Summary
Eine Methode, um komplexe Nanofasern und Nanostrukturen aus einzelnen oder mehreren extrazellulären Matrixproteinen zu erhalten, wird beschrieben. Diese Methode verwendet Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen zu frei stehenden Materialien auf Proteinbasis mit abstimmbaren Zusammensetzung und Architektur für den Einsatz in einer Vielzahl von Gewebe-und Biotechnologie-Anwendungen zu erstellen.
Abstract
Die extrazelluläre Matrix (ECM) in Geweben synthetisiert und von Zellen zusammengesetzt, um ein 3D fibrilläre Proteinnetzwerk mit streng reguliert Faserdurchmesser, Zusammensetzung und Organisation bilden. Neben der Bereitstellung von Strukturförderung, die physikalischen und chemischen Eigenschaften der ECM spielen eine wichtige Rolle in mehrere zelluläre Prozesse einschließlich Adhäsion, Differenzierung und Apoptose. In vivo wird die ECM indem kryptischen Selbstmontage (Fibrillogenese) Websites innerhalb von Proteinen zusammengebaut . Dieses Verfahren unterscheidet sich für verschiedene Proteine, sondern Fibronectin (FN) Fibrillogenese ist gut charakterisiert und dient als Modellsystem für die zellvermittelte ECM Anordnung. Genauer gesagt, Zellen zu verwenden, Integrin-Rezeptoren auf der Zellmembran FN Dimere und Aktomyosin generierten Kontraktionskräfte zu binden, um Bindungsstellen für den Zusammenbau zu entfalten und unlöslichen Fasern freizulegen. Dieser Rezeptor-vermittelte Verfahren ermöglicht Zellen aus der Zellgewebe sca versammeln und organisieren die ECMles. Hier präsentieren wir eine Methode bezeichnet oberflächeninitiierte Montage (SIA), die Zell-vermittelte Matrixanordnung rekapituliert Verwendung von Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen zu ECM-Proteine entfalten und montieren sie in unlösliche Fasern. Zunächst werden ECM-Proteine auf eine hydrophobe Polydimethylsiloxan (PDMS) Oberfläche, wo sie teilweise zu denaturieren (breiten) und setzen kryptische Bindungsdomänen adsorbiert. Die entfalteten Proteine werden dann in wohldefinierten Mikro-und Nanostrukturen durch Mikrokontaktdruck auf eine thermisch ansprechende Poly (N-isopropylacrylamid) (PIPAAm) Oberfläche übertragen. Thermisch ausgelöste Auflösung des PIPAAm führt zur Endmontage und Freisetzung von ECM-Protein unlöslich Nanofasern oder Nanostrukturen mit definierter Geometrie. Complex-Architekturen sind durch Ingenieur definierten Muster auf den PDMS-Stempel für Mikrokontakt-Drucken verwendet werden kann. Neben FN kann die SIA-Prozess mit Laminin, Fibrinogen verwendet werden und Kollagene vom Typ I und IV der Mehrkomponenten-Nano ECM erstellenturen. Somit SIA kann zur ECM-Materialien auf Proteinbasis mit genauer Kontrolle der Proteinzusammensetzung, Fasergeometrie und Gerüst-Architektur, um die Struktur und Zusammensetzung der ECM in vivo gentechnisch zu rekapitulieren.
Introduction
Die extrazelluläre Matrix (ECM) in Geweben aus multifunktionellen Proteine in physikalischen und chemischen Regulation mehrerer Zellprozesse einschließlich Adhäsion, Proliferation, Differenzierung und Apoptose beteiligt 1-3 besteht. Das ECM synthetisiert, zusammengebaut und von Zellen organisiert und die Proteinbestand Fibrillen haben einzigartige Zusammensetzungen, Fasergröße, Geometrien und Architekturen, die mit miteinander verbundenen Gewebetyps und des Entwicklungsstadiums variieren. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass die ECM lehr Hinweise liefern, um Zellen zu Geweben entwickelt 4 zu bilden, was darauf hindeutet, dass die ECM rekapituliert in Bezug auf die Zusammensetzung und Struktur könnte die Entwicklung biomimetischer Materialien für Tissue Engineering und Biotechnologie-Anwendungen ermöglichen zu führen.
