Summary
Streptococcus pneumoniae är den ledande patogen orsakar svår samhällsförvärvad lunginflammation och ansvarig för mer än 2 miljoner dödsfall i världen. Effekterna av bakteriella faktorer inblandade i fitness eller virulens kan följas i realtid på en akut mus lunginflammation eller bakteriemi modell med självlysande bakterier.
Abstract
Lunginflammation är en av de största hälso-och sjukvårdsproblem i utvecklingsländer och industrialiserade länder och är förenat med betydande morbiditet och mortalitet. Trots framsteg inom kunskap om denna sjukdom, tillgången på intensivvårdsavdelningar (IVA), och användning av potenta antimikrobiella medel och effektiva vaccin, dödligheten förblir hög 1. Streptococcus pneumoniae är den ledande patogen av samhällsförvärvad pneumoni (CAP) och en av de vanligaste orsakerna till bakteriemi hos människa. Denna patogen är utrustad med en arsenalen av yt-exponerade adhesinerna och virulensfaktorer som bidrar till lunginflammation och invasiv pneumokocksjukdom (IPS). Bedömningen av vilken roll in vivo av bakteriella fitness eller virulensfaktorer är av yttersta vikt för att riva upp S. pneumoniae patogenicitet mekanismer. Musmodeller av lunginflammation, bakteriemi och meningit används för att bedöma effekten av pneumokocker faktorer vid difka stadier av infektionen. Här beskriver vi ett protokoll för att övervaka i realtid pneumokock spridning i möss efter intranasal eller intraperitoneala infektioner med självlysande bakterier. Resultaten visar förökning och spridning av pneumokocker i de nedre luftvägarna och blod, som kan visualiseras och utvärderas med hjälp av ett bildsystem och medföljande analysprogram.
Introduction
Luftvägsinfektioner orsakade av virus eller bakterier förbli en av de vanligaste samhällsförvärvad eller kliniska problem världen över orsakar ungefär en tredjedel av alla dödsfall i världen. De viktigaste bakteriearter är Haemophilus influenzae och Streptococcus pneumoniae 2. Dessa bakteriearter är normalt vanliga beståndsdelarna i den naturliga luftvägsfloran. Bakteriell vagn är alltså också av viss risk för invasiv sjukdom och beroende på immunstatus eller anlag för individerna. Den asymtomatisk kolonisering utlöses till invasiva infektioner. Streptococcus pneumoniae är den ledande patogen av samhällsförvärvad pneumoni (CAP) och en av de vanligaste orsakerna till bakteriemi hos människor. Hos friska individer S. pneumoniae (pneumokocker) är ofta asymtomatiska och ofarliga kolonisatörer i de övre luftvägarna, där de konfronteras med icke-patogena bakterierav de inhemska växter men även med patogener som Haemophilus spp.. eller Staphylococcus aureus och den första raden i det mänskliga immunförsvaret. Transport är högst i små barn (37%) och ännu högre inom trånga daghem (58%) 3-5. Den yngsta befolkningen och de äldre, tar emot pneumokocker via transmission aerosol från transportörer och nasofaryngeala sekret 6, tillhör högriskgrupper och vaccination genom att använda en av konjugerat pneumokock vaccin (PCV10 eller PCV13 hos barn och 23-valent polysackarid PPSV23 hos vuxna) rekommenderas i USA (US) och många europeiska länder 4. Den PPSV23 omfattar serotyper som är ansvariga för ~ 90% av de bacteremic pneumokocksjukdomar i USA och Europa, hindrar därmed effektivt invasiva pneumokocksjukdomar (IPD) hos vuxna, medan PCVs täcker de vanligaste serotyperna hos barn. Följaktligen IPD grund av vaccintyper (VT) är reduced men nonvaccine serotyper visar en hög virulens potential och antibiotikaresistens har uppstått 4,7-12. Nasofarynx eftersom behållaren är utgångspunkten för pneumokocker att sprida sig till bihålorna eller mellersta öron initierar skadliga lokala infektioner. Viktigare, pneumokocker sprids direkt via luftvägarna till bronker och lungor vilket leder till livshotande CAP 4,13. Lunginfektioner är ofta tillsammans med vävnad och barriär förstörelse, så att patogenen att sprida sig in i blodet och orsakar IPD. Förekomsten av den gemensamma jordbrukspolitiken och IPD är högst i nedsatt immunförsvar personer eller i extremlägena för ålders 4,13. De omständigheter som ansvarar för omvandlingen från en kommen till en patogen med hög virulens är fortfarande under diskussion. Men förutom förändringar i värd känslighet och evolutionär anpassning tillsammans med högre virulens och ökningen av antibiotika resistanser har föreslagits att ha en avgörande inverkan på pneumococcal infektioner 14-16.
