Summary
Werkwijze voor nanovezels en complexe nanostructuren verkrijgen uit een of meerdere extracellulaire matrixeiwitten beschreven. Deze methode maakt gebruik van proteïne-oppervlak interacties vrijstaande eiwit gebaseerde materialen maken met instelbare samenstelling en architectuur voor gebruik in een verscheidenheid van tissue engineering en biotechnologische toepassingen.
Abstract
De extracellulaire matrix (ECM) in weefsels wordt gesynthetiseerd en geassembleerd door cellen Een 3D-fibrillaire, eiwitten zullen vormen met strak gereguleerd vezeldiameter, samenstelling en organisatie. Naast het verlenen van structurele steun, de fysische en chemische eigenschappen van de ECM speelt een belangrijke rol in verschillende cellulaire processen, waaronder hechting, differentiatie en apoptose. In vivo wordt het ECM geassembleerd door blootstelling cryptische zelfassemblage (fibrillogenese) locaties binnen proteïnen . Dit proces verschilt voor verschillende eiwitten, maar fibronectine (FN) fibrillogenese is goed gekarakteriseerd en dient als een modelsysteem voor cel-gemedieerde ECM montage. Specifiek cellen gebruiken integrine receptoren op het celmembraan FN dimeren en actomyosine gegenereerde contractiele krachten binden ontvouwen en bloot bindingsplaatsen voor montage in onoplosbare vezels. Deze receptor gemedieerde proces maakt cellen te monteren en het organiseren van de ECM van de cellulaire weefsel scales. Hier presenteren we een oppervlak geïnitieerde genaamde methode samenstel (SIA), die celgemedieerde matrix samenstel recapituleert met proteïne-oppervlak interacties ECM eiwitten ontvouwen en assembleren in onoplosbare vezels. Eerst worden ECM eiwitten geadsorbeerd op een hydrofoob polydimethylsiloxaan (PDMS) oppervlak waar ze gedeeltelijk denatureren (uitgevouwen) en cryptische bindende domeinen bloot. Ongevouwen eiwitten worden vervolgens overgebracht in welbepaalde micro-en nanopatronen via microcontact printen op een thermisch gevoelige poly (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) oppervlak. Thermisch geactiveerd ontbinding van de PIPAAm leidt tot eindassemblage en het vrijkomen van onoplosbare ECM eiwitten nanovezels en nanostructuren met goed gedefinieerde geometrieën. Complexe architecturen zijn mogelijk door technische gedefinieerde patronen op de PDMS stempels gebruikt voor microcontact afdrukken. Naast FN kan SIA proces gebruikt laminine, fibrinogeen en collageen type I en IV van meerdere componenten ECM nanostruc creërenturen. Aldus kan SIA worden gebruikt om ECM-eiwitten gebaseerde materialen ingenieur nauwkeurige controle over de eiwitsamenstelling, vezelvorm en steiger architectuur om de structuur en samenstelling van de ECM recapituleren in vivo.
Introduction
De extracellulaire matrix (ECM) in weefsels bestaat uit multifunctionele proteïnen betrokken bij fysische en chemische regulatie van verschillende celprocessen zoals hechting, proliferatie, differentiatie en apoptose 1-3. De ECM wordt gesynthetiseerd, geassembleerd, en georganiseerd door de cellen en de samenstellende eiwitfibrillen hebben unieke composities, vezelgrootte, geometrieën en onderling verbonden architecturen die variëren met het type weefsel en het ontwikkelingsstadium. Recent onderzoek heeft aangetoond dat de ECM leerzame aanwijzingen kan geven aan cellen om gemanipuleerde weefsels maken 4, wat suggereert dat recapituleren de ECM in termen van samenstelling en structuur kan de ontwikkeling van biomimetische materialen zorgen voor tissue engineering en biotechnologische toepassingen leiden.
