri akışı yaklaşımlar, nörodejeneratif hastalıklar ve kanser dahil olmak üzere birçok çeşitli patolojik koşullarda, miRNA imzaların tanımlanmasına yol açmıştır. Bu bağlamda, beyin-omurilik sıvısında miRNA ifade profilinin tanımlanması, bizim son çalışmada rapor edildiği gibi, biyolojik analiz için miRNAs cazip adaylar yapar.

_content "> gibi microarrays gibi microRNA, profilleme için çeşitli araçlar vardır, kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR), ve derin sıralama. Burada, kantitatif gerçek zamanlı PCR ile beyin omurilik sıvılarında microRNA profili için hassas bir yöntem açıklanmaktadır. Biz Exiqon mıkroRNA hazır kullanımlı PCR insan panelleri kullanılan I ve II sağlar V2.R, 742 eşsiz insan microRNA algılama. Biz üçlü çalıştırır diziler gerçekleştirilen ve biz genex Profesyonel 5 yazılımı kullanarak veri işleme ve analiz.

Bu protokolü kullanarak, başarılı bir şekilde hücre hatları ve primer hücreler, CSF, plazma ve formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku türlerinde microRNA profilli var.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MikroRNA'lar post-transkripsiyonel gen ifadesini düzenleyen noncoding RNA (uzunluğu nt 21-23) küçük ailesine aittir. microRNA nispeten kararlı olduğu görünen hücre dışı boşlukta salgılanabilir. MiRNA ifade değişiklikleri belirlemek miRNA profillerini performans ve veri büyük miktarda taşıma, biyolojik belirteçlerin belirlenmesi yönünde önemli bir adım olabilir iken korkutucu olabilir.

Burada, bir hassas, gerçek zamanlı PCR ile (veya diğer vücut sıvıları için geçerlidir) beyin-omurilik sıvısında miRNA ifade değişiklikleri belirlemek için bir protokol açıklar. Ayrıca, istatistiksel analiz ve sonuçların grafik gösterimi de dahil olmak üzere, veri analizi için yazılım kullanımını tarif eder. Tüm prosedür nispeten kolay ve basittir ve, profil ve gerçek zamanlı PCR makinelerin sayısı mevcut değil, aynı zamanda nispeten hızlı edilecek numune sayısına bağlı olarak değişebilir. Deneysel bölüm işlemedeki doğruluk gerektirir384-iyi plaka içine RNA ve pipetleme, genex kullanarak veri analizi bölümünde bilişim ve istatistik bazı temel bilgi gerektirir iken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aşağıdaki protokol hazır PCR plakaları kullanılarak BOS ve profil mikroRNA'lar RNA izole etmek için standart prosedür açıklanmaktadır. Organik faz özütleme isteğe bağlıdır, ve bir taşıyıcı RNA RNA maksimum iyileşme sağlanması çıkarma esnasında numuneye eklenir ki unutmayın. Sonuç olarak, RNA ölçmek için herhangi bir gerek yoktur.

CDNA (yaklaşık 2 saat) bir gün önce sentez edilir, genel olarak, 6-8 plakaları arasında bir ortalama bir gün içinde çalıştırılabilir. Tüm örnekler profilli ve yazılım yüklenmiş olduğunda verilerin analizi gerçekleştirilir. Karşılaştırma için örnek / grupları veya bunların kombinasyonu sayısına bağlı olarak, veri analizi, bir ila birkaç saat gerekebilir.

1.. RNA Ekstraksiyon

RNA ekstraksiyonu, CSF örneklerinden yapıldı depolanmış analiz edilinceye kadar alikotları -80 ° C'de donduruldu. Bu işlem için Mirvana Paris izolasyon kiti, üreticinin aletler ile, ardından, kullanılmışToplam RNA izolasyonu için seksiyonlar. Küçük RNA türlerinin zenginleştirme bu kit ile mümkün olmasına rağmen, bu adım yapılmaz ve RNA ekstraksiyon prosedürü toplam RNA izolasyonu aşamasından sonra sona erer, unutmayın. (Piyasada mevcut diğer RNA izolasyon kitleri gibi) Mirvana Paris izolasyon kiti organik çıkarma gerektirmez rağmen ek olarak, bu işlem için bir protokol aşağıda bulabilirsiniz.
RNA ekstre edilmesi için protokol, iki adımdan oluşur:
1.1. Organik Ekstraksiyon (Mirvana Paris RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak eğer gerekli değildir)
1.2.2. Total RNA izolasyonu