Den patogen är utrustad med en mångfald av adhesiner förmedlar intim kontakt till mukosala epitelceller. Efter att övervinna luftvägarna slem, är pneumokocker vidhäftning till värdceller underlättas genom direkta interaktioner av yt-exponerade adhesinerna med cellulära receptorer och genom att utnyttja extracellulära matrixkomponenter eller serumproteiner som överbryggande molekyler 4,17,18. Som mångsidiga patogener pneumokocker är också utrustade med faktorer som kringgående av värdimmun försvarsmekanismer. Dessutom har de förmågan att anpassa sig till olika värdmiljöer såsom lunga, blod och cerebrospinalvätska (CSF), respektive 5,17,19,20.
Effekterna av bakteriella faktorer på patogenes och inflammatorisk värdsvar undersöks i experimentella djurmodeller av lunginflammation, bakteriemi, eller meningit 21-25. Trots att en mänsklig patogen, dessa modeller är vill-etablerade dechiffrera pneumokock vävnad tropism, virulens mekanismer, eller protectivity av pneumokockvaccin kandidater. Den genetiska bakgrunden av inavlade musstammar bestämmer mottagligheten för pneumokocker. BALB / c-möss intranasalt infekterade med pneumokocker befanns vara resistent, medan CBA / Ca och SJL möss var mer känslig mot pneumokockinfektioner 22. Detta innebär att, i likhet med människor, den genetiska bakgrunden och värdförsvarsmekanismerna att avgöra resultatet av infektionen. Därför krävs ytterligare ansträngningar för att riva upp motstånds loci i genomet hos möss är mindre känsliga för pneumokockinfektioner. Resultaten har lett till förändringar i in vivo virulens protokoll. I stället för de inavlade BALB / c-möss som ofta används i det förflutna, är de mycket känsliga CD-1/MF1 utavlade musstammar numera ofta för att studera effekten av förlust-av-funktion pneumokock virulens eller lämplighet faktorer 26-28. Dessutom är tillgångenav bioluminescent pneumokocker och optiska avbildningstekniker gör det möjligt för realtids bioluminescens bioimaging av infektioner. I pneumokocker den optimerade luxABCDE genkassett (plasmid Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km ^) har satts in i ett enda ställe på kromosomen genom transposonmutagenes integration. Bioluminescent pneumokocker har använts för att utvärdera dämpningen av pneumokock-mutanter med brist på virulens eller träningsfaktorer och dess translokation från en anatomisk plats till en annan 26,28-31.
Här ger vi ett protokoll för bioimaging av pneumokockinfektioner i en mus lunginflammation eller blodförgiftning modell. Amplifiering och spridning av bioluminescent pneumokocker i intranasalt eller intraperitonealt infekterade möss kan lätt följas över tid med användning av ett optiskt avbildningssystem och samma djur vid olika tidpunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djur infektion experiment som beskrivs här måste utföras helt i enlighet med den lokala och internationella (t.ex. European Health Law av federationen av Laboratory Animal Science föreningar (FELASA)) riktlinjer och bestämmelser för användning av ryggradsdjur. Försöken måste godkännas av den lokala etiska styrelse och Institutional Animal Care kommittén. Alla experiment med S. pneumoniae i laboratorium eller djurinfektioner genomförs på ett klass II biosäkerhet skåp.
1. Beredning av Smitt lager av Bioluminescent Pneumocococi
- Förbered lager pneumococcal kulturer i Todd-Hewitt-buljong kompletterad med 1% (vikt / volym) jästextrakt och en slutkoncentration av 20% glycerol för upprätthållande vid 80 ° C.