Een aantal fabricage methoden ontwikkeld polymere scaffolds die aspecten van de ECM kunnen nabootsen in weefsels ingenieur. Bijvoorbeeld, elektrospinnen en fase gescheidenatie hebben zowel vermogen gedemonstreerd poreuze matrices van vezels te vormen met een diameter van enkele tientallen micrometers tot tientallen nanometers 5-7. Beide technieken hebben ook aangetoond dat zeer poreuze matrices van nanovezels cel adhesie en infiltratie in de scaffold 8 kan ondersteunen. Echter, deze aanpak beperkt in de mogelijke vezel geometrieën, oriëntaties en 3D-architecturen die kunnen worden gemaakt. Electrospinning geeft gewoonlijk steigers met ofwel willekeurig georiënteerde of zeer gerichte vezels terwijl fasescheiding produceert steigers met willekeurig georiënteerde vezels. Er zijn ook beperkingen op de materialen, met onderzoekers gewoonlijk gebruik van synthetische polymeren, zoals poly (ε-caprolacton) 8 en poly (melkzuur-co-glycolzuur) 9, die vervolgens worden bekleed met ECM eiwitten celadhesie bevorderen. Natuurlijke biopolymeren worden ook gebruikt, zoals collageen type I 10, 11 gelatine, fibrinogeen 12,chitosan 13, en zijde 14, maar vertegenwoordigen slechts een klein deel van de eiwitten in de eigen weefsel. De meeste weefsels bevatten een groter milieu van ECM eiwitten en polysacchariden zoals fibronectine (FN), laminine (LN), Type IV collageen en hyaluronzuur die moeilijk of onmogelijk te nanovezels Bestaande methoden fabriceren zijn.
Om deze uitdaging aan te pakken, hebben we onze onderzoeksinspanningen op het nabootsen van de manier waarop cellen synthetiseren, assembleren en te organiseren ECM eiwitfibrillen in hun omgeving gericht. Hoewel de specifieke fibrillogenese proces varieert voor verschillende ECM eiwitten typisch een conformationele verandering van de ECM eiwitmolecuul wordt veroorzaakt door een enzymatische of-receptor veroorzaakte interactie, die cryptische zelfassemblage plaatsen blootstelt. Hier gebruiken we FN als modelsysteem om beter inzicht in de fibrillogenese proces. Kort FN homodimeren binden aan integrine receptoren op het celoppervlak via de RGD aminozuursequentie in het 10e type IIIk herhaal eenheid. Eenmaal gebonden, de integrines uit elkaar via actomyosine contractie en vouw de FN dimeren cryptische zelfassemblage websites bloot. De blootstelling van deze FN-FN bindingsplaatsen kan de FN dimeren te monteren in een onoplosbare fibrillen direct aan het celoppervlak 15. Werk in cel-vrije systemen heeft aangetoond dat cryptische FN-FN bindingsplaatsen kunnen worden onthuld door ontvouwen behulp denatureermiddelen 16 of oppervlaktespanning bij een lucht-vloeistof-vaste stof grensvlak 17-19. De FN vezels die door deze technieken zijn beperkt tot specifieke vezels afmetingen en geometrieën en zijn meestal gebonden aan een oppervlak.
Hier beschrijven we een aanpak genoemd oppervlak geïnitieerd assemblage (SIA) 20 dat deze beperkingen overwint door gebruik te maken van eiwit-oppervlakte interacties tot vrijstaande onoplosbare nanovezels, nanofabrics (2D vellen) en andere nanostructuren bestaande uit een of meerdere ECM eiwitten (figuur 1 maken ). In dit process, worden ECM eiwitten geadsorbeerd uit een compacte, bolvormige conformatie in oplossing en gedeeltelijk gedenatureerd (uitgevouwen) op een patroon, hydrofoob polydimethylsiloxaan (PDMS) stempel. De ECM eiwitten worden dan overgebracht in deze toestand op een thermisch responsieve poly (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) oppervlak door microcontact afdrukken 22. Wanneer gehydrateerd met 40 ° C water de PIPAAm blijft solide, maar wanneer afgekoeld tot 32 ° C het door een lagere kritische oplostemperatuur (LCST) wanneer hydrofiel wordt geeft zwelt met water en vervolgens lost, loslaten van de geassembleerde ECM nanostructuren uit van het oppervlak. De SIA methode biedt controle over de afmetingen met nanometer-schaal precisie. Door het regelen van belangrijke parameters zoals de samenstelling, vezel geometrie en architectuur, is het mogelijk om vele eigenschappen van de ECM gevonden in vivo recapituleren en geavanceerde steigers voor tissue engineering en biotechnologische toepassingen te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabricage van Master Mold Met behulp Fotolithografie
- De ECM-eiwit nanovezels, nanofabrics en nanostructuren worden gefabriceerd worden eerst ontworpen met behulp van Computer Aided Design (CAD)-software. Deze CAD-bestand wordt vervolgens overgebracht naar een fotomasker. Het type fotomasker hangt af van de resolutie van de functies; met een-transparantie basis photomask voldoende voor functie maten omlaag naar ~ 10 micrometer. Kleinere functies <10 urn zal een chromen op glas fotomasker nodig. Alle van de nanovezels en nanostructuren hier gepresenteerd werden vervaardigd met behulp van een op transparantie gebaseerde photomask, en dus waren nanometerschaal in dikte, maar niet laterale dimensies.