Eine Anzahl von Herstellungsverfahren entwickelt worden, um polymere Gerüste, die Aspekte der ECM in Gewebe nachahmen kann Ingenieur. Zum Beispiel Elektrospinning-und Phasen separation haben sowohl die Fähigkeit gezeigt porösen Matrices aus Fasern mit einem Durchmesser von zehn Mikrometern bis einigen zehn Nanometern 5-7 bilden. Beide Techniken haben auch gezeigt, daß hochporöse Matrizen von Nanofasern Zelladhäsion und Infiltration in das Gerüst 8 unterstützt. Jedoch sind diese Ansätze in den Fasergeometrien möglich, Orientierungen und 3D-Architekturen, die erzeugt werden kann begrenzt. Das Elektro erzeugt typischerweise Gerüste entweder mit zufällig orientierten oder stark ausgerichteten Fasern wohinPhasenTrennung erzeugt Gerüste mit zufällig orientierten Fasern. Es gibt auch Einschränkungen hinsichtlich der Materialien, mit Forschern typischerweise unter Verwendung von synthetischen Polymeren, wie Poly (ε-caprolacton) 8 und Poly (milch-co-glykolsäure) 9, die nachfolgend mit ECM-Proteinen beschichtet sind, um die Zelladhäsion zu fördern. Natürliche Biopolymere werden ebenfalls verwendet, einschließlich Kollagen Typ I 10, 11 Gelatine, Fibrinogen 12,Chitosan 13, 14 und Seide, aber nur einen kleinen Teil der Proteine in nativem Gewebe gefunden. Die meisten Gewebe enthalten eine größere Milieu von ECM-Proteinen und Polysacchariden, einschließlich Fibronectin (FN), Laminin (LN), Kollagen Typ IV und Hyaluronsäure, die schwierig oder unmöglich zu Nanofasern unter Verwendung von existierenden Verfahren herzustellen sind.
Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir unsere Forschung auf die Art und Weise imitiert Zellen synthetisieren, montieren und organisieren ECM-Protein Fibrillen in ihrer Umgebung konzentriert. Während die spezifische Fibrillogenese Verfahren variiert für verschiedene ECM-Proteine, typischerweise eine Konformationsänderung im ECM-Protein-Moleküls wird durch eine enzymatische oder Rezeptor-vermittelte Wechselwirkung, die kryptische Selbstmontagestellen macht ausgelöst. Hier verwenden wir FN als Modellsystem, um die Fibrillogenese Prozess besser zu verstehen. Kurz gesagt, FN Homodimere an Integrin-Rezeptoren auf der Zelloberfläche über die RGD-Aminosäuresequenz in der 10. Typ II bindenIch wiederhole Einheit. Einmal gebunden, bewegen sich die Integrine auseinander Actomyosin über Kontraktion und entfalten die FN-Dimere kryptische Selbstmontagestellen freizulegen. Die Exposition dieser FN-FN-Bindungsstellen ermöglicht es den FN-Dimere nach rechts auf der Zelloberfläche 15 in eine unlösliche Fibrillen zusammenzubauen. Work in zellfreien Systemen hat gezeigt, dass kryptische FN-FN-Bindungsstellen durch Entfaltung mit Vergällungsmittel 16 oder Oberflächenspannung bei einem Luft-Flüssigkeit-Feststoff-Schnittstelle 17-19 offenbart werden. Jedoch werden die FN-Fasern, die durch diese Techniken auf bestimmte Faser Größen und Geometrien beschränkt und sind typischerweise an eine Oberfläche gebunden.
Hier beschreiben wir einen Ansatz bezeichnet oberflächeninitiierte Montage (SIA) 20, die diese Einschränkungen überwindet durch die Verwendung von Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen zu freistehenden unlöslichen Nanofasern, nanofabrics (2D-Pläne) und anderen Nanostrukturen von einzelnen oder mehreren ECM-Proteinen (Abbildung 1 erstellen ). In diesem process, werden ECM-Proteine aus einem kompakten, kugelförmigen Konformation in Lösung adsorbiert und teilweise denaturiert (ungefaltet) auf einem gemusterten hydrophoben Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel. Die ECM-Proteine werden dann in diesem Zustand auf einen thermisch ansprechenden Poly (N-isopropylacrylamid) (PIPAAm) Oberfläche durch Mikrokontaktdruck 22 übertragen. Wenn es mit 40 ° C Wasser hydratisiert die PIPAAm bleibt eine feste, aber wenn bis 32 ° C abgekühlt, es durch eine untere kritische Lösungstemperatur (LCST), wo sie hydrophil wird spielt quillt mit Wasser und dann löst sich, die Freigabe der ECM-Nanostrukturen zusammengesetzt aus der die Oberfläche. Die SIA-Methode ermöglicht die Kontrolle über die Dimensionen mit Nanometer-Präzision. Durch die Steuerung Schlüsselparameter wie Zusammensetzung, Fasergeometrie und Architektur ist es möglich, viele Eigenschaften der ECM in vivo gefunden zu rekapitulieren und zu fortgeschrittenen Gerüste für Tissue Engineering und Biotechnologie-Anwendungen zu entwickeln.