1.1. Organik ekstraksiyon

1.1.1. Reaktifler hazırlayın

  1. Denatüre edici bir çözüm 2x 2-merkaptoetanol ve 375 ul, ve 4 ° C'de saklayın

1.1.2. CSF hazırlayın

  1. RNA ekstraksiyon önce buz üzerinde CSF her kısım Çözülme. Yavaşça 0.5 çözülmüş CSF ml ve MS2 RNA taşıyıcının 1 ug eklemekarıştırın. Organik ekstre atlanırsa, MS2 taşıyıcı, aşağıda 1.2.2.1 'de tarif edilen örnek önce RNA izolasyonu eklenecektir unutmayın.
  2. CSF, oda sıcaklığında 2 x denatüre çözeltiden 0.5 ml karıştırın.
  3. CSF artı 2x denatüre Çözüm kloroform: asit-fenol 1 ml ekleyin kloroform, değil karışımın üstüne yatıyor sulu tampon: asit-fenol içeren alt fazı çekilmiş emin olun. Kloroform Bu reaktif ile çalışırken bir zehir ve bir tahriş edici, kullanımı eldiven ve diğer kişisel koruyucu ekipman fenol içerir: Ayrıca, asit-fenol unutmayın.
  4. 30-60 sn karıştırmak için Vortex. Kolaylık sağlamak için, numunenin 2 ml / çözelti / asit-fenol, denatüre edici: kloroform karışımı iki 1.5 ml Eppendorf tüpleri içine ayrılır.
  5. Oda sıcaklığında maksimum hızda 5 dakika (10,000 xg) için santrifüjleyin.
  6. Dikkatle alt faz veya interfazda bozmadan sulu (üst) fazının ayrılması ve bir transfertaze tüp. Iyileşti hacmi unutmayın.

1.2. RNA izolasyonu

Bu özel bir pipet seti tezgah, ve RNA örnekleri ele için rafları olması tavsiye edilir. Çalışma alanı ve araçları RNaz Zap sprey kullanılarak dekontamine ve önceden her bir deney mendil vardır.

1.2.1. Reaktifler hazırlayın:

  1. MiRNA Yıkama Çözeltisi 1,% 100 etanol içinde 21 ml ilave edilir ve yıkama çözeltisi 2/3 40 ml% 100'lük etanol. MiRNA Yıkama Çözeltisi 1 potansiyel olarak tehlikeli bir maddedir guanidiun tiyosiyanatını içerdiğini unutmayın.

1.2.2. Total RNA izolasyonu

  1. Organik ekstre gelen sulu faza oda sıcaklığında% 100 etanol içinde 1.25 hacim ekleyin ve iyice karıştırın.
  2. Toplama Tüpler birine bir Filtre Kartuşu yerleştirin.
  3. Filtre Kartuş üzerine lizat / etanol karışımı Pipet fazla 700 ul.
  4. En fazla 30 saniye boyunca santrifüjhızı. Aynı filtre arda uygulamalarda 700 ul aşan karışımı uygulayın. Her santrifüj sonra flow-through atın ve yıkama adımlar için Toplama Tüp kaydedin.
  5. Maksimum hızda 15 saniye boyunca Filtre Kartuş ve santrifüj 700 ul miRNA Yıkama Çözüm 1 uygulayın. Toplama Tüp gelen akış atmak ve aynı Koleksiyonu Tüpüne Filtre Kartuşu değiştirin.
  6. Maksimum hızda 15 saniye için 500 ul Yıkama Çözeltisi 2/3 ve santrifüj uygulayın. Toplama Tüp gelen akış atmak ve aynı Koleksiyonu Tüpüne Filtre Kartuşu değiştirin. Maksimum hızda 15 saniye süreyle ikinci bir 500 ul Yıkama Çözeltisi 2/3 ve santrifüj uygulayın. Toplama Tüp gelen akış atmak ve aynı Koleksiyonu Tüpüne Filtre Kartuşu değiştirin. Filtreden kalan sıvıyı almak için maksimum hızda 1 dakika için montaj dönerler.
  7. Taze Koleksiyonu Tüpüne Filtre Kartuşu aktarın. Uygula 100 & pl, Filtrenin merkezine önceden ısıtılmış (95 ° C) nükleaz içermeyen su içinde çözünmüş ve kapağı kapatın. RNA kurtarmak için maksimum hızda 30 saniye boyunca santrifüjleyin.
  8. Seyrelti içeren RNA toplamak ve daha sonraki uygulama için -80 ° C'de saklayın.
  9. NanoDrop 2000C spektrofotometre kullanılarak RNA'nın 1 ul ölçmek. Bir RNA taşıyıcı RNA ekstraksiyonu esnasında numuneye eklenir ise RNA miktar atlanabilir unutmayın. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bu durumda, RNA, 8 ul cDNA sentezine tabi tutulur.