Opmerking: Het is belangrijk om onderscheid te maken welke regio's van de fotomasker donker zal zijn (voorkomen dat UV-licht door) en die transparant zullen (laten UV-licht door te laten), omdat dit, samen met de aard van de fotolak (positief of negatief) , zal de uiteindelijke topografie van de meester mal dicteren. - Voor fabricage van de master schimmel begint, gedehydreerd een 4 "siliciumwafel door het op een kookplaat ingesteld op 150 ° C gedurende 15 minuten.
- Centreer de wafer op het vacuüm boorkop van een spin-coater. Giet SU8-2015 negatieve fotoresist op het midden van de wafel en verder gieten in concentrische cirkels tot ongeveer tweederde van de wafel bedekt.
Opmerking: Bewaar de fles SU8 dicht bij de wafer bij gieten om de vorming van luchtbellen te minimaliseren. - Programmeer de spincoater als volgt:
- Spread cyclus: 500 rpm met een versnelling van 100 rpm / sec gedurende 10 sec.
- Centrifuge: 4000 rpm met een versnelling van 100 rpm / sec gedurende 30 sec.
- Zachte bak de wafer door het op een kookplaat ingesteld tot 95 ° C gedurende 3 minuten.
- Expose de wafer met UV-licht doorhet fotomasker voor een totale dosering van 140 mJ / cm 2.
Opmerking: SU8 is een negatieve fotolak ook regio's waar UV-licht is in staat om door de photomask te passeren na het ontwikkelen blijft en wordt opgevoed functies op de meester mal. - Na blootstelling bak de wafer door het op een kookplaat ingesteld op 95 ° C gedurende 4 minuten.
- Ontwikkel de wafer door het in SU8 ontwikkelaar voor 3 minuten. Na 3 minuten, spoel de wafer met isopropylalcohol. Indien een witte film wordt geproduceerd tijdens het spoelen, wordt de wafel niet volledig ontwikkeld en moet weer in de ontwikkelaar nog 30 seconden worden geplaatst. Spoel opnieuw met isopropylalcohol. Herhaal dit proces tot een witte film niet gevormd tijdens de isopropylalcohol spoelen.
- Droog de wafer in een stikstofstroom en in een 150 mm petrischaal bescherming tegen stof.
2. Het maken van de PDMS Postzegels
- Bereid de PDMS prepolymeer door het combineren van het elastomeer basis en verharder in een10:01 w / w verhouding. Typisch 80 g basis en 8 g verharder worden gebruikt om te zorgen voor voldoende PDMS aan de master schimmel in een 1 cm dikke laag bedekken.
- Mix en ontgas de PDMS met een middelpuntzoekende mixer ingesteld op het volgende:
- Mix: 2.000 rpm gedurende 2 min.
- Ontgas: 2.000 rpm gedurende 2 minuten.
- Als een mixer niet beschikbaar is meng de PDMS met de hand gedurende 10 minuten met behulp van een 10 ml serologische pipet. Ontgas het mengsel door het in een vacuüm exsiccator gedurende 30 minuten om luchtbellen te verwijderen.
- Giet genoeg PDMS pre-polymeer over de meester mal (patroon silicium wafer) aan een 1 cm dikke laag te vormen. Hard de PDMS door bakken bij 65 ° C gedurende 4 uur en bij kamertemperatuur gedurende 48 uur.