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Protocol
1. Herstellung von Master-Mold mittels Photolithographie
- Die ECM-Protein-Nanofasern, nanofabrics und Nanostrukturen hergestellt werden, werden zunächst mit Hilfe von Computer Aided Design (CAD) Software konzipiert. Diese CAD-Datei wird dann auf eine Photomaske übertragen. Die Art der Photomaske auf die Auflösung der Funktionen hängen; mit einer Transparenz-basierte Photomaske ausreichend für Spielgrößen bis zu ~ 10 um. Kleinere Funktionen <10 um eine Chrom auf Glasphotomaske erforderlich. Alle Nanofasern und Nanostrukturen hier vorgestellten wurden mit einem Transparenz-basierte Photomaske nicht lateralen Abmessungen hergestellt und waren damit im Nanometer-Maßstab in der Dicke aber.
Hinweis: Es ist wichtig, zu unterscheiden, welche Regionen der Photomaske wird dunkel sein (verhindert UV Licht passieren) und die transparent sein wird (lassen UV-Licht durchlässt), da dies, zusammen mit der Art des Fotolacks (positiv oder negativ) , wird die endgültige Topographie des Master-Form diktieren. - Zur Herstellung der Master-Form beginnen, dehydrieren ein 4 "Silizium-Wafer, indem Sie es auf einer Heizplatte auf 150 ° C für 15 min eingestellt.
- Zentrieren des Wafers auf dem Vakuumspannfutter einer Schleuderbeschichtungsvorrichtung. Gießen SU8-2015 negativen Photoresist auf die Mitte des Wafers und weiterhin Gießen in konzentrischen Kreisen bis zu zwei Drittel des Wafers bedeckt.
Hinweis: beim Gießen, um die Bildung von Blasen zu minimieren Halten Sie die Flasche SU8 Nähe des Wafers. - Programmieren Sie die Spincoaters wie folgt:
- Spread-Zyklus: 500 min bei einer Beschleunigung von 100 U / s für 10 Sekunden.
- Schleudern: 4000 UpM mit einer Beschleunigung von 100 U / s für 30 Sekunden.
- Weiche backen den Wafer, indem Sie es auf einer Heizplatte auf 95 ° C für 3 min eingestellt.
- Setzen Sie die Scheibe mit UV-Licht durchdie Fotomaske für eine Gesamtdosis von 140 mJ / cm 2.
Hinweis: SU8 ist ein Negativlack also Regionen, in denen UV-Licht ist in der Lage, durch die Photomaske übergeben wird nach der Entwicklung bleiben und hob Features auf der Master-Form. - Nach der Belichtung des Wafers, indem Sie es auf einer Heizplatte auf 95 ° C für 4 min eingestellt.
- Entwickeln Sie die Wafer, indem es in SU8 Entwickler für 3 min. Nach 3 min, spülen Sie die Scheibe mit Isopropyl-Alkohol. Wenn ein weißer Film wird während des Spülvorgangs erzeugt wird, wird der Wafer nicht vollständig entwickelt und es sollte wieder in den Entwickler für weitere 30 Sekunden gesetzt werden. Spülen wieder mit Isopropyl-Alkohol. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis ein weißer Film nicht während der Isopropylalkohol gespült bilden.
- Trocknen der Wafer in einem Stickstoffstrom und in eine 150 mm Petrischale vor Staub zu schützen.
2. Herstellen der PDMS-Stempel
- Bereiten Sie die PDMS-Präpolymer durch die Kombination der Elastomer Basis und Härter in einem10.01 w / w-Verhältnis. Typischerweise 80 g Base und 8 g Härter verwendet werden, um sicherzustellen, dass es ausreichend ist, um das PDMS-Vorlagenform in einer 1 cm dicken Schicht bedecken.