- Plåt en liten mängd av djupfryst lager pneumococcal kultur på en blodagarplatta och inkubera bakterierna för 10 timmar vid 37 ° C i 5% CO2. Than blodagarplatta innehåller lämpliga antibiotika såsom kanamycin (150 pg / ml) för transposonen insättning av luxABCDE genkassetten in i genomet.
- Sub-odla en ny koloni på en ny blodagarplatta i högst 10 timmar.
- Inokulera THY-medium kompletterat med 10% (volym / volym) värmeinaktiverat (30 min vid 56 ° C) fetalt bovint serum (FBS) med pneumokocker och börja odlingen vid ett OD 600 av 0,05 till 0,07.
- Inkubera pneumokocker utan omröring vid 37 ° C och 5% CO2 tills kulturen når ett OD 600 av 0,35 till 0,40. Tillväxten kommer att ta mellan 3-4 timmar.
- Harvest pneumokocker genom centrifugering vid 3750 x g under 10 min och återsuspendera bioluminescent pneumokocker i fosfatbuffrad saltlösning pH 7,4 (PBS) kompletterad med 0,5% FBS.
- Justera inokulatet till den önskade koncentrationen i PBS/10% FBS. Infektionen Dosen beror på pneumokocker stam som används och den genetiska bakgrunden av mice. För att infektera utavlade CD-1-möss intranasalt med S. pneumoniae D39 lux infektionsdosen bör justeras till 1 x 10 7 CFU i en suspension av 20 ^ kompletterat med 90 enheter hyaluronidas. Undvik att skaka eller vortex pneumokocker, eftersom detta kommer att utlösa autolys.
- Verifiera inokulatet koncentration genom utstrykning av 10-faldiga seriespädningar på blodagar och räkning av kolonier efter odling över natten vid 37 ° C i 5% CO2.
- Verifiera mareld av pneumokock ympen genom att mäta mareld med en optisk bildsystem.
2. Intranasal och Intraperitoneal Infektion av möss med Bioluminescent Pneumokocker
- Använd kvinnliga utavlade möss i en ålder av 7-10 veckor för akut lunginflammation och blodförgiftning modell. Vikten av dessa möss bör vara mellan 20 till 30 g.
- Bedöva möss efter intraperitoneal injektion av ketamin och xylazin. Blanda 1,0 mgketamin och 0,1 mg xylazin på 100 l steril 0,9% (vikt / volym) natriumklorid för möss med en kroppsvikt på 20 gram. Detta stämmer överens med en dos på 50 mg / kg kroppsvikt för ketamin och 5 mg / kg kroppsvikt för xylazin. För att vara exakt, väga möss innan injektion av bedövningsmedel.
- Injicera blandningen in i den intraperitoneala håligheten och placera djuren tillbaka in i buren tills anestetika agera och djuren är narcotized. Andning av möss kommer att bli mycket långsam och regelbunden. Möss måste vara fullt narcotized, så att intranasal inympning och inhalation av bakteriesuspensionen inte kommer att leda till nysningar och därmed förlust av inokulat. Detta kan bedömas genom att klämma på musen vid slutet av sin svans, en fullt narcotized mus kommer att sakna gensvar.
- Plocka försiktigt upp en narcotized musknapp och håll nere musknappen mellan fingrarna och tummen med näsan upprätt (Figur 1).
- Använd en pipett med långa smala spetsar (gel LoaderTips) och tappa självlysande pneumokocker i flera små droppar på nares (10 l / näsborre) på musen 26-29. Musen kommer ofrivilligt andas in bakterierna. Håll musen 1-2 min upprätt och observera om musen nyser eller håller inokulat.
- Infect 7-10 veckor gamla CD-1-möss intranasalt med en infektion dos av 1 x 10 7 eller 7,5 x 10 7 pneumokocker av stam D39 och TIGR4, respektive, för att övervaka infektion i realtid. Detektionsgränsen för systemet utan absorption av värdvävnaden är ca 1 x 10 6 självlysande bakterier.