- Eenmaal uitgehard, kunnen de gebieden met de patronen worden uitgesneden om de PDMS postzegels vormen. Om de functie zijkant te onderscheiden van de achterkant van de PDMS stempel, snijd een inkeping uit een van de hoeken aan de achterzijde van de stempel.
3. Microcontact Printing van ECM Patterns
- Clean 25 mm diameter glazen dekglaasjes door sonicatie in 95% ethanol gedurende 1 uur en vervolgens droog in een 65 ° C oven.
- Bereid de PIPAAm oplossing door het oplossen PIPAAm in 1-butanol in een concentratie van 10% (w / v, kenmerkend 1 g in 10 ml).
- Centreer een glazen dekglaasje op de vacuümklem van de spincoater en pipet 200 ul van de oplossing PIPAAm zodat het volledige glasoppervlak bedekt.
- Spincoat het dekglaasje bij 6.000 rpm gedurende 1 minuut.
- Reinig de PDMS stempels door sonicatie in 50% ethanol gedurende 30 minuten en vervolgens droog onder een stikstofstroom.
Opmerking: Drogen en volgende stappen moeten in een bioveiligheid kast worden uitgevoerd om de steriliteit voor toepassingen waar de ECM nanostructuren zal worden gebruikt met cellen te behouden. - Coat het patroon oppervlak van elke PDMS stempel met 200 pl van de eiwitoplossing, typisch 50 ug / ml in steriel gedestilleerd water FN. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
Opmerking: This coating volume voor een 1,5 cm 2 PDMS stempel en moeten worden aangepast aan de grootte van de PDMS stempel, de ECM eiwitten gebruikt en de concentratie van de ECM eiwitten in oplossing. - Was de PDMS stempels in gedestilleerd water om overtollig eiwit en goed afdrogen onder een stroom van stikstof te verwijderen.
Opmerking: Al het water links op de stempel zal de voortijdige ontbinding van de PIPAAm coating triggeren op het dekglaasje blokkeren en de correcte eiwit overdracht. - Voor steriele fabricage, plaatst de PIPAAm-gecoate dekglaasjes in een gesloten petrischaaltje en steriliseer behulp van UV-blootstelling, 45 min onder de UV licht in een bioveiligheid kast is voldoende. Als steriliteit niet nodig deze stap worden weggelaten.
- Voer microcontact afdrukken door het plaatsen van de functie van het PDMS stempel in contact met de PIPAAm-gecoate dekglaasje. Indien nodig, een tang om licht te tikken op de achterkant van de stempels om eventuele luchtbellen te verwijderen en zorgen voor een gelijkmatige contact.
- Na 5 kmn, trek het PDMS stempel van het dekglaasje.
- In dit stadium kunnen andere ECM eiwitten worden gevormd om complexere en multicomponent structuren. Tot 3 drukken zijn geverifieerd om te werken met dit proces, en meer kan haalbaar zijn.
4. Vrijgave van ECM nanovezels en nanostructuren
- Plaats de patroon PIPAAm gecoate dekglaasje in een 35 mm petrischaal en inspecteer het patroon trouw gebruik fasecontrastmicroscopie. Afhankelijk van het patroon kan een CCD-camera nodig zijn om de kenmerken van de patroon lossen. Fluorescentie microscopie kan worden gebruikt om het patroon ontvangen de ECM eiwitten fluorescent gelabelde inspecteren.
- Voeg 3 ml van 40 ° C gedestilleerd water aan de petrischaal en laat het water geleidelijk afkoelen.
- Het oplossen van de PIPAAm laag en de afgifte van het ECM-eiwit patronen kunnen worden gevolgd met fasecontrastmicroscopie. Als de toepassing het gebruik van optische tec niet toelaathniques de vrijgave kan worden gevolgd door meting van de temperatuur van de oplossing. Typisch wordt het water gekoeld tot kamertemperatuur, ver onder de LCST van PIPAAm (32 ° C) die de ECM eiwitten nanostructuren zijn vrijgegeven.