- Mix und entgast die PDMS mit einer zentripetalen Mischpult an den folgenden Einstellungen:
- Mix: 2.000 rpm für 2 min
- Degas: 2.000 rpm für 2 min.
- Wenn ein Mischer ist nicht verfügbar, die PDMS-mischen von Hand für 10 min mit einer 10 ml serologische Pipette. Entgasen der Mischung, indem sie in einem Vakuum-Exsikkator für 30 Minuten, um Blasen zu entfernen.
- Gießen Sie genug PDMS Prepolymer die Master-Form (gemusterten Silizium-Wafer), eine 1 cm dicke Schicht zu bilden. Härten des PDMS durch Backen bei 65 ° C für 4 Stunden oder bei Raumtemperatur für 48 Stunden.
- Einmal ausgehärtet, können die Regionen, die die Muster ausgeschnitten werden, um die PDMS-Stempel zu bilden. Um die Funktion zu Seite, von der Rückseite der PDMS-Stempel unterscheiden, schneiden eine Kerbe von einer der Ecken auf der Rückseite der Briefmarke.
3. Mikrokontakt-PrInting von ECM-Patterns
- Rein 25 mm Durchmesser Glasdeckgläser durch Beschallung in 95% Ethanol für 1 Stunde und dann in einem 65 ° C Ofen trocknen.
- Vorbereitung der PIPAAm durch Auflösen PIPAAm in 1-Butanol bei einer Konzentration von 10% (w / v, typischerweise 1 g in 10 ml).
- Mitte ein Deckglas auf der Vakuumspannvorrichtung und der Spincoater Pipette 200 ul der Lösung PIPAAm so dass die gesamte Glasoberfläche bedeckt.
- Schleuderbeschichtung des Deckglases bei 6.000 rpm für 1 min.
- Reinigen Sie die PDMS-Stempel durch Beschallung in 50% Ethanol für 30 min und dann unter einem Stickstoffstrom trocken.
Hinweis: Die Trocknung und die nachfolgenden Schritte sollten in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden, um die Sterilität für Anwendungen, bei denen die ECM-Nanostrukturen wird mit Zellen verwendet werden, beizubehalten. - Beschichten der strukturierten Oberfläche jeder PDMS-Stempel mit 200 &mgr; l der Proteinlösung, typischerweise 50 ug / ml in sterilem destilliertem Wasser für FN. Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur.
Hinweis: ThBeschichtungsvolumen ist für eine 1,5 cm 2 PDMS-Stempel und müssen je nach Größe der PDMS-Stempel, der verwendet ECM-Protein, und die Konzentration des ECM-Protein in Lösung eingestellt werden. - Waschen Sie die PDMS-Stempel in destilliertem Wasser, um überschüssiges Protein und gründlich trocknen unter einem Stickstoffstrom entfernen.
Hinweis: Jeder Wasser gelassen auf der Briefmarke wird die vorzeitige Auflösung des PIPAAm Beschichtung auf dem Deckglas auslösen und richtige Proteintransfer zu verhindern. - Für sterile Herstellung, legen Sie die PIPAAm-beschichtete Deckgläser in einer geschlossenen Petrischale und sterilisieren mit UV-Exposition, 45 min unter der UV-Licht in einem biologischen Sicherheitsschrank ist ausreichend. Dieser Schritt kann die Sterilität nicht erforderlich weggelassen.
- Führen Mikrokontaktdruck, indem Sie die Funktion Seite der PDMS-Stempel in Kontakt mit der PIPAAm-beschichtete Deckglas. Wenn erforderlich, Pinzette leicht auf der Rückseite der Briefmarken tippen, um Luftblasen zu entfernen und sicherzustellen, gleichmäßigen Kontakt.
- Nach 5 kmn, ziehen Sie die PDMS-Stempel aus dem Deckglas.
- Auf dieser Stufe können weitere ECM-Proteine strukturiert werden, um komplexere und Mehrkomponentenstrukturen. Bis zu 3 Drucke überprüft wurden, um mit diesem Prozess zu arbeiten, und mehr machbar sein.
4. Mitteilung von ECM-Nanofasern und Nanostrukturen
- Legen Sie die gemusterten PIPAAm beschichtete Deckgläschen in einer 35 mm Petrischale und untersuchen das Muster Treue mit Phasenkontrastmikroskopie. Je nach dem Muster, kann eine CCD-Kamera erforderlich sein, die Merkmale des Musters aufzulösen. Fluoreszenzmikroskopie können auch verwendet werden, um die, sofern die ECM-Proteine fluoreszierend markiert Muster zu inspizieren.