- Infektera möss intraperitonealt (IP) för att bedöma och bioimage virulens av pneumokocker i en sepsis mus infektion modell. Använd 5 x 10 3 CFU i 100 l av stam D39 och 1 x 10 4 av stammen TIGR4. Möss är inte bedövas vid användning av IP-väg.
- Inokulera kontrollmöss med PBS.
Figur 1. Intranasal infektion av CD-1-möss med S. pneumoniae. Klicka här för att visa en större bild .
3. Visualisera Pneumococcal Spridning i lungor och blod Använda Imaging System
Bild spridning av pneumokocker efter intranasal infektion kvinnliga utavlade CD1 möss i realtid med hjälp av en in vivo imaging-system.
- Slå på avbildningssystemet och starta bildanalysmjukvara belägen på preconfigurated dator.
- Avbildningssystemet initierar automatiskt och CCD-kameran är termoelektriskt kyld till 90 ° C innan den aktiv.
- Inställningarna och binning beroende av antalet av möss mättsamtidigt och på styrkan av den självlysande signal. Synfältet (FOV) att övervaka mareld av djuren är rörlig och förstoringen varierar mellan en FOV 22,5 cm för att mäta fem möss, och en FOV på 3,9 cm för att mäta en enda mus eller delar av djuret som bröstet eller huvudet.
- Använd rutinmässigt en exponeringstid på 1 minut, en medelgrad binning, och en FOV 22,5 cm (set D). Först väljer du självlysande bildläget och sedan ställa in avbildningsparametrarna.
- Utsläppet av signalen kan bero på den bakteriestam och mus stam som används och pigmentet på musen. Raka bröstet hos möss vid användning av t.ex. C57BL / 6 möss, vilket kan vara fördelaktigt vid avbildande av utvecklingen av lunginflammation hos dessa möss.
- Image infekterade möss vid prechosen tidsintervall. Mät bioluminescens hos möss i den akuta lunginflammation modell vid tidsintervall av maximalt 8 till 12 timmar. Övervaka också välfärd infekterade möss med observing deras utseende, beteende, och bestämning av viktförlusten.
- Söva möss i den narkotiska kammare av anestesisystemet på bildutrustning innan mätningarna i kammaren. Starta inhalation av en blandning av isofluran och syre och vänta tills mössen andas långsamt och regelbundet.
- Placera sövda djur i avbildning kammare i systemet och hålla möss i ryggläge. CCD-kameran på den övre delen av kammaren kommer då bilden den murina luftvägarna.
- Placera djuren med sin näsa in till rör för att tillåta inandning av narkosmedel.
- Isofluran inträde i avbildning kammare via en gas slang tillåts upprätthålla anestesi.
- Aktivera CCD-kamera på toppen av kammaren och börja självlysande optisk avbildning, tryck på "Acquire" i bildprogram. Omedelbart ett fotografi av mössen i den slutna kammaren visas på skärmen. Efter en minut av mätningen en överlagring av mareld uppgifterna och fotot visas.
- Stoppa anestesi efter bildöverlägg visas i fönstret av programvaran och sätta mössen tillbaka i sina burar.
- Möss övervakas för återvinning.
Figur 2. Anestesi och övervakning av möss infekterade med självlysande pneumokocker med hjälp av IVIS anestesi och IVIS Spectrum-systemet, respektive. A) Den IVIS Spectrum Imaging System. B) IVIS anestesisystemet med inkubationskammaren. C) Möss bedövas i inkubationskammaren . D) Möss belägen inom IVIS Spectrum Imaging kammare med näsan andas in bedövningsmedel._blank "> Klicka här för att visa en större bild.
4. Kvantifiering och utvärdering av den Bioluminescens av möss infekterade med Bioluminescent S. pneumoniae
- Bestäm mareld intensiteten hos möss eller i ett valt område av mössen genom att kvantifiera det totala utsläppet fotonen (fotoner / sek) med hjälp av bildanalys programvara.
- Använd värdena för emissions fotonen som tillhandahålls i en Excel-datablad för att framställa en graf. Eftersom data variationen är ofta hög i de grupperade möss, generera en låda morrhår diagram för att visa skillnaderna i möss infekterade med olika pneumokockstammar.