- Na de release, zijn de nanovezels, nanofabrics en andere nanostructuren in het water drijven. Om ze te gebruiken voor verdere toepassingen moeten ze worden gemanipuleerd. De exacte benadering is afhankelijk van het experimentele doel en kunnen stappen zoals immobiliseren op een oppervlak bewegen met een micromanipulator systeem of inbedding in een hydrogel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SIA is in staat technische ECM-eiwit nanovezels met nauwkeurige controle over afmetingen vezels. Om dit aan te tonen, werden arrays van FN nanovezels met vlakke afmetingen van 50 x 20 micrometer patroon op een PIPAAm gecoate dekglaasje (Figuur 2A). Na het loslaten, de vezels gecontracteerd omdat ze onder een inherente pre-stress als patroon op de PIPAAm oppervlak (Figuur 2B). Analyse van de FN nanovezels bleek zij monodisperse pre-release met een gemiddelde lengte van 50,19 ± 0,49 pm en breedte van 19,98 ± 0,17 urn (figuur 2C). Ondanks verdragsluitende aanzienlijk FN vezels na de introductie nog monodispers met een gemiddelde lengte van 14,15 ± 0,92 pm en breedte van 2,65 ± 0,32 urn (figuur 2D). Atomic force microscopie voorzien van een hogere resolutie perspectief van de vezel dimensionale veranderingen in verband met de SIA release proces. Met name vezels pre-release gehadeen uniforme dikte van ~ 5 nm (figuur 2E), terwijl vezels na de introductie had een heterogeen dikte in de orde van enkele honderden nanometers (figuur 2F).
De SIA werkwijze is het mogelijk om een verscheidenheid van ECM eiwitten nanostructuren met variabele grootte, vorm en samenstelling (figuur 3) ingenieur. Bijvoorbeeld, FN nanovezels aanvankelijk 20 urn breed en 1 cm lengte werden gevormd op een PIPAAm gecoate dekglaasje. Bij koeling en PIPAAm ontbinding de nanovezels werden vrijgegeven vormen van lange draden (figuur 3A). Verder, omdat het patroon wordt bepaald door de oppervlakte topografie van de PDMS stempel voor microcontact afdrukken, is het mogelijk om complexe ECM eiwitten nanostructuren ingenieur. Als proof-of-concept, hebben we meerdere gewapende FN sterren die hun algemene vorm na vrijlating (Figuur 3B) behouden. Interessant is dat de armen van de FN ster gecontracteerd als de nanovezels maarhet lichaam van de ster heeft haar grootte. Terwijl FN belangrijk, wilden we aantonen dat SIA werkt met andere ECM eiwitten zoals LN en die meerdere ECM eiwitten kunnen in dezelfde structuur worden opgenomen. Bijvoorbeeld, we engineered een 2-D nanofabric samengesteld uit orthogonale en onderling verbonden nanovezels van FN en LN in een vierkant rooster array (figuur 3C). Pre-laat de FN nanovezels waren 20 micrometer breed en de LN nanovezels waren 50 micrometer breed. Bij het loslaten beide soorten nanovezels gecontracteerd, maar de algehele interconnectiviteit en vierkant rooster structuur werd behouden. Deze resultaten demonstreren dat SIA kan worden om ECM materialen ingenieur met diverse samenstellingen en structuren.
Gevallen van mislukte SIA ECM nanovezels worden getoond in Figuur 4. Een oorzaak onjuiste afgifte van een onvolledige patroon als gevolg van slechte overdracht van ECM-eiwit aan het oppervlak tijdens PIPAAm microcontact afdrukken (figuur 4A). De aanwezigheid van gaten, onregelmatige randen, en andere gebreken zal nanovezels en nanostructuren die onvolledig is en gevoelig voor breuk en fragmentatie op versie te creëren. Snelle oplossing van PIPAAm kan ook leiden tot een slechte patroon trouw na de release (Figuur 4B). Bijvoorbeeld met behulp kamertemperatuur 20 ° C DI water al onder de LCST van PIPAAm plaats van 40 ° C water zal de PIPAAm snel zwellen en oplossen. Dit kan twee problemen veroorzaken; (I) de snelle expansie kan scheuren sommige ECM nanovezels en (ii) de snelle expansie kan verstoring van het patroon regeling na de release veroorzaken.