2. miRNA bilgileri: Mah-PCR Protokolü

MiRNA profilleme için protokol iki adımdan oluşur:

  1. Birinci-şerit cDNA sentezi
  2. Gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu

2.1. Birinci-şerit cDNA sentezi

2.1.1. Şablonu RNA sulandırmak

  1. 5 ng / nükleaz serbest su kullanılarak ul bir konsantrasyona kadar şablon RNA numunelerinin her ayarlayın. EğerRNA (adım 1.2.2.9 bakınız) miktarı değil, daha sonra RNA 8 ul cDNA sentezi için kullanılmaktadır

2.1.2. Reaktifler hazırlayın

  1. Yavaşça 5x Reaksiyon tampon çözülme ve serbest su nükleaz ve hemen buz üzerine yerleştirin.
  2. Vorteks ile karıştırın. Süspanse RNA başak-tüpe 40 ul nükleaz ücretsiz su ekleyerek ve vorteks karışım göre; 15-20 dakika buz üzerinde bırakın. Kullanımdan hemen önce, dondurucu enzim karışımı kaldırmak tüpleri hafifçe vurarak karıştırın ve buz üzerine yerleştirin. Tüm reaktifler aşağı spin.

2.1.3. Ters transkripsiyon reaksiyonu setup

  1. Bir 1.5 ml Eppendorf tüpüne veya eşdeğer bir RT çalışma çözeltisinin gerekli miktarda hazırlayın (oranlarda RNA şablonu haricinde, Tablo 1 'de gösterilen), (maksimum hızda 1-2 saniye) vorteks karışım, kısa bir süre için (aşağı spin biz sabit hızda 10 sn) ile mini bir Eppendorf santrifüj kullanmak ve buz üzerine yerleştirin. Not UniSp6 RNA başak-(Tablo 1 e bakınız) olarak bir RT reaksiyonu önce numuneye eklenir.
  2. Nükleaz ücretsiz PCR tüpleri içine RT çalışma çözüm dağıtmak.
  3. Her bir tüp içinde template RNA dağıtın.
    Not:% 10 fazla hacmi / pipetle ve / veya robotik ölü hacim için her ayıraç hesaplamak için hatırlıyorum.
    Reaktif Panel I Hacim (ul) Panel I + II Hacim (ul)
    5x reaksiyon tamponu 4.4 8.8
    Nükleazlar ücretsiz su 9.9 19.8
    Enzim karışımı 2.2 4.4
    UniSp6 RNA Spike-in şablonunda 1.1 2.2
    Şablon total RNA (5 ng / ml) 4.4 8.8 Toplam Hacim 22 44

    Tablo 1. Transkripsiyon reaksiyonu kurulum Ters.

2.1.4. Mix ve reaktifler dönmeye

  1. Reaktif maddeler iyice karışmasını sağlamak için yumuşak (1-2 saniye) vorteks ile reaksiyonu karıştırın. Karıştırma işleminden sonra, (sabit hızda 10 sn mini Eppendorf santrifüj) aşağı doğru döndürün.