- 3 ml 40 ° C destilliertem Wasser auf die Petrischale und lassen Sie das Wasser nach und cool.
- Die Auflösung des PIPAAm Schicht und die Freisetzung der ECM Proteinmuster kann unter Verwendung von Phasenkontrastmikroskopie überwacht werden. Wenn die Anwendung die Verwendung von optischen tec nicht zulassenhniques kann die Freisetzung durch Messung der Lösungstemperatur überwacht werden. Typischerweise wird das Wasser auf Raumtemperatur und unterhalb der LCST PIPAAm (32 ° C) abgekühlt, um sicherzustellen, dass die ECM-Protein-Nanostrukturen sind bekannt.
- Nach der Freigabe werden die Nanofasern, nanofabrics und anderen Nanostrukturen in Wasser schwimmen. Um sie zu verwenden für weitere Anwendungen, die sie benötigen, um manipuliert werden. Die genaue Vorgehensweise wird auf dem Versuchsziel ab und kann Schritte wie Immobilisierung auf eine andere Oberfläche, bewegt sich mit einem Mikromanipulator-System oder die Einbettung in einem Hydrogel gehören.
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Representative Results
SIA ist in der Lage Engineering ECM-Protein-Nanofasern mit präziser Kontrolle über die Faserabmessungen. Um dies zu demonstrieren, wurden Anordnungen von FN-Nanofasern mit ebenen Abmessungen von 50 x 20 um auf eine PIPAAm beschichteten Deckglas (2A) strukturiert. Nach Freigabe, beauftragte die Fasern, weil sie unter einer inhärenten Vorspannung, wenn auf der Oberfläche PIPAAm (2B) strukturiert. Die Analyse der FN-Nanofasern ergab, waren sie monodisperse Pre-Release mit einer durchschnittlichen Länge von 50,19 ± 0,49 um und einer Breite von 19,98 ± 0,17 um (Abbildung 2C). Trotz Vertrags deutlich, FN Fasern nach der Veröffentlichung waren noch monodisperse mit einer durchschnittlichen Länge von 14,15 ± 0,92 um und Breite von 2,65 ± 0,32 um (2D). Rasterkraftmikroskopie ein höherer Auflösung Perspektive der Faserformänderungen mit dem SIA-Release-Prozess verbunden. Bemerkenswert ist, Fasern Pre-Release hatteeine gleichmäßige Dicke von ~ 5 nm (2E), während die Fasern nach der Veröffentlichung hatte eine heterogene Dicke in der Größenordnung von mehreren hundert Nanometern (2F).
Verwendung der SIA Verfahren ist es möglich, eine Vielzahl von ECM-Protein-Nanostrukturen mit einstellbaren Größe, Form und Zusammensetzung (Figur 3) zu konstruieren. Zum Beispiel FN Nanofasern zunächst 20 um in der Breite und 1 cm Länge wurden auf eine PIPAAm beschichteten Deckglas strukturiert. Beim Abkühlen und PIPAAm Auflösung die Nanofasern freigesetzt wurden lange Fäden bilden (Abbildung 3A). Ferner kann, da das Muster durch die Oberflächentopographie des für Mikrokontaktdrucken verwendet PDMS-Stempel definiert ist, ist es möglich, komplexe ECM-Protein-Nanostrukturen zu konstruieren. Als Proof-of-concept, wir mehrarmige FN Sterne, die ihrer allgemeinen Form nach dem Release (3B) beibehalten erstellt. Interessant ist, dass die Arme des FN-Sterne gezogen wie die Nanofasern, aberder Körper des stern gehalten seine Größe. Während FN ist wichtig, wollten wir auch zeigen, dass SIA arbeitet mit anderen ECM-Proteine wie LN und dass mehrere ECM-Proteine in den gleichen Aufbau integriert werden. Zum Beispiel entwickelt wir eine 2-D-Nanostoff von orthogonalen und miteinander verbunden Nanofasern von FN und LN in einer quadratischen Gitteranordnung (3C) zusammen. Pre-Release die FN-Nanofasern waren 20 um breit und die LN-Nanofasern waren 50 um breit. Nach Freigabe beide Arten von Nanofasern vertraglich aber die gesamte Interkonnektivität und quadratische Gitterstruktur beibehalten wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass SIA kann verwendet werden, um ECM-Materialien mit verschiedenen Zusammensetzungen und Strukturen zu konstruieren ist.