Figuur 1. Schema van SIA proces. (A) een siliciumwafer spincoating met SU8 negatieve fotoresist en blootgesteld aan UV-licht door een fotomasker. Niet-blootgestelde gebieden worden ontwikkeld weg verlaten van een topografisch patroon m aster schimmel. (B) PDMS prepolymeer wordt gegoten over de master schimmel en uitgehard gedurende 4 uur bij 65 ° C. (C) Na uitharding wordt een PDMS stempel uitgesneden. (D) de stempel wordt vervolgens geïncubeerd met een ECM eiwitoplossing waar de eiwitten adsorberen aan de stempel in een gedeeltelijk ontvouwen conformatie. (E) De stempel wordt gespoeld om het overtollige eiwit te verwijderen, gedroogd, en geplaatst in conforme contact met een PIPAAm-gecoat glas dekglaasje. (F) De stempel wordt vervolgens verwijderd met achterlating gevormde ECM eiwit op de PIPAAm gecoate dekglaasje, wordt het patroon bepaald door de topografie van de stempel. (G) Het dekglaasje wordt dan geplaatst in een petrischaal en bedekt met 40 ° C water en daarna afgekoeld onder de LCST van PIPAAm (~ 32 ° C), die de ontbinding van PIPAAm en de afgifte van geassembleerde ECM eiwitten nanovezels en / of nanostructuren van het oppervlak veroorzaakt.
tp_upload/51176/51176fig2.jpg "/>
Figuur 2. Gebruik SIA populaties van monodisperse nanovezels ingenieur. (A) Een serie van FN rechthoeken, 50 pm lang en 20 urn breed zijn gevormd op het oppervlak PIPAAm. (B) Toevoeging van 40 ° C DI water en vervolgens afkoelen onder de LCST van PIPAAm leidde tot de ontbinding van PIPAAm en de vrijlating van de FN nanovezels. Na het loslaten, de vezels een krimp ze onder een voorspanning bij het patroon op het oppervlak PIPAAm. (C) Analyse van nanovezels afmetingen pre-vrijgave onthult de vezels monodisperse een lengte en breedte van 50,19 ± 0,49 pm en 19.98 ± 0.17 um, respectievelijk. (D) Na het loslaten van de nanovezels gecontracteerd maar bleef monodisperse met na de introductie lengte en breedte van 14,15 ± 0,92 micrometer en 2,65 ± 0,32 micrometer, respectievelijk. (E) AFM bleek dat de pre-release nanovezelswaren ~ 5 nm dik. (F) AFM na de introductie nanovezels bleek dat de dikte toegenomen tot enkele honderden nanometer, terwijl de lengte en breedte af. -Scale Bars zijn (A) 50 pm en (B) 10 micrometer.
Figuur 3. Gebruik SIA ECM eiwitten nanovezels en nanostructuren met variabele grootte, vorm en samenstelling ingenieur. (A) FN nanovezels werden gevormd op een PIPAAm gecoate dekglaasje met 1 cm lang en 20 urn breed. Thermische vrijlating resulteerde in de SIA van lange, intact FN nanovezels met een gereduceerde breedte van ~ 3 micrometer. (B) Een voorbeeld van een meer gecompliceerde multi-gewapende FN ster, vertegenwoordiger van de diverse nanostructuren die kunnen worden gemaakt met behulp van SIA. Thermische vrijlating leidde tot de samentrekking van de armen, maar niet de centrale regio van de ster, waar de armen samengevoegd. (C) Het is ookkunnen meerdere ECM eiwitten in dezelfde structuur te integreren. Bijvoorbeeld, orthogonale, onderling verbonden 20 urn brede lijnen FN (rood) en 50 urn brede lijnen LN (groen) lijnen geïntegreerd in een 2D nanofabric werden gevormd en vervolgens losgelaten. Zelfs na de release, het patroon behield haar oorspronkelijke geometrie en interconnectiviteit. Schaal bars zijn 50 micrometer.