2.1.5. Inkübe ve ısı etkisizleştirilmiş

  1. Aşağıdaki gibi bir PCR Makinenizi programlamak:
  2. 42 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe
  3. 95 ° C'de 5 dakika boyunca ters transkripsiyon Isı inaktive
  4. 4 ° C'ye hemen soğuk
  5. 4 ° C veya dondurma depolayın
    Not: protokol bu aşamada kesilebilir. Seyreltilmemiş cDNA kadar 5 hafta (en fazla 4 gün süreyle 4 ° C'de isteğe bağlı mağaza) boyunca -20 ° C'de muhafaza edilebilir.

2.2.1. Gerçek-zamanlı PCR için reaktifler hazırlamak

  1. Buz üzerine (aşama 2.1.5 'dan itibaren) cDNA yerleştirin.
  2. Buz Çözülme nükleaz ücretsiz su ve PCR Master mix. Alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan PCR Master mix şişeleri koruyun. Kullanımdan hemen önce, mini santrifüj 1-2 sn vorteks PCR Master mix mix ve 1 dakika boyunca 1.500 xg'de aşağı doğru döndürün.

2.2.2. SYBR Green ana karışımı, su ve cDNA birleştirin ve PCR plakaları ekle

Aşağıdaki yordam tüp yüzeye yapışmasını cDNA düşük konsantrasyonlarını önlemek için tavsiye edilir:

  1. Plaka mühür çıkarmadan önce, kısaca 1 dakika boyunca 1.500 xg'de soğutmalı santrifüj içinde plaka (lar) aşağı doğru döndürün.
  2. 15 ml konik tüp, 2x PCR Master mix ve su birleştirir. Panel I: 2.000 ul 2x master miks ve 1980 ul su; Panel I + II: 4.000 ul 2x master miks ve 3.960 μ, L su.
  3. 20 ul cDNA (panel I) ya da 40 ul cDNA (I + II panel) ekleyin ve karıştırın.
  4. 1-2 saniye karıştırın hafifçe karıştırın ve 1 dakika boyunca 1.500 xg'de soğutmalı santrifüj içinde aşağı doğru döndürün.
  5. Bir çok kanallı pipet haznesinde PCR Master mix / cDNA karışımı yerleştirin. Bu çok kanallı pipet uzunluğuna sahip olan bir rezervuar tespit etmek gerekebilir. Bu çok kanallı boyunca eşit hacim kesri izin yeterince yüksek hacimli düzeyde tutar. Bu son birkaç alikots eleştirmekte.
  6. 10 ul PCR Master karışım dağıtın / cDNA 16 kanallı bir pipet kullanarak 384 oyuklu plakanın her oyuğuna karıştırın.
  7. Optik conta ile plaka mühür.
  8. Çözüm karıştırın ve hava kabarcıklarını çıkarmak için, soğutmalı santrifüj (1 dakika için 1.500 xg) kısaca plaka Spin.

    Not: deney bu noktada durdurulmuş olabilir. Kadar, 24 saat boyunca 4 ° C'de ışıktan korunmuş reaksiyonları saklayın.

2.2.3. Real-Time PCR

Tablo 2 'de ayrıntılı olarak aşağıdaki parametreler, gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu ve erime eğrisi analizi yapın.

Süreci Adım Ayarlar, Roche LC480
Polimeraz Aktivasyon / doğallık 95 ° C, 10 dakika
Amplifikasyon 45 Amplifikasyon döngüleri de
95 ° C, 10 saniye
60 ° C, 1 dakika
Rampa-rate
1.6 ° C / sn
Optik okuma
Erime eğrisi analizi Evet

Tablo 2. Roche LightCycler 480 kullanarak gerçek-zamanlı PCR döngüsü koşulları.