Instanzen gescheitert SIA von ECM-Nanofasern sind in Abbildung 4 dargestellt. Eine Ursache ist falsche Version von einem unvollständigen Muster aufgrund der schlechten Übertragung von ECM-Protein an der Oberfläche während PIPAAm Mikrokontaktdruck (4A). Die Anwesenheit von Löchern, unregelmäßige Kanten und andere Mängel werden Nanofasern und Nanostrukturen, die unvollständig und bruchanfällig und Fragmentierung bei der Freigabe sind zu schaffen. Schnelle Auflösung PIPAAm kann auch dazu führen, schlechte Muster Treue nach der Freigabe (4B). Zum Beispiel mit Raumtemperatur 20 ° C DI-Wasser schon unterhalb der LCST von PIPAAm statt 40 ° C Wasser bewirkt, dass die PIPAAm schnell anschwellen und zu lösen. Dies kann auf zwei Probleme verursachen; (I) die rasche Expansion auseinander einige ECM-Nanofasern rippen und (ii) die rasche Expansion kann Störung der Musteranordnung nach der Entlassung führen.
Fig. 1 ist. Schema der SVV Prozess. (A) Ein Siliciumwafer mit SU8 negativen Photoresist aufgeschleudert und mit UV-Licht durch eine Photomaske belichtet. Nicht belichteten Bereiche entfernt Verlassen einer topographisch gemusterten m entwickelt aster Form. (B) PDMS Prepolymer wird die Master-Form gegossen und 4 Stunden lang bei 65 ° C (C) Nach dem Aushärten wird ein PDMS-Stempel ausgeschnitten. (D) Der Stempel wird dann mit einem ECM-Protein-Lösung inkubiert wobei die Proteine adsorbieren an den Stempel in einer teilweise entfalteten Konformation. (E) der Stempel wird gespült, um überschüssiges Protein zu entfernen, getrocknet und in einen konformen Kontakt mit einem PIPAAm beschichteten Deckglas gelegt. (F) der Stempel wird dann entfernt zurückgelassen gemusterten ECM-Protein auf der PIPAAm beschichteten Deckglas wird das Muster durch die Topographie des Stempels vorgegeben. (G) das Deckglas wird dann in eine Petrischale gelegt und mit 40 ° C Wasser bedeckt und dann unter die LCST PIPAAm (~ 32 gekühlt ° C), die die Lösung des PIPAAm und die Freisetzung von ECM-Protein zusammengesetzt Nanofasern und / oder Nanostrukturen von der Oberfläche löst.
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2. Verwendung SIA Populationen von monodispersen Nanofasern Engineer. (A) eine Anordnung von Rechtecken FN, 50 um in der Länge und Breite von 20 um wurden auf die PIPAAm Oberfläche gemustert. (B) Zugabe von 40 ° C DI-Wasser und anschließendes Abkühlen unterhalb der LCST von PIPAAm Auslöser für die Auflösung der PIPAAm und die Freilassung der FN-Nanofasern. Nach Freigabe, beauftragte die Fasern, wie sie sind unter einer Vorspannung, wenn auf der Oberfläche PIPAAm gemustert. (C) Analyse von Nanofaserabmessungen Pre-Release zeigt die Fasern mit einem monodispersen Länge und Breite ± 0,49 um 50.19 und 19.98 ± 0.17 um betragen. (D) Bei der Freigabe die Nanofasern unter Vertrag, blieb aber monodisperse mit Post-Release-Länge und Breite von 14,15 ± 0,92 und 2,65 ± um 0,32 &mgr; m. (E) AFM zeigten, dass die Pre-Release-Nanofasernwaren ~ 5 nm dick. (F) AFM von post-release-Nanofasern zeigten, dass die Stärke hatte, um mehrere hundert Nanometer erhöht, während die Länge und Breite verringert. -Scale-Bars sind (A) 50 um und (B) 10 um.