- Ge fotoner per möss eller alternativt resultaten som genomsnittet av utstrålning (fotoner / sek / cm 2 / sr) i ett markerat område.
- Mätdata från ROI (region-av-intresse) i foton läge kan kvantitativt jämföras mellan olika in vivo bildsystem med olika komra inställningar, eftersom mätningarna i enheter av strålglans tar automatiskt hänsyn till kamerainställningar (t.ex. integrationstiden, binning, f / stop, och synfält).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förvärvet och upptag av metionin är av central betydelse för pneumokocker att bibehålla konditionen i värd nisch 32,33. Den metionin ABC transportör lipoprotein kodas i D39 av spd _ 0151-genen (TIGR4: sp_0149) och namngav MetQ 32. Pneumokocker producera ytterligare metionin biosyntetiska enzymer (D39: Spd_0510 - Spd_0511, TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, Mete och MetF). Bristen på metionin i ett kemiskt definierat medium påverkar tillväxten av pneumokocker och liknande, avsaknaden av metionin bindande lipoprotein MetQ nedsatt upptag av metionin 32,33. Denna defekt skulle kunna återställas genom tillsättning av höga koncentrationer av metionin. I mus kolonisationsförsök mutanten saknar MetQ inte försvagades i virulens såsom visas i saminfektion experiment med isogena vildtyp, medan bristen på MetQ försvagat pneumokocker i musmodeller av sepsis och lunginflammation, såsom visas medbestämning av bakteriehalten 32. Realtids optisk bioimaging hjälp av IVIS Spectrum används här tillåter övervakning av förökning och spridning av bakterier i ett enda smittat djur vid olika tidpunkter.
I nedanstående exempel har vi utvärderat effekterna av metionin bindande lipoprotein MetQ på kolonisering och virulens genom tillämpning av akut lunginflammation infektion musmodell. CD-1 utavlade möss (n = 10) infekterades intranasalt med 1 x 10 7 bakterier av stammen av vildtyp S. pneumoniae D39 lux (PN149) eller dess isogena mutant D39 lux Δ metQ (tabell 1). Den metQ mutant (PN252) konstruerades genom insättning-deletionsmutagenes av metQ genen i självlysande D39 pneumokocker. Därför var det metQ genen, 5 'sekvens och 3'sequence amplifieras med PCR med hjälp av primers 382 och 385. PCR-produkten klonades in i vektorn PGEMT-lätt, vilket resulterade i plasmid P559 (Tabell 1). Genom invers PCR med hjälp av primers 383 och 384 (tabell 2) i metQ sekvensen (nt 58 till nt 777) togs bort och ersattes med en erytromycinresistens genkassetten (ermB) med PCR med användning av plasmiden pE89 (Tabell 1) som DNA-mall och primerparet ermB_105/ermB_106 (tabell 2). De resulterande plasmiden p563 34 förvandlades till pneumokocker som beskrivits tidigare med hjälp av kompetensstimulerande peptid-1. Mutanter som saknar lipoproteinet MetQ (Spd_0151) odlades i THY eller på blod-agarplattor kompletterade med erytromycin (5 | ig / ml).
Hälsotillståndet hos mössen övervakades kontinuerligt. Djuren avlivades när visar ingen riktig respons eller tecken på sjuklighet. Dessutom pneumokocker spridning från nasofarynx i lungorna och blodet, vilket leder till svår lunginflammation och blodförgiftning, var övervakred genom mätning av mareld var åttonde timme. I varje grupp av infekterade möss 7 av 10 möss utvecklade allvarliga tecken på sjukdom, medan de andra tre möss uppvisade ingen bioluminiscens och överlevde (Figur 3A). Möss med framgång infekterats med den bioluminescent vildtyp D39 lux utvecklat 32 timmar efter infektion allvarliga lunginfektioner, vilket fortskrider inom 8-16 h till sepsis (figur 3A). Vid tidpunkten 96 tim dukade alla möss som hade utvecklat lunginflammation och blodförgiftning efter infektion med D39 lux. Förlusten-av-funktion metionin bindande lipoprotein signifikant nedsatt virulens hos pneumokocker. Efter 32 timmar endast en mus infekterad med metQ mutanten uppvisade en svag lunginfektion, medan de andra visade inga uppenbara tecken på sjukdom och lunginflammation. Men efter 48 h svåra lunginfektioner blev också uppenbart hos möss som infekterats med mutanten. Som ett resultat av dessa möss utvecklade sepsis 72 hrefter infektion och blev döende senare än 72 h efter infektion, vilket visar att i den akuta lunginfektionsmodell brist på MetQ dämpar pneumokocker.