2.3. Gerçek zamanlı PCR veri analizi

Gerçek zamanlı PCR veri analizi, Exiqon genex Professional 5.0 ile yapılır aşağıdaki to talimatları tavsiye edilir. Genex adım adım kılavuzunu indirebilirsiniz http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
Veri analizi üç aşamadan oluşmaktadır:

  1. Veri ithalat
  2. Veri Ön işleme
  3. İstatistiksel analiz

2.3.1. Veri ithalat

  1. Roche LightCycler 480 yılında 2. türev analiz yöntemini seçin ve samid değerlerini hesaplamak. Veri bir tablo olarak ihraç ve metin dosyaları olarak kaydedilir.
  2. Verileri, açık genex ithalat ve Exiqon ithalat sihirbazı butonuna tıklayın ve "Başlat" tıklayın. Biçimi, alet ve plaka düzeni dosya (lar) seçmek için yönergeleri izleyin. O tabak düzeni dosyaları (excel dosyaları) Exiqon web sitesinden (indirilen Not http://www.exiqon.com/plate-layout-files ).
  3. Import Panelleri I ve II ve "İleri" butonuna tıklayınız.
  4. Dosyası ithalat sonrasında oluşturulan tablo önceden tanımlanmış sütun içerir. Örnekler isimleri düzenlenebilir ve sınıflandırma sütun eklenir veya bu aşamada çıkarılabilir. Bitirdiniz "İleri" yi tıklayın.
  5. Verilerinizi kaydedin ve Veri Editör yükleyin.

2.3.2. Veri Ön işleme

  1. Exiqon ve Genex tarafından önerildiği gibi, birden fazla tabak karşılaştırırken, yapılacak ilk şey, ön işleme menüsünden arası plaka kalibrasyon seçerek plakalar arasında veri kalibre etmektir.
  2. Bu üçlü çalışır miRNA dizileri çalıştırmak için tavsiye edilir. Bir miRNA üç kopyaları üzerinden en az ikisini içinde mevcut değilse o nonexpressed olarak kurulacaktır.
  3. Ön işlem bir sonraki adımda, bir kesim yola. Bir kesme değeri olarak tanımlama bir eşik döngüsü (C t) bu değerden daha yüksek olan veri atılır olduğunu gösterir. Beyin omurilik sıvısı örneği kullanılarak, bu deneylerde, kesme kapalı 39 olarak belirlenmiştir. Oradaefore, üç kopyaları içinde 39 daha C ton daha yüksek olan tüm örnekler atılır. Bir miRNA bir prob (üç kişiden birinin kopya) için> 39 C t varsa, bu okuma, diğer iki sondaları C t ortalama ile değiştirilir onlar 39 ikisi de aşağıda sağlanacaktır.
  4. Referans genleri tanımlamak. Genex Profesyonel referans genleri tanımlamak için geNorm ve / veya NormFinder kullanmak için seçeneği vardır. Tüm örneklem genelinde benzer samid değerlere sahip ve geNorm ve / veya NormFinder çalıştırmak miRNA'ların bir liste seçin. Bu analize göre, burada verilen örnekte, miR-622 ve miR-1266 örneklerin arasında en düzgün değerleri vardı (Şekil 1) referans genler olarak seçilmiştir.
  5. Daha sonra, veriler, referans genler kullanılarak normalize edildi ve elde edilen değerler ΔC t uyuşmaları
  6. CDNA sentez reaksiyonları üçlü olarak gerçekleştirildi, bu noktada değerler ortalaması alınmalıdır.
  7. Yeniden sayfasını doğrulamakboş ve neredeyse boş sütunları taşımak. Ön işleme penceresinde seçin "Ön Onaylayın" ve Kaldır boş sütunlar hattında uygulamak daha. Aşağıdaki satırda, geçerli verilerin istenilen yüzdesini seçti ve uygulamak tıklayın. Tüm örneklerin ortak sadece miRNA'lar karşılaştırmak istiyorsanız Örneğin,% 100 seçin.
  8. Eksik veri işlemek.
    Ön işleme menüsünden "Eksik veri" seçin ve eksik verileri işlemek için seçeneklerden birini seçti. Bu adım gereklidir. Eğer işlenmeyen eksik veri içeren dosyaları yüklemeye çalışırsanız genex size hata verecektir unutmayın.
  9. Örnekler (örneğin, kontrole karşı. Deneyi) grupları arasında nispi miktarını belirler. Gruplar arasında rölatif ölçümü ΔΔ C t yöntemi kullanılarak hesaplanır. Genex yılında, ön işleme sekmesini tıklatın ve nispi miktarını seçin. Penceresinde referans grubu seçin ve uygulayın vurdu. İfade, grafiksel gösterimleri ve / veya ileri istatistiksel analizler için unutmayınEssion verileri bir logaritmik ölçeğe dönüştürülmesi gerekir. Ön işleme menüsünde, Log2 seçin.