Figuur 4. Voorbeelden van problemen die kunnen voorkomen juiste SIA en eiwit vrijlating uit de PIPAAm oppervlak. (A) Matig microcontact afdrukken van ECM eiwitten op de PIPAAm resulteert in fragmentatie en andere gebreken van een 20 micrometer breed FN lijn voorkomt dat de SIA van een continu FN nanovezel, maar resulteert in de vorming vele kleinere FN fragmenten. (B) snel loslaten FN nanovezels van de PIPAAm substraat kan ook de uiteindelijke vezel regeling. In dit geval water eent 20 ° C, al onder de LCST van PIPAAm, toegevoegd en geactiveerd snelle oplossing waardoor de nanovezels terugspringen, breken (30 seconden) en vormen willekeurig, ongeorganiseerde configuraties (52 sec). Schaal bars zijn 50 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De SIA-methode hier gepresenteerde bootst cel gemedieerde matrix assemblage en maakt de engineering van ECM eiwitten nanovezels en nanostructuren met variabele grootte, organisatie en samenstelling. Hoewel niet identiek zijn aan-cel gegenereerd ECM, SIA creëert ECM bestaat uit nanoschaal eiwitfibrillen 20 dat omkeerbaar vouwen ondergaan / ontvouwen tijdens mechanische belasting 21 en kunnen cellen binden 20. Dit biedt een unieke mogelijkheid om ECM-eiwit materiaal dat veel eigenschappen van de ECM in vivo recapituleren bouwen. Bijvoorbeeld kan ECM nanovezels worden vervaardigd in bepaalde lengte met een controleniveau haalbaar met andere technieken. We demonstreren de mogelijkheid om arrays van monodisperse nanovezels (figuur 2) met nauwkeurige controle van lengte en breedte pre-afgifte (figuur 2C) en post-afgifte (figuur 2D) te creëren. Deze ECM nanovezels kan elke lengte zijn, zoals blijkt uit het vervaardigen van FN nanovezels in ~ 1 cm lengte (Figuur 3A). Daarentegen kunnen andere fabricagetechnieken zoals electrospinning en fasescheiding nanovezels te maken maar niet de nauwkeurige controle van lengte produceren voornamelijk continue vezels. Deze technieken zijn ook beperkt in de vezel geometrie en organisatie in een scaffold. SIA worden gebruikt om ECM nanostructuren te bouwen met willekeurige vlakke geometrie, zoals een ster (figuur 3B), en 2-D platen met willekeurige controle vezels organisatie, zoals een nanofabric (figuur 3C). Verder andere fabricagemethoden gebruiken meestal synthetische materialen of slechts een beperkt aantal natuurlijke opties zoals chitosan en fibrine. Ter vergelijking, SIA maakt het samenstel van nanovezels en nanostructuren volledig samengesteld ECM eiwitten zoals FN en LN, die niet kunnen worden vervaardigd met deze andere werkwijzen.
De cruciale stap in de SIA-proces is de thermisch geactiveerd vrijlating uit the PIPAAm oppervlak. Om een goede uitgave mogelijk te maken, zijn er een paar belangrijke stappen die moeten worden overwogen. Eerst nadat de microcontact afdrukken stap de betrouwbaarheid van het overgedragen ECM patroon worden ofwel met fasecontrast microscopie of fluorescentiemicroscopie (indien de ECM eiwitten fluorescent gelabeld zijn) geïnspecteerd. Als er defecten in het eiwit patroon op de PIPAAm oppervlak, dan is de volgende release zal produceren nanostructuren die deze gebreken bevatten (zoals waargenomen in figuur 4A). Als een PDMS stempel herhaaldelijk produceert eiwitpatronen met gebreken, is het waarschijnlijk dat de micropatterned kant van de PDMS stempel is bekrast of bevat fouten en een nieuwe stempel en mogelijk een nieuwe meester mal moet worden gemaakt. Bovendien moet erop worden gelet bij het hydrateren van de eiwit patroon, PIPAAm-gecoate dekglaasje. Het water moet op of nabij 40 ° C en laat men langzaam afkoelen. Als het water niet warm genoeg of te snel afkoelt, zal de PIPAAm zwellen eennd ontbinden te snel waardoor de ECM-eiwit nanovezels en nanostructuren worden mogelijk afgezien van de krachten en lukraak gescheurd vrijgelaten zodanig dat eventuele structurele organisatie lijkt op het droge, pre-released staat zal worden verloren (Figuur 4B).