Tabell 1. Sila och plasmid-listan.
Primer listan Tabell 2.. Restriktionsställen är understrukna.
| Primer Avsedd användning | Primer Namn | Sekvens (5'-3 ') |
| Insättning-deletionsmutagenes | ||
| Amplifiering av sp_0149 + 5 "och 3 'flankerande regionen | 382 385 | 5'-CTACTACTAGAATTCATGCTGAACACACGGACAAC-3 ' 5'-AACCTTCCAAGCTGCAGCCGCTCCCTCCATGATAAAG-3 ' |
| Inverse PCR av sp_0149 + 5 "och 3 'flankerande regionen (pGEMTeasy) | 383 384 | 5'-ATCATCATCATCG AAGCTT AGCCAAACCT GCGACTGTAG-3 ' 5'-ACTCACTCACTG AAGCTT ATCGCAGCTTA CCACACAGA-3 ' |
| Antibiotikum kassett amplifiering | ||
| erytromycin (ermB) | ermB_105 ermB_106 | 5'-GATGATGATGATCCCGGGTACCAAGCTTGA ATTCACGGTTCGTGTTCGTGCTG-3 ' 5'-AGTGAGTGAGTCCCGGGCTCGAGAAGCTT GAATTCGTAGGCGCTAGGGACCTC-3 ' |
Figur 3. Övervakning av pneumokocker spridning i möss efter intranasal infektion. A) Bioluminescent optisk avbildning av möss som infekterats intranasalt med D39 lux eller isogena mutant D39 luxΔmetQ. B) Värdena för mareld intensiteterna grupperade möss (n = 10) visasför angivna tidpunkter i en låda morrhår diagram. Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alla experiment som utförts på djur måste godkännas av lokala myndigheter och etikkommissioner. I in vivo-infektionsexperiment den bakteriella belastningen i de olika värd nischer av infekterade djur måste bestämmas vid olika tidpunkter efter infektion. Under dessa experimentella förhållanden djuren måste offras innan isolering av bakterier från blod, nasofarynx, bronchoalvelar sköljning, eller organ såsom lungor, mjälte och hjärna. För att beräkna antalet bakterier per värd nisch och bedöma effekten av bakteriella faktorer på virulens, blod eller organ måste isoleras följt av bakteriell återhämta sig och plätering på fasta medier. Den bakteriehalten kvantifieras sedan genom uppräkning av CFU. För att nå statistiskt signifikanta data varje tidpunkt behöver en grupp av möss, som under vissa experimentella betingelser leder till svårigheter vid hantering experimentet på grund av det höga antalet möss.
ove_content "> I motsats härtill är den realtids bioimaging metod en mindre tidskrävande metod och varje enskild bakterie-infekterade mus kan övervakas flera gånger under en tidsperiod. Avbildnings teknik medger visualisering av bakterierna inom djuret vid olika tidpunkter efter infektion eller till och med under en längre tidsperiod. Dessutom bioluminescens mätt med den optiska bildanalysmjukvara möjliggör kvantifiering av fotoner som emitteras av det infekterade djuret ytterligare. Detta kan vara begränsad till ett avgränsat område av musen eller hela djur kan betraktas. I in vivo infektion experiment pneumokocker-infekterade möss måste övervakas i intervaller om 8-12 timmar, eftersom spridningen av pneumokocker kan utvecklas snabbt i utavlade CD-1-möss. Realtids avbildning kan användas för att visualisera transmigration av pneumokocker från nasofarynx in i lungan och blod, och dessutom förökning av pneumokocker i blodetefter intraperitoneal infektion kan övervakas av den dramatiska ökningen av mareld intensitet 26,28,29.Vid en jämförelse av virulens potential vildtyp pneumokocker och isogena mutanter är det viktigt att testa först effekten av förlust-av-genen under in vitro odlingsbetingelser. Tillväxt skillnader mellan vildtyp bakterier och mutanter, i synnerhet i kemiskt definierat medium, redan indikerar en minskad bakterie lämplighet 26. Således är dämpning observerades under in vivo-betingelser associerade med en förändrad fysiologi vilket leder till mindre robust pneumokocker under kolonisering och invasiva infektioner.