2.3.3. İstatistiksel Analiz

Genex yazılım T-testi ve ANOVA gibi istatistiksel analizler, geniş bir yelpazede sağlar.

  1. Genex ve açık veri yöneticisi içine nihai mdf dosya yükleyin. Bu istatistiksel analiz yapılır hangi örneklerin doğru örnekleri veya grupları seçmek için önemlidir.
  2. "İstatistik" seçeneğini seçin ve istenen teste karşılık simgesini seçti.
  3. Kontrol paneli pencerede "Çalıştır" a tıklayın. Excel veya mdf dosyaları gibi sonuçları kaydedin.

2.3.4. İfade profilleme

Aşağıdaki gibi MikroRNA'lar ve numuneler, sınıflandırılmış kümelenmiş ve ısı haritaları ve dendogramlardaki görüntülendi olabilir

  1. Genex ve açık veri yöneticisi içine nihai mdf dosya yükleyin. Numune veya miRNA'ların grupları seçmek ve oluşturmak için bu pencereyi kullanın. İşiniz bittiğinde "Uygula" yı tıklayın.
  2. <Sol üst köşesinde seçin kümede li> ve heatmap simgesine tıklayın
  3. Kontrol paneli pencerede "Çalıştır" a tıklayın. Heatmap TIFF veya bmp gibi çeşitli biçimlerde kaydedilebilir, aynı zamanda kopyalanan ve gerektiğinde değiştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu çalışmanın sonuçları, daha önceden 1 yayımlanmıştır. GeNorm uygulamasını kullanarak aday referans microRNA analizi 1. sonuçlarını gösterir Şekil. Bu duruma göre, iki microRNA, miR-622 ve miR-1266, referans genler olarak tespit edilen ve miRNA değerlerini normalize etmek üzere kullanılmıştır.

CSF çalışma için numuneler üç grup vardı: HIV-(n = 10), HIVE Ensefalit olmayan (n = 4) ve HIV + (HIV +, n = 5). İki grup, HIVE + ve HIV, HIV kontrol grubu ile karşılaştırılmıştır. Istatistiksel analizler sonucunda (bölüm 2.3.3) onbir microRNA ifade seviyeleri 1. anlamlı. 2. Bu onbir microRNA bir kutu arsa temsil Şekil bulundu, miR-1203-1224-3p, -182 *,-19b-2 *, -204,-362-5p, -484, -720, -744 * -934, -937 ve. Her sütun ence olmayan HIV + için grubun (KOVAN için yeşil ve kırmızı içindeki örneklerin üzerinden veri dağılımını göstermektedirphalitis). Bıyık medyan, 1 st (Q1) ve 3 üncü (Q3) dörttebirlik ve maksimum ve minimum nonoutliers gösterir.

Şekil 1
Şekil 1. Genex içinde geNorm uygulama sonuçlarını gösteren grafik bar. Ten microRNA mümkün referans genler ve sonuç olarak analiz edildi en stabil ifade miRNAs olarak miR-622 ve miR-1266 (kırmızı bar) gösterir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 2,
Şekil 2. Veri f dağılımını gösteren kutu arsaveya ensefalit (kırmızı HIV +) olmadan KOVAN (yeşil) ve HIV pozitifliği grupları içinde onbir miRNA'ların her. her sütunda bıyık medyan, 1 st (kutunun Q1, alt) ve 3 üncü (Q3, üst belirtmek Kutunun) çeyreklik, nonoutliers (siyah çizgiler) olan maksimum ve minimum değerler. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MicroRNA çeviri engellenmesi ve / veya mRNA bozulmasını 2 teşvik gen ekspresyonunu regüle küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar bulunmaktadır. Nedeniyle hücre içermeyen koşullarda yüksek kararlılık, microRNA birçok vücut sıvılarında tespit edilmiştir. Ayrıca, microRNA ayrı ekspresyon profili, insan kanserlerinin 3-9 çeşitli sahne ve / veya ilerlemesi ile ilişkili olmuştur.