3. Verwendung SIA ECM-Protein-Nanofasern oder Nanostrukturen mit einstellbaren Größe, Form und Zusammensetzung zu konstruieren. (A) FN-Nanofasern wurden auf eine PIPAAm beschichteten Deckglas als 1 cm Länge und 20 um Breite strukturiert. Thermische Auslösung resultierte in der SIA von langen, intakten FN-Nanofasern mit einer reduzierten Breite von ~ 3 um. (B) Ein Beispiel für ein komplizierter Mehr bewaffneten FN Stern, Vertreter der verschiedenen Nanostrukturen, die mit SIA erstellt werden können. Thermische Auslöser in Folge der Kontraktion der Arme nicht aber der zentrale Bereich des Sterns, wobei die Arme miteinander verbunden sind. (C) Es ist auchkönnen mehrere ECM-Proteine in der gleichen Struktur zu integrieren. So wurden beispielsweise orthogonal, miteinander verbundenen 20 um breite Linien von FN (rot) und 50 &mgr; m breiten Linien LN (grün) in ein 2D-Nanostoff integriert Linien gemustert und dann freigegeben. Auch nach dem Release, das Muster behielt seine ursprüngliche Geometrie und Interkonnektivität. Maßstabsbalken sind 50 um.
Abbildung 4. Beispiele für Probleme, die richtige SIA-und Protein-Freisetzung aus der PIPAAm Oberfläche verhindern kann. (A) Schlechte Mikrokontakt-Drucken von ECM-Proteine auf die Ergebnisse in PIPAAm Fragmentierung und andere Mängel einer 20 um breiten FN Linie verhindert, dass die SIA von einem kontinuierlichen FN-Nanofaser und stattdessen führt zur Bildung viele kleinere Fragmente FN. (B) schnell die Freigabe der FN-Nanofasern aus der PIPAAm Substrat kann auch die endgültige Faseranordnung beeinflussen. In diesem Fall ist Wasser eint 20 ° C, bereits unterhalb der LCST von PIPAAm zugegeben und ausgelöst schnelle Auflösung bewirkt, dass die Nanofasern zu schnappen, zu brechen (30 sec) und nach dem Zufallsprinzip, unorganisiert Konfigurationen (52 sec). Maßstabsbalken sind 50 um.
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Discussion
Die hier vorgestellten Methode SIA imitiert Zell-vermittelte Matrixaufbau und ermöglicht die Konstruktion von ECM-Protein-Nanofasern und Nanostrukturen mit einstellbaren Größe, Organisation und Zusammensetzung. Zwar nicht identisch mit Zell-ECM erzeugt, schafft SIA ECM nanoskaliger Protein Fibrillen 20, die reversible Faltung unterziehen / Entfaltung bei der mechanischen Belastung 21 und 20 Zellen binden zusammen. Dies bietet eine einzigartige Fähigkeit, ECM-Protein-Materialien, die viele Eigenschaften der ECM in vivo gefunden rekapitulieren zu bauen. Zum Beispiel können ECM-Nanofasern in bestimmten Längen mit einem Kontrollniveau unmöglich mit anderen Techniken hergestellt werden. Wir zeigen die Fähigkeit, Anordnungen von monodispersen Nanofasern (Abbildung 2) mit präziser Kontrolle von Länge und Breite Pre-Release (2C) und post-release (2D) erstellen. Diese ECM-Nanofasern kann beliebig lang sein, da durch die Herstellung von Nano gezeigt FNFasern in ~ 1 cm Länge (Abbildung 3A). Im Gegensatz dazu können andere Herstellungsverfahren wie Elektro und Phasentrennung Nanofasern mit der präzisen Steuerung der Länge zu erzeugen, aber nicht, wodurch meist kontinuierlichen Fasern. Diese Techniken sind auch in den Fasergeometrien und Organisation innerhalb eines Gerüsts begrenzt. SIA kann verwendet werden, um ECM-Nanostrukturen mit beliebigen planaren Geometrie, wie beispielsweise einem Sternchen (3B) zu bauen, und in 2-D-Platten mit willkürlichen Kontrolle von Faser Organisation, beispielsweise einer Nanostoff (3C). Weiterhin können andere Herstellungsverfahren verwenden typischerweise synthetische Materialien oder nur eine begrenzte Anzahl von natürlichen diejenigen wie Chitosan und Fibrin. Im Vergleich SIA ermöglicht die Montage von Nanofasern und Nanostrukturen vollständig von ECM-Proteine wie FN und LN, welche nicht mit diesen anderen Verfahren hergestellt werden können, zusammengesetzt ist.