Dock bör det nämnas att denna bildteknik är ofta inte tillräckligt för att visa effekten av genen knockouts på pneumokocker virulens. I likhet med andra patogena bakterier pneumokocker är mångsidiga mikroorganismer och har utvecklats mångfacetterade mekanismer to möter värden och undgå immunsystemet. Följaktligen pneumokocker producera å ena sidan proteiner med mångahanda funktioner såsom adhesinet PSPC och, å andra sidan, de är utrustade med flera proteiner som uppvisar liknande funktioner, som sålunda kan kompensera bristen av ett protein på grund av mutationer 4,17,18 , 35. I dessa scenarier andra in vivo-infektion experiment såsom coinfection metod måste användas för att dechiffrera effekten av förlust-av-proteinfunktion i mutant koloniserings eller invasiva infektioner 27,28.
Pneumokocker kolonisera och infektera företrädesvis människor men också isolerad från husdjur eller djurparksdjur 4,36,37. För att dechiffrera effekterna av virulens eller infektion fitness faktorer mus modeller används. Men inte alla pneumokockstammar är musen virulent, och ännu viktigare, känsligheten hos möss beror på den genetiska bakgrunden av djuren 22. Pneumokockvirulens studier och studier skydds numera bedrivs med CD-1 utavlat möss. Men knockout möss eller transgena möss är också av stort intresse för att dechiffrera betydelsen av värdfaktorer för invasiva pneumokockinfektioner sjukdomar. Den knockout eller transgena möss är ofta genereras i musstammar såsom C57/BL6 eller Balb / c.. Dessa stammar mus är mindre känsliga mot pneumokockinfektioner och höga infektionsdoser krävs för att få en dödlig dos, 50% (LD 50). Beroende på infektionsdosen detta motstånd av möss kan försämra realtid bioimaging av pneumokock-spridning till lungorna eller blodet, eftersom pneumokocker är begränsade till multiplicera på ett sätt som krävs för detektering av avbildningssystemet. För att övervinna denna begränsning och att kunna bilden spridning i realtid, hög infektionsdoser måste användas. Risken för detta tillvägagångssätt kan vara att skillnader i värd känslighet inte kan utforskas som spridning fortskrider alltför snabbt.
via intranasal eller intraperitoneal väg. Detta tillvägagångssätt är särskilt lämpligt att jämföra virulens potentialen mellan vildtyp och mutanter av S. pneumoniae.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Forskning i labbet har finansierats med bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) och förbundsministeriet för utbildning och forskning (BMBF) Medicinsk Infektion Genomics (FKZ 0315828A) till SH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500 mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok syringes with needle |
| Gel Loader Tips | PeqLab | 81-13790 | MµltiFlex Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
References
- Niederman, M. S., et al. Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia. Diagnosis, assessment of severity, antimicrobial therapy, and prevention. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1730-1754 (2001).
- WHO, The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization. , (2008).
- Bogaert, D., et al. Colonisation by Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus in healthy children. Lancet. 363, 1871-1872 (2004).
- Gamez, G., Hammerschmidt, S. Combat pneumococcal infections: adhesins as candidates for protein-based vaccine development. Curr. Drug Targets. 13, 323-337 (2012).
- Mook-Kanamori, B. B., Geldhoff, M., vander Poll, T., Dvan de Beek, D. Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 24, 557-591 (2011).
- Musher, D. M. How contagious are common respiratory tract infections. N. Engl. J. Med. 348, 1256-1266 (2003).
- Brueggemann, A. B., Pai, R., Crook, D. W., Beall, B. Vaccine escape recombinants emerge after pneumococcal vaccination in the United States. PLoS Pathog. 3, (2007).