ECM-eiwit nanovezels, nanostructuren en nanofabrics geassembleerd met behulp van SIA hebben vele toepassingen in de biomechanica, tissue engineering, en biotechnologie. Bijvoorbeeld, recente gegevens blijkt dat de mechanische eigenschappen van ECM eiwitfibrillen betreft hun biologische functionaliteit 23. SIA is bij uitstek geschikt om ECM-eiwit nanovezels te maken in gezuiverde vorm voor mechanische analyse. Om deze experimenten uit te voeren, kan vrijgegeven ECM eiwit nanovezels worden gemanipuleerd met precisie micropositioners en vervolgens uitgerekt. Deravi et al. hebben onlangs gebruikt deze benadering zien dat FN nanovezels kunnen weerstaan tot 8-voudige extensies en ze ondergaan elastische, kunststof en st-regen verstijving regimes met toenemende spanning 21. In weefselengineering ECM eiwitten gebaseerde scaffolds in de vorm van gels (bijvoorbeeld collageen type I en fibrine) of ontceld weefsels 4 worden veel gebruikt. Vergeleken met deze techniek het voordeel van SIA is de mogelijkheid om steigers ingenieur met goed gedefinieerde architectuur in 1-D vezels en 2-D platen (Figuur 3C). Zo hebben we eerder aangetoond dat hartspiercellen kunnen worden gezaaid op FN nanovezels functionele onderdelen van de hartspier 20 vormen. Hieruit blijkt dat de FN nanovezels celbinding en dat zij de anisotrope samenstel van cellen direct in lijn weefselstructuren. De 2-D nanofabrics kan de samenstelling en gelaagde structuur van de basale membraan voor toepassing in de techniek van epitheliale en endotheliale weefsels nabootsen. Verder zijn we het ontwikkelen van nieuwe manieren om deze ECM nanovezels en nanofabrics zetten in 3-D door ze binnen hydrogelmatrices.Uit de in dit artikel beschreven werkwijze is het mogelijk om SIA om ECM-eiwitten gebaseerde, nanogestructureerde materialen ingenieur voor uiteenlopende toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Financiële steun werd van de NIH Biomechanica van de NIH Director's New Innovator Award (1DP2HL117750) verstrekt aan JMS in Regeneratieve Geneeskunde T32 Training Program (2T32EB003392), om QJ van Dowd-ICES Fellowship en AWF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Teo, W. E., Ramakrishna, S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology. 17, (2006).
- Reneker, D. H., Chun, I. Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning. Nanotechnology. 7, 216-21 (1996).
- Ma, P. X., Zhang, R. Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix. Journal of Biomedical Materials Research. 46, 60-72 (1999).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60, 613-621 (2002).
- Matthews, J. A., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Collagen Nanofibers. Biomacromolecules. 3, 232-238 (2002).
- Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Ramakrishna, S., Lim, C. T. Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers. Polymer. 45, 5361-5368 (2004).
- Wnek, G. E., Carr, M. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Nanofiber Fibrinogen Structures. Nano Letters. 3, 213-216 (2002).
- Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
- Jin, H. -J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G. H., Kaplan, D. L. Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats. Biomaterials. 25, 1039-1047 (2004).
- Wierzbicka-Patynowski, I., Schwarzbauer, J. E. The ins and outs of fibronectin matrix assembly. Journal of Cell Science. 116, 3269-3276 (2003).
- Mosher, D. F., Johnson, R. B. In vitro formation of disulfide-bonded fibronectin multimers. Journal of Biological Chemistry. 258, 6595-6601 (1983).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biology. 27, 451-461 (2008).
- Ulmer, J., Geiger, B., Spatz, J. P. Force-induced fibronectin fibrillogenesis in vitro. Soft Matter. 4, 1998-2007 (2008).
- Klotzsch, E., et al. Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. , (2009).
- Feinberg, A. W., Parker, K. K. Surface-Initiated Assembly of Protein Nanofabrics. Nano Letters. 10, 2184-2191 (2010).
- Deravi, L. F., et al. Differential Contributions of Conformation Extension and Domain Unfolding to Properties of Fibronectin Nanotextiles. Nano Letters. 12, 5587-5592 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J Vis Exp. , 1065 (2008).
- Vogel, V. Mechanotransduction Involving Multimodular Proteins: Converting Force into Biochemical Signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