Klasik çip dizilimleri veya son derin sıralama teknolojisi dahil microRNA profil mevcut çeşitli araçları vardır. Bununla birlikte, az miktarda RNA'ların gerektiren ek bir avantaja sahiptir, son derece hassas QPCR platformu 10, 11, kullanmak için tercih. MiRCURY LNA Evrensel RT mıkroRNA PCR protokolü 40 tam iki panel dizisi için ng, 20 ul cDNA sentez reaksiyon başına ng toplam RNA 20 kullanmak için optimize edilmiştir. Valuabl ile uğraşırken RNA, az miktarda kullanma seçeneği olması oldukça önemlidir e ve bu CSF veya formalin ile fikse parafine gömülü dokularda 1 gibi zor elde klinik örnekler. Önemli olarak, RNA düşük miktarda kullanan numunede mevcut olan olası inhibitörlerinin konsantrasyonu en aza indirir. Çivi-in alanı Ct değerleri dışında büyük olasılıkla bazı örnek inhibitörlerinin varlığını gösterir. Başak-in probları önce miRNA profil inhibitörlerinin varlığı için numuneler test etmek için ayrı olarak satın alınabilir. Bu test için, tek bir gerçek zamanlı PCR (ister ng veya ul) RNA artan konsantrasyonları kullanılarak gerçekleştirilir.

Mevcut protokolde, biz önce RNA izolasyonu için organik faz çıkarma rapor. Bu, pek çok yeni RNA ekstre etme kiti bu prosedürü gerektirmeyen unutulmamalıdır. Örneğin, başarılı bir fenol / kloroform ekstraksiyonu, doğrudan plazmaya (veriler gösterilmemiştir), 200 ul RNA ekstraksiyonu için miRCURY RNA izolasyon kiti kullanılarak plazma Biofluids miRNA'lar profilli var.

Genel olarak _content ">, bu istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için gerekli suretin uygun sayısını belirlemek amacıyla önceden deney tasarımı önemlidir. replicate sayısı analiz edilecek numune sayısına bağlıdır ve bağlıdır numune veya numune grubu içinde varyasyonlar. biz örneklerinde, toplam 20 nispeten az sayıda kullandığı için bizim çalışmamızda, için, üçlü olarak cDNA sentez reaksiyonu kurmaya karar verdi. deneyleri kurmadan önce bir Biyoistatistik uzmanı ile Danışmanlık olabilir akıllıca bir seçim olacaktır ve şiddetle tavsiye edilir.

C t tanımlanması cut off değeri önemlidir ve örneklerin türüne bağlıdır; yüksek derecede ifade miRNAs için 25-35 arasında ayarlanabilir, ancak bu bizim BOS örneklerinde düşük ifade miRNAs, için, daha yüksek ayarlanabilir. Veri analizi konusunda bir diğer kritik adım referans gen (ler) seçimdir. AG (örneğin miRNA kültürlü hücrelerde profilleme gibi) bazı sağlam veriTüm numunelerin ortalama C t temsil lobal normalleştirme, kullanılabilmektedir. Ancak, bu varyasyonu sunmak CSF gibi örnekler için bir seçenek değildir. Benzer şekilde, bir referans gen genel olarak vücut sıvılarında değişmemiş olarak kabul edilir Bu miRNAs olarak kullanmak olabilir. Bunun yerine, kopyaları da dahil olmak üzere tüm numunelerin genelinde benzer bir C t gösterdi tüm miRNA'lar, seçilmiş ve genex mevcut geNorm analizi (Şekil 1) koştu. Sonuçlar, en az değişken olarak ifade miRNAs miR-1266 ve miR-622 gösterilir ve referans gen olarak kullanıldı. (Ct-Ctrel) - grupları arasında miRNAs ekspresyonunun karşılaştırması standart formülü aşağıdaki 2 Genex göreli olarak miktar aracı kullanılarak belirlenebilir. Son olarak, sonuç ısı haritası şemaları, grafik barlar ya da Şekil 2'de kutu arsa gibi araziler, diğer türleri gibi görülebilir. Genex mevcut görselleştirme Diğer tür hiyerarşik kümeleme dahil,Öz-Organize Haritası (SOM) ve Temel Bileşen Analizi (PCA). MiRNAs ek olarak, bu tür uzun Genex yazılım kodlayıcı olmayan RNA'lar (lncRNAs) profil gibi dizilerin diğer tiplerinin analizi için kullanılabilir. Plaka düzeni excel formatında alınabilir ve miRNA analizi için anlatıldığı gibi veriler ele alınabilir. Gerçekten de, yukarıda adımlarda açıklandığı gibi Mirvana miRNA izolasyon kiti kullanılarak birincil embriyonik fare kortikal nöronlar lncRNAs profil ve biz Genex (yayınlanmamış sonuçlar) kullanarak veri analiz edilmiştir.