Der entscheidende Schritt in der SIA-Prozess ist die thermisch ausgelöste Freisetzung von thE PIPAAm Oberfläche. Um eine ordnungsgemäße Freisetzung zu gewährleisten, gibt es ein paar wichtige Schritte, die berücksichtigt werden sollten. Zuerst wird, nachdem der Mikrokontaktdruckschritt die Genauigkeit der übertragenen ECM Muster sollte entweder unter Verwendung von Phasenkontrastmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie (wenn die ECM-Proteine fluoreszierend markiert) untersucht werden. Wenn es irgendwelche Defekte in der Protein-Muster auf der Oberfläche PIPAAm, dann die anschließende Freisetzung wird Nanostrukturen, die diese Mängel enthalten (wie in Abbildung 4A beobachtet) zu produzieren. Wenn ein PDMS-Stempel immer wieder produziert Proteinmuster mit Mängeln, ist es wahrscheinlich, dass die mikro Seite der PDMS-Stempel wurde zerkratzt oder Mängel enthält und einen neuen Stempel und möglicherweise eine neue Master-Form hergestellt werden soll. Außerdem sollte Sorgfalt bei Hydratisierung des Proteins gemustert, PIPAAm beschichteten Deckglas genommen werden. Das Wasser sollte bei oder in der Nähe von 40 ° C und langsam abkühlen werden. Wenn das Wasser nicht warm genug oder kühlt zu schnell, wird der PIPAAm quellen einnd auflösen zu schnell wodurch die ECM-Protein-Nanofasern und Nanostrukturen, um potenziell abgesehen von den Kräften und planlos abgerissen freigegeben, so dass jede strukturelle Organisation ähnlich der trockenen, vorge gelösten Zustand verloren (4B) werden.
ECM-Protein-Nanofasern, mit Nanostrukturen und nanofabrics SIA zusammengebaut haben viele Anwendungen in der Biomechanik, Tissue Engineering und Biotechnologie. Zum Beispiel zeigt den letzten Beweis, dass die mechanischen Eigenschaften der ECM-Protein-Fibrillen regelt ihre biologischen Funktionen 23. SIA ist ideal geeignet, um ECM-Protein-Nanofasern in gereinigter Form für die mechanische Analyse erstellen. Um diese Experimente durchführen, können veröffentlicht ECM-Protein-Nanofasern mit Präzisions-Mikropositionierer manipuliert und dann gestreckt werden. Deravi et al haben vor kurzem diesen Ansatz verwendet, um zu zeigen, dass FN-Nanofasern können bis zu 8-fach-Erweiterungen standhalten und dass sie eine elastische, Kunststoff und stregen Versteifungs Regime mit zunehmender Belastung 21. In Tissue Engineering, ECM-Protein bezogen Gerüste in Form von Gelen (z. B. Kollagen Typ I und Fibrin) oder dezellularisierte Gewebe 4 sind weit verbreitet. Im Vergleich zu diesen Verfahren ist der Vorteil der SIA die Fähigkeit, Gerüste mit definierten Architektur in 1-D-Fasern und 2-D-Bogen (Fig. 3C) zu konstruieren. Zum Beispiel haben wir früher gezeigt, dass Herzmuskelzellen auf FN-Nanofasern können ausgesät werden, um funktionelle Stränge des Herzmuskels 20 zu bilden. Dies zeigt, dass die FN-Nanofasern sind Zellbindungs und dass sie die anisotrope Anordnung von Zellen in Gewebestrukturen ausgerichtet lenken können. Die 2-D nanofabrics können die Zusammensetzung und die Schichtstruktur der Basalmembran zur Anwendung in der Konstruktion von Epithel-und Endothel-Gewebe zu imitieren. Weiterhin entwickeln wir neue Wege, um diese ECM-Nanofasern und nanofabrics in 3-D durch Einbettung in Hydrogelmatrices einzusetzen.Von der in diesem Artikel beschriebenen Verfahren ist es möglich, SIA, um ECM-Protein-basierte, nanostrukturierte Materialien für eine Vielzahl von Anwendungen zu konstruieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Finanzielle Unterstützung wurde von der JMS NIH Biomechanik in der Regenerativen Medizin T32 Training Program (2T32EB003392) von den NIH Director New Innovator Award (1DP2HL117750) vorgesehen ist, um aus dem QJ Dowd ICES-Fellowship und AWF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
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