- Munoz-Almagro, C., et al. Emergence of invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes in the era of 7-valent conjugate vaccine. Clin. Infect. Dis. 46, 174-182 (2008).
- Whitney, C. G. Impact of conjugate pneumococcal vaccines. Pediatr. Infect. Dis. J. 24, 729-730 (2005).
- Whitney, C. G., et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. N. Engl. J. Med. 348, 1737-1746 (2003).
- Lynch, J. P. 3rd, Zhanel, G. G. Streptococcus pneumoniae: epidemiology and risk factors, evolution of antimicrobial resistance, and impact of vaccines. Curr. Opin. Pulm. Med. 16, 217-225 (2010).
- Singleton, R. J., et al. Invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes among Alaska native children with high levels of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine coverage. JAMA. 297, 1784-1792 (2007).
- Dockrell, D. H., Whyte, M. K., Mitchell, T. J. Pneumococcal pneumonia: mechanisms of infection and resolution. Chest. 142, 482-491 (2012).
- Lieberman, T. D., et al. Parallel bacterial evolution within multiple patients identifies candidate pathogenicity genes. Nat. Genet. 43, 1275-1280 (2011).
- Yang, J., Tauschek, M., Robins-Browne, R. M. Control of bacterial virulence by AraC-like regulators that respond to chemical signals. Trends Microbiol. 19, 128-135 (2011).
- Young, B. C., et al. Evolutionary dynamics of Staphylococcus aureus during progression from carriage to disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4550-4555 (2012).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Voss, S., Gamez, G., Hammerschmidt, S. Impact of pneumococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules on colonization. Mol. Oral Microbiol. 27, 246-256 (2012).
- Koppe, U., Suttorp, N., Opitz, B. Recognition of Streptococcus pneumoniae by the innate immune system. Cell. Microbiol. 14, 460-466 (2012).
- Paterson, G. K., Mitchell, T. J. Innate immunity and the pneumococcus. Microbiology. 152, 285-293 (2006).
- Gerber, J., et al. A mouse model of Streptococcus pneumoniae meningitis mimicking several features of human disease. Acta Neuropathol. 101, 499-508 (2001).
- Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69, 426-434 (2001).
- Holmes, A. R., et al. The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding protein that is essential for virulence. Mol. Microbiol. 41, 1395-1408 (2001).
- Koedel, U., Klein, M., Pfister, H. W. New understandings on the pathophysiology of bacterial meningitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 23, 217-223 (2010).
- Medina, E. Murine model of pneumococcal pneumonia. Methods Mol. Biol. 602, 405-410 (2010).
- Hartel, T., et al. Impact of glutamine transporters on pneumococcal fitness under infection-related conditions. Infect. Immun. 79, 44-58 (2011).
- Hermans, P. W., et al. The streptococcal lipoprotein rotamase A (SlrA) is a functional peptidyl-prolyl isomerase involved in pneumococcal colonization. J. Biol. Chem. 281, 968-976 (2006).
- Jensch, I., et al. PavB is a surface-exposed adhesin of Streptococcus pneumoniae contributing to nasopharyngeal colonization and airways infections. Mol. Microbiol. 77, 22-43 (2010).
- Kadioglu, A., et al. Pneumococcal protein PavA is important for nasopharyngeal carriage and development of sepsis. Mol. Oral Microbiol. 25, 50-60 (2010).
- Orihuela, C. J., Gao, G., Francis, K. P., Yu, J., Tuomanen, E. I. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect. Immun. 69, 3350-3358 (2001).
- Basavanna, S., et al. The effects of methionine acquisition and synthesis on Streptococcus pneumoniae growth and virulence. PLoS One. 8, (2013).
- Hartel, T., et al. Characterization of central carbon metabolism of Streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling. J. Biol. Chem. 287, 4260-4274 (2012).
- Hammerschmidt, S., et al. The host immune regulator factor H interacts via two contact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediates adhesion to host epithelial cells. J. Immunol. 178, 5848-5858 (2007).
- Voss, S., et al. The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin. J. Biol. Chem. , (2013).
- Cartwright, K. Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management. Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).
- vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals. PLoS One. 4, (2009).
- Brehm,, et al. Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1. Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).