Özetle, biz beyin omurilik sıvısında microRNA profili için bir protokol nitelendirdi. RNA ekstre ilişkin bazı değişikliklerle birlikte, bu prosedür, diğer vücut sıvıları ve / veya dokuların başka tür miRNA'lar profil için adapte edilebilir. Burada tarif edilen prosedüre olarak, organik ekstre oluşan basamaklı bir önceki RNA izolasyonu için gerçekleştirilir unutmayın. Ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak Genel olarak, bu durum da, Mirvana Paris ext olarak gerekli değildir,raction kiti. Buna ek olarak, vücut sıvılarından RNA ve bir taşıyıcı RNA ayıklama RNA ve 2-8 ul RNA cDNA sentezi maruz ölçmek için gerek yoktur numunelere ilave edilir. Bizim deneyim ve deneyler bu tip ile ilgili yüksek maliyetler dikkate alınarak, biz ilk birkaç örnekleri denemenizi öneririz, ve sonra istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için profilli edilecek numuneler / kopyaları sayısı için bir istatistikçi ile danışmanlık.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Ruh Sağlığı Ulusal Enstitüsü: açıklanan proje Ödülü sayısı R01MH079751 (F. Peruzzi PI) tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ruh Sağlığı Ulusal Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüsü resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Table 3. List of equipment.

Finnpipette Novus Multichannel Pipetter

Thermo Scientific

HH05279

Finntip Pipette Tips

Thermo Scientific

9400613

Thermal Cycler C1000

Biorad

0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes

Biorad

TLS0801

Flat Cap Strips

Biorad

TLS0803

LightCycler 480 Real-Time PCR System

Roche

LightCycler 480 Sealing Foil

Roche

04 729 757 001

Refrigerated Centrifuge 5804R

Eppendorf

Swing-bucket Rotor, 4-place

Eppendorf

A-4-44

Bench-Top Mini Centrifuge

Fisher

05-090-100

Bench-Top Vortex

Fisher

1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized

Fisher

02-681-5

Matrix Reagent Reservoir, 25 ml

Thermo Scientific

8093

Thermomixer Confort

Eppendorf

Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15

Sigma

Bench-Top Vortex

Velp Scientifica

F202A0173

Table 4. List of reagents.

Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns

Exiqon

203300

SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml

Exiqon

203400

Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free

Invitrogen

10977-015

MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R

Exiqon

203608

mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations

Ambion

AM1556

MS2 RNA carrier

Roche Applied Science

10165948001

2-mercaptoethanol 98%

Sigma Aldrich

M3148-25ml

Ethanol 100%

Carlo Erba

64-17-5

Nuclease free water

Qiagen

1039480

RNAse Zap

Ambion

AM9780

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pacifici, M., et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J. Cell. Physiol. 10, (2012).
  2. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).
  3. Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).
  4. Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
  5. De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders. Brain Res. 1338, 100-111 (2010).
  6. Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).
  7. Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis. Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).
  8. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  9. Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer. Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).
  10. Blondal, T., et al. Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids. Methods. 59, 1-6 (2013).
  11. Jensen, S. G., et al. Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs. BMC Genomics. 12, 435 (2011).
Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pacifici, M., Delbue, S., Kadri, F., Peruzzi, F. Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR. J. Vis. Exp. (83), e51172, doi:10.3791/51172 (2014).More

Pacifici, M., Delbue, S., Kadri, F., Peruzzi, F. Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR. J. Vis. Exp. (83), e51172, doi:10.3791/51172 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter